REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT. 1. Translační aparát. 1. Translační aparát translační faktory

1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) trna c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační proteiny translační faktory REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT 1. Translační aparát translační faktory 1. Translační aparát A: Iniciační faktory eif2 komplex aminoacyl t-rna eif1 + eif1a + eif3 40S ribozomální podjednotka eif6 + eif5-60s ribozomální podjednotka eif4b + eif4f = eif4a, eif4g, eif4e mrna čepička B: Elongační faktory C: Terminační faktory eef1, eef2 erf1, erf3 (pro identifikaci modulačních bílkovinných faktorů byla v 70. letech použita metoda translace in vitro) současný stav: víc jak 50 regulačních faktorů a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) trna c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační proteiny translační faktory 1

Regulace translace 2. Translace 1. Translační aparát Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci Iniciace je klíčovým procesem 2. Translace 3. Proteiny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizaceproteinů v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech 2. Translace - iniciace REGULACE TRANSLACE INICIACE TRANSLACE Nezbytná přítomnost všech složek translačního systému RNA: mrna, trna, rrna, mirna proteiny: ribosomální mrna vazebné regulační (translační faktory) enzymy aminokyseliny energetika ATP, GTP pro zahájení procesu: rrna a ribosomální bílkoviny poskládány do funkčních ribosomálních podjednotek Narušení tohoto uspořádání: stres nebo hladovění 2

2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna preiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdp Aminokyseliny Základní složení všech aminokyselin Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofobní 3

Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofilní a ostatní Iniciace translace aktivace aminokyselin Úloha aminoacyl-trna syntetázy (aars) Přesnost přepisu genetického kodu = navázání odpovídajících aminokyselin na odpovídající trna - zprostředkováno odpovídající aars Rozpoznává celou rodinu izoakceptorů Vytvoření makroergické vazby mezi trna a odpovídající aminokyselinou nabitá Aa = aminoacyladenylát, za odštěpení Ppi esterifikačně váže Aa na trna buď přes 2 nebo 3 -OH na A76 akceptorového ramene trna Aminoacyl-tRNA syntetáza Funkce a) Přenos informace b) Chemická aktivace (charging) Průběh reakce 1) Rozpoznání aminokyseliny 2) Aktivace aminokyseliny (aa + ATP <-> aa~amp + PPi) 3) Rozpoznání vhodných trna 4) Přenos aminokyseliny na trna (aa~amp + trna aa <-> aa~trna aa + AMP) Zachování makroergické vazby 4

Enzym se připojí nejprve k antikodónu rozšířenému o tři baze + pevnou vlásenkou na akceptorovém rameni katalyzuje aminoacylaci, vazbu mezi t-rna a odpovídající aminokyselinou 1. specifický enzym hydrolyzuje ATP a kovalentně váže alfa-karboxylovou skupinu aminokyseliny k 5 fosfátu 2. aminokyselina je napojena na volnou hydroxylovou skupinu terminální ribosy na 3 konci trna Glutamin- trna syntetáza s odpovídající trna Glutamin ARS je monomérní vznik správné aminoacyl-trna s přesností 10 4-10 5 = hlavní sterochemická reakce v průběhu translace = propojení genotypu s fenotypem pozice enzymu závislé na tvaru a velikosti Aa antikodón na bázi Akceptorové aktivní místo trna vpravo nahoře trna červeně Aa + enzym monoméry diméry tetraméry 5

editační schopnosti aa-trna syntetázy Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofobní isoleucin editační schopnosti aa-trna syntetázy isoleucin x valin: chybně acylovaná trna (valin) hydrolyzovaná, odplavena 1. translační aparát - trna a genetický kód Přesnost výběru aminokyselin - editační schopnosti aa-trna syntetázy Izoleucin váže se do části katalytického místa dutiny ve tvaru izoleucinu větší molekuly se nevejdou, a hydrofobní charakter vylučuje vazbu aminokyseliny s vedlejším polárním řetězcem) nelze vyloučit vazbu valinu, (řetězec kratší jen o CH 2 - můstek) s pravděpodobností 1:150 ----editace enzym má editační místo, kam se kovalentně navázaný izoleucin nedostane valin je v editačním místě s trna odštěpen editační místo: rozštěpí chybný aminoacyl adenylát = snížení chybování na 10 4-10 5 isoleucin 6

1. translační aparát - trna a genetický kód ne všechny aminoacylsyntetázy mají editační místo rozlišení mezi strukturně podobnými tyrozinem a fenylalaninem OH-skupina tyrozinu se váže na enzym vodíkovou vazbou Bílkoviny, typy aminokyselin hydrofobní Iniciace translace aktivace aminokyselin Aminoacyl- trna syntetáza: funkce enzymu shodná napříč všemi říšemi velikost od 334 aminokyselin (Trp) až po 1 112 (Phe) tvořeny homodiméry, některé heterodiméry nebo tetramery 3 aktivní místa: vazba ATP, vazba trna, (editace) Strukturované domény jejich vzájemná komunikace nejasná Rozděleny do 2 tříd podle: struktury, lokalizace vazby ATP, vazby aktivované aminokyseliny k ribose na akceptorovém rameni v pozici 2 OH nebo 3 OH Specifita rozpoznání trna enzymem: terciární struktura přímé vodíkové vazby mezi trna CCA a enzymem baze 73 (diskriminační): kys. asrágová diskriminační + 4 další báze kolem antikodónu a další guanin poblíž metylován Stabilizujzující síly těchto domén: vodíkové, iontové, van der Waalsovy vazby 7

Iniciace translace aktivace aminokyselin rozpoznání vazebných oblastí trna pro aars trna Gln trnaasp trna Ser trna na aars červená nezbytné funkční komformace = zelená 2 třídy aars: a) glutaminyl-aars b) aspartyl-aars 1.: dva motivy (HIGH= červená, KMSKS= tm. modrá), v.m. pro ATP = žlutá, pro trna sv. modrá), aktivace AMI v hluboké a značně široké kapse N-konce enzymu, (některé typy obsahují zinek). 2.: tři motivy (červená, t. modrá, zelená), aktivace AMI v hluboce zanořené kapse C-konce enzymu, proto aktivuje spíše menší a polární AMI fosfodiesterové kontakty =fialová trna identifikační elementy hlavní a pomocné antikodon akceptorové rameno Kontrola: Chybová frekvence při translaci: 10-3 10-4 (chybné rozpoznání kodónu) aars prověřuje trna i mrna Prověření vazby trna:trna synthetasy kinetické AMI:tRNA synthetasy - chemické izoleucin + valin = Typ I (2 OH) Iniciace translace aktivace aminokyselin k. glutamová fenylalanin + treonin = Typ II (3 OH) AaRS mnoho dalších domén + inzercí během evoluce = zvýšená katalická aktivita = vysoká míra spolehlivosti translace slabě konzervovaná vazba kodón-antikodón = zvýšená afinita a tím schopnost rozeznat odlišnosti mezi typy trna schopnost prověřovat vazebného partnera a chybného nepřijmout AaRS mnoho dalších domén + inzercí během evoluce = součást velkých komplexů zahrnutých do regulačních, kontrolních systémů buňky 8

Lee SW. et al 2004, Aminoacyl-tRNA synthetase complexes J Cell Sci 117 Non-canonic + non-catalytic functions AaRS vysoká funkční flexibilita multifunkční proteiny regulované odlišnými mechanizmy (lidské buňky) další domény aminoacylační doménu extenze C- i N-konce Funkce: 1. v komplexech až 9 typů AaRS z obou strukturních tříd tvoří komplexy spolu s kofaktory EPRS (k. glutamová a prolin) + p43, p38, p18 a funkcí více, i umlčení translace 2. jednotlivě extenze C- i N-terminálních oblastí (tyrozin) sekretován za apoptózy, odštěpuje přídatné části a čistí prostor 9

Non-canonic + non-catalytic functions Smirnova EV et al. 2012, Biochemistry 77 Lee SW. et al 2004, Aminoacyl-tRNA synthetase complexes J Cell Sci 117 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdp Iniciace translace aktivace 40S podjednotky Stabilita zásoby ribosomálních podjednotek zajištěna fyziologickou koncentrace solí ( K, Cl a Mg iontů) Aktivace 40S podjednotky vazbou příslušných iniciačních faktorů: 40S = eif3,eif1, eif1a eif3 složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eif2, eif4b, eif4f s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mrna and 43S eif1, 1A podílejí se na stabilizaci zásoby 40S podjednotek, na tvorbě TC, na scanování, na vyhledání AUG a na připravovaném spojení s 60S podjednotkou, eif5 spolupráce s eif1 a eif1a, při nalezení AUG a vytvoření ribosomu Inhibice předčasného spojení 40S a 60S: iniciační faktor eif6 (25 kda) na 60S 10

Další role eif3 eif3 složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eif2, eif4b, eif4f s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mrna and 43S Vysoký počet pojednotek = vysoká rozmanitost funkcí (asociační + mutační studie) vazby na eef a tím regulace elongace podíl na uspořádávání cytoskeletu (Hob3p, Cpc2p, Rack1) kvalitativní kontrola translace úloha podjednotek (d + e) Neočekávaně vysoká hladina v jadérku i jádře biogeneze ribozomů podíl na usazování 90S pre-ribozomálních struktur a dále na uspořádávání 40S a 60S (možnost napojení na 40S už v jadérku) konečná podoba prozomů v jádře znázorněno v proporčních velikostech multifunkčnost = dynamický systém translazom spojuje translaci s degradací abiogenezou ribozomů = zvýšená přesnost translace (možnost okamžité likvidace chybných nascentních proteinů) Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36 eif3 (kvasinka) kvalitativní kontrola translace Další role eif3 eif3 složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eif2, eif4b, eif4f s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mrna and 43S Vysoký počet pojednotek = vysoká rozmanitost funkcí (asociační studie) vazby na eef a tím regulace elongace podíl na uspořádávání cytoskeletu kvalitativní kontrola translace úloha eif3d a eif3e Neočekávaně vysoká hladina v jadérku biogeneze ribozomů podíl na usazování 90S pre-ribozomálních struktur a dále na uspořádávání 40S a 60S (možnost napojení na 40S už v jadérku) i jádře konečná podoba prozomů v jádře multifunkčnost = dynamický systém translazom spojuje translaci s degradací abiogenezou ribozomů = zvýšená přesnost translace (možnost okamžité likvidace chybných nascentních proteinů) Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36 11

Model eif3- v translasomu MSC = multisyntetázový komplex, eef1,2,3, iniciační faktory, eif3 Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36 Iniciace translace ternární + preiniciační komplex Aktivace 40S ribosomální podjednotky: Vazba eif3 +eif1 + eif1a Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky Vytváření ternárního komplexu, napojení iniciačního faktoru eif2 (se 6 doménami) k aktivované trna (vazebná místa na trna = červená) Ternární komplex (TC): Met-tRNA + eif2:gtp + Met-tRNA Preiniciační komplex (PIC): Ternární komplex + 40S ribosomální podjednotka aktivovaná eif3 + eif1a + eif1a 12

Iniciace translace -ternární + preiniciační komplex Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky specifita vazby zajištěna faktorem eif2 eif2 tvořen 3 podjednotkami: alfa = 36kDa beta = 38 kda gama = 52 kda eif2 nejprve váže GTP komplex eif2-gtp váže přes trna ternární komplex: eif2-gtp-met trna místem vazby GTP- trnaimet je gama podjednotka místem vazby rrna je beta podjednotky místem vazby pro cytoskelet je alfa podjednotka (zvyšuje podíl F aktinu) ternární komoplex se navazuje na 40S podjednotku, kde už jsou navázány eif3 a eif1a (vazba eif2 na ribosomální podjednotku velmi slabá vazba ternárního komplexu velmi silná závisí na dostatku ATP: nukleosid difosfát kinasa: regenerace GDP na GTP) eif3 stabilizuje vazbu ternárního komplexu na povrchu 40S podjednotky Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdp 13

Iniciace translace aktivace mrna eif4b eif4g Vazba 4 iniciačních faktorů : eif4b (70 kda) eif4e (25 kda), eif4g (174 kda), eif4a (46 kda) = komplex eif4f eif4b zvyšuje aktivity eif4g a eif4a eif4g a eif4a mají motivy pro vazbu na jednořetězcovou mrna eif4a patří mezi DEAD bílkoviny (helikázy, mají sekvenci asp-glu-ala-asp 7x opakovaná sekvence, váže ATP a má ATPázovou aktivitu Navázáním eif4b a komplexu eif4 F je čepička 5 UTR- aktivována a připravena pro navázání preiniačního komplexu eif4b - vazba na PABP - mnohočetná fosforylační místa - míra fosforylace = intenzita translace - stres = defosforylace - jednotlivé stresory - specifická místa defosforylace eif4g - adaptér aktivace čepičky - stres: navázání shsp27 = vyřazení čepičky z funkce + odstranění faktoru do stres granulí zvýšená exprese HSP70 = uvolnění faktoru obnova funkce eif4a Iniciace translace aktivace mrna eif4a 1. aktivace mrna při vazbě 43S 2. aktivita vzrůstá za přítomnosti 4B, 4F, 4H 3. odstranění regulačních proteinů na 5 UTR 4. helikázovou aktivitou uspořádává mrna proscanování 5. navázání na 43S hydrolyzuje ATP = motorem scanování 3 kopie na ribozom (výjímečně!!!) má 3 podjednotky A1: aktivita v rostoucích pletivech A2: aktivita v klidovém stavu buněk A3: funkce mimo translaci, součást konfigurace mrna v jádře A1 - A2 = 95% identita Fosforylace (stres, vývojové procesy), zvyšuje translaci Speciální role eif-4e ne zcela objasněna může být hledaným regulátorem iniciace i karcinogeneze nejnižší kvantitativní zastoupení ze šech eif složena z mnoha podjednotek regulována na třech úrovních transkripční, posttranslační fosforylací eif4e-bp (fosfoproteiny) změny ve fosforylaci (serinu) korelují s průběhem buněčného cyklu vazba fosfoproteinů (serin, treonin) - inhibice translac Karcinogeneze = porucha regulace translace, hyperaktivace, i slabě translatované mrna přepisovány s vysokou účinností eif4e: jedna z klíčových molekul při hledání cílových léků proti karcinogenezi 14

Iniciace translace vazba preiniciačního komplexu na aktivovanou mrna 2. translace- iniciace 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdp pohyb 40S podél mrna od 5-3 = scanování 1. AUG většinou použit jako iniciátor translace antikodon iniciátorové trna + (eif1 + eif1a ) rozhoduje o výběru AUG pro výběr 1. AUG je rozhodující sekvence kolem kodonu kritická u živočichů: -3 a +4 kritická u rostlin jen +4 nebyl nalezen žádný specifický protein řídící scanování (eif4a?) scanovácí aktivitace přímo úměrná počtu smyček na 5 UTR mechanismus pohybu iniciačního komplexu po mrna mechanismus volby AUG objasněny??? 15

Iniciace translace úloha iniciačních faktorů Regulace iniciace Vzniklý preiniačního komplexu (PIC) a role eif1 a eif1a: podporují scanování a umístění AUG do P místa udržují otevřenou komformaci = štěrbinu mrna - 40S zavrhnou při scanování jiný než AUG triplet tim, že blokují uvolnění Pi z částečně hydrolyzovaného eif2-gdp.pi = gate keeper Interakcí Met-tRNAi Met s AUG = komformační změny a ty uvolní C-konec eifa1 pro vazbu s eif5 a N-konec eif1a s PIC disociace eif1 z blízkosti P místa: spolupráce TC, eif1, eif5, eif 3 scanování i selekce AUG ukončena Iniciační faktor eif1a D: eif1a(žlutá) + eif5 (šedá) 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG spojení ribosomálních podjednotek Scanování ukončeno, navázání antikodonu trna na AUG startovací kodon připojení 60S blokují iniciační faktory navázané v iniciačním komplexu na 40S na uvolnění se podílí eif5 (50 kda), který odváže eif1a a eif3 eif5 hydrolysuje GTP v ternárním komplexu eif2-gtp-met-trna a tato konformační změna uvolní iniciační faktory ze 40S eif5 je in vitro schopen hydrolyzovat ATP i GTP, ale za in vivo podmínek působí jako aktivátor GTPázy další faktor eif5a (17 kda se specifickou posttranslační modifikací lysinu na N-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysin funkce eif5a: asistuje při připojení 6OS a při přemístění obou jednotek z bodu A do kapsy bodu P 16

2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG co podstatným způsobem ovlivňuje proces scanování: struktura 5 UTR smyčky charakter iniciačního kontexu, volba 1. AUG mini-orf = snížená účinnost přepisu, reiniciace = 40S nedisociuje po terminaco stop kodonem, další AUG z ORF = leaky scaning dostupnost iniciačních faktorů eif2 vážící trna se podílí se na hledání iniciačního kodonu fosforylace eif2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eif2b, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena) u rostlin existence 2 forem na čepičku vázaného komplexu eif4f: eif4f nebo iso-ei4f, to skýtá možnost výběru = regulační funkce 4F (24 kda + 220 kda v poměru 4:1) má vyšší afinitu k monometylované čepičce iso-4f (28 kda + 80 kda v poměru 1:1) má vyšší afinitu k dimetylované čepičce smyčka v 5 UTR stabilizuje vazbu 4F a iso formu destabilizuje 3.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG Výběr z více AUG iniciačních kodonů Leaky scanning 2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG co podstatným způsobem ovlivňuje proces scanování: struktura 5 UTR smyčky charakter iniciačního kontexu, volba 1. AUG mini-orf = snížená účinnost přepisu, reiniciace = 40S nedisociuje po terminaco stop kodonem, další AUG z ORF = leaky scaning dostupnost iniciačních faktorů eif2 vážící trna se podílí se na hledání iniciačního kodonu fosforylace eif2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eif2b, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena) u rostlin existence 2 forem na čepičku vázaného komplexu eif4f: eif4f nebo iso-ei4f, to skýtá možnost výběru = regulační funkce 4F (24 kda + 220 kda v poměru 4:1) má vyšší afinitu k monometylované čepičce iso-4f (28 kda + 80 kda v poměru 1:1) má vyšší afinitu k dimetylované čepičce smyčka v 5 UTR stabilizuje vazbu 4F a iso formu destabilizuje 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Recyklace eif2.gdp Vazba PABP na čepičku 17

2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG 2. translace-recyklace eif2.gdp k zahájení translace je nezbytné změnit eif2 uvolněné z iniciačního komplexu do formy vážící GTP a tím zahájit další iniciaci vazba eif2-gdp je asi 100 krát silnější než eif2-gtp k překonání této bariery - další faktor eif2b eif2b = recyklační faktor 2. Translace - recyklace eif2.gdp Další funkce eif2 je podmíněna změnou vazby eif2:gdp na eif2:gtp eif2:gdp musí navázat další faktor eif2b (guanidin nukledotid exchange faktor) fosforylace eif2b zintensivní vazbu faktorů, komplex eif2:eif2b:gdp je stabilní = dramatický pokles iniciace a brání vytvoření eif2:gtp Regulace účinnosti translace: dostatek eif2.gtp i u rostlin potvrzena role GCN2 kinázy Ladeix et al. BMC Plant Biol. 2008, 8:134 Fosforylace eif2 inaktivuje i IF4A a eif4g = signál k tvorbě stresových granulí (SG) 18

2.translace - scanování preiniačním komplexem k AUG co podstatným způsobem ovlivňuje proces scanování: struktura 5 UTR smyčky charakter iniciačního kontexu, volba 1. AUG mini-orf = snížená účinnost přepisu, reiniciace = 40S nedisociuje po terminaco stop kodonem, další AUG z ORF = leaky scaning dostupnost iniciačních faktorů eif2 vážící trna se podílí se na hledání iniciačního kodonu fosforylace eif2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eif2b, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena) u rostlin existence 2 forem na čepičku vázaného komplexu eif4f: eif4f nebo iso-ei4f, to skýtá možnost výběru = regulační funkce 4F (24 kda + 220 kda v poměru 4:1) má vyšší afinitu k monometylované čepičce iso-4f (28 kda + 80 kda v poměru 1:1) má vyšší afinitu k dimetylované čepičce smyčka v 5 UTR stabilizuje vazbu 4F a iso formu destabilizuje 2. translace- iniciace Poslední fáze iniciace: Odpoutání iniciačních faktorů z 40S podhednotky a z čepičky (podíl ATP nezbytný) Recyklace eif2-gdp na eif2-gtp Aktivace 60Sribosomální podjednotky uvolněním eif6 (podíl aktivovaného faktoru eif5-gtp nezbytný) 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Recyklace eif2.gdp Vazba PABP na čepičku znázorněno v proporčních velikostech 19

1. Translační aparát mrna a vazebné bílkoviny na 3 UTR Poly-A konec = stimuluje translaci = kooperace PABP + bílkovinných faktorů navázaných na čepičku 3 UTR cytoplamatický polyadenylační element (CPE) = místo vazby CPEB Komplex: CPEB-Maskin-eIF4E = inhibice translace Fosforylace CPEB = navázání PAB (poly (A)polymerázy = prodloužení poly(a) = vazba dalších PABP = odstranění Maskin proteinu a aktivace translace Iniciace translace vazba PABP Vazba mrna na ribosom a scanování vyžaduje PABP Poly(A) má nejméně 1 PABP vazebné místo PABP jsou fosforylovány, míra fosforylace se mění, má regulační funkci (heterogenní míra fosforylace) fosforylace určuje afinitu vazby PABP-mRNA, PABP PABP a PABP- 4G - 4E, PABP-4B kompetice mezi 4G a 4E o PABP1 a složitá konfigurace jejich společné vazby podmíněna fosforylací všech tří typů proteinů PABP ovlivňují funkční aktivitu mrna: Regulace iniciace role PABP Iniciace translace scanování kruhová struktura mrna Možnost dalších iniciací, přepis 1 molekuly mrna serií ribozomů 20

Iniciace translace vazba PABP Vazebná doména pro PABP u rostlin nalezen u 4E, zatím ne u 4G kruhové uspořádání mrna molekuly potvrzeno PABP se váže i na 4B (u rostlin druhově specifická) = zvýšení translační účinnosti pokud je 4B fosforylován (časné fáze vývoje semen) u živočichů tato vazba spojena s apoptosou ( caspasae-3 + proteása odbourávají 45 N-terminálních AMI 4B faktoru a tím zmizí místo vazby pro PABP = inhibice proteosyntesy za apoptosy) vysoká hladina fosforylace 4A se podílí na účinnosti proteosyntézy víc než fosforylace ostatních složek 4F (nízká fosaforylace za stresu) zvýšení afinity vazby PABP a helikasové aktivity zajištěno nejen vazbou s 4E, 4G, ale i s kompletním 4F translační účinnost ovlivněna i koncentrací PABP (ježovka v prvním rýhování, jen 1 PABP) dostatek PABP přednostně přepisovány čepičkované, výrazně polyadenylované mrna se strukurovanou 5 UTR Iniciace translace vazba iniciačních faktorů na PABP jakou roli hraje fosforylace PABP v iniciaci translace??? míra fosforylace iniciačních faktorů a PABP selektivně ovlivňuje jejich vzájemné interakce, ovlivňuje intensitu translace PABP 2. translace- iniciace PABP: interakce s eif4g stimulace vazbu mrna 43S PIC stimulací vazby eif4f k čepičce stimulace připojení 60S podjednotky interakce s terminačními faktory erf1, erf3 Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Recyklace eif2.gdp Vazba PABP na čepičku 21

2. Translace modifikace iniciace Regulace účinnosti translace:dostatek volného eif4e fosforylace a iniciace regulace translace = regulace iniciace = regulace aktivity iniciačních faktorů + PABP počet fosforylací koreluje s účinností translace zvýšený počet fosforylací = zvýšená účinnost translace míra poklesu translace neodpovídá ekvivaletně míře fosforylace, 80-95% pokles translace = 15-25% fosforylace F2 fosforylace 4F (4G) zvyšuje kompetivnost mrna při obsazování translačního aparátu, hlavně méně aktivních typů mrna existují výjímky: - fosforylace eif2 nebo její alfa podjednotky = ztráta aktivity ( za stresu, při virové infekci)!!!- defosforylace a tím recyklace eif2 = aktivace translace Úloha fosforylace v iniciaci translace 2. translace- iniciace Iníciace končí nalezením prvního AUG, uvolněním všech iniciačních faktorů a tím zformování ribosomu 22

2. translace- iniciace 2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna 2. translace- iniciace Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace čepička na 5 UTR = scanovací model platí vždy??? Proč nový model pro iniciaci? celá řada poznatků není v souladu se scanovací hypotézou - nebere v úvahu proměnlivost ribosomů - proměnlivost afinity mrna k iniciačním faktorů - v sekvenci mrna nalezeny oblasti odpovídající sekvencím rrna - přímá vazba mrna na rrna - 40S tyto interakce ovlivněny structurálními změnami ribosomů během ontogeneze rrna-like sekvence nalezeny v mrna v délce 7-14 nucleotidů sekvence GC-typu, komplementární v 13 místech 28S rrna = site of IRES iniciace prokaryontního typu 2. translace- iniciace, IRES 23

Prokaryonta: 2. translace- iniciace, IRES mrna bez čepičky, AUG se identifikuje iniciačním komplexem = 30S podjednotka + iniciátorová trna ( formylmethioninem fmet-trna) + 3 iniciační faktory ( IF1, IF2, IF3) iniciační kodon AUG, (GUG + UUG) iniciační komplex se váže přímo na iniciační kodon, který je umístěn za sekvencí Shine-Dalgarno (SD) SD = 7 purimových nukleotidů jež komplementují Eukaryonta- přímá vazba 40S + cis sequence mrna (cis regulační sekvence v mrna) IRES (internal ribosomal entry side) = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu) funkce: vnitřní regulační signál 2. translace- iniciace, IRES IRES další způsob iniciace v eukaryontních buňkách některé eukaryontní mrna bez čepičky, nepoužívají scanovací model jejich 5 UTR oblast obsahuje určitou sekvenci (obdoba SD) = IRES (internal ribosomal entry side = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu) tento iniciační faktor nezbytný pro IRES přepis i pro IRES systém platí nezbytnost rozvinutí 5 UTR struktury IRES = obdoba iniciace prokaryont hypotéza ribosomálního filtru ribosomal tethering and clustering Hypotéza ribosomálního filtru Iniciace: scanování x fitr??? A: 40S se váže na vazebná místa na mrna (šedé zony) B: pevná vazba mezi 40S a mrna zpomalí nebo až blokuje posun k AUG = regulace translace C: slabší vazba 40S podjednotky, flexibilita, možnost navazovat další podjednotky D: v případě C, více možností 1=pohyb k čepičce 2=reorientace na mrna scanování 3=vazba na další vazebné místo 4=pohyb k AUG pomocí ternárního komplexu jak by filtr mohl fungovat? silné interakce mezi 40S a mrna = stop translaci slabé interakce pohyb 40S: - k čepičce - nebo přímo k AUG pomocí ternárního komplexu hypotéza dovoluje jedné sekvenci působit jako umlčovatel i jako zesilovač podle stavu v buňce účinnost translace se může měnit podle vzdálenosti mezi lokalizací ribosomu a iniciačním kodonem co zůstává nepotvrzeno podíl na ribosomy navázaných proteinů na iniciaci translace dopad konfiguračních změn ribosomů na základě proměnlivosti zastoupení jednotlivých r-proteinů 24

Ribosomální filtr Významná role ve virové patogenezi lidských buněk (roztroušená sklerosa) IRES elementy u napadených buněk mohou umožnit aktivaci několika kodonů a to jak pro polyprotein, tak pro L proteiny (virové typy) Zelená = IRES Bledě modrá = 40S eif2 = červená eif3 = tmavo modrá trna = černá ITAF = bílkovina modulující IRES ve prospěch využívání všech AUG pro různé typy bílkovin Iniciace: scanování x IRES??? co mluví ve prospěch IRES interakce = párování basí mezi komplementárními segmenty mrna a rrna a vazbou mezi mrna a ribosomálními proteiny interakce na základě kompeticí různých mrna segmentů o vazbu na rrna filter může také modulovat změny nebo maskovat určitá vazebná místa na ribosomech tyto interakce ovlivněny strukturální proměnlivostí ribosomů a mohou být využívány systémem IRES buňka může využívat obou systému iniciace a upřednostňovat jednu z nich podle situace v buňce, nebo v celém organismu Iniciace: hypotéza ribosomálního filtru nová hypotéza vysvětluje existenci trvale na polysomy navázaných mrna podporou hypotézy je prokázaná heterogenitou ribosomů a složení 5 UTR mrna vysvětlí zesílení i umlčení přepisu podporou je i důkaz IRES sekvence u řady mrna lokalizovaných v buňce excentricky (vedou k morfogenesi) pokud by hypotéza byla prokázána mělo by smysl vnášet ribosomy do nepříbuzných organismů nebo z jednoho vývojového stádia do druhého ribosomy = nový nástroj regulace translace 2. translace- initiace altivní role ribosomů ribosom = regulační struktura = selection + preferenční syntheza specifikých mrna interakce mrna rrna = kompetitivní charakter filter může: modulovat změny, maskovat vazebná místa ribosomu změny vazebných míst: -hererogenita složení ribosomů - interakce s bílkovinami vázanými na ribosomy - interakce s microrna (21-24 nukleotidů) - fosforylace ribosomálních bílkovin 25

Iniciace: scanování x IRES??? heterogenita ribosomů podmíněna geneticky: heterogenita r-proteinů: kvalitativními změnami v 6 proteinech kvantitativnimi změnami ve 29 proteinech metylací ve 14 a fosforylací u 2 proteinů heterogenita rrna: rrna kodovany mnohočetnými rodinami substituce a delece mezi jednotlivými rrna geny časté Děkuji za pozornost v lidských buńkách nalezeno 35 variant 28S rrna variabilita častá i u 5S rrna: u ježovky oocyty - se 6 rozdílnými nukleotidy somatické buňky - se 120 royzdílnými nukleotidy Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 26