Biotechnologické in vitro metody u ohrožených druhů vrb

Brandová B., Hroneš M., Knitl M., Richterová L., Skálová D., Navrátilová B. & Vašut R.J. 2011: Biotechnologické in vitro metody u ohrožených druhů vrb. Opera Corcontica 48: 79 88 Biotechnologické in vitro metody u ohrožených druhů vrb Biotechnological in vitro methods with endangered willow species Blanka Brandová, Michal Hroneš, Michal Knitl, Lenka Richterová, Dagmar Skálová, Božena Navrátilová & Radim J. Vašut Oddělení biosystematiky a ekologie rostlin, Katedra botaniky Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, radim.vasut@upol.cz Abstrakt Vysokohorské druhy vrb představují zajímavou skupinu pro studium genetické variability populací. Pro nastavení podmínek pro molekulární analýzy je nutný kultivovaný materiál. Vzhledem k vzácnosti vysokohorských vrb v ČR byly testovány metody in vitro manipulace za účelem získání rostlin nedestruktivní metodou. Dva testované druhy, Salix lapponum a S. hastata, byly podrobeny metodám mikropropagace a metodě ovule culture. Byla testována řada různých médií vhodných pro in vitro kultivaci dřevin. Mikropropagace z pupenů a nodálních segmentů proběhla úspěšně. Naopak, techniku ovule culture kultivaci neoplozených vajíček, se nepodařilo optimalizovat. Vzhledem k úspěšnosti mikropropagace se metoda jeví jako vhodná pro případnou kultivaci ohrožených druhů vrb. Klíčová slova: Salix lapponum, Salix hastata, mikropropagace, organogeneze, kultivace nezralých vajíček (ovule culture) Abstract The high-mountainous willow species represents attractive study object for genetic variability studies in endangered and relic populations. Setting up the conditions for molecular research requires available plant material for DNA extraction. In order to avoid damaging plants of endangered willow species in nature, we tested in vitro methods in Salix species. In this study, we applied methods of micropropagation and ovule cultures on two willow species, i. e. Salix lapponum and S. hastata. Several cultivation media for woody plants were tested in order to find suitable condition for growing. Micropropagation from buds and nodal segments was successful, whereas ovule culture (cultivation of unfertilized ovules) has not been satisfactorily optimized yet. Successful micropropagation seems to be promising tool for cultivation of endangered willow species. Keywords: Salix lapponum, Salix hastata, micropropagation, organogenesis, ovule culture Zkratky BA benzyladenin GA 3 kyselina giberelová IAA kyselina indolyloctová IBA kyselina indolylmáselná KIN kinetin PPM Plant cell preservative mixture PPM (Plant Cell Technology, Washington, DC) (roztok pro desinfekci rostlinného materiálu) 79

Brandová et al.: Množení ohrožených druhů vrb ÚVOD S jistotou můžeme říct, že květena českých pohoří je posledních několik století podrobována pečlivým průzkumům, inventarizována novými a novými botaniky, fytocenology i amatéry, zkoumána ze všech možných hledisek a poznání o ní je velké a vzrůstá každým dnem. Co je však akutně potřeba a čeho je zatím poměrně nedostatek, jsou informace o jednotlivých ohrožených společenstvech, populacích či druzích, které pouhou návštěvou v terénu nezískáme (genetická variabilita druhů a populací, rozmnožovací strategie rostlin), a praktické návrhy, jak tuto vzácnou a charakteristickou květenu chránit pro další generace. Tento článek pojednává o technice, která může pomoci naše dva ohrožené druhy vrb lépe a účinněji studovat i chránit. Rod vrba (Salix L.) je v ČR zastoupen především stromovitými a keřovitými druhy rostoucími poblíž vody. Významnou skupinou vrb jsou horské keřovité druhy, které se vyskytují v sudetských pohořích a jsou reliktního charakteru. Hlavním areálem jejich rozšíření je boreální pásmo severní polokoule, případně velehory střední a jižní Evropy (Alpy, Karpaty, Dinaridy aj.). Lokality v českých horách představují parapatrické arely a naše populace jsou tudíž geneticky izolované. Mohou tak zachovávat vzácné fragmenty genetické diverzity druhu. Vrba laponská (Salix lapponum L.) se u nás vyskytuje v Krkonoších (11 recentních přirozených populací; Hroneš et al. 2011) a v Hrubém Jeseníku (1 populace, tvořená pravděpodobně jediným samičím klonem). Vrbu hrotolistou (Salix hastata L.) můžeme najít pouze v Hrubém Jeseníku (4 populace, z nich pouze 1 početnější; Brandová & Vašut 2010). Jsou to druhy dvoudomé, t.j. rostliny jsou buď samčí nebo samičí, a někdy se na lokalitě mohou vyskytovat jedinci pouze jednoho pohlaví, tudíž je pohlavní rozmnožování téměř vyloučeno. Z uvedených vlastností a omezeného výskytu těchto dvou druhů vrb vyplývá, že jsou náchylné k náhodným vlivům prostředí, náhodným fluktuacím podmínek nebo k disturbancím. Pro budoucí přežití a uchování těchto druhů jsou tkáňové kultury jednou z velice perspektivních možností. Je to dáno možností regenerace původních genotypů rostlin z malých fragmentů rostlinného pletiva (listy, pupeny), které pouze minimálně poškozují mateřské rostliny. Metodika byla již úspěšně použita u různých druhů dřevin (např. Blakesley et al. 1996, Karkonen et al. 1999, Mashkina et al. 2010). Tkáňové kultury (TK) mají v ochraně přírody velký potenciál. V rovině obecné můžeme mluvit o zabránění ztrátám biodiverzity nebo o uchování genetické variability druhů. V konkrétních případech nám TK mohou pomoci s posilováním či doplňováním populací a společenstev ohrožených či jinak významných druhů rostlin, s repatriací či reintrodukcí původních druhů organismů či s kultivací vzácných genotypů k zachování genetické diverzity populace. V principu se jedná o to, že z jedné rostliny, lépe řečeno z několika nepatrných částí této rostliny, můžeme pomocí technik tkáňových kultur dostat řádově desítky až stovky rostlin (Amo-Marco & Lledo 1996). Velkou výhodou je, že mateřské rostliny tím nejsou ničeny, jako např. řízkováním. Zároveň se lze cíleně zaměřit na specifické genotypy. Tento postup lze aplikovat při tvorbě záchranných programů rostlin nebo programů péče. V budoucnosti by se dalo uvažovat i o záchranných transferech rostlin, kdy by se z rostlin na lokalitě určené k likvidaci vypěstovaly rostliny s nimi identické, a ty se následně vysadily na vhodném blízkém vyhovujícím biotopu, popř. o tvorbě samčích a samičích rostlin k posílení pohlavního rozmnožování u vybraných druhů. Ochrana druhů a populací, jejich genetická diverzita zachovaná pro budoucí generace, to všechno předpokládá zájem jak ze strany vědců zabývajících se tkáňovými kulturami, tak od lidí studujících konkrétní druh pokud možno z co nejvíce stran a v neposlední řadě ochranářů z praxe. Cílem této práce bylo otestování vhodných médií pro regeneraci vzácných druhů vrb. Záměrem práce bylo nalezení vhodných podmínek pro nedestruktivní regeneraci ohrožených druhů vrb pro přenos do kultivace a následnou studii genetické variability horských vrb. Výsledky přinesly zjištění, která jsou využitelná i v ochranářské praxi. 80

Opera Corcontica 48/2011 MATERIál a METODIKA ROSTLINNý MATERIál Rostlinný materiál S. lapponum byl odebrán z mateřských rostlin na lokalitě Pančavská louka, na vrcholovém plató západně od Labského dolu v západních Krkonoších ve výšce přibližně 1330 m n. m. (viz Hroneš et al. 2011). S. hastata byla sbírána ve střední části Velké kotliny v Hrubém Jeseníku v červnu r. 2009, pro experiment byla použita 1 samičí rostlina. METODIKA Mikropropagace Obr. 1. Vzrostné vrcholy S. lapponum po sterilizaci na Petriho misce (kultivace na ½ MS médiu). Fig. 1 S. lapponum apex after sterilization on a Petri dish (cultivation on ½ MS media). Letorosty z dospělých jedinců S. lapponum (15 20 cm) byly narašeny ve vodě ve fytotronu (18 C den/15 C noc). Prorůstající pupeny (2 cm) byly odebrány a povrchově desinfikovány následovně: vloženy do kádinky a opláchnuty v 70 % etanolu (1 min), desinfikovány pomocí 2,5 % chloraminu B (7 min, s mírným protřepáváním), opláchnuty ve sterilní destilované vodě již ve sterilním prostředí (3, 10 min, laminární flowbox) a poté byla bazální část odřezána a vrcholová část (1 1,5 cm) umístěna do Petriho misky s ½ MS médiem (Murashige & Skoog 1962) (Obr. 1). Po 24 hodinách byly vrcholové části opět desinfikovány 2,5 % chloraminem B (2 min) a opláchnuty sterilní destilovanou vodou a vysazeny na médium MS v Petriho miskách (pro vyloučení kontaminací). Po 2 týdnech byly vrcholové části přesazeny na OK médium (Erlenmayerovy baňky, 4 ks/baňka). Po 8 týdnech kultivace byly počítány prorůstající adventivní prýty dlouhé 2 3 cm (delší prýty byly rozřezány na polovinu) a opět přeneseny na svěží OK médium (4 ks/baňka). Nodální segmenty S. hastata byly odebírány ze síťového izolátu a byly testovány na eliminaci vnitřních kontaminací pro založení in vitro kultury. Segmenty byly opláchnuty a sterilizovány jako apexy S. lapponum. Po 24 hodinách byla část nodálních segmentů sterilizována opět jako S. lapponum a vysazena na médium MS. Druhá část segmentů byla kultivována na médiu MS doplněném o 0,1 % PPM a po 2 týdnech byly segmenty bez kontaminací přeneseny na OK médium v Erlenmayerových baňkách. Kultivace všech explantátů probíhala v kultivační místnosti s denním režimem 16/8 h den/noc a teplotou 22 + 2 C. Složení médií je uvedeno v Tab. 1. 81

Brandová et al.: Množení ohrožených druhů vrb Tab. 1. Složení kultivačních médií pro biotechnologické manipulace u rodu Salix sp. The composition of cultivation media for biotechnological manipulation in the genus Salix. Základní médium/ Basic medium MS médium MS médium WPM médium SH médium Zkratka pro media/ Media abbrev.* Ostatní komponenty/ Other components Literatura/References Mikropropagace/Micropropagation MS Murashige & Skoog 1962 MS+PPM 0,1 % PPM Niedz & Bausher 2002 OK 20 mg/l kyselina askorbová a ; Gajdová et al. 2006, 0,01 mg/l BA; 0,01 mg/l Skálová et al. 2008 IBA; 20 g/l sacharóza b Ovule culture O1 30 g/l sacharóza b Calagari et al. 2004 O2 O3 O4 9,5 mg/l glycin c, 500 mg/l kaseinhydrolyzát d ; 4 mg/l IAA; 0,5 mg/l KIN; 4 mg/l GA3; 30 /40 g/l sacharóza b Castano & De Proft 2000, Popielarska 2005, Skálová et al. 2010 50 ml/l kokosové mléko e ; 30 g/l sacharóza b Scheiber & Robacker 2003 0,2 mg/l BA; 20 g/l sacharóza Agrawal & Gebhardt 1994 Vysvětlivky/ Explanatory notes: *Všechna média byla sterilizována autoklávováním; ph = 5,8; pro zpevnění bylo použito 8 g/l agaru. *All media were sterilized in an autoclave; ph = 5.8; 8 g/l of agar were used for solid media (for all media). a ascorbic acid; b sucrose; c glycine; d caseinhydrolysate; e coconut water. Ovule culture kultury nezralých vajíček Metoda ovule culture byla využita pro in vitro propagaci vybraných chráněných druhů rodu Salix sp. Byla izolována a kultivována nezralá vajíčka S. lapponum a S. hastata. Vlastní in vitro metodika ovule culture probíhala v několika krocích. V první řadě, byly samičí jehnědy s nezralými semeníky S. lapponum a S. hastata po odběru v terénu umístěny do chladničky. Byly zde skladovány v Petriho miskách po dobu 2 dnů, při teplotě cca 4 C. Dále byly jehnědy po proběhnutí chladového předpůsobení sterilizovány pomocí 70 % etanolu (2 min). Poté byl jako sterilizační činidlo použit 2,5 % chloramin B (10 min). Následně byly jehnědy již ve sterilním prostředí (laminární flowbox) propláchnuty ve sterilní destilované vodě (3, 10 min). Izolace nezralých vajíček probíhala pomocí binokulární lupy (Olympus SZ51). V první řadě byly izolovány pomocí sterilních mikroskopických nástrojů (pinzeta a jehla) nezralé semeníky z celých jehněd, poté byla izolována jednotlivá vajíčka (Obr. 2). Izolovaná nezralá vajíčka byla kultivována na čtyřech médiích (médium O1, O2, O3, O4; složení médií v Tab. 1). Média byla vybrána na základě předchozích expe- 82 Obr. 2. Izolace vajíček S. lapponum (otevřený semeník s vajíčky). Fig. 2 S. lapponum egg isolation (open ovary with eggs).

Opera Corcontica 48/2011 rimentů a na základě jejich využití v této či podobné metodice u jiných rodů. Základem pro ně bylo většinou médium MS (Murashige & Skoog 1962), WPM (Lloyd & McCown 1980) a médium SH (Schenk & Hildebrandt 1972). Médium MS se běžně využívá pro explantátové kultury, média WPM a SH se často používají právě pro dřeviny. Tato média byla doplněna o látky podporující gynogenezi popř. embryogenezi (jako je např. kaseinhydrolyzát, kokosové mléko, růstové regulátory např. GA 3 ). Nezralá izolovaná vajíčka byla kultivována v Petriho miskách (průměr 6 cm) po deseti. Celkový počet kultivovaných vajíček od obou druhů rodu Salix na jednotlivých typech médií je uveden ve výsledné Tab. 2. Regenerační schopnosti izolovaných nezralých vajíček byly hodnoceny po třech měsících kultivace v termostatu (27 C; tma). Tab. 2. Ovule culture u rodu Salix sp. Ovule culture in the genus Salix. Druh rodu/species S. hastata S. lapponum Médium Počet explantátů/ No. of explantates Počet a typ regenerace/ No. and type of regeneration * O1 100 100 (0) O2 100 100 (0) O3 100 100 (0) O4 100 100 (0) O1 150 150 (0) O2 160 160 (0) O3 110 110 (0) O4 150 150 (0) Vysvětlivky/ Explanatory notes: *0 žádné změny v průběhu kultivace. *0 no changes during cultivation. VýSLEDKy a DISKuSE MIKROPROPAGACE Pro mikropropagaci bylo použito 25 rostoucích apexů S. lapponum, které jsou vhodnější pro rychlé množení než nodální segmenty, i vzhledem k tomu, že rychleji rostoucí apexy mají méně vnitřních kontaminací než dřevité letorosty. Důležitým stupněm založení in vitro kultury je povrchová desinfekce odebraných explantátů. Ve starší literatuře (Chalupa 1983) je u dřevin často používán chlorid rtuťnatý (HgCl 2 ), ale pro jeho toxicitu byl vybrán vhodnější, běžně používaný desinfekční prostředek, chloramin B. Pro iniciaci in vitro kultury bylo použito dvoustupňové povrchové desinfekce opakující se po 24 hodinách. 28 % explantátů prorůstalo v prýty. Pro mikropropagaci S. lapponum bylo vybráno médium OK s velmi nízkým obsahem růstových látek (auxin a cytokinin) 0,01 mg/l IBA a 0,01 mg/l BA a doplněné 20 mg/l kyseliny askorbové (Obr. 3). Rostlinky na OK médiu byly normálního vzhledu a po 8 týdnech kultivace dosahovaly prýty v průměru až 6 cm, byly zelené a všechny kořenily. Průměrné zmnožení Obr. 3. Zmnožení prýtů u S. lapponum (po kultivaci vzrostných vrcholů na médiu OK; prýty vzniklé z jednoho vzrostného vrcholu). Fig. 3 S. lapponum cultivation on the OK media. (Plant originated from single apex.) 83

Brandová et al.: Množení ohrožených druhů vrb Tab. 3. Mikropropagace Salix spp. Genotyp po 1. pasáži bylo 3,5 prýtů na původní explantát a po 2. pasáži 4,7 prýtů na explantát, i díky tomu, že bylo možno dlouhé prýty rozřezat na polovinu (segmenty dlouhé 3 cm), během 4 měsíců kultivace lze získat v průměru 16,45 kořenících rostlinek na 1 původně vysazený explantát (Tab. 3). Při rozřezání delších výhonů na segmenty 2 cm dlouhé lze získat i většího zmnožení na 1 původní explantát. Díky tvorbě kořenů již na OK kultivačním médiu nebylo potřebné rostliny pasážovat na kořenící médium. V rámci in vitro kultivace nebyly u rostlin pozorovány žádné abnormality (jako tvorba kalusu na bázi, vitrifikace, nekrotizace). Také přítomnost kyseliny askorbové (vitamín C) v kultivačním médiu, která působí proti stárnutí pletiva, měla pozitivní vliv na rostlinky, byly zelené během 8 týdnů kultivace bez pasáže. Medium MS doplněné o růstové regulátory (auxin, cytokinin) je běžně používáno pro mikropropagaci dřevin (Bhojwani 1980, Amo-Marco & Lledo 1996, Shibli et al. 1997, Cui et al. 2009, Peternel et al. 2009). Při vyšších koncentracích kombinace auxin a cytokinin (0,5 1,0 mg/l) jsou rostlinky menší, mohou mít vitrifikovaný (hyperhydratovaný) vzhled (Chalupa 2002, 2003). Chalupa (2002) u nodálních segmentů Sorbus aucuparia testoval in vitro rozmnožování, sledoval složení kultivačních médií a pozoroval, že se stoupající koncentrací BA (0,2 1,0 mg/l) stoupal také počet vytvořených prýtů (3,6 8,2), ale jejich délka klesala (1,8 cm 1,1 cm), nejvyšší koeficient zmnožení sledoval u explantátů odebraných z juvenilních části stromu (tzv. kmenových výmladků). Taktéž Chalupa (2003) využil metodu mikropropagace u Tillia platyphylos z nodálních segmentů, kdy za nízkých koncentrací BA a IBA byla sledování stimulace prodlužování prýtů z axilárních pupenů, při koncentraci 0,1 mg/l IBA a 0,6 mg/l BA v médiu bylo zmnožení 3,3 a délka prýtů 2,2 cm. Lyyra et al. (2006) využili mikropropagaci z adventivních pupenů u Salix nigra a popisují, že tvorba prýtů závisí nejen na složení kultivačního média, ale i na genotypu. Pro iniciaci kultury S. hastata z nodálních segmentů (bylo použito 104 nodálních segmentů) byl zvolen také postup dvoustupňové povrchové desinfekce explantátu i využití PPM v médiu, které je používáno komerčně k eliminaci vnitřních (endogenních) mikrobiálních kontaminací explantátu 84 Micropropagation in the genus Salix. Explantát (počet)/ Explantate (No.) Médium Kontaminace/ Contamination Nekrotizace/ Necrotization (%) Rostoucí Explantáty/ growing explantates % Celkové zmnožení/ No. of shoots per explantate S. lapponum apexy (25) OK 20 (52) 28 (3,5)* 4,7** S. hastata nodalní segment (66) nodalní segmenty (38) MS+ PPM/ OK 80 ( ) 20/*** Kvalita explantátů/ Quality of explantates normální vzhled, dlouhé rostlinky, zelené a kořenící/ normal, long plants, green and rooting krátké rostlinky, světle zelené/ short plants, light green MS 100 ( ) 0/0 Vysvětlivky/ Explanatory notes: *Zmnožení 3,5 rostlin po 1. pasáži; the number of shoots per explants after the 1. transfer to fresh medium (3.5); **4,7 rostlin na explantát po 2. pasáži/ 4.7 shoots per plants after the 2. transfer to fresh medium; *** Experimenty s PPM pokračují/ Experiments with PPM continue.

Opera Corcontica 48/2011 (Compton & Koch 2001, Niedz & Bausher 2002). V tomto experimentu nodálních segmentů bylo aplikováno 0,1 % PPM v kultivačním médiu, a vnitřní kontaminace byly eliminovány ze 100 % na 80 %; bylo získáno tak 20 % rostoucích explantátů (Obr. 4). V našich experimentech byly explantáty na médiu bez přidání PPM během 2 týdnů přerostlé mikrobiálními kontaminacemi. V dalších navazujících experimentech bude zvýšen objem PPM v médiu. Komerčně doporučené množství PPM v kultivačním médiu výrobcem je v rozmezí od 0,05 do 0,2 %, které vede ke zvýšení produktivity a neovlivňuje vlastní indukci adventivních pupenů na explantátu. Množení Salix spp. metodou in vitro má význam pro záchranu ohrožených populací, kdy během krátké doby (vzhledem k porovnání množení v přírodě) bez ohledu na roční období a v kontrolovaných podmínkách, lze reprodukovat rostliny ohrožených nebo k zachování vybraných odolných genotypů.výsledky mikropropagace pro S. hastata a S. lapponum jsou shrnuty v Tab. 3. Obr. 4. Kultivace nodálních segmentů S. hastata na médiu MS doplněném o 0,1 % PPM. Fig. 4 Micropropagation from buds and nodal segments on MS media with 0.1% PPM. OvuLE culture kultury NEZRALých VAjíček Byla izolována nezralá vajíčka u dvou vybraných druhů rodu Salix (400 vajíček z jehněd S. hastata a 570 vajíček z jehněd S. lapponum). Bylo testováno několik variant médií. Tato média byla testována již dříve především pro kultivaci již oplozených vajíček po intraspecifické hybridizaci (např. u rodu Cucumis Supronova & Shmykova 2008; nebo u rodu Aechmea Vervaeke et al. 2001; z dřevin např. u rodu Populus Calagari et al. 2004, Mofidabadi et al. 1998) či interspecifické hybridizaci (např. u rodu Abelia Scheiber & Robacker 2003). Izolace a kultivace neoplozených vajíček u rodu Salix probíhala dle dostupných opublikovaných prací vůbec poprvé. Kultivace nezralých vajíček v případě těchto dvou druhů tohoto rodu zatím nebyla úspěšná. Po dobu tří měsíců nebyla u izolovaných vajíček pozorována žádná změna (Obr. 5). Nebyla pozorována žádná forma regenerace zvětšování a zezelenání vajíček; tvorba mikrokalusů, kalusů; či tvorba rostlin. Výsledky pro S. hastata a S. lapponum jsou shrnuty v Tab. 2. V jiných případech se podařilo získat po kultivaci oplozených vajíček (intra- i interspecifická hybridizace) alespoň mikrokalusy (např. u rodu Cucumis Skálová et al. 2010), v některých případech (intraspecifická hybridizace) i rostliny (např. u rodu Helianthus Popielarska 2005). Obr. 5. Kultivace izolovaných vajíček S. hastata (stav po třech měsících, kultivace na médiu O1). Fig. 5 S. hastata cultivation of isolated eggs (state after 3 months; cultivation on O1 medium). 85

Brandová et al.: Množení ohrožených druhů vrb I v těchto případech je ovšem frekvence takovéhoto stupně regenerace velmi nízká (2,2 2,3 % pro rostliny u rodu Helianthus). U dřevin dosáhla kultivace izolovaných vaječníků či semeníků vysokého stupně regenerace. Ve většině případů se ovšem jednalo o vajíčka oplozená, po intraspecifické hybridizaci (rostliny u rodu Populus Calagari et al. 2004, Mofidabadi et al. 1998) či po interspecifické hybridizaci (rostliny u rodu Abelia Scheiber & Robacker 2003). Na druhou stranu, i když u vajíček S. hastata a S. lapponum nebyl pozorován žádný typ regenerace, vajíčka nebyla nekrotická, jak bývá u tohoto typu explantátových kultur obvyklé (Calagari et al. 2004, a další). Pro zisk lepších výsledků u obou testovaných druhů rodu Salix bude potřeba izolovat a kultivovat větší množství vajíček. Důležitou roli zde hraje také složení médií (možnost testovat jiná média) a především také genotyp, popř. druh. V této práci byly použity pouze dva ohrožené druhy rodu Salix. Pro komplexnější a lepší výsledky pro rod Salix, je potřeba provést experimenty pro více druhů (genotypů). Závěr Metodika regenerace rostlin pomocí mikropropagace z malých částí pletiva u dvou ohrožených druhů vrb byla úspěšná. Metodika může být použita i u jiných druhů ohrožených vysokohorských vrb. Potenciál metody spočívá ve snadné a poměrně rychlé kultivaci rostlin, u kterých by získávání většího množství řízků mohlo vést k poškození rostlin. Metodika ovule culture, která má potenciál produkovat haploidní rostliny nebyla zatím pro studované dva druhy optimalizována, přestože u jiných rodů se mikrokalusy podařilo získat. Metoda mikropropagace může mít praktický význam při obnově populací původními genotypy rostlin. Poděkování Výzkum studentů (BB, MH, MK a LR) byl finančně podpořen interním grantem PřF UP (IGA) č. Prf 2010 001 Biodiverzita rostlin a jejich interakce s prostředím. Děkujeme Správám KRNAP a CHKO Jeseníky za umožnění realizace výzkumu. Děkujeme S. Hrachové (PřF UP) za pomoc při sběru S. lapponum. LITERATuRA Agrawal D. C. & Gebhardt K. 1994: Rapid micropropagation of hybrid willow (Salix) established by ovary culture. J. Plant. Physiol. 143(6): 63 765. Amo-Marco J. B. & Lledo M. D. 1996: In vitro propagation of Salix tarraconensis Pau ex Font Quer, an endemic and threatened plant. In vitro Cell Dev. Biol. Plant 32: 42 46. Bhojwani S. S. 1980: Micropropagation method for a hybrid willow (Salix matsudana alba NZ 1002). New Zealand J. Bot. 18: 209 214. Blakesley D., Pask N., Henshaw G. G. & Fay M. F. 1996: Biotechnology and the conservation of forest genetic resources: In vitro strategies and cryopreservation. Pl. Growth Regul. 20: 11 16. Brandová B. & Vašut R. J. 2010: Je u nás vrba šípová ohrožena hybridizací? Ochrana Přírody 2010/5: 19 21. Calagari M., Mofidabadi A. J., Tabari M. & Hosseini S. M. 2004: Intraspecific hybridization of Populus euphratica Oliv. Using in vitro Technique. J. Sci., Islamic Rep. of Iran 15 (2): 109 112. Castano C. I. & De Proft M. P. 2000: In vitro pollination of isolated ovules of Cichorium intybus L. Plant Cell Rep. 19: 616 621. Chalupa V. 1983: In vitro propagation of willows (Salix spp.), european mountain-ash (Sorbus aucuparia L.) and black locust (Robinia pseudoacacia L.). Biol. Plant. 25(4): 305 307. Chalupa V. 2002: In vitro propagation of mature trees of Sorbus aucuparia L. and field performance of micropropagated trees. J. For. Sci. 48(12): 529 535. Chalupa V. 2003: In vitro propagation if Tillia platyphyllos by axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis. J. For. Sci. 49(3): 537 543. Compton M. E. & Koch J. M. 2001: Influence of plant preservative mixture (PPM) on adventitious organogenesis in melon, petunia and tobacco. In vitro Cell Dev. Biol. Plant 37: 259 261. 86

Opera Corcontica 48/2011 Cui H., Gu X. & Shi L. 2009: In vitro proliferation from axillary buds and ex vitro protocol for effective propagation of Syringa hyacinthiflora Luo Lan Zi. Sci. Hort. 121: 186 191. Gajdová J., Navrátilová B., Smolná J. & Lebeda A. 2006: Factors affecting protoplasts isolation and cultivation of Cucumis spp. J. Appl. Bot. Food Qual. 81: 1 6. Hroneš M., Hrachová S., Dančák M. & Vašut R. J. 2011: Vrba laponská (Salix lapponum L.) v Krkonoších. Opera Corcontica 48: 69 78. Karkonen A., Simola L. K. & Koponen T. 1999: Micropropagation of several Japanese woody plants for horticultural purposes. Ann. Bot. Fenn. 36: 21 31. Lloyd G. B. & McCown B. H. 1980: Use of microculture for production and improvement of Rhododendron spp. Hortscience 15(3): 416 417. Lyyra S., Lima A. & Merkle S. 2006: In vitro regeneration of Salix nigra from adventitious shoots. Tree Physiol. 26: 969 975. Mashkina O. S. Tabatskaya T. M., Gorobets A. I. & Shestibratov K. A. 2010: Method of Clonal Micropropagation of Different Willow Species and Hybrids. Appl. Biochem. Microbiol. 46: 769 775. Mofidabadi A. J., Modir-Rahmati A. R. & Tavesoli A. 1998: Application of Ovary and Ovule Culture in Populus alba L. P. euphratica Oliv. Hybridization. Silvae Gen. 47: 5 6. Murashige T. & Skoog F. 1962: A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15(3): 473 497. Niedz R. P. & Bausher M. G. 2002: Control of in vitro contamination of explants from greenhouse- and field-grown trees. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 38: 468 471. Peternel Š., Gabrovšek K., Gogala N. & Regvar M. 2009: In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesis. Sci. Hort. 121: 109 112. Popielarska M. 2005: In vitro pollination of isolated ovules of sunflower (Helianthus annuus L.) Acta Biol. Cracov. Bot. 47/1: 85 92. Scheiber S. M & Robacker C. D. 2003: Interspecific hybridization between Abelia grandiflora Francis Mason and A. schumannii via ovule culture. Euphytica 132: 1 6. Schenk R. U. & Hildebrandt A. C. 1972: Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant-cell cultures. Can. J. Bot. 50(1): 199 204. Shibli R. A., Ajlouni M.M., Jaradat A., Aljanabi S. & Shatnawi M. 1997: Micropropagation in wild pear (Pyrus syrica). Sci. Hort. 68: 237 242. Skálová D., Navrátilová B. & Lebeda A. 2008: Embryo-rescue of cucumber (Cucumis sativus) and some wild Cucumis spp. (C. anguria, C. zeyheri, C. melo, C. metuliferus). J. Appl. Bot. Food Qual. 82: 83 89. Skálová D., Navrátilová B., Ondřej V. & Lebeda A. 2010: Optimizing culture for in vitro pollination and fertilization in Cucumis sativus and C. melo. Acta Biol. Cracov. 52: 111 115. Supronova T. & Shmykova N. 2008: In vitro induction of haploid plants in unpollinated ovules, anther and microspore culture of Cucumis sativus. In: Pitrat M. (ed) Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IX th EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae, INRA, Avignon (France), May 21 24 th, 371 374. Vervaeke I., Parton E., Maene L., Deroose R. & De Proft M. P. 2002. Pollen tube growth and fertilization after different in vitro pollination techniques of Aechmea fasciata. Euphytica 124: 75 83. 87

88