REGULACE TRANSLACE DEGRADACE BÍLKOVIN. 4. Degradace bílkovin. 4. Degradace bílkovin. 4. Degradace bílkovin

Transkript

1 4. Degradace bílkovin Degradace - několik proteolytických cest, specifických pro určitý buněčný kompartment REGULACE TRANSLACE DEGRADACE BÍLKOVIN 4. Degradace bílkovin 4. Degradace bílkovin Degradace bílkovin probíhá v buňce neustále = celullar housekeeping Degradace: 1. odstraňuje abnormální, chybné bílkoviny (mutace, chyba v translaci, uspořádávání bílkoviny) 2. podporuje akumulaci podjednotek u oligomérních bílkovin pro zachování správné stochiometrie 3. udržuje správný kvantitativní poměr mezi enzymem a substrátem 4. hraje klíčovou roli v mnoha biologických procesech likviduje spouštecí, signální bílkovinu v kaskádě dějů 5. zásobuje buňku aminokyselinami z recyklací Proteolytické systémy jednotlivých buněčných kompartmentů nesou stopy svého fylogenetického vývoje Mitochondrie + chloroplasty = prokaryontní buňka Vakuola (může tvořit až 90% obsahu buňky) je obdobou lysosomu Protein body v semenech specializovaná vakuola, reservoár zásobních bílkovin pro první fáze klíčení semen Nejlépe prostudován degradační systém v cytosolu 1

2 4. Degradace bílkovin 4. Degradace bílkovin stabilita bílkovin dána jejich N-terminální sekvencí (Met, Thr, Ser, Gly, Val) nebo postranslační modifikací typu acetylace nestabilita bílkovin také určována sekvencí aminokyselin ( Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Leu, Glu) 4. Degradace bílkovin 4. Degradace bílkovin = ubiquitinace kovalentně navázaný ubiquitin (76 AMI) označuje protein pro následnou degradaci Přidání argininu značka pro degradaci komplex enzymů: E1 = ubiquitin-aktivační E2 = ubiquitin konjugační E3 = ubiquitin ligační 1. protein s degradačním signálem rozpoznán E3 2. dvěma kroky navázán ubiquitin na protein 3. pro degradaci je nutné o navázat 4 ubiquitiny 4. translokace proteinu na místo degradace 5. ubiquitiny uvolněny 6. protein degradován 2

3 Regulace translace 4. Degradace bílkovin Ubiquitinace 1. Translační aparát 2. Translace 3. Posttranslační modifikace bílkovin 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích REGULACE TRANSLACE TRANSLACE V CHLOROPLASTECH A MITOCHONDRIÍCH 3

4 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích Endosymbiotické organely Vlastní DNA, mrna, rrna, trna, ale informační obsah nestačí pokrýt potřeby organel, 80-90% bílkovin kódováno jaderně Iniciace translace prokaryontního typu, bez úpravy 5 UTR mrna SD sekvence Růst a dělení organel v interfázi, není synchronní s dělením buněk, závisí na inkorporaci buněčných bílkovin a lipidů chloroplasty Chloroplastový genom sekvenován pb, v závislosti na druhu pb = translační aparát pb = bílkoviny fotosyntetického aparátu Součinnost jaderných a chloroplastových genů (Rubisco) 4

5 chloroplasty chloroplasty Rubisko: malá podjednotka je kódována jadernou DNA velká podjednotka je kódována chloroplastovou DNA Rubisko téměř 50% celkových rozpustných bílkovin v listech Obsah chloroplastú z víc jak 40% vyplněn ribosomy chloroplasty chloroplasty Grana = PSII Stroma = PSI, ATPsyntáza Cytochrom b 6 f = v obou typech mambrán 5

6 chloroplasty chloroplasty translační regulace exprese bilkoviny D1 chloroplasty chloroplasty D1 bílkovina z komplexu RCII její exprese je translačně regulována D1 je kódována chl-genem Transkript stále v nadbytku přítomen Přepis transkriptu regulován vazebnou bílkovinou Vazebná bílkovina kódována jaderně, exprese regulována světlem prvnídetailnípopis translační regulace genové exprese v rostlinné buňce a regulace je příkladem součinnosti jaderných a chloroplastových genů 6

7 chloroplasty translační regulace exprese bilkoviny D1 chloroplasty translační regulace exprese bilkoviny D1 D1 bílkovina poločas rozpadu 30 minut Optimální podmínky: po 30 minutách D1 vytěsněna a lokalizována nová molekula D1 Vysoká ozářenost = potřeba snížení počtu RCII komplexů: 1. Degradace 2. Blokace funkce = poškozená D1 není vytěsněna, ale je fosforylována a v této podobě nemůže opustit RCII komplex Změna podmínek = D1 defosforylována, vytěsněna, vstup nové D1 molekuly, = aktivace RCII komplexu Signálem pro translační regulaci D1 bílkoviny je ozářenost a ta reguluje: Expresi D1mRNA kódována chloroplastovou DNA Expresi D1mRNA-vazebné bílkoviny (kódována jaderně) Expresi kináz a fosfatáz modujících aktivitu D1 (kódovány jaderně) chloroplasty translační regulace exprese bilkoviny D1 chloroplasty, LHCII LHCII = světlosběrný komplex = anténa pro PSII Jeho funkce regulována fosfyrylací Fosforylace: negativní náboj molekuly LHCII odpoutání se molekuly od hydrofobního povrchu granalních membrán pokles světelné absorbce do PSII 7

8 mitochondrie chloroplasty, organizace cytochromového komplexu PetG, cytf, PetL a PetM = jednovláknová šroubovice v membráně Cyt b6, Podjednotka IV = několik transmembránových šroubovic mitochondrie mitochondrie = základní organela respirace u eukaryontních buněk biogeneze mitochondrií stále nejasná mitochondrie vykazují heterogenitu morfologickou i funkční (aktivita ADH oxidázy) proměnlivé je složení lipidů a bílkovin heterogenita i ve spektrech bílkovin počet mitochondrií per buňka velmi variabilní, ale koncentrace mitochonrií per objem buňky mnohem stabilnější hodnotou počet mitochondrií v rostlinné buňce je menší než v buňce živočišné respirační rychlost rostlinné buňky je vyšší V rostlinných mitochondriích: existují plazmidy a to integrované i volné, jedno i dvouvláknové RNA volně se replikující 8

9 Mitochondrie mitochondrie Mitochondriální DNA (mtdna) je maternálně (cytoplasmaticky) dědičná Objem DNA druhově charakteristický: lidské pb kvasinkové pb rostlinné pb U rostlin více typů mtdna Přenos mt-genů z mitochondrií do jádra (reverzní transkripce viz psedogeny) Dlouhé nekódující oblasti trna u pšenice jaderně kódován Mutace mt-genů = heteroplasma problém v buňkách či tkáních s vysokým nárokem na dostupnost ATP: tapetum u rostlin, cytoplasamatická samčí sterilita řada závažných chorob, ischemická choroba srdeční Alternativní oxidáza jedinečný komplex u rostlin rostlinné mitochondrie translace velmi variabilní délky transkriptů, sestřih, editace ojedinělý jev: translace i aberantních transkriptů a díky špatné nebo žádné editaci: nefunkční ribosomální bílkoviny selekce až na úrovni bílkovin otvírání nových čtecích rámců ( nedostatečný sestřih? nedostatečná proteázová aktivita?) fosforylace mitochondriálních bílkovin: u savců běžná, má regulační charakter u rostlin mt kináza nenalezena, nepřímým důkazem autofosforylace HSP70 Úloha mitochondrií za stresu: exprese shsp aktivace glutation-askorbátového cyklu = Úloha mitochondrií v apoptose, mitochondrie = sensor stresu mitochondrie mirochondrie: oxidace organických látek = oxidativní fosforylace ATP Přesná organizace přenosu elektronů v rotlinné mitochondrii komplexy I IV Ubiquinon (UQ), redukovaný ubiquinol (UQH 2 ) volně difundují ve vnitřní membráně Přenos elektronů od dehydrogenázy buď na komplex III nebo na alternatrivní oxidázu červená = cesta elektronů modrá = translokace protonů Pohyb protonů přes membrány vytváří protonový elektrochemický gradient ten rozjíždí syntézu ATP z ADP + P pomocí 1TP syntázy 9

10 Mitochondrie, funkce alternativní oxidázy Mitochondrie u rostlin U zralého květu se v apendixu aktivuje alternativní oxidáza, Volná energie je uvolněna v podobě tepla, teplota se zvýší z 10 na 25 o C, zvýší se uvolňování vonných látek Regulace genové exprese? nebyla nalezen systém regulující exprese mt genů kódujících základní bílkoviny mt komplexů (přesný systém pro COX 1-3 popsána u živočichů) díky plastidům nezávislé na zdrojích kyslíku a uhlíkatých látek Známé indukční podmínky: alternativní oxidáza = stres citrát syntáza = květní meristémy Rf2 (jaderně kódovaný gen) = ovlivnění funkce během zrání pylu mitochondrie rostlinné mitochondrie mirochondrie: oxidace organických látek = oxidativní fosforylace ATP Vztah mezi mitochodriemi a plastidy nevyřešen Přesná organizace přenosu elektronů v rotlinné mitochondrii komplexy I IV Ubiquinon (UQ), redukovaný ubiquinol (UQH 2 ) volně difundují ve vnitřní membráně Přenos elektronů od dehydrogenázy buď na komplex III nebo na alternatrivní oxidázu červená = cesta elektronů modrá = translokace protonů Pohyb protonů přes membrány vytváří protonový elektrochemický gradient ten rozjíždí syntézu ATP z ADP + P pomocí 1TP syntázy změna zaváděcí sekvence bílkovin patřící do jedné organely naruší translokaci u obou fotosyntéza je závislá na oxidativní fosforylaci mitochondrií - zastavení ATP syntázy a tím i oxidativní fosforylace výrazně snižovalo uvolňování kyslíku fotosyntézou 10

11 Metody studia bílkovin Příprava vzorku- neiontové detergenty Přehled nejčastěji používaných technik Metody studia bílkovin Úloha detergentu při separaci sekrečních proteinů Na intaktních tkáních, sledování exprese jednotlivých bílkovin : GFP, imunodetekce Po homogenizaci buněk: Oddělení bílkovin jednotlivých buněčných kompartmentů Využití celé řady metod pro vydělení určité bílkoviny a pro její charakterizaci Homogenizace ( způsob rozbití buněk, délka homogenizace, volba pufru ) = klíčový bod úspěšné a reprodukovatelné analýzy 11

12 Subcelulární frakcionace Částečné peptidové mapy Dělení bílkovin -SDS PAGE Identifikace bílkovin Nativní PAGE a následné dělení vysokomolekulárních komplexů 12

13 Dělení bílkovin 2D SDS PAGE Využití radioizotopů autoradiografie, fluorografie Identifikace bílkovin - Western blot Identifikace bílkovin indukovaných stresem puls experiment + 2D SDS PAGE fluorografie 13

14 Zjištění lokalizace a stability bílkovin pokus pulse-chase Identifikace bílkovin transkripce-translace, glykosylace a deglykosylace in vitro 14

15 Děkuji za pozornost Doufám že jste si vytvořili představu o syntéze a významu bílkovin a že vám to pomůže nahlížet na vaše výsledky z dalšího horizontu poznání rostlinné buňky 15