Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 1. Struktura a replikace DNA Literatura: Alberts a kol.: Základy buněčné biologie Espero Publishing, 2000 Garrett & Grisham: Biochemistry 2nd ed., Saunders College Publishing, 1999
Nositelem genetické informace je DNA Griffith (1928) naočkoval baktérie způsobující penumónii do myší Směs tepelně denaturovaného virulentního typu S a nevirulentního typu R myši usmrtila Vysvětlení: typ R byl transformován typem S! Avery (1944) prokázal, že transformaci způsobuje DNA! Griffithův pokus na myších
Další důkazy Lederberg a Tatum (1946) ukázali, že 2 kmeny E. coli lišící se autotrofií vůči aminokyselinám jsou schopny si vyměňovat geny Hershey a Chase (1952) při studiu bakteriofágů, označili jeho DNA s 32 P a proteiny s 35 S Další generace bakteriofága produkovaná po infekci baktérií obsahovala 32 P (tedy DNA z původního bakteriofága), ale ne 35 S(způvodních proteinů)! Experiment Lederberga a Tatuma
Základní dogma molekulární biologie Nukleové kyseliny, DNA a RNA Polymery spojené 3' - 5' fosfodiesterovou vazbou Sekvence se vždy čte od 5' -konce k 3' konci V sekvenci genu to odpovídá od N-konce k C-konci proteinu DNA jeden typ, jedna úloha uložení genetické informace RNA - 3 základní typy a úlohy - ribosomální RNA (rrna) struktura a funkce ribosomu - mediátorová RNA (mrna) přenáší informace o genech - transferová RNA (trna) přenáší aminokyseliny Další typy RNA snrna, snorna, mikro RNA, atd.
Základní složky nukleových kyselin RNA vs. DNA
Rozdíly mezi DNA a RNA Proč DNA obsahuje thymin? Cytosin samovolně deaminuje a vytváří uracil Enzymy y opravující chyby y v DNA jsou schopny rozpoznat tyto mutace a nahrazují takovýto uracil cytosinem Jak byl ale tyto enzymy rozpoznaly přirozený uracil od mutantního? DNA tedy obsahuje thymin (5-methyl-uracil) namísto uracilu Proč je DNA 2'-deoxy a RNA není? Vicinální -OH skupiny (2' a 3') v RNA způsobují její náchylnost k hydrolýze DNA, která neobsahuje 2'-OH je stabilnější Důvod genetický materiál musí být stabilní RNA je použita a poté degradována Dvoušroubovice DNA Objev struktury DNA 1953 Základní princip - párování bazí prostřednictvím vodíkových vazeb Erwin Chargaff měl data o párování bazí, ale nedokázal je interpretovat Rosalinda Franklinová získala difrakční X-ray data vlákna DNA Francis Crick objevil, že je to šroubovice (helix) James Watson odvodil princip vodíkových vazeb Antiparalelní dvoušroubovice Průměr vlákna 2 nm, délka 1.6 x 10 6 nm (E. coli), složená struktura (buňka E. coli má délku 2000 nm) Lidská DNA ~2 metry, jádro buňky 5 µm, DNA uložena ve formě chromatinu, histony
Párování bazí v DNA Struktura DNA a párování bazí
Struktura dvoušroubovice DNA Buňka obsahuje kompletní genetickou informaci o organismu
Strom života Bacteria, Archaea ~ 1.000-4.000 genes, Eukaryotes ~ 6.000-30.000 genes Prokaryota
Struktura eukaryotní buňky Velikost genomu
Velikost genomu Porovnání velikostí různých genomů
Chromosomy u člověka Replikace DNA Semikonzervativní model Prokázali Matthew Meselson a Franklin Stahl pomocí izotopového značení Replikace DNA vede k vytvoření dvou DNA molekul, ve kterých je jedno vlákno z původní a druhé zcela nové
Vlastnosti replikace DNA Nejlépe prozkoumány u E. coli, mnohé vlastnosti obecné Replikace je obousměrná - probíhá ve dvou replikačních vidličkách, které se pohybují v opačných směrech Dvoušroubovice musí být rozvinuta - helikasy Překroucení (supercoiling) musí být kompenzován - DNA gyrasa DNA replikace je semidiskontinuální Vedoucí vlákno se replikuje průběžně Druhé vlákno se replikuje v protisměru prostřednictvím Okazakiho fragmentů, které musí být poté spojeny (Tuneko and Reiji Okazaki)
Replikační vidlička Důkaz obousměrné replikace DNA
Enzymologie replikace DNA DNA polymerasa I U baktérie E. coli Arthur Kornberg (1957) prokázal existenci DNA polymerasy I Polymerasa I vyžaduje všechny 4 nukleotidy, templát a primer (ss DNA s volným 3'-OH), který se páruje s templátem a vytváří krátký úsek dvoušroubovice Replikace probíhá od 5' k 3' - konci Nukleotidy jsou připojovány od 3'-konce vlákna Pol I katalyzuje kolem 20 cyklů polymerizace než se nové vlákno oddělí od templátu Pol I z E. coli je monomer, 928 aminokyselin (109 kda) Kromě 5'-3' polymerásové aktivity, enzym má také 3'-5' a 5'-3' exonukleasové aktivity E. coli DNA Polymerasa I
DNA Polymerasa III Hlavní" polymerasa u E. coli Deset rozdílných podjednotek Jádro" enzymu má 3 podjednotky α - polymerasa ε - 3'-exonukleasa θ - neznámá funkce β podjednotka vytváří prstenec kolem DNA Procesivita - 5 millionů bazí! E. coli DNA Polymerasa III
Proteiny podílející se na vytváření replikační vidličky DNA replikace u eukaryot Stejný princip jako u E. coli, ale komplexnější Lidská buňka: kopírování 6 miliard bp M h čátků lik 1 3 300 kb Mnoho počátků replikace: 1 na 3-300 kbp Známo několik DNA polymeras DNA polymerasa α - 4 podjednotky - polymerasová aktivita (procesivita = 200) - ne 3'-exonukleasová aktivita - ne 3 -exonukleasová aktivita DNA polymerasa β - ε
Buněčný cyklus Jiný způsob vzniku DNA RNA-řízená DNA polymerasa Howard Temin (1964) pozoroval, že inhibitory DNA syntézy zabraňují infekci buněk v kultuře RNA viry DNA tedy zprostředkovává replikaci viru. Temin a Baltimore (1964) nezávisle objevují RNA řízenou DNA polymerasu reverzní transkriptasu
Opravy poškozené DNA Základní rozdíl oproti RNA, proteinům, lipidům, atd. Všechny ostatní složky mohou být nahrazeny, ale DNA musí být zachována Buňky potřebují nástroje pro opravy chybějících, pozměněných nebo nesprávných bazí, opravy insercí a delecí, poškození UV zářením pyrimidinové dimery, přerušení vlákna, cross-link Existují dva základní mechanismy oprav: oprava chyb v párování bazí (mismatch repair) a opravy chemického poškození Tvorba pyrimidinových dimerů působením UV záření
Porušení vlákna DNA Opravy chyb v párování bazí (Mismatch repair) Opravné enzymové systémy kontrolují dvoušroubovici DNA a identifikují nesprávně párované báze, poté vyříznou chybný usek a nahradí jej. Příkladem je methylační dráha u E. coli. Methylace DNA probíhá po replikaci, takže tento systém identifikuje methylovaný řetězec jako původní a opraví nesprávně párovanou bázi na druhém řetězci.
Restrikční endonukleasy Baktérie dokážou zabránit ("restrict ) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli. Opravy chemického poškození DNA Pyrimidinové dimery mohou být přímo opraveny enzymem fotolyasou. Vystřihnutí a oprava: DNA glykosylasy odstraní poškozenou bázi a vytvoří AP místo. AP endonukleasa rozštěpí poškozený řetězec, endonukleasa odstraní několik residuí okolo a mezera eeaje vyplněna ě apomocí oc DNA polymerasy a DNA ligasy.
Oprava poškozené báze v DNA Mechanismus genové rekombinace Obecná rekombinace: jakékoliv dva homologní (velice si podobné) úseky DNA mohou sloužit jako substráty. Robin Holliday (1964) navrhl model využívající jednovláknového naštípnutí v homologních místech. Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení (ligaci) dvou naštípnutých homologních řetězců vzniká Hollidayovo spojení (Holliday junction)
Holliday junction