MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOCHEMIE Molekulová podstata chřipkových virů Bakalářská práce Brno 2006 Markéta Melicharová

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně, jen s využitím informačních zdrojů uvedených v kapitole Literatura. Markéta Melicharová 2

Děkuji paní RNDr. Michaele Wimmerové, Ph.D. za vedení mé bakalářské práce, za odbornou konzultaci a všestrannou pomoci při řešení problémů. Děkuji svým rodičům za jejich neustálou podporu. 3

Obsah 1. Úvod a cíle práce..6 2. Viry..8 2.1. Obecné vymezení pojmu 8 2.2. Klasifikace a dělení virů.8 2.3. Struktura virových částic...8 3. Chřipka...10 3.1. Obecné vymezení chřipkového onemocnění...10 3.2. Patogeneze chřipky 10 3.3. Klinické příznaky chřipky 10 4. Orthomyxoviry (viry chřipky)...11 4.1. Klasifikace Orthomyxovirů..11 4.2. Společné znaky orthomyxovirů 11 4.3. Molekulární struktura virionu.12 4.3.1. Povrchové antigeny virů chřipky...15 4.3.2. Vnitřní antigeny virů chřipky 16 5. Životní cyklus chřipkových virů.18 5.1. Vztah viru a hostitelské buňky.18 5.2. Adsorpce viru na hostitelskou buňku..18 5.3. Penetrace viru do buňky...20 5.4. Reprodukce chřipkových virů..21 5.5. Molekulární mechanismus exprese genomu chřipkových virů..23 5.5.1 Transkripce...23 5.5.2 Translace...23 4

6. Variabilita chřipkových virů v souvislosti s jejich epidemickým šířením.24 6.1. Zdroje variability virů chřipky...24 6.2. Antigenní zvrat (antigenní shift)..24 6.3. Antigenní posun (antigenní drift) 25 7. Závěr...27 8. Zkratky...30 9. Literatura...31 5

1. Úvod a cíle práce Viry jsou nebuněčné nukleoproteinové částice. Řadí se mezi tzv. intracelulární (vnitrobuněčné) parazity a způsobuji rozmanitá onemocnění rostlin, hub a živočichů člověka nevyjímaje. Mezi virová onemocnění rostlin patří například vřetenovitost bramborových hlíz, zakrnělost chmele, bledost okurek, mozaiková onemocnění tabáku a další. Živočišné viry způsobují kulhavku a slintavku hovězího dobytka, vzteklinu lišek, myxomatózu králíků, mor u drůbeže, opičí a kravské neštovice, koňskou encefalomyelitidu a další. U člověka jsou viry původci dětské obrny, rýmy, chřipky, spalniček, příušnic, zarděnek, klíšťové encefalitidy, oparu, pásového oparu, planých neštovic, hepatitidy A, B, C a E, AIDS (= syndrom získané imunodeficience, způsobené viry HIV) a dalších. Je prokázáno, že některé virové infekce patří k významných rizikových faktorů při vzniku maligního bujení. Problematika virů je tedy středem zájmu mnoha disciplin. Výzkumy v oblasti virologie jsou nezbytné pro humánní a veterinární medicinu, imunologii, farmakologii, biotechnologii, zemědělství a ekologii. Přičemž se hojně využívá schopnosti virů přenášet nerůznější makromolekuly mezi buňkami a možnosti modifikace genomu buňky. Po úvodním představení virů a jejich základním členěním se v mé bakalářské práci se zaměřím na viry chřipky. Viry chřipky jsou zařazeny do oddělení Orthomyxoviridae, kde rozlišujeme rody Influenza virus A, B a C, přičemž Influenza virus A je nejčastěji se vyskytujícím a nejvíce infekčním rodem. Infekce chřipkovými viry vyvolá u člověka chřipku, což je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí. Viry chřipky patří mezi tzv. obalené živočišné RNA viry. Poté popíši jednotlivé fáze životního cyklu chřipkových virů. Pro viry, jakožto intracelulární parazity je životně nezbytný hostitel. Přirozenými hostiteli jsou kromě člověka vepř, kůň, domácí a divoce žijící ptactvo, někteří mořští savci (lachtani, velryby). Aby se viry mohly reprodukovat, musí nejprve infikovat hostitelskou buňku a poté se díky jejímu translačnímu systému mohou množit. Prvním nezbytným krokem a předpokladem infekce buňky virem je adsorpce (= přilnutí) viru na 6

hostitelskou buňku. Úspěšná adsorpce je závislá na povrchových proteinech virové částice a na receptorech hostitelské buňky. Druhým krokem je penetrace (= proniknutí) viru do buňky. Penetrace se u chřipkových virů děje endocytózou za účasti mnoha proteinů. Třetím krokem je exprese virového genomu, ke kterému dochází v jádře hostitelské buňky (transkripce, translace). Klíčovým enzymem je virová RNA-dependentní-RNA-polymeráza. Během vlastní reprodukce viru dochází k syntéze virových bílkovin, k replikaci virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a uvolňování z buňky, tj. eluci. Na závěr se zmíním o ohromné variabilitě chřipkových virů, která je způsobena především jejich segmentovaným genomem. Epidemie chřipky, které mohou přejít až v pandemie, jsou obvykle spojeny s tzv. antigenním zvratem (= antigenní shift). Nejzávažnější zaznamenanou chřipkovou pandemií v lidské populaci byla tzv. Španělská chřipka, která v letech 1918/1919 způsobila smrt 20 milionů lidí. Dalším, zato méně závažným zdrojem variability je antigenní posun (antigenní drift). Velkým pokrokem pro vědu a výzkum, zabývající se chřipkovými viry bude objasnění a vysvětlení molekulárního mechanismu adsorpce (identifikace receptorů, jejich struktura, vazebné schopnosti), vstupu viru do buňky skrze buněčné membrány a dalšího působení virové částice v infikované buňce. Tato bakalářská práce má na základní úrovni shrnout dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech životního cyklu chřipkových virů. 7

2. Viry (1, 2, 3) 2.1. Obecné vymezení pojmu Viry jsou nukleoproteinové (NP) částice o rozměrech 25 400 nm, vyznačující se schopností infikovat hostitelskou buňku a v ní se reprodukovat v závislosti na jejím translačním systému. S živými organismy viry spojuje pouze jediná vlastnost, a to že mají genetický kód pro vlastní replikaci. Genetická informace virů je zapsána vždy jen v jediném typu nukleové kyseliny. Podle toho dělíme viry na DNA a RNA viry. V genomu viru nejsou geny pro rrna a trna ani strukturní geny kódující ribozomové proteiny, z čehož vyplývá, že syntéza virových proteinů je zcela závislá na translačním systému hostitelské buňky. (Viry se nemnoží, ale jsou pomnožovány hostitelskou buňkou). Patří mezi obligátní intracelulární parazity. 2.2. Klasifikace a dělení virů Oddělení Viry (Vira) spadají do Říše: Nebuněční (Subcellulata), taxonomicky jsou utříděny do čeledí, rodů a jednotlivých druhů rodu. Příslušníci jednotlivých čeledí mají stejný typ nukleové kyseliny, stejné uspořádání virionu a stejnou strategii replikace. Názvy čeledi jsou charakterizovány příponou viridae. Rody zahrnují příslušníky čeledi více či méně antigenně příbuzné. Názvy rodů jsou charakterizovány příponou virus. Jednotlivé druhy virů příslušející do stejného rodu se liší svými biologickými vlastnostmi. Podle typu hostitelské buňky dělíme viry na viry bakterií (tzv. bakteriofágy) a eukaryotické viry. Podle typu hostitele můžeme rozlišovat viry živočišné a rostlinné. Podle typu nukleové kyseliny dělíme viry na RNA a DNA viry. Podle toho, zda mají či nemají kolem kapsidu lipoproteinový obal, rozlišujeme viry obalené, resp. neobalené. 2.3. Struktura virových částic Virová částice, která je schopna infikovat hostitelskou buňku, se nazývá virion. Nejdůležitější složkou virionu je nukleová kyselina (DNA nebo RNA), která obsahuje 8

genetické informace nezbytné pro realizaci reprodukce viru. Nukleová kyselina má funkci genoforu (= nosiče genů), u převážné většiny představuje celý genom viru. Genom může být buď cirkulární nebo lineární. U DNA virů je zpravidla tvořen dvěma komplementárními vlákny, u RNA virů jediným (+ nebo -) vláknem. V obou případech však existují výjimky (viz. Tabulka1). RNA s pozitivní polaritou (+RNA) má povahu informační RNA (irna) a může být přímo překládána na ribozomech hostitele do příslušných polypeptidů. RNA s negativní polaritou (-RNA) je přepisována do informační podoby virovou RNA-polymerázou, která je součástí virionu. U některých virů není genom souvislý, ale je tvořen separátními segmenty. Kolem nukleové kyseliny virového genomu se tvoří proteinový obal, zvaný kapsid. Tento (deoxy)ribonukleoproteinový komplex se označuje též jako nukleokapsid. Virové kapsidy se vyznačují symetrickým uspořádáním. Nejobvyklejším typem symetrie je symetrie helikoidální nebo kubická. U řady virů reprezentuje nukleokapsid kompletní virion, takový virion označujeme jako neobalený (nahý). Tzv. obalené viry mají kromě kapsidu ještě další lipoproteinový obal, který je tvořen lipidovou dvojvrstvou hostitelského původu, kterou se kapsid obalí při postupu skrze membrány hostitelské buňky. Tabulka 1: Názvy hlavních skupin virů podle typu jejich genomu (1) Typ virového genomu Označení skupiny virů s příslušným genomem dsdna lineární nebo kružnicová dsdna-viry ssdna lineární nebo kružnicová ssdna-viry dsrna dsrna-viry Pozitivní ssrna +ssrna-viry Negativní ssrna -ssrna-viry RNA určená ke zpětné transkripci v hostitelské buňce do DNA, Rna-viry s reverzní jejíž kopie po replikaci slouží jako matrice pro syntézu virového transkriptázou RNA-genomu DNA určená k transkripci v hostitelské buňce do RNA jako DNA-viry s reverzní matrice pro zpětnou transkripci do DNA opět s funkcí virového transkriptázou genomu 9

3. Chřipka (2) 3.1. Obecné vymezení chřipkového onemocnění Chřipka je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí způsobené chřipkovými viry. Viry chřipky se přenášejí kapénkovou infekcí (vzdušnou cestou). Nakažlivost, zejména virem chřipky A (viz kap. 4.1.), je vysoká. 3.2. Patogeneze Místem primárního pomnožení virů je sliznice dýchacích cest. Virová neuraminidáza snižuje viskozitu ochranného hlenu a umožňuje virionům přístup k receptorům vnímaných buněk. Množení viru vede k rozvoji zánětlivého infiltrátu, edému a destrukci sliznice. Typická pro chřipku je tracheobronchitida (zánět průdušnic a průdušek). Nejčastější komplikace chřipky jsou způsobeny sekundární bakteriální invazí rozrušených sliznic. Přidružená infekce je nejčastěji vyvolávána patogenními stafylokoky. Výjimečně, při rozsáhlém postižení pneumocytů (primární chřipková pneumonie), může porucha oxido-redukčních funkcí způsobit náhlou smrt postižené osoby. Při neletálním průběhu onemocnění se stav nemocného postupně v průběhu 5-16 dnů zlepšuje. Nejvážnější důsledky může mít chřipka u osob imunologicky oslabených (malých dětí, chronicky nemocných, osob starších sedmdesáti let a těhotných žen). 3.3. Klinické příznaky Po jednom až třech dnech inkubační doby dochází k vzestupu tělesné teploty, provázené bolestmi hlavy, svalstva, končetin, zad a očí. Vysoká horečka, rýma, zduřená nosní sliznice a suchý kašel jsou nejčastější symptomy. Nekomplikované onemocnění trvá 3 7 dní. Kašel a pocity slabosti trvají 1 2 týdny. Přidruží-li se sekundární bakteriální infekce, onemocnění trvá déle a je doprovázeno hnisavou rýmou a mukopurulentní expektorací. U dětí do pěti let může být onemocnění komplikované zánětem středního ucha, bronchitidou nebo bronchopneumonií. U dospělých je nejčastější komplikací bronchitida a bronchopneumonie. Výše uvedené klinické příznaky provázejí infekce viru chřipky typu A i B. Virus chřipky C vyvolává lehké infekce horních cest dýchacích převážně u dětí. 10

4. Ortomyxoviry 4.1. Klasifikace Ortomyxovirů (1) Viry způsobující chřipku spadají do oddělení Orthomyxoviridae (Ortomyxoviry), kde rozlišujeme dva rody. Rod Influenza virus A, B sem patří virus influenzy A (virus chřipky A), který způsobuje chřipku u člověka a onemocnění dýchacích cest koní, ptáků a prasat. Influenza virus B (virus chřipky B) způsobuje chřipku jen u člověka. Rod influenza virus C, kam patří virus influenzy C (virus chřipky C), způsobuje chřipku u člověka, většinou u dětí. Obr. 1: Influenza virus A (4) 4.2. Společné znaky Ortomyxovirů (1, 3) Ortomyxoviry jsou živočišné RNA viry. Jejich genom tvoří lineární jednořetězcová negativní segmentovaná RNA (-ssrna viry). Jejich viriony jsou obalené, kulovitého tvaru o průměrné velikosti 120 nm. 11

Za negativní genomovou RNA (-RNA) viru se považuje taková genomová RNA, která se přepisuje do RNA s funkcí mrna a replikuje do RNA s funkcí antigenomu, obě RNA mají vzhledem k negativní genomové RNA opačnou orientaci fosfodiesterových vazeb. Jako antigenom se pak označuje pozitivní RNA, která slouží jako matrice pro replikaci do negativní RNA s funkcí genomu, přičemž pozitivních RNA při této replikaci se využívá ve funkci mrna. 4.3. Molekulární struktura virionu (1, 5) Ortomyxoviry mají nukleokapsid obalený lipoproteinovou dvojvrstvou hostitelského původu, kterou se obalí při prostupu skrze membrány hostitelské buňky. Viry chřipky mají tři základních typy membránových proteinů, a to hemaglutinin (HA), neuraminidázu (NA) a M-proteiny (M2). (Rod Influenza C virus má pouze jeden jednoduchý membránový protein typu hemaglutininu HEF (Hemagglutinin-esterasefusion protein). Na vnitřní straně lipoproteinové dvojvrstvy jsou molekuly matricového typu (M-proteiny, M1), které vážou obal k nukleokapsidu. Na vnější straně obalu ční výběžky tvořené biologicky aktivními glykoproteiny, jejichž součástí jsou také hemaglutininy (HA, HEF), neuraminidáza (NA) a případně další transmembránové proteiny (BM2, CM2). V nukleokapsidu se nachází segmentovaný genom viru tvořený negativní RNA, který je obklopen membránovým obalem. U virů chřipky A a B je genom rozdělen do 8 segmentů, viry chřipky C mají genom rozdělen do 7 segmentů. Každý segment většinou kóduje jeden protein (viz. Tabulka 2). Na každý segment se vážou molekuly nukleokapsidového proteinu (NP-proteinu). Na 3 -konec segmentů se váže RNAdependentní-RNA-polymeráza, která sestává z proteinů PB1, PB2 a PA případně z P1, P2 a P3. V nukleokapsidu se dále nacházejí v malém množství nestrukturální proteiny (NS1, NS2). 12

Tabulka 2: Proteiny kódované segmenty v genomu chřipky A, B a C (1) Segment Virus chřipky A Virus chřipky B Virus chřipky C 1 PB2 PB1 P1 2 PB1 PB2 P2 3 PA PA P3 4 HA HA HEF 5 NP NP NP 6 NA NA, NB CM2 7 M1, M2 M1, BM2 NS1, NS2 8 NS1, NS2 NS1, NS2 - Nejběžněji se vyskytujícím a také nejinfekčnějším virem chřipky je Influenza virus A. Struktura jeho virionu patří mezi nejlépe prostudované. Proteiny virionu Influenza viru A a jejich funkce je pro úplnost shrnuta v Tabulce č. 3. Tabulka 3: Proteiny kódované segmenty genomu viry chřipky A a jejich funkce (6) Číslo segmentu a Funkce kódovaný protein 1. PB2 2. PB1 Komplex tří proteinů (PB2, PB1, PA) zajišťuje virovou replikaci a 3. PA (proteiny virové transkripci. Replikují virovou RNA v komplexu s NP. PB2 vykazuje při replikaci specifitu vůči hostiteli. RNA-dependentní- RNA-polymerázy 4. Hemaglutinin Hemaglutinin zajišťuje vazbu viru na receptory kyseliny sialové (HA) (SA). Navozuje vstup viru do buňky endocytózou a způsobuje fůzi virového obalu a endosomální membrány. Díky specifické sekvenci a struktuře HA řídí specifické navázání k SA. Aby HA navodil fůzi, musí být nejprve proteolyticky rozštěpen. Významným úkolem HA je neutralizovat imunitní odpověď, změny struktury HA mají za následek vyhnutí se imunitní odpovědi. 13

5. Nukleoprotein (NP) 6. Neuraminidáza (NA) 7. M-proteiny (M1, M2) 8. Nestrukturální proteiny (NS1/NS2) Zastává roli v řízení replikace virové RNA v komplexu s PB2, PB1 a PA Enzym, který štěpí terminální sialové kyseliny z glykoproteinů buněčného povrchu a také z glykokonjugátů virového původu. Specifita NA k jednotlivým typům vazeb kyseliny sialové a aktivita neuraminidázy muže být variabilní a závisí na mutacích ve vazebném místě a délce spojovací části, která ji drží na membráně. Odštěpení kyseliny sialové z hemaglutininu zabraňuje agregacím virionů. NA je cílem imunitní odezvy, existuje několik antigenních variant. M1: Řídí transport virových ribonukleoproteinových komplexů do jádra a z jádra. Napomáhá zrání ribonukleoproteinového komplexu (RNP) v plasmatické membráně během výstavby virionů. M2: Funguje jako iontový kanál skrz který vstupují H + do virionu, navodí tak M/NP disociaci, což umožní ribonukleoproteinovému komplexu (RNP) dostat se do jádra. Moduluje ph Golgiho aparátu a umožňuje molekulám HA, které jsou na kyselé prostředí citlivé, prostoupit buněčným povrchem neporušeně. NS1: Váže a odděluje RNA, brání aktivaci proteinkinázy A a zabraňuje buněčné apoptóze. NS2: Je zapojený v jaderném exportu virových RNP 14

Obr. 2: Struktura virionu chřipky A (1) 4.3.1. Povrchové antigeny viru chřipky (1, 7) Jak již bylo zmíněno výše, povrchovými antigeny virů chřipky jsou hemaglutinin (HA) a neuraminidáza (NA). Kombinace subtypu hemaglutininu se subtypem neuraminidázy charakterizují příslušný kmen viru (např. H3N1) a podmiňuje rozlišování antigenních subtypů a variant. Hemaglutinin viru chřipky je trimer. Každý monomer se skládá ze dvou polypeptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Hemaglutinin se vytváří v endoplazmatickém retikulu infikovaných buněk z polypeptidového prekurzoru HA0 tvořeného přibližně z 560 aminokyselin. V retikulu je protein glykosylován, trimerizuje se a skládá do správné konformace. Správně složený protein je poté transportován do Golgiho aparátu a plazmatické membrány a je zabudován do virové částice. V Golgiho aparátu se HA0 proteolyticky štěpí na HA1 a HA2 podjednotky. Hotový protein obsahuje dvě domény: globulární tvořenou HA1, která obsahuje vazebné místo pro sacharid, a doménu tvořenou převážně z HA2. Existuje celkem patnáct subtypů hemaglutiniu označovaných jako H1-H15. 15

Obr. 3: Struktura virového hemaglutininu (8) Neuraminidáza je aktivní jako tetramer. Z receptorů odštěpuje N-acetylneuraminovou (sialovou) kyselinu, což vede k inaktivaci receptoru a zabrání se tak vazbě virionu na receptory v membráně. Existuje celkem devět subtypů neuraminidázy označovaných jako N1-N9. 4.3.2 Vnitřní antigeny virů chřipky (10) Mezi vnitřní antigeny virů chřipky patří nukleoprotein (NP) a matricový protein M1 (M-protein). Na identitě hlavních vnitřních proteinových antigenů je založeno členění rodů na Influenzavirus A, B a C. Matricový protein M1 řídí transport virových ribonukleoproteinových komplexů do jádra a z jádra. Nukleoprotein (NP) zastává roli v řízení replikace virové RNA. 16

Obr. 4: Výskyt jednotlivých subtypů H a N (9) 17

5. Životní cyklus chřipkových virů 5.1. Vztah viru a hostitelské buňky (2) Vztah viru a hostitelské buňky je velmi specifický. Infekčnost jednotlivých druhů je často omezena na úzký okruh nebo dokonce na jediný druh hostitele. Schopnost viru infikovat určitou buňku a množit se v ní je podmíněna její vnímavostí a permisivitou k danému druhu viru. Vnímavost buňky k virové infekci je určována přítomností vhodných receptorů na buněčném povrchu, umožňujících adsorpci a penetraci virionu do cytoplazmy. K množení viru v hostitelské buňce však dojde pouze tehdy, je-li buňka metabolicky vybavena k realizaci úplného replikačního cyklu. Taková buňka je označována jako k dané virové infekci permisivní. Reprodukce viru spojená s tvorbou nových virových částic zahrnuje několik stádií popsaných níže. 5.2. Adsorpce viru na hostitelskou buňku (1, 2, 10, 11, 12) Prvním důležitým krokem interakce viru s hostitelskou buňkou je adsorpce virionu na povrch hostitelské buňky. Připojení viru na hostitelskou buňku je řízeno jednak povrchovými proteiny virové částice (viral attachment proteins VAPs) a dále receptory na povrchu buňky. Mezi tzv. VAPs patří hemaglutinin. Adsorpce je zprostředkována vazbou hemaglutininu na N-acetylneuraminovou (sialovou) kyselinu (SA), která je obsažena v glykoproteinech specifických receptorů hostitelské buňky. Bylo zjištěno, že převažujícími receptory pro influenzavirus A a B jsou sialylglykoproteiny a gangliosidy obsahující monosialo-laktozoamin typu I a II. SAα2,3(6)D-Galβ1,3(4)D-GlcNAcβ1 Kyselina sialová (SA) je tedy nezbytnou složkou vnějších buněčných receptorů. V přírodě se vyskytuje více než čtyřicet derivátů SA. Dva majoritní druhy kyseliny sialové, které podmiňují molekulární mechanismus rozpoznávání receptoru chřipkovými viry, jsou 5-N-acetylneuraminová kyselina (Neu5Ac) a 5-N-glykolylneuraminová kyselina (Neu5Gc). Tyto dva druhy se liší funkční skupinou na uhlíku C5. Na uhlíku C5 je navázána N-acetylová skupina, pak jde o Neu5Ac. Neu5Gc je derivátem Neu5Ac, vzniká enzymatickou hydroxylací N-acetylové skupiny CMP- Neu5Ac. 18

Sialové kyseliny se typicky vyskytují na terminálních koncích N-glykanů, O-glykanů a glykosfingolipidů. Je tu potenciální možnost dodatečné substituce hydroxylových skupin (-OH) na uhlíku v pozici 4, 7, 8 a 9 (O-acetyl, O-methyl, O-sulfát a fosfátové skupiny). Existují různé možnosti α- vazeb s C2 - různé kmeny virů chřipky specificky rozeznávají buď rezidua kyseliny sialové navázané na povrch buňky vazbou α(2,6)- anebo α(2,3)-. To vše se podílí na jejich široké strukturální rozmanitosti. Cílovými hostitelskými buňkami influenzavirů A jsou u lidí, prasat a koní buňky průdušnicového epitelu, u ptáků jsou to buňky střevní sliznice. Hemaglutininy (HA) influenzavirů A rozpoznávají kyselinu sialovou (SA) navázanou na povrch hostitelských buněk vazbou (2,3) nebo (2,6). Hemaglutininy lidských influenzavirů jsou výhradně (2,6) specifické, hemaglutininy prasečích influenza virů jsou (2,6) i (2,3) specifické, přičemž lehce převažuje (2,6) specifita. Hemaglutininy koňských i ptačích influenzavirů jsou též (2,6) i (2,3) specifické, přičemž specifita (2,3) silně převažuje. Analýzou nukleotidové sekvence bylo zjištěno, že potenciální substituce aminokyselin hemaglutininů v určitých pozicích mají zásadní vliv na jejich vazebnou specifitu k SA. Příklad pro Neu5Ac: Subtyp hemaglutininu H3, který obsahuje v pozici 226 leucin je α(2,6) specifický, zatímco přítomnost glutaminu v této pozici odpovídá α(2,3) specifitě. Dojde-li tedy k substituci leucinu glutaminem, změní se vazebná specifika k Neu5Ac z Neu5Ac(2,3)Gal na Neu5Ac(2,6)Gal. Příklad pro Neu5Gc: Glykokonjugáty obsahující Neu5Gc se typicky vyskytují u mnohých druhů zvířat, ale v normálních lidských tkáních ještě nebyly detekovány. Bylo zjištěno, že zásadní vliv na schopnost viru rozpoznat vazebné místo v Neu5Gc mají aminokyseliny v pozicích 143, 155 a 158. 19

Obr. 5: Vazebné místo receptoru hemaglutinu H3 v komplexu s kyselinou sialovou s vyznačenými aminokyselinami v pozicích 143, 155 a 158 (12) 5.3. Penetrace viru do buňky (1, 2, 5, 7) Viry vyvinuly mnoho strategií, jak proniknout do hostitelských buněk. Způsob vstupu viru do buňky je primárně určen jejich strukturou. Rozlišujeme viry obalené a viry neobalené. Viry chřipky patří mezi viry obalené, jejich dvouvrstevný lipoproteinový obal je hostitelského původu, kapsid se jím obalí právě při prostupu skrze membrány hostitelské buňky. Segmentovaný genom, složený z osmi (resp. sedmi) jednořetězcových negativních RNA, je sbalen do virového ribonukleoproteinového komplexu (vrnp). Ve vrnp se nachází nukleoproteiny (NP) a RNA-polymerázy (složené z proteinů PA, PB1 a PB2). Po navázání chřipkových virů na receptory obsahující SA jsou virové partikule sevřeny cytoplazmatickou membránou a aktivně endocytovány buňkou. Vstupují do buňky jako tzv. časné endozomy (ph = 6). Následně jsou virové partikule dopraveny do 20

tzv. pozdních endozomů (ph = 5). Nízké ph v endozomu vede ke konformační změně podjednotky HA2 hemaglutininu. HA2 v této aktivní formě zprostředkovává fůzi membránového obalu viru s endozomální membránou, což způsobí uvolnění vrnp do cytosolu. Okyselení přes protonovou pumpu M2-proteinu navodí disociaci N/MP, což umožní transport vrnp přes póry jaderné membrány do jádra. V jádře poté dochází k expresi virového genomu. Obr. 6: Endocytóza virové částice (5) 5.4. Reprodukce viru (1, 3) Během vlastní reprodukce viru dochází k syntéze virových bílkovin, k replikaci virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a uvolňování z buňky, tj. eluci. Časový úsek od adsorpce až po zahájení syntézy nových virionů se nazývá eklipse. Doba mezi počátkem interakce viru s buňkou a uvolněním prvních virových částic je označována jako latentní stadium. 21

Při transkripci negativního řetězce (-ss RNA) se syntetizuje (+ss RNA), jež vystupuje z části jako mrna a z části je přepisována do (-ss RNA) začleněné do nově vznikajících virových částic. -ss RNA +ss RNA -ssrna Virion mrna proteiny U ortomyxovirů se tedy uskutečňuje první transkripce, která probíhá na segmentech negativní genomové RNA ještě před její replikací v hostitelské buňce a druhá transkripce probíhající na segmentech negativní genomové RNA vzniklých jejich replikací v hostitelské buňce. V první fázi exprese genomu dochází k tzv. první nebo-li primární transkripci a translaci virových genů kódujících nestrukturální virové proteiny (regulační polypeptidy a enzymy, které se nestanou součástí nově tvořených virionů). Během primární transkripce jsou syntetizovány mrna komplementární s genomovou RNA jednotlivých segmentů. Následná translace vede k tvorbě polypeptidů, představujících složky polymerázy a vnitřní bílkoviny nukleoproteinu. Současně s primární transkripcí dochází k replikaci genomové RNA za vzniku komplementárního +ss RNA řetězce, který slouží jako matrice pro syntézu dceřiných virových -ss RNA. Z jádra jsou jednotlivé RNA přenášeny do cytoplazmy, kde dochází k sekundární transkripci nově vytvořených (dceřiných) genomových RNA za tvorby mrna kódujících syntézu strukturních bílkovin. Syntéza těchto bílkovin probíhá na polyribozomech, z nichž jsou vytvořené polypeptidické řetězce přenášeny přes drsné a hladké endoplasmatické retikulum do buněčné membrány na místo tvorby virionů. Obalové bílkoviny jsou přitom zároveň glykozylovány. Stavba nukleokapsidů je uskutečňována na plasmatických membránách za účasti nukleonu a membránové bílkoviny. V průběhu maturace se nukleokapsidy spojují s virově modifikovanými složkami buněčné membrány, tj. lipoproteiny a glykoproteiny a zralé viriony se v podobě pupenů oddělují od hostitelské buňky. 22

5.5. Molekulární mechanismus exprese genomu chřipkových virů (1) Virová RNA-dependentní-RNA-polymeráza je navázána na 3 -konec jednotlivých segmentů genomu. Syntézu mrna může začít až poté, co je 5 konec této mrna modifikován čepičkou (cap) m 7 G. (jde o strukturu obsahující mj. methylovaný guanin a ribózu). RNA-dependentní polymeráza využívá čepičku z mrna hostitelských buněk. Tento mechanismus kradení čepičky má mimo jiné ten význam, že se jím přeruší transkripce a translace hostitelské buňky a přepne se na výrobu chřipkových virionů. 5.5.1. Transkripce Polymerázový komplex (PB1, PB2, PA) se specificky naváže na 5 -konec genomové RNA, tím se aktivuje k vazbě na čepičku buněčné mrna. Dochází ke změně konformace genomové RNA do vlásenkové struktury, čímž se aktivuje endonukleáza polymerázového komplexu. Endonukleáza štěpí čepičku buněčné mrna a dojde k vytvoření aktivního transkripčního komplexu. Prodlužování virové mrna se zúčastňují proteiny PB1, PB2 a PA RNA-dependentní-RNA-polymerázy. Transkripce se ukončí polyadenylací. Polyadenylace začne probíhat, jakmile se transkripcí dosáhne oligo U-sekvence na 5 - konci genomové RNA. Vlastní polyadenylace probíhá tak, že se U-sekvence přepisuje do A-sekvence. Malé transkripty se upravují částečně sestřihem, kterého se jako kofaktor zúčastňuje NS1-protein. 5.5.2. Translace Následnou translací mrna viru se vytváří polypeptidy představující složky polymerázy a vnitřní bílkoviny nukleoproteinu. Translace proteinů membránového obalu viru (HA-protein, případně NA a M2) probíhá na membráně endoplasmatického retikula. Po odstranění signálního peptidu z proteinů HA a M2 se prostřednictvím Golgiho systému tyto proteiny dopravují k buněčnému povrchu. Přitom vytvářejí trimery a tetramery a glykosylují se. 23

6. Variabilita chřipkových virů v souvislosti s jejich epidemickým šířením 6.1. Zdroje variability virů chřipky (1) Virus chřipky je charakteristický svým segmentovaným genomem, který způsobuje značnou variabilitu virů chřipky. Segmentovaný genom totiž umožňuje přeskupování genomových segmentů. K přeskupování dochází, infikují-li současně stejnou hostitelskou buňku různé kmeny téhož druhu. Přeskupením mezi dvěma segmentovanými osmicemi genomů se může vytvořit 2 8 tj. 256 nových kombinací. Vznikají tak nové kmeny chřipky s novým antigenním typem, který není lidská populace schopna imunologicky rozeznat. Rozhodujícím činitelem pro vznik epidemie chřipky v lidské populaci je změna antigenních vlastností viru. Ke změnám v antigenních vlastnostech dochází dvěma způsoby, a to buď antigenním zvratem (antigenní shift) nebo antigenním posunem (antigenní drift). 6.2. Antigenní zvrat (antigenní shift) (1, 9) Antigenním zvratem se rozumí náhlá a zásadní změna v antigenní vlastnostech viru, která je výsledkem přeskupení mezi segmentovanými genomy virů stejného druhu lišících se v antigenních vlastnostech. Dojde-li k antigennímu zvratu, hrozí nová možnost vzniku pandemie chřipky. Po antigenním zvratu virus chřipky disponuje buď novým subtypem samotného hemaglutininu nebo novým subtypem hemaglutininu i neuraminidázy. Nový virus je antigenně odlišný od dříve se vyskytujících chřipkových virů v lidské populaci, proto nemohl vzniknout jejich mutací. Přirození hostitelé virů chřipky A (člověk, vepř, kůň domácí i divoce žijící ptáci a někteří mořští savci) mají podobné vnitřní antigeny NP a M1, liší se však navzájem povahou povrchových glykoproteinů. Až dosud bylo identifikováno patnáct různých typů hemaglutininů, které se označují pořadovými čísly H1 H15 a devět různých typů 24

neuraminidázy, N1 N9. Antigenní typ, který je pro příslušný kmen charakteristický, se vytvoří kombinací subtypu hemaglutininu se subtypem neuraminidázy. Kompletním rezervoárem virů chřipky je vodní ptactvo. Ve vodním ptactvu se nacházejí všechny antigenní subtypy H a N viru influenzy A, a to ve všech kombinacích. Pravděpodobně se virus přenáší nepřímo z vodního ptactva na prasata, teprve až v praseti dochází k přeskupování genomových segmentů mezi viry vodního ptactva a lidskými. Lidský virus se může v praseti zkřížit s ptačím za vzniku nového antigenního typu. (viz. Obr. 7) Obr. 7: Cirkulace antigenů H a N mezi živočišnými druhy (9) 6.3. Antigenní posun (1, 2) I v období mezi vznikem nových pandemických subtypů dochází plynule k menším antigenním změnám převládajících subtypů virů chřipky. Tyto změny se označují jako antigenní posun. Antigenním posunem se rozumí postupné hromadění drobných mutací obvykle charakteru nukleotidových substitucí ve virovém genomu, které 25

vedou jen k nepatrně pozměněným antigenním vlastnostem viru, takže jsou imunitním systémem hostitele jen slabě rozpoznávány. Antigenní posun umožňuje reinfekci osob, které již nákazu daným subtypem prodělaly. Téměř každá nová pandemie chřipky byla vyvolána virem influenzy A vzniklým přeskupením jeho genomových segmentů. V Tabulce č. 4 jsou uvedeny pandemie chřipky, které se vyskytly v lidské populaci od roku 1918. Tabulka 4: Chřipkové pandemie v lidské populaci (1) Označení Antigenní Vznik Poznámka typ Španělská chřipka H1N1 Antigenní posun Pandemie v roce 1918/1919 způsobila smrt 20 milionů lidí. Virus byl přenesen do Evropy americkými vojáky z Kansasu Asijská chřipka H2N2 Antigenní zvrat, kmen H1N1 získal nové alely z ptačího rezervoáru V roce 1957 nahrazuje kmen H2N2 kmen H1N1 Hong Kong H3N2 Antigenní zvrat, nové Nastupuje v roce 1968 rozsáhlou alely opět získány pandemií z ptačího rezervoáru Ruská chřipka H1N1 Pravděpodobný únik z laboratoře Nastupuje v roce 1977, od té doby působí v lidské populaci kmeny H3N2 i H1N1 26

7. Závěr Viry jsou nebuněčné nukleoproteinové částice o velikostech desítek až stovek nm, schopné rozmnožování pouze v hostitelských buňkách. Viry mají genetický kód pro vlastní replikaci, avšak chybí jim translační aparát, proto jsou zcela závislé na translačním systému hostitelských buněk. Virová částice, která je schopna infikovat hostitelskou buňku, se nazývá virion. Viry patří mezi intracelulární parazity a způsobují různorodá onemocnění rostlin a živočichů. Genom virů je tvořen vždy jedním typem nukleové kyseliny, buď DNA nebo RNA (mohou být dvouřetězcové nebo jednořetězcové, lineární či cirkulární), podle toho rozlišujeme DNA-viry a RNA-viry. Podle typu hostitele dělíme viry na živočišné a rostlinné. Dále rozlišujeme viry obalené či neobalené, podle toho, zda mají kolem svého kapsidu lipoproteinový obal. Má bakalářská práce byla zaměřena na viry chřipky. Viry chřipky spadají do oddělení Orthomyxoviridae (Otromyxoviry), kde rozlišujeme dva rody, rod Influenza virus A, B a rod Influenza virus C. Influenza viry způsobují chřipku, což je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí. Viry chřipky se přenášejí kapénkovou infekcí. Ortomyxoviry patří mezi tzv. obalené živočišné RNA-viry. Jejich genom tvoří lineární jednořetězcová negativní segmentovaná RNA (-ssrna viry). Jednotlivé segmenty RNA tvoří spolu s nukleoproteiny (NP) a RNA-polymerázou (PB1, PB2, PA resp. P1, P2, P3) tzv. virový ribonukleoproteinový komplex (vrnp). vrnp je uložen v nukleokapsidu ještě s nestrukturálními proteiny (NS1, NS2). Nukleokapsid je obalen dvojvrstevnou lipidovou membránou hostitelského původu. Mezi tři základní typy membránových proteinů patří hemaglutininy (HA, HEF), neuraminidáza (NA) a M2 protein (M-protein). Na vnitřní straně této dvojvrstvy jsou molekuly matricového typu (M-proteiny, M1), které vážou obal k nukleokapsidu. Na vnější straně obalu ční výběžky tvořené biologicky aktivními glykoproteiny. Z hlediska schopnosti viru infikovat hostitelskou buňku je determinujícím činitelem struktura povrchových antigenů viru a struktura receptoru hostitelské buňky. Povrchovými antigeny virů chřipky jsou hemaglutinin a neuraminidáza. Kombinace subtypu hemaglutininu (H1 H15) se subtypem neuraminidázy (N1 N9) podmiňují 27

rozlišování antigenních variant. Mezi vnitřní antigeny patří nukleoprotein (NP) a matricový protein M1. Na identitě vnitřních antigenů je založeno členění rodů na Influenza virus A, B či C. Prvním a nezbytným krokem infekce buňky virem je adsorpce (přilnutí) viru na hostitelskou buňku. Adsorpce chřipkových virů je zprostředkována specifickou vazbou hemaglutininu na kyselinu sialovou (SA), která je obsažena v glykoproteinech specifických receptorů hostitelské buňky. Dvěma majoritními druhy SA jsou 5-Nacetylneuraminová kyselina (Neu5Ac) a 5-N-glykolylneuraminová kyselina (Neu5Gc). Hemaglutininy rozpoznávají SA navázanou na povrch hostitelských buněk vazbou α(2,3) nebo α(2,6). Po úspěšné adsorpci dochází k penetraci (proniknutí) virové částice do hostitelské buňky. Viry chřipky pronikají do buňky endocytózou ve formě tzv. endozomů. Hemaglutinin, po konformační změně způsobené nízkým ph endozomu, zprostředkuje fůzi membránového obalu viru s endozomální membránou. Virový nukleoproteinový komplex (vrnp) se tak dostane do cytozolu hostitelské buňky, následuje transport vrnp do jádra, kde dochází k expresi virového genomu. Při transkripci negativního řetězce (-ss RNA) se syntetizuje (+ss RNA), jež vystupuje z části jako mrna a z části je přepisována do (-ss RNA) začleněné do nově vznikajících virových částic. U ortomyxovirů se tedy uskutečňuje první transkripce, která probíhá na segmentech negativní genomové RNA ještě před její replikací v hostitelské buňce a druhá transkripce probíhající na segmentech negativní genomové RNA vzniklých jejich replikací v hostitelské buňce. Klíčovým enzymem je RNA-dependentní-RNApolymeraza. Syntézu mrna může začít až poté, co je mrna modifikována čepičkou (cap, m7g). RNA-dependentní polymerázy využívá čepičku výhradně od mrna hostitelské buňky, štěpí ji enzymem endonukleázou (endonukleáza je součástí polymerázového komplexu). Následuje translace. Během vlastní reprodukce viru dochází k syntéze virových bílkovin, k replikaci virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a uvolňování z buňky ve formě pupenů. Viry chřipky se vyznačují oproti ostatním virům značnou proměnlivostí. Příčinou proměnlivosti chřipky je segmentovaný genom a separátní translace jeho částí, což usnadňuje reasortaci segmentů RNA různých kmenů téhož druhu, infikují-li současně stejnou hostitelskou buňku. Vznikají tak nové kmeny chřipky s novým antigenním typem, který není lidská populace schopna imunologicky rozeznat. Příčinou změny antigenních 28

vlastností je buď antigenní zvrat nebo antigenní posun. Antigenním zvratem se rozumí náhlá a zásadní změna v antigenní vlastnostech viru, která je výsledkem přeskupení mezi segmentovanými genomy virů stejného druhu lišících se v antigenních vlastnostech. Antigenní zvrat může způsobit epidemii, výjimečně i pandemii chřipky. Antigenním posunem se rozumí postupné hromadění drobných mutací, obvykle charakteru nukleotidových substitucí, ve virovém genomu. Antigenní posun umožňuje reinfekci osob, které již nákazu daným subtypem prodělaly. 29

8. Zkratky BM2, CM2..M-proteiny, transmembránové proteiny virionu Gal..D-galaktóza (D-galactose) Glc..D-glukóza (D-glucose) GlcNAc..N-acetyl-D-glukozamin (N-acetyl-D-glucosamine) HA..Hemaglutinin (Haemagglutinin) HEF..Hemaglutinin (Haemagglutinin-esterase-fusion protein) M1,M2..M-proteiny (Matric protein 1, Matric protein 2) NA..Neuraminidáza (Neuraminidase acid) NeuNAc..N-acetylneuraminová kyselina (N-acetylneuraminic acid) NP.. Nukleoprotein (Nucleoprotein) NS1, NS2.. nestrukturální proteiny (Nonstructural protein 1, nonstructural protein 2) PAK..Proteinkináza A (protein kinase A) PB1, PB2, PA..proteiny RNA-dependentní-RNA-polymerázy (Polymerase basic protein 1, polymerase basic protein 2) SA..Kyselina sialová (Sialic acid) VAPs. virové povrchové proteiny (viral attachment proteins) vrnp..virový ribonukleoproteinový komplex (Viral ribonucleoprotein komplex) 30

9. Literatura 1. S. Rosypal (2002). Úvod do molekulární biologie, díl třetí. Brno 2. M. Bednář, V. Fraňková, J. Schindler, A. Souček, J. Vávra (1999). Lékařská mikrobiologie. Praha:Marvil 3. M. Němec, D. Horáková (1999). Základy mikrobiologie. Brno 4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ictvdb/ictvdb/00.046.0.01.htm 5. M. Lakadamyali, M. j. Rust, X. Zhyny (2004). Endocytosis of influenza viruses. Microbes and Infections. 6: 929-936 6. C. R. Parrish, Y. Kawaoka (2005). The Origins of New Pandemic Viruses: The Acquisition of New Host Ranges by Canine Parvovirus and Influenza A Viruses. The Annual Review of Mikrobiology. 59: 553-586 7. P. J. Klasse, R. Bron, M. Marsh (1998). Mechanisms of enveloped virus entry into animals cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 34: 65 91 8. http://chemistry.umeche.maine.edu/chy431/proteins11.html 9. K. G. Nicholson, J. M. Wood, M. Zamlon (2003). Influenza. The Lancet, 362:1733-1732 10. Y. Suzuki. (2005). Sialobiology of Influenza Molecular Mechanism of Host Range Variation fo Influenza Viruses. Biological and pharmaceutical bulletin, 28(3): 399-408 11. W.I. Weis (1997). Cell-surface carbohydrate recognition by animal and viral lectins. Current Opininon in Structural Biology. 7: 624-630 12. H. Masuda, T. Suzuki, Y. Sugiyama, G. Horrike, K. Murakami, D. Miyamoto, K. I. P. J. Hádači, T. Ito, H. Kida, M. Kiso, K. Fukunaga, M. Obuchu, T. Toyoda, A. Ishihama, Y. kawaoka, Y. Suzuki (1999). Substitution of amino acid residue in influenza A virus hemagglutinin affects recognition of sialyl-oligosacharides containing N-Glycolylneuraminic acid. FEBS Letters, 464: 71-74 31