Tkáňové inženýrství a testování biokompatibility polymerů. B. Dvořánková
Historie transplantací 2. st. př.n.l. Čína transplantace orgánů a štěpů Indie autologní kožní štěpy 3. st.n.l. Kosmos a Damián transplantace nohy V roce 1668 popsal holandský lékař Job van Meereken první úspěšnou transplantaci kosti - tkáňovým štěpem získaným z lebky psa. 1. klinický přenos autologní kosti - 1820 v Německu Alexis Carrel (1873 1951) - zakladatel cévní a transplantační chirurgie. Zásoby tkání pro chirurgické účely, vědecký základ metodám konzervací tkání. Specializované tkáňové banky 30.léta 20.stol Filatov - prvním transplantovaným kadaverózním štěpem byla rohovka. Začátek osmdesátých let - orgánové transplantace
Transplantace Přenos živých buněk, tkáně nebo orgánu z jedné části těla na jinou nebo z jednoho jedince na jiného. Transplantát s vlastním cévním zásobením Štěp bez cévního zásobení Ledviny, srdce, játra, plíce, pankreas, střevo, Langerhansovy ostrůvky Kůže, krevní buňky, kostní dřeň
Transplantace Autotransplantace v rámci jednoho organizmu Syngenní (izo)transplantace jednovaječná dvojčata U laboratorních zvířat imbrední kmeny Alotransplantace mezi geneticky odlišnými jedinci v rámci druhu Xenotransplantace mezi jedinci dvou různých druhů
Transplantace Imunitní reakce příjemce proti buňkám transplantátu Hodně pacientů X málo orgánů
Imunita Schopnost organizmu bránit se proti antigenům z vnějšího i vnitřního prostředí Spouští imunitní odpověď Řídí ji imunitní systém
Imunitní systém Zajišťuje integritu organizmu Rozeznávání a odstraňování nefunkčních složek organizmu buňky staré, mrtvé, nádorové, nemocné nebo tělu cizí parazitujících mikroorganizmů cizorodých makromolekulárních látek (proteiny, polysacharidy) Obranyschopnost X autotolerance
Antigen Molekula, na kterou je organizmus schopen zareagovat specifickou imunitní reakcí Cizí Vlastní autoantigen Většinou na ně nereaguje - imunotolerance Nadměrná reakce poškození orgánů - autoimunitní choroba
Prezentace antigenu - MHC MHC I receptory mají je všechny jaderné buňky prezentace cytosolických proteinů (peptidy buňce vlastní + peptidy virů a bakterií žijících v cytosolu) 8-11 aminokyselin receptory na povrchu Tc lymfocytů rozeznávají peptid i MHC receptor aktiv. CD8+ T lymf. MHC II receptory 1.antigen-prezentující buňky; 2. neprofesionální epitelové, endotelové b. prezentace peptidů z prostředí mimo buňku 12-25 aminokyselin, vyšší citlivost komplex antigenu s MHC II receptorem aktiv.t CD4+ lymfocytů B-lymfocyty
T-lymfocyty rozpoznávají: cizí antigeny v komplexu s vlastními molekulami MHC, což vede k imunitní reakci, vlastní antigeny v komplexu s vlastními molekulami MHC, což vede k toleranci, cizí molekuly MHC (transplantační reakce)
HLA typizace HLA - Human Leukocyte Antigenes Shoda v HLA antigenech mezi dárcem a příjemcem i přes velký pokrok v imunosupresivní léčbě je životně důležitá pro transplantaci kmenových buněk a má (stále) význam pro dlouhodobé přežití transplantovaných orgánů (ledviny, srdce, pankreas)
Tkáňové kultury Jako buněčné kultury jsou označovány rostlinné, živočišné nebo lidské buňky pěstované mimo organizmus v laboratoři. Tato technika je nazývána in vitro.
Tkáňové kultivace Vědecké biologický a lékařský výzkum Výroba vakcín, očkovacích látek; výroba biofarmak vakcína proti vzteklině, očkovací látka proti obrně Testování léčiv či materiálů pro klinické využití možnost částečného nahrazení pokusů na zvířatech Diagnostické kultivace lymfocytů při karyotypizaci krevních buněk Terapeutické Tkáňové inženýrství
Buňky normální buňky nádorové buňky kmenové buňky multipotentní buňky primární kultury buněčné linie
Interakce buněk s okolím 2D kultivace tkáňový polystyren sklo potažený povrch 3D kultivace proteinové sítě polymerní sítě ECM matrigel, vyrobené buňkami neadhezivní povrchy - sféry
Vzájemné ovlivňování buněk Přímá kokultura více buněčných typů Insertový systém Kondiciovaná média Migrační testy
Biokompatibilita materiálu biokompatibilita snášenlivost látek zejm. materiálů v biologickém prostředí; biokompatibilní materiál se posuzuje podle interakce s prostředím, zejm. podle cytotoxického působení, podle toxikologických a alergických reakcí, podle karcinogenních, teratogenních či mutagenních reakcí, podle vlivu na infekční procesy, podle rozsahu a kvality biodegradace. Důležité je, aby materiál neovlivňoval např. koagulace, nevyvolával zánětovou reakci, neuvolňoval potenciálně toxické látky apod. Velký lékařský slovník
Biokompatibilita materiálu Biokompatibilita je schopnost materiálu fungovat ve specifické aplikaci a vyvolat přiměřenou odpověď hostitele http://web.mit.edu/murj/www/v11/v11-features/v11-f5.pdf
Testování biokompatibility In vitro testování cytotoxicity přímý není bariéra mezi buňkami a materiálem - agarový difuzní test netestuje strukturu a povrch - eluční test Nezohledňuje interakci materiálu s ostatními buňkami v lidském těle In vivo materiál je implantován do zvířecího těla - podle cílového využití u člověka volba zvířete Testování materiálu u člověka
Přímý test cytotoxicity Výběr vhodných buněk Jejich kultivace v přítomnosti materiálu Hodnocení jejich růstu ve srovnání s kontrolou - MTT test
Studium adheze a proliferace vhodných buněk na povrchu polymerních materiálů Hydrofobní/hydrofilní Reliéf povrchu Povrchové napětí kontaktní úhel Přítomnost určitých skupin PTFE, povrch ošetřený plazmovým výbojem, naroubován PEG 300
Kmenové buňky embryonální kmenové buňky v průběhu embryonálního vývoje dospělé kmenové buňky cirkulující kmenové buňky separace z krve kostní dřeň pupečníková krev tkáň amniového vaku tuková tkáň indukované pluripotentní buňky
Kultivace buněk pro léčbu: Náhrada epidermis Náhrada chrupavky Mezenchymové kmenové buňky Kostní dřeň Periferní krev Pupečníková krev
Kůže Největší orgán lidského těla Průměr 1,7 m 2 Dvě hlavní vrstvy epidermis a dermis Léčba rozsáhlých kožních ztrát představuje závažný lékařský problém Anatomia del corpo humano Juan Valverde de Amusco (Rome, 1560)
Funkce lidské epidermis Ochranná funkce mechanický úraz ztráta tekutin invaze patogenů Metabolická funkce produkce vitaminu D, cytokinů a interleukinů termoregulace Estetická funkce
Rozsáhlé popáleninové trauma Popáleniny I.stupeň II. stupeň III. stupeň Nutno hodnotit hloubku termického úrazu i jeho rozsah
Epidermis není vaskularizovaná - buňky jsou vyživovány difuzí přes bazální membránu - pouze jeden buněčný typ keratinocyty dostačuje pro její rekonstrukci In vitro kultivace keratinocytů - první lidský orgán připravený v laboratoři (Rheinwald and Green), v klinické praxi použit poprvé v r. 1981 - určeno pro rozsáhle popálené pacienty s nedostatkem odběrových míst
Kultivace keratinocytů I autologní štěpy jsou schopné vytvořit trvalý kryt léčba kožních ztrát v plné tloušťce odběr - dermo-epidermální štěp 2-5 cm 2 minimální doba přípravy cca 3 týdny možno připravit tisíce cm 2 epidermálních štěpů
Kultivace keratinocytů II allogení štěpy nejsou schopné vytvořit trvalý kryt využívá se jejich stimulační účinek na hojení: popáleniny IIa stupně odběrové plochy trofické defekty otestovaní dárci zbytková kůže z plastických operací zásoba zmražených buněk v kapalném dusíku minimální doba přípravy 10-12 dní
Kultivované štěpy na textilním nosiči velmi nízká úspěšnost přihojení vysychání transplantovaných buněk častá mikrobiální kontaminace štěpu z ranné plochy enzymatické odvolnění štěpu snižuje viabilitu transplantovaných buněk Vyvinout nový způsob přípravy kultivovaných epidermálních štěpů
Nový způsob kultivace keratinocytů kultivace buněk a jejich aplikace přímo na polymerním nosiči kultivační podložka (nosič) by měl tvořit optimální kryt pro transplantované buňky vyloučení feedrových buněk z kultivačního systému Tkáňové inženýrství
Na přípravu nosiče pro kultivaci keratinocytů byl vybrán polyhema hydrogel poly(2-hydroxyetyl metakrylát) -ve vodném prostředí tvoří hydrogel (35-40% vody) -dlouhodobé zkušenosti s využitím v medicíně - kontaktní čočky
Krok 1 vytvořit podmínky pro adhezi a proliferaci buněk na povrchu hydrogelu preinkubací hydrogelového nosiče v bovinním séru dojde k sorpci bílkovin na jeho povrchu
Integra - schema popáleninová medicína rekonstrukční chirurgie traumatologie
Integra - aplikace
Tvorba neodermis
Transplantace plochy
Výhody Integry rychlé překrytí velkých ploch nedochází k rejekci čas pro další transplantace DE štěpy 0,l - 0,2 mm kosmetický a funkční efekt Integra roste s pacientem
Náhrada chrupavky umělá chrupavka a kostní implantáty vypěstované na podložkách z buněk pacienta samotného nebo z buněk kostní dřeně Autologní chondrocyty + Tissucol náhrada patelly Contipro-group lešení z kyseliny hyaluronové
průhledná kopulovitě zakřivená, dokonale čirá, lesklý povrch neprocházejí žádné cévy součást opt. prostředí - láme paprsky, filtruje UV záření, +/- 43 dioptrií ochrana proti vnějším vlivům vyživa - výměškem slzného aparátu a komorovou vodou mnoho nervových zakončení, citlivá na dotyk, podráždění Rohovka (cornea) Rohovkový epitel - 5-6 vrstev buněk, stálá regenerace Endotel!!!
Zkalení rohovky, ztráta průhlednosti Příčiny : poranění, poleptání, zánět (vrůstání cév), glaukom, zvýš. obsah vody (protržení Descemetské m. nebo endotelu) a další
Transplantace rohovky 1905 Olomouc Oční banky skladování rohovek Úspěšnost 90-95% Keratoplastika štěp z mrtvého dárce perforující 7-8 mm, našití na mateřskou roh. přední lamelární keratoplastika zadní lamelární keratoplastika Laserové operace jen určitá vrstva
Umělá rohovka Komerčně dostupné rohovkové náhrady keratoprotézy AlphaClar phema - 2005 KeraKlar rohovka není odstraněna v celé tloušťce riziko poop.komplikací jednodušší provedení - ambulantně
Schopnost akomodace v rozsahu 10 17 D, věkem se snižuje (na 2D až 0,5D) Zákal čočky
Šedý zákal - katarakta
Intraokulární čočka Původně hydrofóbní, nyní hydrofilní polymerní materiály hydrogely Přesná dioptrická hodnota Implantace do oka - náhrada čočky při šedém zákalu