Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS Úkol: Stanovte množství chininu v nealkoholickém nápoji (tonik) pomocí kapilární zónové elektroforézy ve spojení s hmotnostní spektrometrií Teoretická část: Kapilární zónová elektroforéza (CZE) patří spolu s dalšími elektromigračními metodami mezi moderní a vysokoúčinné separační techniky. CZE je založena na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli, je tedy použitelná pro analyty schopné nést náboj v důsledku jejich disociace či protonizace. Dalším jevem ovlivňujícím separaci je elektroosmotický tok kapaliny křemennou kapilárou. Separace je uskutečňována v kapiláře, která je nejčastěji vyrobena z taveného křemene (dalším používaným materiálem je např. teflon). Kapilára má vnitřní průměr od 10 do 100 μm a její délka se pohybuje v rozmezí od 40 do 100 cm. Křemenná kapilára je potažena vrstvou polyimidu (vnější průměr kapiláry je 375 μm), který zvyšuje její pružnost a snižuje křehkost. Konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách s vhodným separačním pufrem a tyto nádobky jsou opatřeny platinovými elektrodami. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kv. Rozseparované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru, který je umístěn na opačném konci kapiláry, než je dávkován vzorek. Dávkování vzorku se provádí buď elektrokineticky, nebo tlakem (hydrodynamické dávkování). Obr. 1. Schématické znázornění kapilární elektroforézy
Elektroosmotický tok Po vložení vysokého napětí napříč kapilárou naplněnou pufrem obvykle dochází ke vzniku elektroosmotického toku (EOF), který unáší analyty směrem ke katodě nebo anodě. Při použití křemenné kapiláry vzniká EOF v tom případě, kdy je hodnota ph separačního pufru větší než 2 (jedná se pouze o přibližnou hodnotu). Nad touto hodnotou ph totiž dochází k disociaci silanolových skupin (Si-OH) a ke vzniku záporného náboje na povrchu kapiláry, což má za následek přitahování kationtů separačního pufru a vznik elektrické dvojvrstvy na povrchu kapiláry. Pokud dojde k vložení vysokého napětí, migrují kationty směrem k záporné elektrodě tedy ke katodě. Jelikož jsou kationty solvatovány, strhávají s sebou veškerou kapalinu. Rychlost EOF je zpravidla větší než elektroforetické rychlosti jednotlivých iontů, je tudíž schopen strhávat všechny kationty, neutrální částice i anionty ke katodě, u které je umístěn detektor. Pohyb iontů v kapiláře Rychlost pohybu iontů v je přímoúměrná intenzitě vkládaného elektrického pole E: (1) kde µ je elektroforetická pohyblivost (elektroforetická mobilita), U je vložené napětí a L je celková délka kapiláry. Pokud budeme separovaný ion považovat za kulově symetrický, můžeme předpokládat, že během separace budou na ion působit dvě síly opačného směru, a to síla elektrická a síla odporová. V ustáleném stavu dojde k vyrovnání těchto sil, což vyjadřuje rovnice (2) definující vztah pro elektroforetickou pohyblivost: (2) kde q je náboj iontu, η je dynamická viskozita prostředí, r je efektivní poloměr kulovité částice (včetně solvatačního obalu). Z této rovnice (2) mimo jiné vyplývá, že vícenásobně nabité ionty budou mít vyšší pohyblivost a naopak ionty s větším efektivním poloměrem budou mít elektroforetickou pohyblivost menší.
Pokud zahrneme vliv dalších transportních dějů (především vliv elektroosmotického toku), které se podílejí na migraci analytu, získáme mobilitu zdánlivou, kterou vyjadřuje rovnice (3): (3) kde l je to efektivní délka kapiláry, L celková délka kapiláry, t m migrační čas analytu, U separační napětí. Detekce v CE V kapilární elektroforéze jsou možné dva způsoby detekce, kterými jsou off-line a on-line detekce. Častěji využívanou detekcí je on-line detekce probíhající přímo. Nejčastěji využívanými typy detektorů jsou spektrofotometrické detektory, jejichž citlivost je však omezena krátkou optickou délkou danou průměrem separační kapiláry. Pro citlivější detekci je možné použít např. hmotnostní spektrometrii nejčastěji ve spojení s ionizací elektrosprejem. Hlavními výhodami spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem jsou: dosažení nižších koncentračních limitů ve srovnání s UV detekcí, možnost zakoncentrování analytů během separace a přesná identifikace analytů. Spojení CE-MS-ESI Pro spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií je důležité zvolit takové složení separačního elektrolytu, aby byla zajištěna stabilita elektrospreje, elektrolyt nepotlačoval proces ionizace a složky elektrolytu nekontaminovaly iontový zdroj. Běžný průtok základního elektrolytu, daný elektroosmotickým tokem v křemenné separační kapiláře, se pohybuje v řádu nl/min, což poskytuje objemové množství nedostatečné pro vytvoření stabilního spreje. Chybějící objem kapaliny je tedy nutno dodat z externího zdroje; obvykle se pro tyto účely používá tzv. pomocná kapalina (sheath liquid). Nejčastěji je to vodný roztok těkavé soli a vhodného organického rozpouštědla. Tato kapalina jednak zajišťuje vodivé spojení elektrických okruhů kapilární elektroforézy a hmotnostního spektrometru a jednak upravuje průtok a těkavost základního elektrolytu pro ionizaci elektrosprejem. Pro podpoření tvorby spreje a zvýšení jeho stability se do prostoru zdroje ESI přivádí pod vhodným tlakem inertní zmlžovací plyn. Realizace spojení CE-MS-ESI využívaného v cvičení je znázorněna na Obr. 2.
Obr. 2 Realizace spojení CE-MS-ESI Chinin Chinin (M r = 324,42 g/mol) je alkaloid mající zásadité vlastnosti vyskytující se v přírodě v kůře chinovníku. Nejčastěji je používán v medicíně jako antimalarikum, antipyretikum a analgetikum. Dále pak v potravinářství jako hořké ochucovadlo nápojů (např. tonik). Obsah chininu v toniku se pohybuje v rozmezí 25 75 mg/l. Nejvyšší povolené množství chininu v nealkoholických nápojích na bázi vody je stanoveno na 75 mg/l (hodnota pro Českou republiku). Smrtelná dávka chininu pro člověka je 8 10 g. Oba dusíkové atomy vyskytující se v molekule chininu (viz Obr. 3) jsou schopné protonizace. Disociační konstanty chininu jsou: pk 1 = 4,3 a pk 2 = 8,3. Obr. 3 Struktura chininu
Praktická část: Chemikálie: Methanol a voda pro hmotnostní spektrometrii, acetát amonný, standard chininu, deionizovaná voda, tonik Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky (50 ml, 100 ml), nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, teflonové míchadlo, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 81 cm), viálky, ependorfky Přístroje: Agilent HP 3D CE s UV-Vis a MSD detektorem, elektromagnetická míchačka, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, ph metr, váhy Separační parametry: Separační napětí: + 20 kv Dávkování: hydrodynamicky 50 mbar/5s Promývání mezi analýzami: 5 minut separačním pufrem Teplota: 20 C Průtok pomocné kapaliny: 0,4 μl/min Příprava roztoků: Připravte elektrolyt: 10 mm acetát amonný o ph = 7 (ředit vodou pro MS!) Připravte pomocnou kapalinu: směs MeOH : 10 mm acetát amonný (1:1) Připravte sadu kalibračních roztoků: koncentrace chininu 10, 20, 30 a 40 mg/l (ředit vodou pro MS!) Příprava vzorku: Nealkoholický nápoj (tonik) 2x nařeďte vodou pro MS Zředěný vzorek umístěte na 10 minut do ultrazvuku
Postup: Podle instrukcí vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry (81 cm). Ve vzdálenosti 21 cm odstraňte (pomocí vypalovače) polyimidovou vrstvu kapiláry (cca 0,5 cm), čímž vytvoříte detekční okýnko potřebné pro online detekci Okýnko omyjte methanolem a důkladně vysušte Podle instrukcí vedoucího cvičení umístěte na kapiláru interface a vložte kapiláru do CE kazety a následně do přístroje Za pomoci vedoucího cvičení zapněte přístroj, promyjte kapiláru (10 minut H 2 O, 10 minut separační pufr) a nastavíte všechny parametry metody (separační napětí, způsob dávkování, promývání, teplotu, atd.). Do dvou plastových viálek odpipetujte 600 µl separačního elektrolytu (10 mm acetát amonný ph 7,0): 1. viálka bude sloužit jako promývací, 2. jako separační. Dále připravte viálky obsahující připravený vzorek a kalibrační vzorky. Postupně proměřte všechny kalibrační roztoky a poté vzorek (každé měření provádějte 3x!) Sestavte kalibrační křivku a vypočtěte množství chininu v předloženém vzorku toniku (nezapomeňte na ředění vzorku při úpravě vzorku). Otázky: Co má vliv na elektroforetickou pohyblivost iontů? V jaké oblasti ph má elektroosmotický tok větší rychlost - v kyselé nebo zásadité a proč? Jaké jsou výhody spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem? V jakém odvětví se používá chinin a k čemu? LITERATURA 1. Quantitative Applications of Mass Spectrometry (Paperback) by P. Traldi, F. Magno, I. Lavagnini, R. Seraglia. 2. Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation (Hardcover) by J.T. Watson, O.D. Sparkman. 3. Mass Spectrometry: Principles and Applications, by E. de Hoffmann, V. Stroobant. 4. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašíčka.