Obsah přednášky 1. Definice genové terapie 2. Typy a strategie genové terapie 3. Principy genového přenosu 4. Základní technologie genové terapie 5. Způsoby přenosu genů 6. Příklady využití genové terapie 7. Budoucnost genové terapie
Co je to genová terapie? Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro pacienta
Genová terapie versus symptomatická léčba Symptomatická léčba geneticky podmíněných chorob neléčí podstatu, ačkoli je známa příčina onemocnění Genová terapie léčí příčinu onemocnění
Symptomatická léčba Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů...) Vyvarování se substrátu, který nelze správně metabolizovat (speciální diety) Chirurgické zákroky Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů Farmakologické zlepšení kvality života Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje, pomůcky) Transplantace chorobou poškozeného orgánu
Co zahrnuje genová terapie? Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy Genová terapie in vitro (ex vivo): odběr buněk, provedení genové modifikace mimo organismus, návrat buněk zpět Genová terapie in vivo: intravenózní transformace přímo genovým konstruktem Genová terapie in situ: (modifikace in vivo) genový konstrukt je injikován do postižené tkáně nebo její blízkosti
Techniky genové terapie In vivo, In situ klonovaný gen transfer genu In vitro (Ex vivo) selekce a namnožení buněk X + odběr buněk buňky pacienta X - některé buňky X + buňky X + návrat geneticky modifikovaných buněk pacientovi
Co lze léčit genovou terapií? Vrozené poruchy (genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu) Nádorová onemocnění (poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a reparačních genů) Nemoci imunitního systému (alergie, záněty a autoimunní choroby) Infekční nemoci (virový nebo bakteriální patogen)
Projekt HUGO a genová terapie Projekt sekvenování lidského genomu 1990-2001 SCIENCE 291, February 2001
Kdy lze použít genovou terapii? Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby tzn. gen, jeho umístění, povahu produktu a hlavně mechanizmus patologického účinku Správně vytvořenou strategii genové terapie Součástí strategie je i volba vhodného vektoru a vytipování cílových buněk genové terapie S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba provádět genovou terapii pouze pokud je úspěšně otestována a schválena k použití
Základní strategie 2x2 Reparace genů in situ - terapie genů GT somatická Ektopická reparace terapie geny GT germinální
Strategie genové terapie KLASICKÁ Optimální exprese vloženého genu Tvorba chybějícího produktu Přímá likvidace nemocných buněk Aktivace imunitního systému NEKLASICKÁ Inhibice exprese patogenního genu Restaurace normální exprese sirna
Genová terapie klasická Jejím cílem je dopravit geny do vhodných cílových buněk tak, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů a Zajistit produkci látky, která chybí Aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky
Genová terapie neklasická Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese
Genová terapie podle typu buněk 1) Zárodečných buněk 2) Somatických buněk
GT zárodečných buněk Do oplodněného vajíčka se dodá kopie správné verze příslušného genu a vajíčko se implantuje zpět do těla matky Gen je zpravidla přítomný ve všech buňkách nového jedince Provádí se mikroinjekcí DNA do vajíčka Teoreticky použitelná k léčení jakékoli dědičné choroby
GT somatických buněk Manipulace s buňkami, které lze z těla odebrat, transfekovat a vrátit zpět do těla Nadějná pro léčbu dědičných onemocnění krevních buněk Vnášejí se geny do kmenových buněk kostní dřeně Jako vektory slouží viry retroviry, adenoviry Jak se vypořádat s dominantními defekty?
GT kmenových buněk nový gen kmenová buňka transfekce implantace diferenciace B-lymfocyt eozinofil makrofág T-lymfocyt bazofil neutrofil Všechny zralé buňky obsahují nový gen
Somatické nebo zárodečné buňky? Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací
Provedení genové terapie zahrnuje Vytvoření genetické informace (metodami rekombinantní DNA), která je určená pro transport do buněk Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena (in vivo, in vitro) Výběr vhodného vektoru Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací
Důsledky genové terapie 1) Zvýšení genové exprese efekt genové dávky 2) Usmrcení nemocných buněk 3) Usmrcení buněk za asistence imunitního systému 4) Cílená inhibice genové exprese 5) Cílená oprava mutace
Zvýšení exprese genu gen X Zvýšená tvorba produktu genu X buňky s deficiencí X - normální fenotyp X
Příklad
Usmrcení nemocných buněk gen T pro toxin Buňky zabité exprimovaným toxinem P T P T P T buňky s deficiencí gen P pro prodrug Buňky zabité léčivem
Usmrcení buněk za účasti imunitního systému gen pro antigen vystavení antigenu buňky s deficiencí produkce cytokinů buňky imunitního systému gen pro cytokin likvidace buněk
Cílená inhibice genové exprese antimediátorový gen Inhibice genové exprese buňky s deficiencí A A A Zablokování produkce patologického proteinu
Cílená oprava mutace gen X + gen X + gen X - Genová konverze buňky s deficiencí X - X + - X + - X + - Normální fenotyp
Transfer genů do buněk 1) Pomocí virů 2) Nevirový transfer
Transfer genů do buněk pomocí virů Savčí virové vektory Retrovirové vektory Adenovirové vektory Vektory viru herpes simplex Vektory adenoasociovaného viru
Retrovirus Signál obalování Replikace/integrace 5LTR y Gag Pol Env 3LTR Proteiny core Obalové proteiny
Vektor na bázi retroviru Signál obalování Exprese genu 5LTR y Marker Promotor Cizorodý gen 3LTR Identifikace/separace Opravný gen
Postup při genové terapii retrovirem
Genová terapie s adenovirovým vektorem
Vstup adenoviru endocytózou vazba na receptor plasmatická membrána invaginace rozpad vesikulu endosom jaderná membrána vstup do jádra
Transfer genů do buněk nevirový Endocytóza navozená receptory Transfer prostřednictvím lipozómů Přímý přenos DNA Bombardování částicemi
In vivo transfer lipozómy voda lipid fosfát voda lipidová dvojvrstva aniontové lipozómy kationtové lipozómy směs transfer fůze cílová buňka jádro
Příklady GT dědičných onemocnění Onemocnění Buňky Strategie ADA deficience T buňky, HSC ex vivo transfer genu ADA retrovirem Cystická fibróza Respirační epitel in vivo transfer genu CFTR retrovirem nebo lipozómy Familiální hypercholest erolémie Ledviny ex vivo transfer genu pro receptor LDL retrovirem Gaucherova choroba HSC ex vivo transfer genu GBA retrovirem
Příklady GT nádorů
Schválené postupy Deficience adenosindeaminázy první historicky úspěšný postup GT Familiální hypercholesterolemie, deficience LDLR retrovirový transfer do hepatocytů Cystická fibróza adenovirový transfer genu CFTR do epiteliálních buněk aerosol DMD chybí vhodný vektor
Etické aspekty genových terapií Bezpečnost manipulací Ověření na savčích modelech Hierarchické schvalování protokolu Nebezpečí vedlejších účinků GT zárodečných buněk Perspektivy GT
Nevýhody genové terapie Velmi vysoká finanční náročnost Technická a technologická náročnost Nízká úspěšnost terapie, pokud jsou problémy s "uchycením" vnášené genetické informace Náhodnost vložení genetické informace = narušení protoonkogenu, tumorsupresorového genu = maligní transformace buňky Genová terapie je eticky problematická
Září Znovuzrození v roce 2009? Přenos genů pro pigmenty vedl k restauraci barevného vidění u opic Říjen Přenos genů pro tvorbu protizánětlivých proteinů podpořil uchycení transplantovaných plic Listopad Léčba adrenoleukodystrofie HIV terapií u lidí Přenos genu blokujícího rozpad svalové hmoty u opic v budoucnosti léčba degenerativních svalových onemocnění?
Terapie adrenoleukodystrofie poškození lignoceroyl-coa-ligázy HSC s opraveným genem ABCD1 odbourávání tukových zásob vektor na bázi HIV s genem ABCD1 potomstvo HSC se šíří po celém těle HSC = kmenové buňky L. Naldini Science 326, 805-806 (2009)
Více svalové hmoty? Myostatin brzdí růst svalové hmoty Do svalových buněk makaka byl vnesen negativní regulátor myostatinu, lidský follistatin Jako vektor použit adenoasociovaný virus Důsledkem bylo ovlivnění svalové hmoty a malý vliv na jiné buňky Využití při léčbě svalových onemocnění? Kota J. et al. (2009): Follistatin Gene Delivery Enhances Muscle Growth and Strength in Nonhuman Primates. Sci Transl Med 11 November 2009
Více svalové hmoty? www.colorado.edu/intphys/class/iphy3730/image/myostatin
Schválena v červenci 2012 Určena k léčbě familiárního deficitu lipoprotein lipázy onemocnění se projevuje zvýšenými hladinami chilomikronů, částic (komplexů protein-lipid) přenášejících v krvi některé tuky je způsobeno defekty v genu pro lipoprotein lipázu, který zpracovává tuky z potravy pokud enzymu není v těle dost, nebo když nepracuje správně, dochází k dramatickému zvýšení hladin tuku v krvi
vnáší do těla nemocného funkční kopii genu pro lipoprotein lipázu gen je přenášen vektorem na bázi adenoasociovaného viru serotypu 1, který se váže na receptory svalových buněk Glybera je aplikována jednorázovou sérií intramuskulárních injekcí do nohy odstraňování chylomikronů FFA = free fatty acids
Budoucnost genové terapie Záchrana života pacientů s těžkými genetickými chorobami či rakovinou Zpříjemnění života mnoha dalším lidem, jejichž choroba sice není natolik závažná, ale stejně jsou odkázáni na podpůrnou terapii Nutné vymezení hranice mezi tím, na co je ještě etické genovou terapii použít a na co už ne Budou v budoucnosti "děti na objednávku"? Budeme si moc určit barvu očí, vlasů či výšku našich dětí? Dočkáme se éry superlidí? Stane se z genové terapie takový obchod, jakým je dnes třeba plastická chirurgie? Vylepšení genomu na objednávku a jen pro majetné by bylo vyložené pošlapání současných nadějí
Kde se dozvím více? European society of gene and cell therapy http://www.esgct.eu/ American society of gene and cell therapy http://www.asgct.org/ Stránky HUGO http://www.ornl.gov/sci/techresources/huma n_genome/medicine/genetherapy.shtml
Shrnutí přednášky 1. Definice genové terapie 2. Typy a strategie genové terapie 3. Principy genového přenosu 4. Základní technologie genové terapie 5. Způsoby přenosu genů 6. Příklady využití genové terapie 7. Budoucnost genové terapie