BIOLUMINISCENČNÍ TEST PRO RYCHLÉ VYHODNOCOVÁNÍ TOXICITY ODPADNÍCH VOD Summary. A bacterial bioluminescence test of aquatic toxicity (the Microtox test) and its use for monitoring environmental contamination is described. The potential of the method as an express bioanalytical technique is discussed. Examples of assays of substances barely soluble in water but exhibiting considerable acute toxicity under certain conditions, such as aromatic and halogenated hydrocarbons, PCB, and commonly used pesticides, are given. The test is recommended as a method of choice for routine determination of waste water toxicity since it yields results showing good correlation with data from ordinary bioassays but within up to 100-fold shorter assay times. ÚVOD Biotesty Současný stav přístrojové techniky umožňuje s vysokou přesností stanovit ve vzorcích z životního prostředí velmi malá množství znečisťujících látek. Metody chemické i fyzikální analýzy, byť sebecitlivější, však nemohou zodpovědět všechny toxikologické otázky z těchto důvodů: 1. Četné chemické a biologické reakce probíhající např. v odpadních vodách nejsou dosud dostatečně známé. Detailně je prozkoumána jen malá část látek figurujících jako polutanty v životním prostředí a ne všechny jsou měřitelné chemickou či fyzikální analýzou. 2. Jen na základě znalosti složení a koncentrace jednotlivých sloučenin není možno spolehlivě předpovědět jejich toxický vliv na různé formy života. 3. U směsí toxikantů nebývá vždy výsledný účinek prostým součtem toxických účinků jednotlivých složek; nelze předem určit, jestli toxikanty ve směsi nebudou vykazovat synergický nebo naopak antagonistický efekt. Tyto mezery je obvykle možno překlenout použitím biotestů. Biotest (bioesej, angl. bioassay) je biologická analytická metoda využívající určitého počtu jedinců vhodného druhu indikátorových organismů, které se vystaví působení testovaného vzorku (např. odpadní vody), a po vhodné době expozice se posuzuje některý životní projev těchto organismů. Moderní biotesty jsou obvykle koncipovány tak, že se indikátorové organismy sledují v několika různých koncentracích testovaného materiálu, přičemž kontrolní organismy se za stejných podmínek exponují netoxickému referenčnímu prostředí a eventuální inhibiční efekt se od toxického efektu testovaného vzorku odečítá. Z naměřených hodnot se zkonstruuje dávková křivka vyjadřující závislost sledovaného životního projevu na koncentraci vzorku, v níž lze interpolací zjistit tzv. efektivní koncentraci pro určitou procentuální hladinu snížení tohoto životního projevu. Obvykle se toxický účinek vyjadřuje pomocí EC50, což je taková koncentrace, která vyvolává právě 50% snížení měřené životní funkce. Tato hodnota je za daných podmínek konstantní a je mírou jedovatosti dané látky. Čím je efektivní koncentrace nižší, tím je vyšší toxicita testované látky k použitým indikátorovým organismům. Biotesty se většinou používají k detekci látek nebo směsí látek o koncentracích řádově mg/l (ppm), které vyvolávají měřitelné poškození zdravotního stavu testovacích organismů. Od biotestů nelze očekávat extrémně vysokou analytickou citlivost ani specificitu; jsou určeny spíše ke zjišťování globálního potenciálního nebezpečí pro životní prostředí a k posuzování vzorků z biologického hlediska, zatímco přesná, specifická a vysoce citlivá detekce toxikantů zůstává doménou analytické chemie. V německé státní normě DIN 38412 jsou popsány 4 biotesty doporučené pro testování toxicity odpadních vod. Biotesty jsou navrženy tak, aby indikátorovými organismy byly typické druhy zastupující nejvýznamnější složky ekosystémů povrchových vod: ryba (Leuciscus idus), drobný korýš (Daphnia magna), zelená řasa (Scenedesmus subspicatus) a světélkující baktérie (Vibrio fischeri nebo Photobacterium phosphoreum). Posledně zmiňovaný biotest, známý též jako Microtox test (1), je běžně používán i v naší laboratoři a jeho praktickému použití pro měření toxicity odpadů je věnován tento příspěvek. Nevýhody dosavadních biotestů Metody stanovení toxicity vod, které se u nás v současné době rutinně používají (zejména biotesty na rybách, perloočkách a semenech hořčice bílé), mají četné nevýhody. Vzhledem k omezenému počtu jedinců použitých v testu jsou statisticky málo spolehlivé, jejich vyhodnocení je značně subjektivní, testovací organismy je třeba
množit a udržovat v definovaném fyziologickém stavu, takže k provádění testů je nutný speciálně školený personál. Rybí test je v mnoha zemích silně kritizován ochránci zvířat, kteří mají námitky proti etické stránce této metody. Hlavním nedostatkem současných biotestů je však dlouhý čas nutný k zjištění výsledků (24 96 h). Při ekologických haváriích se proto může kontaminace během doby testování toxicity rozšířit na rozsáhlé území a dojde k velkým ekologickým i ekonomickým škodám. Minimalizace času nutného k určení toxicity různých materiálů je žádoucí ve všech případech; například zbytečně dlouhé skladování velkého množství podezřelého odpadu do té doby než je známa jeho případná toxicita rovněž přináší problémy a finanční ztráty. Biotesty založené na mortalitě mají nutně diskrétní charakter, tzn. že poskytují jen odpověď typu ano/ne, která neumožňuje jemněji kvantifikovat slabší toxický účinek a už vůbec ne eventuální stimulaci. Další nevýhodou všech dosavadních toxikologických biotestů je, že využívají eukaryotické organismy, takže xenobiotika a kontaminanty preferenčně působící na prokaryota, která tvoří základ trofické pyramidy vodních ekosystémů, mohou uniknout pozornosti. Bakteriální bioluminiscenční test toxicity Uvedené nedostatky nemá alternativní biotest, bakteriální bioluminiscenční test toxicity (BBTT), který se ve vyspělých průmyslových zemích, především v Německu, Kanadě a Francii, s úspěchem používá pro stanovení akutní toxicity různých látek. Princip BBTT. Procedura je založena na schopnosti mořských světélkujících baktérií reagovat změnou bioluminiscence na přítomnost xenobiotik v jejich okolí. Luminiscenční baktérie, které výrobce dodává v dehydratovaném stavu zaručujícím dostatečnou reziduální bioluminiscenci, se až do stanovení toxicity uchovávají v chladu a rehydratují se teprve těsně před použitím. Po resuscitaci se se suspenzí pracuje jako s obyčejnou chemikálií, žádná speciální biologická erudice není nutná. V luminometru (luminiscenčním fotometru) se nejprve změří výchozí bioluminiscence bakteriální suspenze v nepřítomnosti cizorodých látek, pak se přidá testovaná látka v několika koncentracích (normálně se přidává 0,5 ml roztoku s toxikantem k 0,5 ml bakteriální kultury), směsi se určitou dobu (5 30 min) inkubují a nakonec se změří výsledná hodnota bioluminiscence. Čím je testovaná látka toxičtější resp. čím vyšší je koncentrace toxikantů ve vzorku, tím je pokles bioluminiscence výraznější. Jako referenční roztok (blank) se používá netoxický solvent (2% NaCl), v němž je testovaná látka rozpuštěna. Koncentraci chloridu sodného je třeba dodržet, luminiscenční baktérie jako mořské mikroorganismy by při nižší osmolaritě zlyzovaly. Protože bioluminiscence jako enzymový proces závisí na teplotě, provádí se inkubace s toxikantem i měření v temperovaném prostředí, obvykle při 15 C. Z naměřených hodnot bioluminiscence v přítomnosti a nepřítomnosti toxikantu se sestrojí dávková křivka, z níž se vypočítá nebo graficky odečte efektivní koncentrace toxikantu, tj. taková koncentrace, která vyvolává zvolený pokles bioluminiscence (např. EC50 pro 50% inhibici produkce světla). Vybavení pro BBTT. Základním přístrojem pro provádění BBTT je temperovaný analytický luminometr, tj. fotometr vybavený citlivým fotonásobičem pro registraci světla emitovaného luminiscenčními baktériemi. U nás jsou tč. na trhu dva systémy pro měření bioluminiscence, a to poloautomatický LUMIStox německé firmy Dr. B. Lange GmbH a jednoduchý tuzemský luminometr LUMINO M90a distribuovaný pražskou firmou Spinex. Oba výrobci rovněž zajišťují dodávky indikátorových baktérií. Na Západě se většinou používají luminometry Microtox a baktérie americké firmy Microbics Corp. (původně odnož Beckman Instruments Inc.), která tuto metodu vynalezla. Praktické provedení BBTT. Postup závisí na tom, zda je cílem měření zjistit efektivní koncentraci pro určitou hladinu inhibice bioluminiscence nebo jen relativní inhibici vztaženou buď k netoxickému rozpouštědlu (2% NaCl) nebo standardnímu toxikantu (např. síranu zinečnatému). V prvním případě se postupuje zhruba tak, jak je uvedeno v odstavci týkajícím se principu metody. Naměřené hodnoty produkovaného světla se nejprve transformují pomocí tzv. funkce gama, jež je definována jako poměr světla ztraceného v důsledku působení toxikantu a světla zbývajícího. Logaritmus funkce gama se potom vynese v závislosti na logaritmu koncentrace do grafu, z něhož se grafickou interpolací nebo výpočtem zjistí efektivní koncentrace. Toto uspořádání má obvykle smysl jen pro látky, jejichž chemické složení je známé. U vzorků z reálného životního prostředí se spíše uplatní jednodušší (screeningová) verze BBTT, při níž se proměřuje jen jedna koncentrace testované látky a toxicita se vyjadřuje relativně k účinku referenčního roztoku. V extrémním případě lze bioluminiscenci měřit jen jednou, až po proběhnutí inkubace s toxikanty. Tato varianta je tedy mimořádně výhodná pro screening početných vzorků z terénu. Je-li I B výsledná intenzita světla naměřená ve zkumavce, kam byl přidán referenční roztok (blank), a I intenzita světla ve zkumavce s toxikantem, je relativní inhibice tohoto toxikantu vzhledem k blanku rovna H = (1 I / I B ) 100%. Hodnota H může být i záporná, jestliže došlo místo inhibice ke stimulaci. V normálním provedení biotestu by I > I B vedlo k neřešitelné situaci
(logaritmus záporného čísla neexistuje). V tomto smyslu tedy má screeningová verze BBTT širší použitelnost než úplná verze poskytující hodnoty efektivních koncentrací. MATERIÁL A METODY Měření bioluminiscence Bioluminiscence chemicky čistých látek byla měřena v luminometru LUMIStox (Dr. B. Lange GmbH, SRN), ostatní měření byla prováděna pomocí tuzemského přístroje LUMINO M90a. V prvním případě jsme použili firemní indikátorové baktérie Vibrio fischeri NRRL-B-11177 a BBTT prováděli podle normy DIN 38412 (tj. doba kontaktu s toxikantem byla 30 min a ředicí řada 1:1). Ke sběru dat sloužil osobní počítač vybavený programem LUMISsoft (Dr. Lange). V druhém případě jsme pracovali s lyofilizovanými baktériemi Photobacterium phosphoreum LX-1, kontaktní doba byla 15 min a ředicí řada byla volena podle potřeby. Látky s omezenou rozpustností ve vodě byly rozpouštěny ve 2% NaCl obsahujícím 2% (v/v) 2-propanolu, takže jeho konečná koncentrace ve směsi s baktériemi byla 1%. Naměřené hodnoty jsme zpracovávali buď pomocí programu Quattro Pro nebo programem MTOX napsaným v jazyce Turbo-Pascal (Borland). Xenobiotika Pokud není uvedeno jinak, chemicky čisté látky pocházely od firmy Riedel de-haën (Seelze, SRN); o-kresol byl od Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) a 2,4,6-trichlorfenol od firmy Merck-Schuchardt (Hohenbrunn, SRN). Anonymní výluhy z pevných odpadů a vzorky povrchových vod nám poskytla firma EKOS z Hradce Králové. DELOR 104 (směs polychlorovaných bifenylů) byl výrobkem někdejšího n.p. Chemko Strážske. CBM 8 (směs 20% 2-(1-methylethoxy)fenolmethylkarbamátu, chlorbenzenu a dimethylformamidu) byl od firmy TAD Pharmazeutisches Werk GmbH (Cuxhaven, SRN). Dimethoate (aktivní látka: O,O-dimethyl-S(N-methylkarbamoylmethyl)-dithiofosfát, 380 g/l), Elocron (aktivní látka: 2-(1,3 dioxolan-2-yl)-fenyl-n-methylkarbamát, 50%), Nematin (methyldithiokarbamát sodný, 29,5%) a Reglone (bromid 1,1'-ethylen-2,2'-dipyridylia, 200 mg/l) byly získány z Výzkumného ústavu bramborářského v Havlíčkově Brodě. Salmocid 240 byl od firmy Salmocid GmbH (Selfkant, SRN). VÝSLEDKY Typický graf BBTT anorganického toxikantu s divaletním kationtem těžkého kovu (pořízený pomocí kalkulačního listu v Quattro Pro) je na obr. 1. Roztok CdCl 2 ve 2% NaCl byl proměřován ve 3 časech (5, 15 a 30 min inkubace s indikátorovými baktériemi). Pro látky tohoto typu je charakteristické, že s prodlužující se dobou expozice výrazně roste toxický efekt, což se v grafu projevuje posunem dávkové křivky nahoru..obr. 1. BBTT chloridu kademnatého
Výsledky měření toxicity chemicky definovaných xenobiotik jsou shrnuty v tab. 1. Protože indikátorové baktérie velmi dobře tolerovaly 2-propanol v koncentracích, které byly nutné pro udržení málo rozpustných aromatických xenobiotik v roztoku, byl tento alkohol zvolen jako přídavek do vodných roztoků ke stanovení toxicity dotyčných organických látek. Hodnoty efektivních koncentrací pro 50% inhibici bioluminiscence byly podle metody QSAR (quantitative structure activity relationships, ref. 2) přepočteny na L/mmol a logaritmovány, čímž byla získána toxicita T r. Tabulka 1. Toxicita vybraných xenobiotik podle výsledků BBTT a xenobiotikum M r EC20 EC50 T r [mg/l] [mg/l] [mm] 2-propanol 60,09 11320,00 17960,00 298,885 2,476 dusičnan olovnatý 333,11 0,86 1,51 0,005 2,344 dusitan sodný 69,00 279,03 790,03 11,450 1,059 chlorid kademnatý 183,32 1,58 7,55 0,041 1,385 chlorid nikelnatý 129,62 155,33 481,41 3,714 0,570 chlorid rtuťnatý 271,50 0,28 0,31 0,001 2,942 toluén 92,14 2,02 19,70 0,214 0,670 hydrochinon 110,11 0,12 0,20 0,002 2,741 o-kresol 108,14 6,43 24,10 0,223 0,652 m-kresol 108,14 2,64 10,88 0,101 0,997 p-kresol 108,14 0,25 1,34 0,012 1,907 2,4,6-trichlorfenol 197,45 0,73 2,11 0,011 1,971 pentachlorfenol 266,34 0,68 1,78 0,007 2,175 a Měření v systému LUMIStox podle DIN 38412 M r : relativní molekulová hmotnost; EC20, EC50: efektivní koncentrace pro 20% resp. 50% inhibici bioluminiscence při 15 C a kontaktní době 30 min; T r : toxicita (ref. 2) Vodné výluhy z průmyslových odpadů byly připraveny standardním způsobem a BBTT byl proveden pomocí luminometru LUMINO M90a. Před měřením jsme neupravovali ph roztoků, aby se tak dal vyjádřit příspěvek ph k celkové toxicitě. Výsledky BBTT chemicky nedefinovaných vzorků z praxe jsou shrnuty v tab. 2. Protože u látek tohoto typu nelze vyjádřit hodnotu T r (srv. tab. 1), a přitom EC50 u četných vzorků chybí, byla jako ukazatel toxicity zahrnuta veličina RH (%) pracovně označovaná stupeň inhibice, která je rovna poměru hodnoty H dosažené s maximální použitou koncentrací daného xenobiotika k obdobné hodnotě H st odpovídající inkubaci se standardním toxikantem (ZnSO 4, 50 mg/l). Z tabulky je zřejmé, že z testovaných odpadů byl nejtoxičtější elektrárenský popílek. V tomto ojedinělém případě bylo nutno původní vodný výluh pro BBTT 100 předředit. Některé materiály jako např. výkopové zeminy neumožňovaly výpočet efektivní koncentrace, protože inhibice byla naopak příliš nízká (často docházelo ke stimulaci bioluminiscence) nebo dávková křivka měla jinak anomální charakter. Látky uvedené v této tabulce byly testovány rovněž biotesty zahrnutými u nás do norem (V. Dvořák, nepublikováno). Tyto studie prokázaly, že mezi výsledky BBTT a standardních biotestů je vynikající korelace. Citlivost BBTT byla srovnatelná s citlivostí testu na Poecilia reticulata (popř. o něco lepší) a poněkud nižší než je citlivost Daphnia magna. I když ani BBTT nebylo možno aplikovat na všechny typy výluhů, měla tato metoda o poznání méně bílých míst než klasické biotesty. Poslední série xenobiotik zahrnovala PCB a pesticidy běžně používané v zemědělství (tab. 3). Látky málo rozpustné ve vodě byly podobně jako organické toxikanty z tab. 1 měřeny v přítomnosti 1% 2-propanolu. Tabulka ukazuje, že jak DELOR 104, tak většina studovaných pesticidů jsou dost toxické vůči Photobacterium phosphoreum, takže BBTT je možno použít např. k detekci kontaminace půdy, vody a zemědělských produktů těmito látkami.
Tabulka 2. Toxicita vodných výluhů průmyslových odpadů a vzorků z životního prostředí materiál ph EC50(15,15) RH (%) (% max.konc.) standard ZnSO 4, 50 mg/l 6,95 17,6 100 výkopová zemina 7,61 a 5 popílek 13,45 0,3 120 b kal 7,68 a 52 odpadní voda 11,50 23,0 113 povrchová voda 7,78 a 82 chemický odpad 9,10 24,4 92 barvivo 6,42 36,8 c 30 a Anomální dávková křivka, hodnota EC50 neexistuje b Pro 100 zředěný výluh c Hodnota EC20(15,15), 50% inhibice nebylo dosaženo Tabulka 3. Toxicita PCB a některých pesticidů Označení použití EC20(15,15) a EC50(15,15) a (mg/l) (mg/l) DELOR 104 různé aplikace 0,2 1,9 CBM 8 insekticid 17,1 65,7 Dimethoate insekticid 18,1 50,3 Elocron insekticid 86,5 164,3 Salmocid dezinficiens 0,056 0,15 Nematin víceúčel. pesticid < 2 10-4 0,0053 Reglone desikant 1464,0 b a Vztaženo k navážce distribuční formy preparátu b 50% inhibice nebylo dosaženo DISKUSE Výsledky uvedené v tomto sdělení ukazují, že BBTT lze uspokojivě využít ke stanovení akutní toxicity řady anorganických i organických xenobiotik, a to jak chemicky definovaných čistých látek, tak komplexních směsí z prostředí a průmyslových odpadů. Jako velmi výhodná se ukázala možnost měření toxicity v ternárních soustavách xenobiotikum/voda/2-propanol, v nichž lze analyzovat i látky prakticky nerozpustné v čisté vodě. Pro dokonalé rozpuštění všech studovaných toxikantů stačila výsledná koncentrace 2-propanolu 1% (v/v), ale v případě ještě méně rozpustných látek by bylo možno množství 2-propanolu dále zvýšit. Tato možnost je u dosud známých biotestů unikátní a velmi cenná, protože jak ukazují výsledky uvedené v tab. 1, i chemikálie s minimální rozpustností ve vodě (pentachlorfenol) vykazují v přítomnosti relativně velmi nízkých koncentrací alkoholu vysokou toxicitu. Podobné podmínky je nutno předpokládat i v povrchových vodách, jež mohou být současně kontaminovány málo rozpustnými organickými toxikanty a alkoholy či jinými rozpouštědly, které jejich toxicitu radikálně zvyšují. Výhodou BBTT dále je, že umožňuje kvantifikovat i libovolně velký stimulační efekt, v čemž se podobá biotestu s klíčením semen hořčice bílé, ale ve srovnání s touto metodou je BBTT mnohem přesnější, reprodukovatelnější, statisticky robustnější a nakonec i pohodlnější na provádění. Za největší výhodu BBTT oproti tradičním biotestům je však nutno pokládat bezkonkurenčně krátký čas potřebný k získání výsledků. V této práci byl čas kontaktu s xenobiotikem většinou 15 nebo 30 min, takže včetně přípravy pracovní suspenze indikátorových baktérií trval kompletní test i s vyhodnocením zhruba 1 hodinu. V naléhavých případech, kdy je nutno velmi rychle předběžně zhodnotit toxicitu neznámých vzorků, jako např. při ekologických haváriích, lze (jen s malou újmou na přesnosti) zkrátit jak dobu přípravy, tak inkubaci s toxikantem, takže měření lze provést během cca 30 min. Celý biotest je tedy asi 50 100 rychlejší než bioanalytické metody zahrnuté u nás do oficiálních metodik.
BBTT má samozřejmě, stejně jako všechny biotesty, svá omezení. Především je to metoda zcela nespecifická, neumožňující určit ani rámcově chemickou podstatu toxikantu: menší množství toxičtější látky vyvolá stejný sumární efekt jako větší množství méně jedovaté látky. Bez předběžných pokusů nelze předem stoprocentně určit, zda určitá látka bude pro luminiscenční baktérie toxická. Jak je však vidět z předložených výsledků, spektrum typů sloučenin, které se dají bioluminiscenčním testem sledovat, je značně široké, takže je naděje, že BBTT bude vyhovovat i pro další toxikanty. Při měření zbarvených toxikantů se musí provádět korekce na absorbanci, která by jinak simulovala vyšší toxický efekt. V popisovaných verzích BBTT bylo nutné do roztoků toxikantů přidávat NaCl kvůli osmolaritě. Naše nedávné pokusy však ukazují, že jednoduchá úprava metody tuto nutnost odstraňují, čímž se BBTT stává ještě rychlejším a pohodlnějším. Všechny uvedené skutečnosti nás utvrzují v přesvědčení, že bakteriální bioluminiscenční test toxicity je neobyčejně hodnotná metoda pro expresní vyhodnocování akutní toxicity různých xenobiotik, která by měla být co nejdříve zahrnuta mezi oficiální biotesty i u nás. Literatura (1) Bulich, A.A. (1982): A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples, Process Biochemistry, Vol. 17, pp. 45 47. (2) Kaiser, K.L.E., Ribo, J.M. (1985): QSAR of toxicity of chlorinated aromatic compounds, in Tichý, M. (ed.): QSAR in Toxicology and Xenobiochemistry, Elsevier, Amsterdam, pp. 27 38.