Comparison of in vivo and in vitro digestibility in horses Porovnání in vivo a in vitro stravitelnosti u koní K. Blažková 1, F. Jančík 1, P. Homolka 1, V. Kudrna 1, M. Maršálek 2, J. Čermáková 1 1 Institute of Animal Science, Prague-Uhříněves, Czech Republic 2 Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in České Budějovice, Czech Republic ABSTRACT: The objective of this study was to determine possibilities of in vitro methodologies developed for the Ankom Daisy II Incubator for prediction of accurate assessment of in vivo equine dry matter digestibility (DMD), when equine feces were used as the inoculum source. Five mature horses (geldings and mares) were used in experiments to determine in vivo dry matter digestibility of corn silage and grass hay plus oats. Horses were individually housed and fed. Feces were collected and deep freezing until to chemical analyses and calculate in vivo digestibility during each experimental period (2 3 days). Digestion of the both diets was evaluated by in vitro method using the Daisy II Incubator. Incubation vessel contained 11 filter bags (5 containing corn silage, 5 containg grass hay and oats and one was blank for correction). Samples were incubated for 72 h. There were found significant differences (P < 0.001) in the interactions among the feeds and methods. The values of dry matter digestibility 48.64, 62.84, 63.29 and 69.26 % were found for in vivo LSO, in vitro LSO, in vivo KS and in vitro KS, respectively. Results of in vivo and in vitro methods were highly correlated (r = 0.820). ABSTRAKT: Cílem této studie bylo určit možnosti in vitro metody vyvinuté pro Ankom Daisy II Incubator pro přesné odhady in vivo stravitelnosti sušiny u koní, jestliže bylo použito koňských výkalů jako zdroje očkovací látky. Do pokusů in vivo stanovení stravitelnosti sušiny kukuřičné siláže a lučního sena s ovsem bylo zařazeno pět dospělých koní (valachů a klisen). Koně byli individuálně ustájeni a krmeni. Během každé periody (2 3 dny) byly veškeré výkaly shromažďovány a zamrazeny pro následné provedení chemických analýz a výpočtů in vivo stravitelnosti. Pomocí Ankom Daisy II Incubator byla u stejných krmných dávek hodnocena in vitro stravitelnost. Inkubační nádoba obsahovala 11 filtračních sáčků (5 s obsahem kukuřičné siláže, 5 s obsahem lučního sena a ovsa a jeden sáček pro korekci). Sáčky byly inkubovány 72 h. Byly zjištěny průkazné rozdíly (P < 0,001) u interakcí mezi krmivy a metodami. Nejnižší hodnota stravitelnosti sušiny byla zjištěna u in vivo LSO (48,64 %), vyšší u in vitro LSO (62,84 %), dále vyšší u in vivo KS (63,29 %) a nejvyšší u in vitro KS (69,26 %). V porovnání pomocí korelace byla zjištěna vysoká závislost mezi in vivo a in vitro metodami (r = 0,820). KEYWORDS: dry matter digestibility, corn silage, hay, oats, horses KLÍČOVÁ SLOVA: stravitelnost sušiny, kukuřičná siláž, seno, oves, koně ÚVOD A LITERÁRNÍ PŘEHLED Kvantitativně stanovit množství přijatého krmiva a vyloučených výkalů je považováno za nejpřesnější stanovení stravitelnosti krmiv u koní (Schurg, 1981; Bergero et al., 2009). Tyto metody stanovení stravitelnosti in vivo jsou však finančně nákladné a časově zdlouhavé. Z toho důvodu se začali využívat alternativní laboratorní techniky (Schurg, 1981; Abdouli a
Ben Attia, 2006). První metodou se stala in vitro dvoustupňová metoda, navrhnutá vědci Tilley a Terrym (TT) (Tilley a Terry; 1963). Za účelem zvýšení efektivity práce a zvýšení přesnosti stanovení stravitelnosti vznikaly různé modifikace TT (Goldman et al., 1987; Stern et al., 1997) a jednou z posledních je systém Ankom Daisy II Incubator (Daisy II ) (Ankom Technology Corp., Fairport, NY). Nevýhodou této metody je získávání očkovací látky z kanylovaných zvířat, proto se vědci začali zabývat testováním výkalů jako potencionálního zdroje očkovací látky (Nsahlai a Umunna, 1996; Akhter et al., 1999). Lowman et al. (1999) dokázali, že koňské výkaly mohou být využívány jako zdroj mikrobiální očkovací látky, a že mikroflóra výkalů je životaschopná ještě po několika hodinách po kálení. Lattimer et al. (2007) uvádí, že Daisy II může být využívána pro predikování správných odhadů stravitelnosti sušiny s použitím očkovací látky získané z koňských výkalů za předpokladu, že jsou koně krmeni vysoce kvalitní krmnou dávkou. Cílem této studie je ověřit schopnost metody in vitro, vyvinuté pro přístroj Daisy II, poskytovat přesné odhady in vivo stravitelnosti sušiny, za předpokladu použití koňských výkalů jako zdroje očkovací látky. MATERIÁL A METODIKA Testovaná krmiva Ve dvou bilančních pokusech byla sledována stravitelnost sušiny dvou různých krmných dávek. V prvním pokusu byla zkoumaným krmivem kukuřičná siláž (KS). Druhá testovaná krmná dávka obsahovala luční seno s ovsem (LSO). Všechna krmiva byla vyrobena na farmě VÚŽV v.v.i., Praha Uhříněves. In vivo bilanční pokusy Bilanční pokusy byly provedeny v akreditované stáji v Netlukách v majetku VÚŽV v.v.i., Praha Uhříněves. Do pokusu bylo zařazeno pět koní (valaši a klisny) plemene Český teplokrevník o hmotnosti 500 585 kg. Věk koní byl v rozmezí 7 17 let. Koně byli po dobu pokusu ustájeni v individuálních boxech s volným přístupem k vodě (prostřednictvím automatických napáječek). Před začátkem experimentu byla koním provedena korektura kopyt, odčervení a byla zaznamenána jejich živá hmotnost na začátku a na konci pokusu. Krmná dávka LSO obsahovala 75 % sena a 25 % ovsa a byla rozdělena do tří dávek za den. Přípravné období bylo omezeno na 6 dní (2 3 dny), protože touto krmnou dávkou jsou koně běžně krmeni i mimo bilanční období. Pokusné období probíhalo 6 dní. Osmnáctidenní přípravné období bylo provedeno u krmné dávky tvořené ze 100 % KS. Navazovalo pokusné hlavní období v délce trvání 6 dnů. Živinové složení krmných dávek znázorňuje tabulka 1. Tabulka 1: Chemické složení krmiv v 100% sušině Chemické složení Kukuřičná siláž Luční seno Oves Sušina 34,59 86,39 87,77 OH 94,74 90,09 96,95 Tuk 4,24 0,85 3,92 NL 9,41 8,70 12,50 Vláknina 18,47 39,34 9,56 NDV 39,54 59,36 32,77 ADV 22,26 35,71 7,58 ADL 3,15 6,51 1,36 Popel 4,50 9,90 3,10 ph 3,60 - -
OH - organická hmota; NL - dusíkaté látky; NDV - neutrálně detergentní vláknina; ADV - acido detergentní vláknina; ADL - acido detergentní lignin. Během bilančního pokusu koně vykonávali po dobu jedné hodiny lehkou práci (krok, klus). Krmiva, zbytky a výkaly byly zváženy s přesností 0,01 kg. Výkaly byly průběžně sbírány do uzavíratelných plastových vaků a jednou denně homogenizovány a zamrazeny. Vzorky krmiva a zbytků byly usušeny po dobu 48 hodin při 50 C. Pro sušinu výkalů byla použita metoda lyofilizace (CHRIST ALPHA 2-4 LSC). Usušené vzorky byly namlety na 1 mm (CYCLOTEC 1093 Sample Mill). Následovaly chemické analýzy na sušinu a popel (AOAC, 1990). Množství příjmu sušiny a výkalů bylo využito k výpočtům stravitelnosti sušiny. In vitro stravitelnost Ke stanovení stravitelnosti in vitro byly použity vzorky krmiv z in vivo pokusů, tedy kukuřičná siláž a luční seno s ovsem setým namleté pomocí mlýnku (CYCLOTEC 1093 Sample Mill) na velikost 1 mm. Filtrační sáčky Ankom Technology (F57) byly nejprve proprány v acetonu (3 5 minut) a poté řádně vysušeny. Před navažováním bylo nutné sáčky označit popisovačem odolným proti rozpouštědlům, dále byl každý sáček zvážen a hmotnost zaznamenána. Přímo do filtračních sáčku bylo naváženo 0,25 g vzorku. Každý sáček byl zataven pomocí tepelné pulsní svářečky a umístěn do digesční nádoby přístroje Daisy II Incubator. U každého krmiva bylo provedeno 5 opakování na stanovení sušiny. Láhev obsahovala zatavené sáčky se zkoumaným krmivem, jeden prázdný sáček pro korekci výsledků, 1500 ml roztoku A a 300 ml roztoku B (Ankom Technology, 2005) (tabulka 2). Konečné ph roztoku bylo upravováno na ph metru na hodnotu 7 doplňováním roztoku B do roztoku A. Tabulka 2: Příprava roztoků A a B Pufr roztok A: g/l Pufr roztok B: g/l KH 2 PO 4 10 Na 2 CO 3 15 MgSO 4 7 H 2 O 0,5 Na 2 S 9 H 2 O 1 NaCl 0,5 CaCl 2 H 2 O 0,1 Močovina 0,5 Veškerý materiál, použitý k přípravě očkovací látky, byl udržován při teplotě 39 C včetně filtračních sáčků. Připravené pufry byly ohřívány na 39 C v digesčních nádobách. Výkaly byly odebrány od klisny, která byla zařazena do in vivo pokusů. V době odběru se krmná dávka pro tuto klisnu skládala ze sena a ovsa. Odebrané výkaly z rekta klisny byly ihned umístěny do termosky předehřáté na 39 C teplou vodou, po transportu do laboratoře (cca 5 minut) bylo 40 g vzorku umístěno do mixéru s 360 ml předehřátého pufrovacího roztoku a za stálého sycení CO 2 se látky při vysokých otáčkách smíchaly (cca 30 s). Následně došlo k přefiltrování tekutiny přes dvě vrstvy filtrační tkaniny. Roztok byl přelit do digesční nádoby, která byla před uzavřením vymyta po dobu 30 sekund CO 2. Následovala inkubace po dobu 72 hodin za konstantní teploty 39 C a za stálého míchání (otáčení). Po dokončení inkubace byly nádoby vyjmuty, tekutina odčerpána a sáčky vypláchnuty proudem studené vody, dokud nebyla voda čirá. Během proplachování bylo použito minimálního
mechanického míchání. Sáčky byly ponechány v sušárnách po dobu 6 hodin při teplotě 103 ± 2 C. STATISTICKÉ ANALÝZY Statistická analýza byla provedena pomocí GLM procedury (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Druh testovaného krmiva, opakování bilance a pokusné zvíře byly do statistického modelu vloženy jako pevné efekty. Dále bylo provedeno porovnání výsledků mezi in vitro a in vivo hodnotami stravitelnosti sledovaných krmiv, kde byly v modelu sledovány metody a jejich interakce s krmivy. Vztah mezi hodnotami stravitelnosti sušiny zjištěnými metodami in vitro a in vivo byl posouzen také pomocí korelace a jednoduché lineární regrese. VÝSLEDKY A DISKUSE Výkaly představují levný a běžně dostupný zdroj mikroorganizmů. Dřívější studie z výživy přežvýkavců potvrzují, že výkaly mohou být využity jako alternativa k bachorové tekutině (Akhter et al., 1999). Lowman et al. (1999) potvrdil ve svých studiích, že koňské výkaly jsou vhodnou očkovací látkou pro studie plynové produkce u koní. Dále ještě Lattimer et al. (2007) a Earing et al. (2010) provedli studie, které charakterizují koňské výkaly jako vhodný zdroj pro in vitro pokusy s využitím Daisy II. V in vitro pokusu bylo použito inkubační doby 72 h. Data publikovaná Lattimerem et al. (2007) indikují, že přesné stanovení in vivo stravitelnosti sušiny mohou být získány po 48 h inkubační doby, zatímco Earing et al. (2010) ze svých studií vyhodnotili, že inkubační délka 72 h poskytuje odhady, které jsou mnohem blíž k hodnotám z in vivo pokusů. Neshoda mezi studiemi je pravděpodobně výsledkem rozdílu složení hodnocených krmných dávek. Dieta s vysokým podílem vlákniny použita Lattimerem et al. (2007) obsahovala pouze 33 % NDV, zatímco vojtěška a vojtěška s ovsem ve studii Earing et al. (2010) obsahovala 51 % NDV a 44 % NDV. Z výsledků tedy vyplývá, že pro diety s vyšším podílem vlákniny je delší doba inkubace výhodnější pro přesnou predikci in vitro stravitelnosti sušiny. V této studii byla použita krmiva s obsahem NDV 39,54 % u KS a 52,63 % u LSO, proto jsme zvolili délku inkubační doby 72 h. In vivo a in vitro stravitelnost sušiny Zjištěná in vivo stravitelnost sušiny KS pro jednotlivé koně je znázorněna v grafu 1 a dále stravitelnost sušiny LSO je zřejmá z grafu 2. Statistickou analýzou byly zjištěny rozdíly ve stravitelnosti sušiny mezi krmivy, kdy průkazně vyšší (P < 0,001) byla zjištěna stravitelnost pro KS (63,29 %) oproti LSO (48,64 %) (SE = 1,09 %). stravitelnost sušiny v % 70 65 60 55 50 64,96 66,33 66,36 60,15 58,63 1 2 3 4 5 Graf 1. in vivo stravitelnost sušiny KS v % zjištěná pro jednotlivá pokusná zvířata pokusná zvířata
stravitelnost sušiny v % 70 60 50 40 30 20 10 0 47,92 49,04 49,50 51,39 45,34 Graf 2. in vivo stravitelnost sušiny LSO v % zjištěná pro jednotlivá pokusná zvířata 1 2 3 4 5 pokusná zvířata In vivo stravitelnost sušiny stanovená v této studii pro krmnou dávku LSO (48,64%) se blíží výsledku zjištěném Earingem et al. (2010), kteří zjistili u velmi podobné krmné dávky stravitelnost 55,1 % (SE = 1,62). V případě KS není prozatím dostupná další studie u koní, se kterou by bylo možné udělat srovnání. In vitro stravitelnost sušiny vyhodnocená po 72h inkubaci v Daisy II činila pro krmnou dávku LSO 62,84 %, tato hodnota je vyšší než zjištění Earing et al. (2010), kteří po stejné délce inkubace stanovili in vitro stravitelnost 52,7 % u velmi podobné krmné dávky. Hodnota in vitro stravitelnosti KS byla stanovena na 69,26 %. Stejně jako v případě in vivo metody, dosud nejsou známé studie, kde by byla zahrnuta in vitro stravitelnost kukuřičné siláže u koní. Porovnáním výsledků in vitro a in vivo stravitelnosti byla zjištěna průkazně vyšší (P < 0,001) průměrná hodnota (66,05 %) pro in vitro metodu v porovnání s metodou in vivo (55,96 %). Byly zjištěny také průkazné rozdíly ((P < 0,001) v interakci mezi krmivy a metodami, kde byla zjištěna nejnižší hodnota stravitelnosti sušiny in vivo LSO (48,64 %), vyšší u in vitro LSO (62,84 %), dále vyšší u in vivo KS (63,29 %) a nejvyšší u in vitro KS (69,26 %). Z uvedeného vyplývá větší rozdíl mezi in vivo a in vitro stravitelností sušiny LSO (14,2 %) oproti KS (5,97 %). Ovšem v porovnání pomocí korelace byla zjištěna vysoká závislost mezi in vivo a in vitro metodami (r = 0,820). Byl zjištěn vysoký koeficient determinace (R 2 = 0,672) a vypočtena rovnice umožňující výpočet in vivo stravitelnosti na základě hodnot zjištěných metodou in vitro (graf 3). Graf 3. Závislost mezi in vitro a in vivo stravitelností sušiny sledovaných krmiv 70,00 65,00 60,00 In vivo 55,00 50,00 45,00 y = 1.808x - 63.48 R 2 = 0.672 40,00 60,00 62,00 64,00 66,00 68,00 70,00 72,00 74,00 In vitro Z výsledků, které poskytují ve svých studiích Lattimer et. al. (2007) a Earing et al. (2010) vyplývá, že in vivo metoda poskytuje vždy nejvyšší hodnoty stravitelnosti oproti hodnotám
získaným z in vitro pokusů v Daisy II. V naší studii je vždy in vitro stravitelnost vyšší než in vivo. Může to být způsobeno velikostí částic testovaného krmiva, která byla v našem případě 1 mm, kdežto ve studiích dvou výše jmenovaných autorů se jednalo o velikost 2 mm. Z toho důvodu je nutné provést další srovnávací studie, které umožní tuto metodu zpřesnit. ZÁVĚR V uvedené studii byla prokázána pomocí metody in vivo vyšší stravitelnost sušiny KS v porovnání s LSO. Jako využitelné se ukázalo použití výkalů koní jako inokulantu pro in vitro metodu s použitím Daisy II Incubatoru, i když zjištěné hodnoty zcela neodpovídaly metodě in vivo. Proto je třeba více zpřesnit in vitro metodiku a vyzkoušet její nové modifikace (zejména jemnost mletí vzorků, množství použitého inokulantu a délku inkubace), jelikož ani autoři celosvětově pojednávající o tomto tématu nejsou v těchto otázkách jednotní. V budoucnu bude také třeba uskutečnit další in vivo a in vitro experimenty a díky nim vytvořit přesnější predikční rovnice, které umožní korekci výsledků in vitro vzhledem k in vivo hodnotám. DOPORUČENÍ PRO PRAXI Vzhledem k finanční i časové náročnosti in vivo pokusů je in vitro systém s použitím Daisy II Incubatoru příslibem rychlého a přesného odhadování stravitelnosti krmiv pro koně. Pro přežvýkavce je na stejné téma uděláno větší množství studií a výsledky jsou velmi stabilní. Považuji za velmi přínosné vypracování metodiky na in vitro stanovení stravitelnosti krmiv u koní a doporučuji následné zavedení metody do běžného krmivářského průmyslu. Výsledkem by měly být hodnoty poskytující údaje odpovídající skutečné stravitelnosti krmiv pro koně, nebo doplnění metodiky o korekční rovnice náležící k určitým krmivům či skupinám krmiv. Optimalizace krmných dávek, tak jako u ostatních hospodářských zvířat, je aktuální i u koní a tento systém může být dalším prvkem jejího dosažení, obzvláště v dnešní situaci, kdy koně jsou jediným hospodářským zvířetem v ČR, jehož stavy se v současné době zvyšují. SEZNAM LITERATURY Abdouli A., Ben Attia S. (2007): Evaluation of a two-stage in vitro technique for estimating digestibility of equine feeds using horse faeces as the source of microbial inoculum. Animal Feed Science and Technology, 132, 155 162. Akhter S., Owen E., Theodorou M. K., Butler E. A., Minson D. J. (1999): Bovine faeces as source of microorganisms for the in vitro digestibility assay of forages. Grass and Forage Science, 54, 219 226. Ankom Technology. (2005): In vitro true digestibility using the DAISY incubator. Accessed Sep. 13, 2010. http://www.ankom.com/ media/documents/ivdmd_0805_d200.pdf AOAC. (1990): Official Methods of Analysis, Association of Official Analytical Chemists. 15th ed. Washington, USA Bergero D., Préfontaine C., Miraglia N., Peiretti P.G. (2002): A comparison between the 2 N and 4 N HCl acid insoluble ash methods for digestibility trials in horses. Animal 3, 1728 1732. Earing J. E., Cassill S.H., Hayes S.H., Vanzant E.S., Lawrence L.M. (2010): Comparison of in vitro digestibility estimates using the DaisyII incubator with in vivo digestibility estimates in horses. Journal of Animal Science, 88, 3954-3963 Goldman A., Genizi A., Yuzari A., Seligman N. G. (1987): Improving the reliability of the two-stage in vitro assay for ruminant feed digestibility by calibration against in vivo
data from a wide range of sources. Animal Feed Science and Technology, 18, 233 245. Lattimer J. M., Cooper S. R., Freeman D. W., Lalman D. L. (2007): Effect of yeast culture on in vitro fermentation of a highconcentrate or high-fiber diet using equine fecal inoculums in a DaisyII incubator. Journal of Animal Science, 85, 2484 2491. Lowman R. S., Theodorou M. K., Hyslop J. J., Dhanoa M. S., Cuddeford D. (1999): Evaluation of an in vitro batch culture technique for estimating the in vivo digestibility and digestible energy content of equine feeds using equine faeces as the source of microbial inoculum. Animal Feed Science and Technology, 80,11 27. Nsahlai I. V., Umunna N. N. (1996): Comparison between reconstituted sheep feces and rumen fluid inoculum and between in vitro and in sacco digestibility methods as predictors of intake and in vivo digestibility. Journal of Agriculture Science Cambridge, 126, 235 248. SAS. (2008): SAS for Windows, Release 9.2. SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA. Schurg W.A. (1981): Compilation of data evaluating various techniques for determining digestion of equine rations. In: Proceedings of the 7th Equine Nutrition and Physiology Society Symposium, Warrenton, VA, USA, pp. 1 2. Stern M. D., Bach A., Calsamiglia S.(1997): Alternative techniques for measuring nutrient digestion in ruminants. Journal of Animal Science, 75, 2256 2276. Tilley J.M.A., Terry R.A., (1963): A 2-stage technique for the in vitro digestion of forage crops. Journal of British Grassland Society, 18, 104-111.