Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody

Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody Materiál je určen studentům k předmětu Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv bakalářského studia oboru Analýza léčiv Zpracoval a editoval kolektiv autorů pod vedením prof. Dr. RNDr. Pavla Matějky Obsah Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody... 1 1. Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů... 7 1.1. Úvod charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv... 7 1.2. Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky... 8 1.3. Vibrační spektroskopie... 10 1.3.1. Základní uspořádání spektrometru... 11 1.3.2. Infračervená spektroskopie v blízké a střední infračervené oblasti... 12 1.3.3. Instrumentace pro střední infračervenou oblast... 13 1.3.4. Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR... 15 1.3.5. Aplikace vibrační spektroskopie... 15 1.3.6. Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR spektroskopie... 16 1.4. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti... 17 1.4.1. Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti... 17 1.4.2. Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast... 18 1.4.3. Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat... 21 1.4.4. Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie... 23 1.4.5. NIR spektroskopie a polymorfismus... 26 1.4.6. Pseudopolymorfismus, hydráty a solváty... 27 1.4.7. Ověřování léčiv a odhalování padělaných a klonovaných verzí... 28 1.4.8. Příklady dalšího farmaceutického použití NIR spektrometrie... 29 1.5. Ramanova spektroskopie... 31 1

1.5.1. Teorie Ramanova rozptylu... 31 1.5.2. Instrumentace Ramanovy spektroskopie... 34 1.5.3. Farmaceutické aplikace Ramanovy spektroskopie... 35 1.5.4. Ramanova spektrometrie jako technika pro proces monitorování, degradace, stability a krystalizace... 36 1.5.5. Polymorfismus a použití Ramanovy spektroskopie... 40 1.5.6. Pseudopolymorfismus a Ramanova spektroskopie... 42 1.5.7. Využití Ramanovy spektroskmopie jako procesní analytické techniky v rámci PAT... 44 1.5.8. Ramanova spektroskopie další příklady farmaceutických aplikací... 46 1.6. Chemické zobrazování a mapovací mikrospektroskopické techniky... 48 1.6.1. Principy spektrálního zobrazování a mapování... 48 2. Spektroskopie nukleární magnetické resonance jako nástroj pro studium farmaceutických systémů... 51 2.1. Principy spektroskopie nukleární magnetické resonance... 51 2.2. Farmaceutické aplikace NMR spektroskopie... 53 2.3. Využití NMR spektroskopie těžších jader ve farmacii... 53 2.4. NMR spektroskopie a polymorfismus... 54 2.5. Analýza léčivé látky a lékové formy pomocí NMR... 56 2.5.1. Konformace, stereochemie a interakce vodíkových vazeb... 56 3. Terahertzová pulzní spektroskopie... 57 3.1. Teoretický úvod k THz spektroskopii... 57 3.2. Instrumentace THz spektroskopie... 57 3.3. Příprava vzorku a manipulace s ním... 59 3.4. Nedávný rozvoj THz instrumentace... 60 3.5. Farmaceutické aplikace THz spektroskopie... 60 4. Termická analýza konvenční techniky... 74 4.1. Úvod do termické analýzy... 74 4.2. Diferenční skenovací kalorimetrie... 74 4.2.1. Měření tepelného toku... 75 2

4.2.2. Derivační křivky při DSC... 76 4.2.3. Praktické pokyny pro DSC experiment... 77 4.2.4. Enkapsulace pro DSC měření... 77 4.2.5. Teplotní rozsah běžných DSC měření... 79 4.2.6. Rychlost skenování při DSC experimentu... 80 4.2.7. Ustavení rovnováhy v DSC přístroji... 81 4.2.8. Kalibrace DSC... 82 4.2.9. Faktory ovlivňující DSC kalibraci... 82 4.2.10. Systém DSC s dvojitou pecí... 83 4.2.11. Systém DSC s jednoduchou pecí... 84 4.3. Diferenční termická analýza (DTA)... 85 4.3.1. Modulovaný profil teploty... 86 4.4. Postupné/krokové metody termické analýzy... 87 4.5. Termogravimetrická analýza (TGA)... 88 4.5.1. Design přístroje pro TGA... 88 4.5.2. TGA kalibrace základní pokyny... 89 4.5.3. Praktická upozornění pro TGA experiment... 89 4.5.4. Interpretace TGA záznamu vzorku... 92 4.6. Dynamická mechanická analýza (DMA)... 93 4.6.1. Definice dynamické mechanické analýzy... 93 4.6.2. Principy dynamické mechanické analýzy... 94 4.7. Zjištění chování pevných krystalických látek v průběhu tání... 97 4.7.1. Vyhodnocení přechodu bodu tání... 98 4.7.2. Určení bodu tání pro identifikaci vzorků... 99 4.8. Polymorfismus a termická analýza... 100 4.8.1. Význam polymorfismu ve farmaceutických aplikacích... 101 4.8.2. Termodynamické a kinetické aspekty polymorfismu: enantiotropie a monotropie... 102 4.8.3. Charakterizace polymorfů pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)... 105 4.8.4. Zjišťování polymorfní čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie... 108 3

4.8.5. Interpretace naměřených DSC termogramů vzorků vykazujících polymorfismus... 113 4.8.5.1. Křivky typu 1: Přechod pevná látka-pevná látka... 113 4.8.5.2. Křivky typu 2: Rekrystalizace kapalina-tavenina... 114 4.8.5.3. Křivky typu 3: Zjišťování bodu tání... 114 4.9. Solváty a hydráty (pseudopolymorfismus) a termická analýza... 115 4.9.1. Faktory ovlivňující experimentální DSC křivky hydrátů a solvátů... 115 4.9.2. Typy desolvatace/dehydratace v termické analýze... 117 4.9.2.1. Křivky typu 1: Dehydratace/desolvatace bez rekrystalizace... 117 4.9.2.2. Křivky typu 2: Dehydratace/desolvatace provázená rekrystalizací... 119 4.10. Spřažená emisní termogravimetrická analýza (EGA) a simultánní měření... 120 4.11. Složení amorfních látek a jejich význam ve farmacii... 122 4.11.1. Úvod k amorfním látkám... 122 4.11.2. Charakterizace amorfní pevné látky pomocí termických metod: teplota skelného přechodu 123 4.11.3. Kvantifikace amorfních látek použitím diferenční skenovací kalorimetrie... 126 4.12. Stanovení čistoty preparátů použitím diferenční skenovací kalorimetrie... 129 4.12.1. Typy nečistot ve farmacii... 129 4.12.2. Diferenční skenovací kalorimetrie jako metoda pro stanovení čistoty ve farmacii... 130 4.12.3. Praktické provedení termické analýzy a potenciální interference... 132 4.13. Kompatibilita pomocných látek... 135 4.13.1. Screening kompatibility pomocné látky pomocí diferenční skenovací kalorimetrie... 136 5. Mikroskopie... 142 5.1. Úvod k mikroskopickým technikám... 142 5.2. Mikroskop jako analytický přístroj... 143 5.3. Jaký mikroskop použít?... 144 5.4. Optická mikroskopie... 145 5.4.1. Polarizační optický mikroskop pro studium vlastností látek v pevné fázi... 147 5.4.2. Příprava vzorku pro optickou mikroskopii... 150 4

5.4.3. Charakterizace krystalických a amorfních materiálů s využitím polarizační optické mikroskopie... 152 5.4.4. Určování optických vlastností krystalů... 153 5.4.5. Měření indexu lomu pevných látek... 161 5.4.6. Určení mikrorozpustnosti pevných látek... 162 5.5. Tvar krystalů... 164 5.6. Velikost částic... 166 5.7. Optická mikroskopie za nestandardních podmínek... 168 5.7.1. Termomikroskopie... 169 5.7.2. Stupeň vlhkosti... 178 5.7.3. Stolek pro mrazové sušení... 179 5.7.4. Výzkum tekutých krystalů s využitím optické mikroskopie za nestandardních podmínek. 180 5.8. Skenovací elektronová mikroskopie... 182 5.8.1. Princip řádkovací elektronové mikroskopie (SEM)... 185 5.8.2. Příprava vzorku pro řádkovací elektronovou mikroskopii... 187 5.8.3. Interakce elektronového paprsku se vzorkem... 190 5.8.3.1. Sekundární elektrony... 191 5.8.3.2. Zpětně rozptýlené elektrony... 193 5.8.3.3. Rentgenové záření v elektronové mikroskopii... 195 5.8.3.4. Katodoluminiscence... 195 5.8.3.5. Environmentální SEM a VP SEM (mód s proměnným tlakem - variable pressure mód) 196 5.8.4. Kvantitativní analýza SEM obrazů... 198 5.9. Prvková rentgenová mikroanalýza... 200 5.9.1. Detekce rentgenového záření... 201 5.9.2. Rentgenové emisní spektrum... 202 5.9.3. Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza jednotlivých částic a mapování prvků... 203 5.10. Mikroskopie atomárních sil... 205 5.10.1. Princip jednotlivých technik mikroskopie atomárních sil... 207 5

5.10.1.1. Zobrazování... 207 5.10.1.2. Příprava vzorku... 210 5.10.2. Aplikace AFM ve farmaceutické analýze... 211 5.10.2.1. Morfologická analýza... 211 5.10.2.2. Analýza lokálních interakcí mezi sondou a vzorkem... 217 5.10.3. Vyhlídky do budoucnosti... 220 6

1. Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů 1.1. Úvod charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv Fyzikální a fyzikálně chemická charakterizace pevných farmaceutických látek a pevných léčiv je nedílnou součástí procesu vývoje léčiv, a dále je také nezbytnou součástí kontroly výroby farmaceutických látek i léčiv v konkrétních formulacích. Charakterizace farmaceutických látek i léčiv v jednotlivých formulacích hraje důležitou roli i z hlediska patentových práv a také z hlediska kontroly léčiv dozorovými autoritami. Již dlouho je známo, že farmakav pevné fázi mohou existovat ve více než jedné pevné formě (např. polymorfní krystaly a podchlazené amorfní kapaliny viz Haleblian a McCrone 1969). Jednotlivé pevné formy léčiv mohou vykazovat výrazně odlišné fyzikální a chemické vlastnosti, včetně barvy, morfologie, stability, rozpustnosti, sypkosti, tableting behaviour a biologické dostupnosti (Holzgrabe a kol. 1999) {poznámka překladatele: Biologická dostupnost je údaj, který vyjadřuje procento podané dávky, které je organismem využito}. Běžně se pro vývoj finálního produktu volí termodynamicky nejstabilnější forma, ale v posledních letech se začínají uplatňovat metastabilní formy, z důvodu vyšší rozpustnosti nebo profilu biologické dostupnosti. Ve všech případech je úplná charakterizace aktivní farmaceutické složky nezbytná pro pochopení chemických a fyzikálních vlastností materiálu. Při rozšíření uvedeného konceptu musí kvalitativní analýza zahrnovat aktivní farmaceutickou složku ve dvou úrovních: jako samotnou léčivou látku a stejně tak ve finálním léčivu. V návaznosti na tento krok je nezbytná rovněž kvantitativní analýza obou forem. V minulosti byla charakterizace aktivní farmaceutické složky založena na optické mikroskopii, rentgenové difrakci a termálních technikách, včetně diferenciální skenovací kalorimetrie a termogravimetrické analýzy. V roce 1940 se další využívanou technikou v multidisciplinárním postupu 7

charakterizace pevných farmaceutických látek stala infračervená spektroskopie. Nedávno byly do arzenálu používaných technik přidány spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), Ramanova spektroskopie, nukleární magnetická rezonance pevné fáze a terahertzová spektroskopie. Výběr a správná aplikace těchto analytických technik pro charakterizaci pevných farmak závisí na požadované analytické informaci a fyzikální a chemické povaze vzorku. Všechny tyto techniky zahrnují měření interakce elektromagnetického záření externího zdroje se vzorkem a schopnost vzorku podstoupit další energetické změny. Energie tohoto elektromagnetického záření určuje fyzikálně-chemické vlastnosti vzorku, které mají být zkoumány. Je proto vhodné důkladně zopakovat vlastnosti samotného elektromagnetického záření. 1.2. Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky Elektromagnetické spektrum pokrývá oblast vibračních energií a vlnových délek od několika metrů do 10-2 nanometru (kosmické záření). Bylo demonstrováno, že elektromagnetické záření se chová jednak jako vlnění a jednak jako proud částic. Vlnění můžeme popsat pomocí klasického sinusoidálního vlnového modelu. Elektromagnetické záření můžeme proto charakterizovat jeho vlnovou délkou, λ, frekvencí, v, rychlostí šíření, c, a amplitudou (obr. 3.1). Vlnová délka je vzdálenost dvou následujících bodů s odpovídající fází vlny a je rovna podílu rychlosti záření jeho frekvencí (jednotka: metr). V molekulové spektroskopii je vlnová délka často z pohodlnosti vyjádřena v nanometrech (nm) nebo mikrometrech (µm) (nanometr je 10-9 m; mikrometr, někdy též hovorově mikron, je 10-6 m). Frekvence, ν, značí počet kompletních vlnových cyklů, které proběhnou za sekundu (jednotka: Hz/s -1 ) (Murray and Williams 1987). Rychlost elektromagnetického záření, c, je konstanta nazývaná rychlost světla (ve vakuu c = 2.997925. 10 8 ms 1 ). Vzájemný vztah vlnové délky, frekvence a rychlosti ve vakuu je popsán následující rovnicí: 8

Energie fotonu (jakožto kvanta) elektromagnetického záření je přímo úměrná jeho frekvenci a tedy nepřímo úměrná vlnové délce. Převrácená hodnota vlnové délky je známa jako vlnočet, (jednotka: cm -1 ): λ λ Obr.: Schématické znázornění elektromagnetické vlny: rovinně polarizovaný vektor elektrického pole Energie elektromagnetického záření, E, je přenášena v diskrétních svazcích či kvantech, nazývaných fotony a je vztažena k frekvenci (nebo vlnočtu) přes Plankovu rovnici kde h je Plankova konstanta (h = 6.626 196 10 34 J s). Elektromagnetické záření je příčné vlnění a nevyžaduje pro svůj přenos hmotné či podpůrné prostředí, tj. je schopné šiřit se vakuuem. Sinusoidálně vlnový model popisu elektromagnetického záření není schopen odpovídajícím způsobem popsat absorpci a emisi zářivé energie. Tyto jevy lépe popisuje částicový (kvantový) model elektromagnetického záření. V tomto modelu je záření představováno proudem oddělených (diskrétních) částic (vlnových balíků), které nazýváme fotony. Oba uvedené modely se vzájemně doplňují v popisu vlastností EM záření, a proto obvykle mluvíme o vlnově-částicovém chování EM záření. Energie EM záření je přímo úměrná jeho frekvenci (Murray a Williams 1987). 9

Vlnový model EM záření rozlišuje elektrickou a magnetickou složku, které jsou navzájem kolmé, jsou kolmé ke směru šíření, a jejich sinusoidální oscilace jsou ve fázi. V případě lineárně polarizovaného záření je elektrická složka omezena jednou rovinou rovinou vibrace. Magnetický vektor osciluje rovněž v jediné rovině, kolmé k rovině vibrace, kterou nazýváme rovinou polarizace (obr. 3.2). Je to právě elektrická složka EM záření, která se uplatní při spektroskopických jevech: absorpce, průchod, reflexe a refrakce při interakci s materiálem. Při každém z těchto procesů molekula absorbuje energetický foton a dojde k přechodu molekuly ze základního na vzbuzený rotační, vibrační nebo elektronový energetický stav. Tento přechod provází absorpce odpovídajícího množství energie, ΔE, a molekula tak může absorbovat pouze takový foton, jehož energie odpovídá frekvenci charakteristické vibrace molekuly. Oblast elektromagnetického záření může být rozdělena na několik podoblastí, které nám pomohou vhodně zvolit analytickou techniku (obr. 3.3). 1.3. Vibrační spektroskopie Infračervená oblast elektromagnetického spektra leží v oblasti 800 až 1000000 nm (0,8 až 1000 µm). Spektra se nejčastěji měří s linearizovanou stupnicí, která je inverzní k vlnové délce a nazývá se vlnočet (, jednotka: reciproký centimetr), protože vlnočet je přímo úměrný k energii a frekvenci absorpčního přechodu a nabývá smysluplnější číselné hodnoty vůči kterým je spektrum vynášeno. IR oblast můžeme rozdělit na tři podoblasti: rozsah 12500 až 4000 cm -1 (0,8 2,5 µm) je známa jako blízká infračervená oblast; střední infračervenou oblastí nazýváme rozsah 4000 až 400 cm -1 (2,5 25 µm) a rozsah 400 až 10 cm -1 (25 1000 µm) je nazýván dalekou infračervenou oblastí (někdy též terahertzová oblast) (Murray and Williams 1987). Při farmaceutické analýze se využívá oblast střední nebo blízká infračervená. Blízkou infračervenou oblast můžeme dále dělit na rozsahy 780 až 1100 nm (Herschlova oblast) a 1100 až 2500 nm. Tato oblast se při farmaceutické analýze využívá častěji. Ramanova spektroskopie se zabývá měřením neelastického rozptylu monochromatického záření koherentního zdroje na zkoumaném vzorku. Frekvenční posun odpovídající jednotlivým vazebným vibračním módům je stejný jako odpovídající vlnočet absorpčního pásu ve střední infračervené oblasti. Ramanova spektroskopie a spektroskopie ve střední infračervené oblasti jsou proto komplementárními technikami. 10

1.3.1. Základní uspořádání spektrometru Molekulární spektroskopie využívá pro analýzu nejčastěji jedno ze dvou základních uspořádání: transmisní a reflexní měření. V prvním případě záření s žádanou vlnovou délkou nebo s určitým rozsahem délek prochází kolmo přes kyvetu, s fixní optickou dráhou, obsahující měřený analyt. Intenzita záření vystupujícího z kyvety je porovnávána s intenzitou záření vystupujícího z referenční kyvety (obvykle obsahuje stejné prostředí, ve kterém se nachází měřený analyt; tímto prostředím může být vzduch, sintrované PTFE, rozpouštědlo aj. obr. 3.4) Reflexní spektroskopie využívá dopadajícího záření dané vlnové délky, resp. rozsahu vlnových délek, a měří intenzitu záření reflektovaného (odraženého) vzorkem. Dopadající a odražený paprsek se měří v úhlu 45 k rovině neprůhledného difusně reflexního vzorku (obr. 3.4). Intenzita reflektovaného záření je porovnávána s intenzitou záření reflektovaného neabsorbujícím standardem (např. sintrované PTFE Spectralon v NIR spektroskopii nebo lisovaný práškový síran barnatý). Oba typy instrumentací pracují s mírou absorpce záření o dané vlnové délce (resp. vlnových délkách při měření celého spektra). Označme intenzitu vstupujícího záření (záření prošlé slepým vzorkem nebo reflektované standardem) při jednotlivých vlnových délkách jako I 0 a záření prošlé či reflektované vzorkem při stejné vlnové délce jako I. Obr. 3.4 Základní konfigurace spektrometru v reflexním a transmisním uspořádání (převzato z Practical NIR spectroscopy with applications in food & beverage analysis). Transmitance, T, je pak dána poměrem: běžně vyjadřované jako procenta transmitance, %T, dané vztahem: Reflektance, R, je obdobně dána poměrem 11

Reflektance i transmitance jsou definovány jako poměr a jsou tedy bezrozměrné, hodnoty nabývají v rozsahu 0 až 1. Pro každou vlnovou délku je při měření vzorku v transmisním uspořádání absorbance, A, definována jako: ( ) ( ) Při měření v reflexním uspořádání je absorbance, A, definována obdobně jako: ( ) ( ) Absorbance je rovněž bezrozměrnou veličinou. V reflexním uspořádání nabývá hodnot od 0 do 2 (například v NIR oblasti s využítím 99% PTFE reflexního standardu), v transmisním módu, v závislosti na zvoleném rozsahu a citlivosti detektoru může absorbance nabýt hodnot od 0 do 6. Výjimečně může být hodnota absorbance i vyšší (intenzita záření prošlého na detektor je nižší nebo rovna miliontině intenzity záření dopadajícího na vzorek). 1.3.2. Infračervená spektroskopie v blízké a střední infračervené oblasti Spektroskopie v blízké i střední infračervené oblasti se zabývá studiem rozptylu, reflexe, absorpce nebo propustnosti infračerveného záření. Spektra vznikají na základě absorpce infračerveného záření odpovídající vibračním modům molekuly. Z hlediska vibračních módů rozlišujeme dva druhy valenčních vibrací (změna v délce vazby) a čtyři módy deformačních vibrací (změna vazebného úhlu). U infračerveného spektra nás zajímá několik charakteristik: počet vibračních pásů a jejich vlnočet, intenzita a šířka vibračního pásu. Každá molekula léčiva bude mít (3N-6) vibračních módů, kde N značí počet atomů v molekule. Tyto módy označujeme jako fundamentální a vyžadují pro svou excitaci energii ve střední infračervené oblasti spektra. Avšak pouze nejintenzivnější vibrace budou detekovány s přesným přiřazením vlnočtu. Tyto vlastnosti závisí jak na síle vazby, tak na hmotnosti vázaných atomů. Obecně, při pokojové teplotě, většina vazeb bude v základním energetickém stavu. Přechod ze základního stavu, v=0, na vzbuzený fundamentální stav (v=1) se projeví absorpcí dodané 12

infračervené energie s fundamentální frekvencí. Tyto fundamentální frekvence jsou charakteristické pro danou vazbu a umožňují tak identifikovat jednotlivé funkční skupiny. Běžné vibrace jsou uvedeny v tabulce 3.1. Infračervená spektra jsou ale mnohdy složitější, především v oblasti 1800 až 400 cm -1. Tato oblast otisku palce je bohatá na úzké absorpční pásy (malá pološířka linií), z nichž většina je nepřiřaditelná k dané funkční skupině. Přesto navzdory komplexnosti dané oblasti, zůstávají použitelné jako charakteristické absorpce celé molekuly, Tabulka: Charakteristické infračervené přechody a umožňují tak identifikaci (například s využitím počítačových vyhledávacích databází nejintenzivnějších absorpčních pásů nebo porovnáním s tabelovanými a knihovnovými spektry. Přístroje s Fourierovou transformací (FT) mají excelentní poměr signál-šum, přesnou frekvenci a stabilitu. Spektroskopie ve střední IR oblasti je nejstarší ze všech tří vibračně-spektroskopických technik a s využitím tradiční instrumentace trpí několika nevýhodami. Záření MIR neprochází přes většinu obvyklých optických materiálů a omezuje tak vzorkovací možnosti (není například možné analyzovat pevný vzorek ve skleněné vialce). Mnoho materiálů má vysokou molární absorptivitu ve střední IR oblasti. Z tohoto důvodu musí být pevné vzorky často připravovány v tabletách alkalických halogenidů nebo jako tenké filmy v tekutém parafinu (Nujol) mezi okénky z alkalických halogenidů (např. NaCl, KBr). Hydratované vzorky musí být ve formě velmi tenkých filmů, protože páry vody jsou rovněž interferentem. 1.3.3. Instrumentace pro střední infračervenou oblast Většina MIR spektrometrů využívaných při farmaceutické analýze je buď dispersní povahy či mnohokanálového multiplexního typu (využívájící Fourierovu transformaci). Multiplexní spektrometry využívají obvykle Michelsonův interferometr a jsou jednopaprskové. Tento typ využívá pohyblivé zrcadlo, které se posouvá plynulým pohybem o konstantní rychlosti úsekem vlnových délek (rozsah 50 1000 µm). V případě spektrometrů ve střední a blízké IR oblasti je toto zrcadlo obvykle přiděláno na plovoucím, vzduchovém polštáři voně mezi přesnými nerezovými objímkami. Zrcadlo je poháněno pomocí lineárního motoru, který zvyšováním napětí v elektromagnetické cívce umožňuje 13

zrcadlu pohyb konstantní rychlostí. Dráha pohybu zrcadla v interferometru se pohybuje od 1 do 20 cm s obvyklou skenovací rychlostí 0,01 až 10 cm/s (Skoog a kol.). Spektrometry s Fourierovou transformací dosahují ve střední IR oblasti více jak o řád lepší poměr signálu k šumu v porovnání s vysoce výkonným dispersním spektrometrem. Díky tomu umožňují rychlé měření (doba měření: několik sekund) akceptovatelných spekter, s malým počtem kompletních skenů. Kromě toho umožňují přístroje s Fourierovou transformací vysoké rozlišení (<0,1 cm -1 ), přesnost a reprodukovatelnost frekvenční škály. Většina dispersních MIR spektrometrů je naopak dvoupaprskových, a to z důvodu relativně malé intenzity infračervených zdrojů záření, nízké citlivosti detektorů a především kvůli absorpci MIR záření atmosférickou vodní parou a oxidem uhličitým (může vyvolat interference). Referenční paprsek kompenzuje tyto atmosférické absorpce a fluktuace výkonu zdroje záření, což se projeví stabilní základní linií na hodnotě 100%T. Záření zdroje je rozděleno do dvou paprsků, přičemž polovina záření prochází vzorkovým prostorem a polovina slouží jako srovnávací (referentní). Intenzita srovnávacího paprsku je zeslabena pohybem hřebenu, procházejícím příčně skrz paprsek. Pro dělení referenčního a měřícího paprsku se využívá nízkofrekvenční dělič (5 až 13 rotací za sekundu). Tento motorem řízený disk střídavě propouští měřící paprsek a odráží paprsek srovnávací. Oba paprsky následně prochází přes monochromátor (hranol nebo mřížka) a rozdělují se podle vlnových délek, které jsou detegovány, převedeny na napětí a zaznamenány (Skoog a kol.). Při měření pevných vzorků zahrnuje příprava vzorku buď tvorbu lisovaných diskových tablet vzorku v halogenidu alkalického kovu (např. KBr) nebo suspenze vzorku v uhlovodíku s dlouhým řetězcem (např. Nujol), která je umístěna mezi dvě okénka halogenidu. První je měřeno srovnávací spektrum/interferogram pozadí a až následně je do paprsku umístěn analyzovaný vzorek. Žádané spektrum je pak dáno poměrem spektrálního záznamu vzorku a spektra referentního. Ve střední infračervené oblasti se obvykle akumuluje více jednotlivých skenů pro každé měření. V případě fourierovských přístrojů jsou jednotlivé interferogramy sčítány, u přístrojů dispersních se jednotlivá měření průměrují (obvykle 16 nebo 32 kompletních skenů pro oba typy spektrometrů). 14

1.3.4. Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR Spektroskopie totální vnitřní reflexe, označovaná častěji jako technika zeslabeného úplného odrazu (attenuated total reflection (ATR)) je technika umožňující měřit infračervená spektra vzorků, u nichž by standardní techniky nešly použít (Skoog a kol.). Z farmaceutického hlediska může být takovým materiálem například obtížně rozpustitelné léčivo a pomocné látky, tenké filmy, práškové vzorky a pasty. Příklad ATR modulu je uveden na obrázku 3.5. Spektrometrie zeslabeného úplného odrazu je založena na jevu reflexe záření při průchodu záření z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího. Během tohoto procesu část energie dopadajícího paprsku projde do velmi tenké vrstvy opticky řidšího prostředí (obr. 3.5). Hloubka průniku záření je závislá na vlnové délce, úhlu dopadu optického paprsku a indexu lomu obou optických materiálů. Obr.: Schématické znázornění přístroje pro měření zeslabeného úplného odrazu: (a) vzorek umístěný na vnitřně reflexní vrstvě; (b) internal reflection adapter Běžně se hloubka průniku pohybuje od zlomků vlnové délky záření až po několik jednotek vlnové délky. Pronikající záření je známo jako evanescentní vlna. Spektroskopie zeslabeného úplného odrazu je běžně dostupná jako přídavný nástavec většiny moderních infračervených spektrometrů (obr. 3.5). Vzorek se pouze přiloží na vnější stranu transparentního krystalu o vysokém indexu lomu (např. bromid thalný/jodid thalný, germaniová destička nebo selenid zinečnatý). Úhel dopadu záření je nastaven tak, aby nastalo několik vnitřních reflexí na rozhraní krystalu a vzorku předtím, než záření dorazí na detektor. {pozn. překladatele: uvedené platí pro případ víceodrazového ATR, jednoodrazové ATR využívá právě jednu reflexi} Při každé této reflexi nastane absorpce záření vzorkem a tedy zeslabení intenzity záření. Spektra zeslabeného úplného odrazu jsou velmi podobná běžným absorpčním spektrům, včetně polohy jednotlivých vibračních pásů. Relativní intenzity jednotlivých pásů se liší od tradičnítransmitanční MIR spektrometrie. Běžně záření proniká do hloubky několika mikrometrů vzorku. 1.3.5. Aplikace vibrační spektroskopie FT-IR s využitím zeslabeného úplného odrazu se široce využívá pro charakterizaci farmaceutických látek v pevném stavu. Metoda se využívá i pro studium interakcí mezi jednotlivými složkami léku, míry rozpustnosti (dissolution rate) a uvolnění léčiva z polymerní matrice (polymer-drug formulation) 15

(Park a kol. 1999). ATR FT-IR využili Kazarian a Matirosyan (Kazarian a Matirosyan 2002) při in situ studiu vysokotlaké superkritické impregnace (impregnation) PVP ibuprofenem v superkritickém CO 2. Autoři ve své práci ukázali, že je tato technika vhodná pro studium impregnace široké skupiny polymerů molekulami léčiva v prostředí superkritické kapaliny. Dále bylo ukázáno, že superkritická kapalinová impregnace léčiva do polymerní matrice vede k molekulárně rozptýlenému léčivu v polymerní matrici, bez krystalizace léčiva. Další zkoumání bylo provedeno analýzou pomocí Ramanovy spektroskopie. Autoři popsali využitelnost tohoto postupu pro optimalizaci (tailor) rychlosti uvolňování léčiva s řízeným uvolňováním, snadněji kontrolovatelnému díky absenci krystalické fáze. Spektra ATR FT-IR prokázala interakci mezi léčivem a polymerní matricí, specifickou vodíkovou vazbou mezi hydroxy- skupinou ibuprofenu a karbonylovou skupinou PVP; tato interakce tedy potlačuje asociaci molekul ibuprofenu. Interakce ibuprofenu s karbonylovou skupinou PVP potlačuje pohlcování vody. Závěrem lze říct, že bylo prokázáno, že metoda je použitelná pro přípravu impregnovaných polymerních filmů; CO 2 změkčuje PVP film, usnadňuje difundování léčiva do filmu, a jako rozpouštědlo se snadno odstraňuje. Metoda soupeří s tradiční metodou přípravy pevných disperzí, zejména s použitím ve vodě špatně rozpustného léčiva. 1.3.6. Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR spektroskopie Použití ATR-FT-IR spektroskopie pro charakterizaci pevné fáze zahrnuje identifikaci látky, její kvantifikaci a určení krystalové formy. V porovnání s tradiční MIR spektrometrií je nutná jen mírná předúprava a drobné množství vzorku (řádově miligramy) může být rychle analyzováno, přičemž získáme ostré intenzivní spektrální pásy s vysokým poměrem signálu k šumu. Tabulka 3.2 uvádí deset nejintenzivnějších pásů vyskytujících se u práškových léčivých a pomocných látek (řazeno podle klesající intenzity) při analýze ATR technikou. Tato tabulka zdůrazňuje použitelnost metody pro rychlou nedestruktivní identifikaci a roztřídění práškových, krystalických materiálů. Vybrané ukázky ATR FT-IR spekter α-laktózy (monohydrát a bezvodá forma) jsou uvedeny na obrázku 3.6 a 3.7. Obrázky 3.8 a 3.9 ukazují spektra naměřená pro kofein a paracetamol a na obrázku 3.10 je ukázka spektra stearátu hořečnatého (lubrikant). Technika je rovněž schopna odlišit jednotlivé polymorfní 16

formy materiálu. Ukázka identifikace a odlišení dvou polymorfních forem Salmeterol xinafoate_u je popsána v tabulce 3.3 a na obrázcích 3.11 a 3.12. Tabulka 3.2 Pozice ATR FT-IR absorpčních pásů běžných farmaceutických a pomocných látek (řazeno podle klesající intenzity, lineárně interpolováno ze záznamu prvních derivací spekter, rozsah vlnočtů: 4000,4 648,08 cm -1 ). Obr.: ATR spektrum monohydrátu α-laktózy Obr.: ATR spektrum bezvodé α-laktózy 1.4. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti Spektroskopie v blízké infračervené oblasti z velké míry spadá do vibrační spektroskopie, ale vzhledem k jejím specifickým aspektům se často probírá samostatně. 1.4.1. Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti Absorpce v blízké infračervené oblasti (NIR) odpovídá svrchním tónům (overtonům), kombinačním a rozdílovým přechodům odpovídajících fundamentálních vibračních přechodů (obr. 3.13), ale také některým nízkoenergetickým elektronovým přechodům. NIR absoprce projevuje se v rozsahu vlnových délek cca 700 2500 nm (14300 4000 cm -1 ). Jelikož jsou tyto přechody z hlediska kvantové mechaniky pro případ harmonického oscilátoru zakázané, mají tendenci být oproti MIR pásům slabší. Ačkoliv se při NIR absorpci uplatňují fotony s vyšší energií, jsou propouštěny běžnými optickými materiály i sklem. Molární absorptivita těchto materiálů je v NIR oblasti o dva až tři řády slabší než v MIR oblasti a tyto materiály tak propouštějí NIR záření do větší hloubky. Při NIR analýze tak není nutná tak důkladná příprava vzorku, nebo použití tenkých filmů. Je naopak možná neinvazivní analýza pomocí vláknové optiky nebo přes skleněnou nádobu. Z tohoto důvodu je tato technika široce užívána farmaceutickými firmami při výrobě k identifikaci pomocných látek. Obr. ATR spektrum paracetamolu Obr. ATR spektrum bezvodého kofeinu 17

Dokonce i po smíšení práškových látek, tvorbě tablety nebo kapsle můžou být tyto kompaktní formy nebo kapsle analyzovány pomocí difusní reflexe nebo transmisního měření. Kubelka-Munkova teorie difusní reflexe se běžně využívá při popisu interakce NIR záření s pevnou látkou (Kortüm 1969). Všechny práškové farmaceutické látky rozptylují dopadající NIR záření. Tento rozptyl je závislý na vlnové délce velikosti částic a jejich tvaru. Při průchodu záření přes vzorek zpět na detektor dojde k opoakovanému rozptylu na jednotlivých částicích látky. Kromě toho mohou částice v průběhu rozptylu část záření rovněž absorbovat. Důsledkem toho je, že spektra pevných látek obsahují kromě absorpčních pásů prohnutou či posunutou základní linii. Surová reflektanční spektra mohou být převedena pomocí matematické Kubelka-Munkovi funkce, která vztáhne reflektanci k teoretickým absorpčním (přímá úměra (direct relationship)) a rozptylovým koeficientům (nepřímá úměra). Obr. ATR spektrum stearátu hořečnatého Tabulka 3.3 Pozice deseti nejintenzivnějších absorpčních pásů ATR spekter práškových polymorfních forem Salmeterol xinafoate_u (forma I a II), získané pomocí zero-crossing point první derivace spektrálního záznamu (sedmibodový filtr typu Savitzky-Golay, kubický polynom) Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma I) Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma II) Obr. Hladiny vibrační energie v diatomické molekule. Fundamentální přechod (ν=0 ν=1); první svrchní tón (ν=0 ν=2); druhý svrchní tón (ν=0 ν=3) Mnoho literárně publikovaných aplikací pak využívá buď další matematické předzpracování surových dat (např. převod na absorbanci, ( )) nebo samotná surová data (reflektanci, R, nebo transmitanci, T). Základním požadavkem teorie difusní reflexe je nekonečná tloušťka vrstvy práškového materiálu. V praxi bylo zjištěno, že práškový vzorek by měl být ve vrstvě alespoň 1 cm, aby bylo dosaženo reprodukovatelných spekter s vysokým poměrem signál/šum (Yoon a kol. 1998); u tablet většinou postačí několik milimetrů. 1.4.2. Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast Spektrometry pro blízkou infračervenou oblast jsou svým designem velmi podobné UV-Vis spektrometrům a můžeme je dělit na tři základní typy podle způsobu spektrálního výběru: disperzní, 18

interferometrické a netermální. První dva typy využívají širokospektrální tepelný zdroj záření, nejčastěji žhavené vlákno (např. halogenovou výbojku quartz tungsten). Netermální design obsahuje studený zdroj záření a výběr vlnových délek je inherentně dán díky širokému spektrálnímu rozsahu emitovaného záření (Osborne a kol. 1993). Disperzní přístroje rozdělují širokopásmové záření zdroje prostorově (úhlově) použitím hranolu nebo mřížky. Hranol se stává neefektivním a trpí slabou nelineární, anomální disperzí (především rozptyluje spektrální oblast ve které absorbují OH vazby a to i v případě záření z IR čistého křemene). Z tohoto důvodu se v těchto přístrojích více používají difrakční mřížky. Vesměs se jedná o holografické reflexní mřížky z vysoce leštěného kovu (např. hliník) s laserově nebo photo-etched ekvidistantními drážkami. Alternativní dispersní systém využívá akusticko-optický laditelný filtr (AOTF). Tento typ využívá anisotropického krystalu (např. TeO 2 ) jako disperzního prvku. Tento krystal is formed into aligned, cut a leštěného krystalu s rovinnou akustické vlny procházející transverzálně skrz krystal. Blízké infračervené záření dopadá na krystal kolmo k akustické rovině a interaguje s periodicitami v indexu lomu materiálu (periodicity je rovna vlnové délce akustického vlnění). Krystal tak pracuje jako podélná difrakční mřížka. Změnou frekvence akustického signálu se změní vlnová délka, při které jsou oba signály ve fázi. S využitím širokopásmového rovině polarizovaného zdroje je tedy možné, aby krystal fungoval jako laditelný úzce pásmově propustný filtr. Akustický signál je generován jedním nebo více piezo-elektrickými převodníky (transducers), které jsou vakuově přivařené ke straně krystalu. Pro NIR oblast záření pracují převodníky s frekvencemi 20 150 MHz a spotřebovávají jen několik watů. Využívané radiofrekvenční zdroje produkují vysoce stabilní frekvenční pásmo s rychlou změnou frekvence (několik mikrosekund). Vysokofrekvenční stabilita obvykle znamená kratší kalibraci než v případě mřížkového difrakčního systému (Osborne a kol. 1993). Interferometrické systémy využívají k spektrálnímu výběru optickou interferenci. Klasickým interferometrem je ten vytvořený Michelsonem v roce 1891 a nesoucí název Michelsonův interferometr (obr. 3.14). Základním principem, na kterém je systém postaven je rozdělení vstupního záření na dva samostatné paprsky, prodloužení optické dráhy jednoho z paprsků a jejich opětovné spojení. Základní sestava interferometru obsahuje dvě kolmá zrcadla, jedno pevné a druhé pohyblivé umístěné souběžně se vstupujícím zářením. Mezi oběma zrcadly je v úhlu 45 stupňů umístěn dělič paprsků, který rozděluje vstupující záření na dva paprsky a po odrazu na příslušném ze dvou zrcadel oba paprsky opět 19

kombinuje. Pokud je pohyblivé zrcadlo v základní poloze, jsou obě zrcadla, fixní i pohyblivé, ve stejné vzdálenosti od děliče paprsků. Optická dráha odraženého a znovu složeného paprsku je tak dvojnásobkem vzdálenosti zrcadel od děliče. Pokud je tedy pohyblivé zrcadlo v základní poloze, neexistuje žádný dráhový rozdíl (zpoždění (retardation)) mezi oběma rozdělenými paprsky a při jejich kombinaci dochází ke konstruktivní interferenci. V případě monochromatického záření dochází při posunu zrcadla o λ/4 k dráhovému rozdílu λ/2 a tedy k destruktivní interferenci obou paprsků, která vyústí v nulový detekovaný signál. Obr. Schéma Michelsonova interferometru (převzato z Osborne, Fearn & Hindle (1993), Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis) Zrcadlo interferometru se pohybuje konstantní lineární rychlostí a vytváří sinusoidální změny v intenzitě detekovaného signálu. Signál je zaznamenáván ve formě interferogramu, který je závislostí variability signálu na čase, resp. zpoždění (retardation). Protože používané zdroje jsou širokopásmové, je výsledný interferogram součtem jednotlivých sinusoidálních signálů odpovídajících každé vlnové délce. K rekonstrukci spektra z interferogramu je potřeba počítač, který využívá algoritmus inverzní Fourierovi transformace (ifft) a výpočet probíhá téměř okamžitě. Interferometrické přístroje jsou mnohokanálové (multiplexní), protože všechny části spektra jsou měřeny současně. Existuje rovněž několik modifikací Michelsonova interferometru. Příkladem může být interferometr na obr. 3.15, využívající místo zrcadel refrakční hranoly (Buhler NIRVIS, Buhler ANATEC AG, Uzwil, Švýcarsko). Zdroje záření pro NIR oblast jsou obecně širokopásmové a emitují záření od viditelné oblasti až po vlnovou délku 3 µm. Záření emitované zdrojem nemusí mít v celém rozsahu stejnou intenzitu, ale musí být stabilní v čase. Většina spektrometrů využívá žhavené objekty, emitující záření černého tělesa, kterým je typicky křemeno-wolframová halogenová žárovka s maximem okolo 1 µm a běžnou provozní teplotou 2400 K. Pro dosažení delší životnosti, obvykle několik tisíc hodin, není používána maximální teplota a výkon (až 3200 K), ale teplota nižší, která nevyvolává takové ztráty wolframu ve vlákně a prodlužuje životnost výbojky (Osborne a kol. 1993:69). Detektory, používané v NIR spektroskopii se liší svou citlivostí pro tuto oblast. Fotodiody z křemíku a germánia jsou citlivé v oblasti Vis-NIR. Křemíkové diody jsou nejcitlivější v oblasti vlnových délek od uv-a (0,38 µm) nebo viditelné (0,4 µm) až po 1 µm, s maximem u ca. 0,85 µm. 20

Germániové detektory mají maximum okolo 1,3 µm. Častěji jsou používané detektory z olověných solí (sulfidu, PbS, a selenidu, PbSe), využívající fotoelektrický jev. Obr. Schématické znázornění FT-NIR spektrometru (Buhler FT-NIR Universal Spectrometer, System NIRVIS, převzato z Buhler NIRVIS manual, Buhler Anatec, Uzwil, Švýcarsko) Detektory ze sulfidu olovnatého jsou nejcitlivější v rozsahu 1 2,5 µm, zatímco selenidové jsou celkově méně citlivé, s použitelnou citlivostí v rozsahu vlnových délek 2,5 3 µm. Nejnovějším detektorem pro NIR oblast jsou detektory z indium-galium arzenidu (InGaAs), pracující v rozsahu 1 1,8 µm, s maximem odezvy u 1,7 µm. Citlivost tohoto detektoru je o několik řádů vyšší než u detektoru z PbS, kratší je rovněž doba odezvy (<1 µs versus 100 200 µs)(osborne a kol. 1993). Optické součásti používané pro NIR spektroskopii jsou stále častěji z křemíku (oblast: viditelná 2,5 µm) nebo z bezvodého IR-čistého (IR-grade) křemene (VIS 3,5 µm). Stále častější je ve farmaceutické analýze, především při řízení a kontrole procesů, použití optických vláken. Jejich použití umožňuje umístit spektrometr mimo nebezpečné či nevhodné prostředí (s nebezpečím požáru, exploze, mechanických vibrací či s expozicí rozpouštědel aj.) a dokonce při užití více optických vláken umožňuje měření a kontrolu na více místech výrobního procesu, tedy odstraňuje potřebu použití více spektrometrů a s tím spojených investic. 1.4.3. Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat Surová NIR spektra často obsahují široké a překrývající se absorpční pásy, které dělají interpretaci složitější než v případě MIR spekter. NIR spektra pevných látek kromě toho často obsahují efekty vícenásobného rozptylu, které jsou funkcí vlnové délky, distribuce velikosti částic, kompaktnosti vzorku a jeho vlhkosti (O Neil a kol. 1998). Rozptyl interagujícího NIR záření nastává na částicích, které jsou mnohem větší než vlnová délka záření (0,78 2,5 µm, Tyndall, 1869) a tento jev tak nastává u práškových farmaceutických materiálů, které mají velikosti částic v rozsahu několika mikrometrů až po 1 mm. Na soustředěné vrstvě částic nastává několikanásobný rozptyl a produkuje neostrý difusní odraz. Malá část interagujícího záření může být absorbována i z jediné vrstvy částic, tento jev je výrazně zesílen při mnohonásobném rozptylu, který nastane uvnitř silnější vrstvy částic (protože celková optická dráha interagujícího 21

fotonu může být až 80-krát síla vrstvy (Butler a Norris, 1960)). Kubelka-Munkův matematický popis difusní reflexe vedl k vývoji fenomenologické teorie difusní reflexe (Kubelka a Munk, 1931). Jejich teorie uvádí, že pro neprůsvitnou nekonečně silnou (v praxi 1 cm a více) vrstvu difusně reflektujících částic může být intenzita difusně reflektovaného záření, R, vztažena k stupni rozptylu (ratio of a scatter), s, a absorpčnímu koeficientu, k. Tento vztah je označován jako Kubelka-Munkova funkce, F(R ), a je dán následující rovnicí: ( ) ( ) Analogicky k Lambert-Beerovu zákonu můžeme uvažovat, že absorpční koeficient, k, je součinem koncentrace, c, a absorptivity, a (Kortüm 1969). Uvedenou rovnici pak můžeme přepsat: ( ) ( ) Efekt difusní reflexe se projeví v surových NIR spektrech pevných látek, prášků nebo kompaktních vzorků obvykle prohnutou či posunutou základní linii. NIR spektra pevných látek tak obsahují informace o chemické i fyzikální podstatě vzorku. Přítomnost obou typů informace může být přínosem pro kvalitativní aplikace, kde jsou velikost částic a obsah vody důležitými parametry. Pro ostatní aplikace, například pouhou identifikaci, způsobuje kolineární povaha spektra (díky nelineární základní linii) potíže při užití surových spekter. Tyto aplikace vyžadují předzpracování spekter, za účelem odstranění rozptylových efektů. Pro odstranění těchto jevů lze použít například digitální polynomický vyhlazovací algoritmus (například Savitzky-Golay, druhé derivace spektra), tvořící derivované spektrum ve kterém jsou chemické pásy rozlišené. Spektra druhé derivace jsou podobná MIR oblasti otisku palce a jsou tedy často používána při identifikaci. Kromě výpočtu spektrálních derivací můžeme minimalizovat efekt vícenásobného rozptylu použitím metody SNV (standard normal variate) a multiplikativní korekce rozptylu (MSC). MSC vyžaduje znalost průměrného spektra materiálu pro výpočet alfa a beta koeficientů pro opravu posunu základní linie a efektu vícenásobného rozptylu v jednotlivých spektrech materiálu. SNV i MSC předzpracování dat může být užito samostatně nebo v kombinaci s derivacemi. 22

Typické aplikace, v případě pevných látek, jsou identifikace velkého množství farmaceutických pomocných látek, srovnání šarží multikomponentních tabletových (dosage) forem nebo kontrola meziproduktu oproti uloženému průměrnému spektru. Kvalitativní a kvantitativní aplikace NIR spektroskopie jsou založeny na použití vícerozměrných statistických metod analýzy "celého spektra". Pro identifikaci jsou využívány metody jako například Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) a příbuzná technika SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy). Kvantitativní stanovení je obecně založeno na vícerozměrných regresních metodách, například regrese hlavních komponent (Principal components regression, PCR) nebo regrese částečných nejmenších čtverců (Partial least squares, PLS). Pro získání žádaných informací (například obsah aktivní složky, velikost částic, obsah vlhkosti) z NIR dat jsou vytvářeny regresní modely. Tyto modely umožňují předpověď hodnot žádaných proměnných z následných NIR měření. Pro dosažení optimální správnosti a přesnosti modelu jsou většinou aplikovány některé techniky předzpracování dat (např. korekce rozptylu). Rovněž je nutné sestavit kalibrační a testovací soubory dat. Sestavení kvalitativního či kvantitativního NIR modelu je proto časově náročný proces vyžadující odborné znalosti chemometriky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti není technikou stopové analýzy a v případě multikomponentního pevného vzorku vyžaduje pro detekci přítomnost alespoň 1% obsahu analytu. Technika se nejlépe hodí pro kvantifikaci složek s obsahem mezi 10 a 90 %hm. Pro kompaktní pevné materiály se při stanovení obvykle dosahuje větší přesnosti a správnosti u transmisního měření než u techniky reflexní, protože toto měření je méně citlivé na nehomogenitu. 1.4.4. Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie V poslední době je NIR spektroskopie široce využívanou analytickou technikou ve farmaceutickém průmyslu. Na tuto skutečnost upozornili v roce 1998 ve své přehledové práci Blanco a kol. (Blanco a kol., 1998). V roce 1999 akceptovala tuto techniku (spolu s dalšími) pro kontrolu farmaceutického výrobního procesu, od kontroly vstupních materiálů po zpracování meziproduktů (např. kontrola práškových směsí) do konečných lékových forem, americká agentura pro kontrolu léčiv (U.S. Federal Drug Agency s Process Analytical Technology (PAT) initiative (www.fda.gov/cder/ops/pat.htm)). 23

Cílem této instituce je podporovat lepší pochopení farmaceutických výrob a provádět jejich kontrolu v souladu s aktuálním systémem kvality. Kvalita tedy nemůže být testována v konečném produktu, ale musí být implementována v celém procesu. FDA původně definovala PAT jako systém pro návrh, analýzu a řízení výroby pomocí měření kritických kvalitativních a výkonnostních parametrů surových materiálů a meziproduktů v reálném čase za účelem zajištění kvality finálního produktu. Procesní analytická technologie (PAT), jako celek, zahrnuje širokou paletu nástrojů pro zajištění výroby s "řízeným rizikem". NIR spektrometrie, jako moderní procesní analytická technika, je důležitým nástrojem většiny farmaceutických procesů. Další nástroje zahrnuté v PAT jsou techniky vícerozměrného sběru dat a vícerozměrné analytické nástroje (např. pro interpretaci vícerozměrných NIR dat); nástroje k monitorování a určení konce procesu (jako například sondy s vláknovou optikou a stroje se softwarovou zpětnou vazbou) a nástroje pro kontinuální vylepšení a management znalostí (například lepší pochopení výrobního procesu a jeho kritických parametrů). Již dříve popsali zajímavou aplikaci NIR spektroskopie pro zjištění shody fyzikálních a chemických vlastností farmaceutických přísad s předpisem Plugge a van der Vlies (1993). S použitím trihydrátu ampicilinu jako modelového léčiva demonstrovali autoři schopnost určit konec uvolňování na základě NIR měření, čímž nahradili předepsané testování (compendial identification), určení obsahu vody a assay tests a vytvořili tak nový parametr pro určení přijatelnosti, známý jako index shody. Později autoři implementovali novou metodu kontroly kvality, založenou na NIR spektroskopii. Tato metoda zahrnuje transformaci souboru spekter do polárních souřadnic a pro každé transformované spektrum vypočítává těžiště. Tato jsou následně zobrazena do kartézkých souřadnic a umožňují rozlišení podobných materiálů, pomocí klastrové analýzy, (např. formy laktózy) mírně se lišících fyzikálními a chemickými vlastnostmi (např. amorfní, bezvodé, monohydrát, odlišné velikosti částic). Metoda byla rozšířena, aby ukázala potenciál NIR spekter pro kontrolu homogenity směsí s použitím analýzy rozptylu. Hailey a kol. v roce 1996 a Sekulic a kol v roce 1998 popsali automatický systém pro on-line monitoring a kontrolu míchání práškových vzorků za pomoci NIR spekter. V těchto pracích je míchací zařízení řízeno v reálném čase pomocí vláknové optiky a softwarové zpětné vazby. Studie zkoumá skupinu technik pro předzpracování spektrálních dat a jejich kombinace např. metodu SNV, polynomický rozklad metodou kvadrátů nejmenších čtverců či druhé derivace spektra a úspěšně demonstruje vztah mezi změnami ve spektrální variabilitě a homogenitou směsi. Dále zde byly 24

použity k zajištění on-line procesní kontroly metody SIMCA a blokově prováděný výpočet směrodatné odchylky. Jinou on-line aplikaci vícekanálové NIR techniky zavedli k monitorování obsahu směsi v granulátoru s fluidační lože Rantanen a kol. (Rantanen et al., 1998). Metoda zkoumala tři granulovací postupy a jeden peletovací (vytvářené vytlačováním přes předlohu - extrusionspheronization). Při porovnání s referenční metodou úbytku hmotnosti při sušení (loss-on-drying) bylo dosaženo nejistoty směrodatné odchylky (standard error on prediction) 0,2 % pro granulovací postup. Byl studován efekt různých průtoků kapaliny (liquid flow rates) a koncového sušení a bylo zjištěno, že technika je vhodná ke stanovení konce a řízení farmaceutických procesů. Aplikace pro monitorování a kontrolu procesu potahování tablet byla popsána Anderssonem (Andersson et al., 1999). Tloušťka potahu tablety dvou granulovaných jader může být monitorována s využitím metody vícenásobné korekce rozptylu, PCA a PLS. Maximální tloušťka potahu, která umožňuje stanovit základní chemické složení, byla stanovena v rozmezí 0,1 0,2 mm. Využití NIR měření pro předpověď tvrdosti tablety popsali Kirsch a Drennen (1999). Autoři použili dvě metody kalibrace PCR a fitovací algoritmus. Byly vytvořeny modely pro tablety Cimetdine s obsahem 1-20 %hm a tvrdostí tablet mezi 1-7 kp. Směrodatná odchylka kalibrace pro PCR a fitovací model byla O,42 a 0,46 kp. Charakteristické rysy chemických složek pozorované v NIR spektrech je činí použitelnými pro identifikační a kvantifikační účely. Identifikační metody obvykle vyžadují databázi referenčních spekter vzorku. Jednoduché metody identifikace pevných látek zahrnují například vhodnou transformaci do druhé derivace (např. Savitzky-Golay) a porovnání šesti nebo deseti nejintenzivnějších pásů oproti těm z databáze (Jee 2004). Pro účely pozitivní identifikace je obvykle dostatečná tolerance několika desítek nanometrů na obě strany od referenční hodnoty. NIR spektra farmaceutických pevných látek obyčejně poskytují více než 20 spektrálních pásů. Uživatel tak musí pečlivě volit pásy reprezentující jedinečné chemické absorpce (Jee, 2004). Alternativní metodou diskriminační analýzy, která využívá celé spektrum, je metoda SIMCA. Tato metoda využívá konstrukci separátního PCA modelu z NIR spekter pro každý materiál. Metoda křížové validace (Cross-validation) je využívána pro určení použitého počtu hlavních komponent v každém modelu (například použitím PRESS statistiky (Predicted residual error sum of squares) Následně měřená spektra jsou vždy přiřazena ke třídě, se kterou dosahují minima PRESS statistiky (Jackson, 1991). Využití této metody pro identifikaci pomocných látek popsali Candolfi a kol. (Candolfi et al., 1999). Autoři využili hlavní komponenty, 25