MS - historie a současnost Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Spřažené metody pro analýzu léčiv N 402062 GC MS Pavel Zachař
Hmotnostní spektrometrie Vývoj hmotnostní spektrometrie instrumentace EI spektra vznik, principy Interpretace EI spekter
Doporučená literatura H.C.Hill: Introduction to Mass Spectrometry, Heyden & Son Ltd, London 1972 Spektroskopická společnost JMM: Organická hmotnostní spektrometrie, studijní materiál 4. školy hmotnostní spektrometrie, Praha 1996 Fred W. McLafferty, František Tureček: Interpretation of Mass Spectra, University Science Books, California 1993 Fourth Edition Terrence A. Lee:A Beginner s Guide tomass Spectral Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester1998 - Reprinted 2003
Doporučená literatura - pokračování Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant: Mass Spectrometry, Principles and Applications, John Wiley & Sons, Chichester, Second edition 1999, Reprinted 2002 Budzikiewiczh., Djerassi C., William D.H.:Interpretation of Mass Spectra of Organic Compounds - ruský překlad, ústav 342 McLafferty F.W.: Interpretation of Mass Spectra (N.Y.1967) ústav 342 Bohm S., Smrčková Voltrová S.: Strukturníanalýza organických sloučenin, VŠCHT
Hmotnostní spektrometrie Vývoj MS, instrumentace
Základy pro vznik MS Druhá polovina 19. století: intenzivní studium elektřiny a magnetismu studium elektrických výbojů ve zředěných plynech mechanické vývěvy Sprenglerovy a Töplerovy (10-3 Torr) 1858 objev katodových paprsků (1897: jsou to elektrony) 1883 thermoemise tepelná emise elektronů a iontů 1886 anodové ( kanálové ) paprsky kladně nabité částice (E. Goldstein při studiu výbojů v plynech)
Počátky MS 1898 Wilhelm Wien, NP 1911 Emil Wiechert zakřivení dráhy anodových (kanálových) paprsků, tj. urychlených kladných částic iontů, v elektrickém a magnetickém poli: Wienův filtr vzájemně zkřížená pole (B,E) napříč k pohybu nabité částice umožní zachování přímé dráhy jen iontu určité hmotnosti při změnách elektrického pole zachovají přímý směr částice různé hmotnosti
Vlastnosti příčného magnetického pole Lorentzova síla F = q. (v x B) Flemingovo pravidlo levé ruky Rovnováha odstředivé síly (částice m, rychlosti v) a síly dostředivé (Lorentzovy) způsobí kruhový pohyb (r) m v 2 / r = q.v.b r = m.v / ze. B
Dispersní vlastnosti magnetického pole Dispersní vlastnosti optického hranolu
Fokusační vlastnosti spojnéčočky Fokusační vlastnosti magnetického pole
Joseph John Thomson 1910 - parabolový spektrograf - záznam na foto. desku vzájemně rovnoběžná pole B a E, příčná k pohybu iontu Thomsonovy paraboly částice mající stejný specifický náboj a různou rychlost 1913 důkaz existence izotopů 20 Ne, 22 Ne první důkaz existence izotopů neradioaktivních prvků
Joseph John Thomson - otec MS Benjamin Thompson, hrabě Rumford: 1753-1814, termodynamika Thomas Thomson: 1773-1852, Skot, lékař a chemik pedagog William Thomson, lord Kelvin, 1824-1907, Skot, kalorimetrie - absolutní teplota, Joule- Thomsonův jev, zrcátkový galvanoměr, transatlantický kabel Joseph John Thomson, Sir: 1856-1940, objev elektronu, částicová fyzika, NP 1906 Cavendishova laboratoř (Cambridge), Aston, Záviška Georg Paget Thomson, Sir: 1892 1975, syn J.J., difrakce elektronů, NP 1937
B a E rovnoběžné
Joseph John Thomson 1912 - parabolový spektrometr - Faradayova klícka, elektrometr, postupná registrace iontů zjištění existence fragmentových iontů význam až za 50let! Rays of Positive Electricity and Their Application to Chemical Analysis
butan
Francis William Aston GB, 1877 1945, NP- chemie: 1922 1919 hmotový spektrograf zdroj iontů: výbojová trubice rozptyl rychlosti částic rychlostní fokusace příčné elektrické pole disperse a směrová fokusace konstantní magnetické pole detekce fotografická deska hmotové spektrum záznam všech dopadajících iontů najednou
Arthur Jeffrey Dempster USA, 1886 1950 1918 hmotový spektrometr zdroj iontů: thermoionisace malá rychlost iontů podélné elektrostatické pole (proměnné) uděluje stejnou rychlost iontům (původní zanedbatelná) magnetické pole (konstantní) směrová fokusace rozbíhavého svazku iontů, disperse iontů dle efektivní hmotnosti m/z.e konstantní výstupní štěrbina elektrometrická detekce - závislost náboje (proudu) na parametrech B a E
Dempster konstantní B, proměnné E dnešní přístroje konstantní E, proměnné B Rovnice spektrometru m / ze = r 2. B 2 / 2U m/ze - efektivní hmotnost
jednotlivé body dopad iontů při daných parametrech B a E
Vývoj a využití MS 2. etapa 20. a 30. léta 20. století stanoveny stabilní isotopy všech prvků (MS jediná známá metoda stanovení izotopů neradioaktivnívh prvků) spektrografy přesné stanovení hmotností spektrometry stanovení zastoupení isotopů (společný název spektroskopie) 1935 Aston: MS se vyčerpala, nepřinese nic nového
Další vývoj MS 3. etapa 40. léta: fragmentace organických molekul Fragmentové ionty charakteristické, slouží k identifikaci. petrochemie - nízké ropné frakce (letecký benzin) fingerprint porovnání bez porozumění spektru typová analýza skupinové zastoupení uhlovodíků (alkany, alkeny, uhlovodíky větvené, aromatické,...) naftařské koncerny komerční přístroje (během 10 let bylo vyrobeno 100 přístrojů)
3. etapa - pokračování 50. a 60. léta MS organických látek - čisté látky! ionizace EI, fragmentace molekul, teorie a mechanismus reakcí iontů v plynné fázi, ionizační potenciály látek, teorie fragmentace org. molekul, metastabilní ionty (J.Hipple 1947) V předchozí etapě fyzikové - konstruktéři V této etapě nastupuje nová generace pracovníků - chemiků spojení fyzikální + organické chemïe
Osobnosti organické hmotnostní spektrometrie J. Beynon (ICI - Imperial Chemical Industries, GB) K. Biemann (Massachussets Institute of Technology, USA) H.Budzikiewicz (Universität zu Köln, BRD) C.Djerassi (Stanford University, USA) F.W.McLafferty (Cornell University, Ithaca, USA) H.Kienicz, D.H.Williems,... Djerassi: MS vývoj ukončen, aplikační možnosti vyčerpané!?!
Hmotnostní analyzátory jednofokusační MS nízké rozlišení Dempsterova konstrukce rychlostní fokusace: podélné E dnes konstantní směrová fokusace a disperse: příčné B dnes proměnné rovnice spektrometru m/z.e= r 2. (B 2 /2U) (m/z.e...efekt. hmot.) m/z=(r 2 /2U). B 2 =konst.b 2 dvoufokusační MS vysoké rozlišení (elementární složení) odstranění chromatické vady filtr energií, příčné elstat. pole konstrukce: 1934 Mattauch- Herzog fokus. pro všechny m/z 1953 Nier Johnson fokusace pro jednu hmotu další konstrukce: Matsuda a inversní uspořádání
Typy hmotnostních analyzátorů Statické MS stanoven 1 ion při konstantním magnetickém (resp. i elektrostatickém poli) Dynamické MS k stanovení 1 iontu nutná proměnná vysokofrekvenční eltr. pole (nemusí být magnetické pole) 1899 Wiechert, Kirchner metoda dvou kondenzátorů první dynamický analyzátor hmot
Dynamické analyzátory - 1: A. Selektivní urychlovače (a decelerátory- zpomalovače) 1. lineární - van de Graffův urychlovač aj. 2. lineární periodické (kmitavý oscilační pohyb)- paletron aj. 3. rotační periodické: (+ příčné magnetické pole)- cyklotron aj. B. Průletové analyzátory (TOF time of flight) 1. lineární nemagnetické 2. cyklické magnetické (prostorová spirála)
Lineární průletový analyzátor (TOF) s iontovým reflektorem
Dynamické analyzátory 2: C. Systémy se stabilní drahou (1 iontu - ostatní nestabilní): 1. W.R.Smythe, J.Mattauch (1932) 1. nemagnetický MS vysokofrekvenční filtr rychlostí (kondenzátor) elektrostatický filtr energií (cylindr) 2. Kvadrupólový hmotnostní filtr W.Paul, H.Steinwedel (1953) W.Paul, H.P.Reinhard, U. von Zahn (1958) 4 souosé parabolické (kruhové) tyče superpozice statické a vf. složky napětí U+V o cosωt není citlivý na rozptyl počátečních energií
Kvadrupólový hmotnostní filtr
Dynamické analyzátory 3: Systémy se stabilní drahou pokračování 3. Iontová past ITD trojrozměrný kvadrupól hyperboloidní prstenec, 2 hyperboloidy W. Paul (1953) počátky iontově selektivní detekce (1953 1962) selektivní uchovávání iontů (1968 1982) selektivní vypuzování iontů (od r. 1984) velká citlivost (pg, fg)
Iontová past
Hmotnostní analyzátory využití Jaderná fyzika studium elementárních částic (CERN 1954 Evropská laboratoř pro fyziku částic 6,5tis. vědců, 500 universit, 80 národností; urychlovač - kruh 27 km) selektivní urychlovače průletové analyzátory Organická hmotnostní spektrometrie: statické hmotnostní spektrometry (magnetický sektor) kvadrupólový hmotnostní filtr iontová past TOF - lineární průletové analyzátory
Spojení GCMS 4. etapa vývoje J.C.Holmes, F.A.Morrel (1957) podmínky spojení GC a MS: srovnatelné nároky na množství vzorku rychlost snímání MS srovnatelná s šířkou píku GC limitující faktor GC těkavost limitující faktor MS rychlost snímání a záznamu spektra (sektor kvadrupól) GC atmosférický tlak...x...ms vakuum: náplňové kolony separátory kapilární kolony přímé spojení
Becker- Ryhageho separátor
Spojení GC-MS 20 let (šedesátá až osmdesátá léta) jediné spojení separačních metod a spektrální identifikace využití analýza bohatých přírodních i průmyslových směsí organických látek, stopová znečištění produktů - farmaceutický průmysl, toxikologie, potravinářství
70. 80. léta spojení kvadrupólový hmotnostní filtr a GC zrychlení analýzy (proti sektorovému MS) - výhodné spojení s kapilární GC zmenšení přístrojů, zlevnění rozšíření do praxe ITD - iontová past snížení požadavků na množství analytu pg, fg výhodné využití pro stopovou analýzu ve spojení GC MS analytika životního prostředí
Spojení HPLC-MS 5. etapa Hlavní podmínka spojení HPLC-MS: nutnost redukce velkého objemu plynné fáze po odpaření kapalné mobilní fáze (redukce tlaku pro MS bez ztráty citlivosti přístroje) Baldwin, McLafferty (1973) McFadden a spol.(1976) pohyblivý pás Další vývoj vyžadoval nové ionizační techniky
Stávající ionizační techniky - přehled Původní způsoby ionizace EI v plynné fázi ( tvrdá ionizační technika) termoionizace jiskra, oblouk FD a FI desorpce a ionizace polem CI chemická ionizace ( měkká ionizační technika ) Munson, Field (1966) Barber (1982) FAB Fast Atom Bombardment
Nové ionizační techniky pro HPLC-MS Blakley, Vestal (1983) thermosprej (TSI) prudké odpaření vzorku, FD, CI/EI Willoughby, Browner (1984) particle beam zmlžení mobilní fáze heliem, odpaření teplem, tryskový separátor, odsátí mobilní fáze do vakua Fenn (1984) elektrosprej (ESI) vysoké napětí mezi tryskou a pláštěm, kapky vystřikovány proti proudu dusíku - není topeno Využití: analýza tepelně labilních látek a velkých molekul, které nejsou spojením GC MS analyzovatelné (cukry, peptidy) expanze MS do biochemie, medicíny aj.
Další ionizační techniky 6. etapa MS MALDI - Hillenkamp, Karas (1989) ve spojení s TOF Matrix Asisted Laser Desorption and Ionisation UV (IČ) pulsní laser, molekuly analytu v matrici dostatečně separovány, není intermolekulární působení, analýza velkých (i termolabilních) molekul, možné spojení s TOF (velké molekuly delší doba letu) Nové oblasti využití: analýza biologických materiálů polypeptidy, bílkoviny sekvence aminokyselin (DNA aj.)
Vývoj nových analyzátorů pokračuje Analyzátory iontové mobility analyzátor iontové mobility umožňuje rozlišit ionty na základě velikosti, tvaru, náboje a hmotnosti využívá rozdílů pohyblivosti iontů v oblasti s el. polem v inertním plynu (asi 10-3 Pa)
Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS a MS n analýza) Pro MS/MS, tj. MS 2 musíme mít za sebou tři kvadrupóly: QqQ nebo QqTOF první kvadrupól (Q) slouží jako filtr pro výběr určitého iontu hmotnostního spektra získaného v iontovém zdroji rozpadem ionizované molekuly druhý kvadrupól (q) slouží jako kolizní cela pro srážky s inertním kolizním plynem, čímž dojde k dalšímu definovanému rozpadu tohoto iontu (na tento kvadrupól je zavedeno pouze střídavé napětí a je naplněn kolizním plynem) třetí kvadrupól (Q) nebo TOF - slouží jako analyzátor pro záznam hmotnostního spektra získaného rozpadem vybraného iontu
Qq Q
QqTOF
GC-MS/MS TripleQ (QQQ) Technika GC-MS/MS 3Q je určená pro analýzu stopových koncentrací nečistot v komplikovaných matricích. Hlavní uplatnění proto nachází při analýze stopových kontaminantů v potravinách, v analýze biologických vzorků, vzorků extrahovaných z pevných matric apod. Pro analýzu těchto typů vzorků předurčuje trojitý kvadrupol jeho schopnost vybrat z komplikované směsi iontů pouze jeden zvolený iont a ten následně rozštěpit v kolizní cele ("druhém kvadrupolu") a výsledek této fragmentace analyzovat pomocí třetího kvadrupolu. Tento proces dramaticky sniží šum základní linie a zvýší tak poměr signál/šum (S/N=citlivost). Přestože absolutní úroveň signálu je ve srovnání s jednoduchým kvadrupolem nižší (složitější dráha iontu do detektoru), odstranění šumu je u komplikovaných vzorků tak významné, že výsledná citlivost (S/N) je několikanásobně vyšší než u jednoduchého kvadrupolu. Základem kvalitního kvadrupolového analyzátoru jsou elektrodové tyče hyperbolického průřezu. Výsledkem je stabilní RF pole, které umožňuje vysokou propustnost iontů (positivně ovlivní citlivost) a stabilní trajektorii iontů (zvýší rozlišení).
Využití MS Minimalizace rozměrů detektory netěsností, specifické detektory (Ion Mobility Spectrometry)-armáda, kosmos Maximalizace rozměrů tandemové přístroje (MS n ) studium fragmentace organických látek, nanosekundových dějů aj. Oblasti využití MS a spojení MS a separačních technik: fyzika elementárních částic, anorganická chemie, geologie, speciační analýza prvků, organická chemie, farmacie, potravinářská chemie, zemědělství, chemický průmysl, petrochemie, odpadové hospodářství, stopová analýza, analytika ŽP, zdravotnictví, biochemie, proteomika
Dnes nejužívanější techniky v chemii GC MS EI/CI: běžné těkavé tepelně stálé organické látky strukturní informace, srovnání s knihovními spektry HPLC MS ESI/APCI: velké (nevypařitelné) a tepelně labilní molekuly, šetrná ionizace biochemie MALDI TOF: proteomika ICP MS: prvková analýza (spojení s GC/HPLC speciace) GC /LC MS 3Q (QqTOF): ultrastopová, především kvantitativní, analýza ve všech oborech (potraviny, léčiva, biologické materiály, životní prostředí aj.), zejména při zpracování vzorků z komplikovaných matric
Československá hmotnostní spektrometrie 50. léta nákladné přístroje ještě neovlivňovaly úroveň 1953 první čs. MS vlastní konstrukce, srovnatelný se světem (USA, GB aj.) Ústav fyzikální chemie ČSAV V.Čermák, V.Hanuš, Č.Jech, J.Cabicar; později Z.Dolejšek, Z.Herman V.Čermák iontově molekulové reakce, Peningovská ionizace V.Hanuš nestor čs. MS organická MS MS alkaloidů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR ÚFCH ČSAV (1954-1957) První využití - izotopická analýza 15 N/ 14 N biologických experimentů - analýza vzácných plynů, čistota vzácných plynů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR ÚFCH ČSAV (1954-1959) přístroj Nierova typu R = 152 mm m/ m 130-200 spektrum isotopů Hg (prosinec 1953)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR DEMPSTEROVA TYPU Zdeněk Dolejšek: diplomová práce 1956-57 - úhel odklonu 180 0 v permanentním magnetickém poli - m/ m 30
1973 JEOL JMS-D100 m/ m > 10 000 VLADIMÍR HANUŠ 1973-87 František Tureček 1987 92 Martin Smrčina 1992 - M. Polášek Objasňování struktury organických a bioorganických látek chemie (K. Mach organometal.komplexy) biologie (přírodní produkty) medicina (metabolity) farmacie (syntéza léčiv) toxikologie (klinické případy)
Československá hmotnostní spektrometrie 1967 8x MCH 1303 (130, 1306), 2xAtlas, 1x Jeol VŠCHT Praha MCH 1303 (SSSR) LKB 9000 (Švédsko) 1. GCMS v ČSR ÚMCH ČSAV, FCHT VUT Bratislava AEI MS 902 (dvoufokus.) 1978 v ČSR 44 přístrojů 2000: 18 th International Meeting on MS (F.W. McLafferty-N.Y., F.Turecek Washington)