Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad

Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad prof. MUDr. Eva Syková, DrSc. Ústav neurověd UK 2.LF V Úvalu 84 150 00 Praha 5 Editoři Redakční rada RNDr. Alexandr Chvátal, CSc. Oddělení neurověd, Ústav experimentální medicíny AVČR Vídeňská 1083, 140 00 Praha 4 Doc. MUDr. Miroslav Ryska, CSc. Klinika transplantační chirurgie Vídeňská 1958/9 140 00 Praha4 Ing. Petr Dvořák, CSc. Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR Zemědělská 1, 613 00 Brno Ing. Milan Hájek, DrSc. Institut klinické a experimentální medicíny Vídeňská 1958/9, 140 00 Praha4 Ing. Josef Fulka, DrSc., Jr. Výzkumný ústav živočišné výroby Přátelství 815, POB 1, 104 01 Praha 10 Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc. Ústav živočišné fyziologie a genetiky AVČR Rumburská 89, 277 21 Liběchov RNDr. František Rypáček, CSc. Ústav makromolekulární chemie AVČR Heyrovského nám. 2, 140 00 Praha 4 OBSAH 1. Předmluva 2. Pokroky v transplantacích a výzkumu kmenových buněk 3. Buněčná terapie na úrovni samičích a samčích pohlavních buněk 4. Embryonální kmenové buňky a buněčná terapie 5. Neurální prekurzory - kam na ně? 6. Embryonální kmenové buňky ve vývojové biologii 7. Molekulární biologie a buněčná terapie 8. Nové přístupy v imunoterapii - nástup dendritických buněk

9. Membránové vlastnosti neuronů, gliových a kmenových buněk v centrálním nervovém systému Předmluva Založení centra buněčné terapie a tkáňových náhrad V loňském roce vláda uvolnila 700 milionů Kč ročně na Program center výzkumu a vývoje. Ministerstvo školství a Rada vlády pro výzkum a vývoj proto vypsaly soutěž na založení těchto center ve všech vědních oblastech. Na základě hodnocení podaných návrhů pak bylo schváleno financování 33 projektů výzkumných center. Jedním z nových center je Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad. Proč vzniklo právě toto centrum? V České republice existuje dobře rozvinutá platforma výzkumu v oblasti vývojové biologie, v oblasti syntézy biokompatibilních polymerů, v oblasti neurověd a transplantační chirurgie. Snaha o vytvoření Centra pro buněčnou terapii a tkáňové náhrady byla logickým vyústěním předchozích vědeckých kontaktů mezi těmito obory. Hlavním cílem Centra je soustředit vybrané směry základního výzkumu v těchto disciplínách do vzájemně provázaného celku, poskytujícího základnu pro výzkum v oblasti buněčné terapie a tkáňových náhrad na kvalitativně nové úrovni, srovnatelné s úrovní dosahovanou ve vyspělých zemích EU a USA. Vedle základního výzkumu je cílem také výzkum nových léčebných postupů, preparátů a jejich kvalifikovaného a včasného preklinického testování. Cílem Centra je výraznější uplatnění naší vědecké komunity v mezinárodním měřítku. K praktickým výstupům Centra je reálné se dopracovat přes vytvoření buněčné banky a přes vývoj nových medicinálních polymerů, které budou vykazovat optimální interakci s buňkami cíleně diferencovanými in vitro, za současného vývoje postupů poskytujících vhodné buněčné linie. Centrum si tedy klade nejen vědecké cíle, ale současně se chce stát koordinačním střediskem výzkumu a vývoje nových terapeutických přístupů, základnou pro systematickou postgraduální výchovu a místem intenzivní domácí a mezinárodní spolupráce. Centrum má dnes více než 50 pracovníků. Z nich ti starší mají v Centru pouze částečný uvazek, zatímco ti mladší, kterých je více než polovina, mají v centru plný pracovní úvazek. Základní organizační jádro Centra, konzultační středisko a místo setkávání všech řešitelů, studentů a klinických pracovníků tvoří Ústav neurověd Univerzity Karlovy, 2. lékařské fakulty. Unikátní nové prostory ve Fakultní nemocnici v Motole (FNM) jsou vhodné pro Centrum svým uspořádáním a umístěním. Lokalizace jádra Centra v prostorách FNM umožňuje operativní kooperaci s klinickými jednotkami. Dalšími institucemi, které se mimo pracovišť FNM, 1. a 2. lékařské fakulty účastní na plnění projektů centra, jsou některá oddělení Ústavu experimentální medicíny AVČR, Ústavu makromolekulární chemie AVČR, Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AVČR, Institutu klinické a experimentální medicíny (IKEM), Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a Výzkumný ústav živočišné výroby v Uhříněvsi. Koncentrací lidského a materiálního potenciálu pracovišť, která se dosud uvedenou problematikou zabývala v dílčích otázkách, se podařilo vytvořit podmínky pro rozvoj

Centra patří tyto záměry: 1. Vytvořit experimentální podmínky pro získávání a kontrolovanou diferenciaci kmenových buněk zvířat (embryonálních a orgánových) s cílem získat buněčné typy s požadovanými vlastnostmi pro transplantační pokusy na zvířatech. Důraz je kladen na definování podmínek, které vedou k diferenciaci kmenových buněk do neurálních linií a analýzu jejich osudu in vivo. 2. Vyvinout nové biokompatibilní polymerní materiály, jak inertní tak i biologicky aktivní, vhodné pro studium buněčné diferenciace in vitro, jako náhrada extracellulární matrix pro transplantaci buněk nebo pro přímou implantaci in vitro kultivované tkáňové struktury do organizmu. 3. Zavést vhodné experimentální modely patologických stavů u zvířat pro transplantační pokusy a ověření přínosu buněčné terapie a tkáňových náhrad pro léčbu onemocnění. 4. Studovat morfologické a membránové vlastnosti prekurzorových a diferencovaných buněk (zvl. nervových) včetně vlastností tkání které budou těmito buňkami osídleny. 5. Vyvinout nové léčebné technologie, využívající kmenových buněk a biologicky aktivních polymerních implantátů pro použití a léčbu neurodegenerativních onemocnění (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza míšní), ischemických lézí mozku, úrazů mozku a míchy, mozkových nádorů, popáleninových traumat, trofických vředů, diabetu, onemocnění jater a dalších onemocnění. 6. Využít naše a zahraniční vědecké poznatky pro rozvoj dalších oborů, pro včasné a klinické využití u našich pacientů ve spolupráci s klinickými pracovišti a farmaceutickými firmami. Centrum bude dbát, aby jedinečné postupy vypracované v Centru byly odpovídajícím způsobem patentově chráněny a tak zajištěny pro další ekonomické zhodnocení. Cílem Bulletinu je průběžně informovat lékařskou i laickou veřejnost o výsledcích nejen na našem pracovišti, ale i na předních světových pracovištích. K informaci je možné využít i naše internetové stránky: http://www.medicon.cz/cbt/ Prof. MUDr. Eva Syková DrSc. Vedoucí Centra buněčné terapie a tkáňových náhrad Vedoucí Ústavu neurověd UK 2. LF Pokroky v transplantacích a výzkumu kmenových buněk Syková, E. Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad a Ústav neurověd UK 2. LF Oddělení neurověd Ústav experimentální medicíny AVČR Kmenové buňky se na samém konci minulého tisíciletí staly středem pozornosti, a je

Proč může být jejich význam tak obrovský? Především proto, že jsou to buňky, které se mohou měnit na všechny typy buněk, ze kterých se skládá živý organizmus, a vzbuzují tím naději, že by se mohly měnit podle přání lékařů a sloužit pro tzv. buněčnou terapii. Tyto buňky se totiž nevyskytují pouze ve vyvíjejícím se zárodku, ale na mnoha místech existují i u dospělých jedinců, včetně lidí. Důsledky pro medicínu by mohly být nesmírně významné, ale jejich využití ještě bude předcházet velmi intenzivní výzkum. Využití kmenových buněk stojí v cestě nejen řada praktických, ale i etických překážek. Jsou naše naděje, které vkládáme do této technologie, oprávněné? Stojí za to překonat některé etické překážky, abychom zachránili lidské životy a zlepšili jejich kvalitu? Úlohou vědců je nejen přinést nové poznatky a objevy, často ještě v době, kdy na ně není lidstvo připraveno, ale také vypracovat a navrhnout postupy jak využít tyto poznatky v praxi pro blaho lidstva. Není lepšího údělu než přispět k narození zdravého potomstva, zmírnění fyzického i duševního utrpení nemocných dětí i dospělých, přispět k odstranění vrozených vad, nádorů a dalších smrtelných nemocí, vrátit do života jedince těžce postižené selháním některého důležitého orgánu nebo jedince postižené těžkými úrazy a neštěstími. Jedinečnost každého člověka je tím imperativem, pro který je třeba učinit vše, co je v našich silách. Kmenové buňky Všechny buňky pochází z jiných buněk; co tedy znamená "kmenová" buňka? Kmenové buňky jsou nediferencované buňky (buňky bez specializace), které se mohou samy neustále obnovovat (Morrison a spol., 1997) a kromě toho dávají vzniknout i jednomu nebo více druhům vysoce diferencovaných (specializovaných) buněk, které mají v těle charakteristické funkce. V medicíně se takové buňky objevují velmi často, například nádory začínají mnohdy jako jediná buňka a u řady tumorů se objevuje několik typů buněk odvozených z jedné nádorové "kmenové" buňky. Krajním případem jsou nádory varlat zvané teratomy nebo teratokarcinomy. U myší mohou být tyto nádory uměle vytvořeny prostým přenesením obyčejných buněk varlat na jiné místo v těle. Objev, že jediná nádorová buňka může vytvářet mnoho odlišných druhů buněk, měl dramatické důsledky. To je však situace patologická a věnujme se nyní fyziologickým funkcím kmenových buněk. Kmenové buňky jsou určeny svým vývojovým potenciálem. Pojem kmenové buňky má význam v souvislosti se zárodečnou linií: vajíčka a spermie, které po splynutí vytvoří celý organizmus, jsou produktem zárodečných linií. Oplozené vajíčko (zygota) je totipotentní (z latinského totus = úplný) kmenová buňka vytvářející všechny buňky organizmu, včetně například buněk placenty, které nejsou součástí embrya. Během vývoje jsou buňky směrovány k jednotlivým vývojovým drahám a jejich vývojový potenciál se mění, ale je stále ještě široký. Tyto multipotentní kmenové buňky již mohou vytvářet jen omezený počet druhů buněk; například kmenové buňky v mozku dávají na konci své vývojové dráhy vzniknout různým druhům nervových a podpůrných buněk v centrálním nervovém systému. Kmenové buňky, často multipotentní ale i unipotentní, se však vyskytují také v dospělých tkáních. Například dospělé svalové kmenové buňky se účastní přestavby svalu a hematopoetické kmenové buňky mohou vytvořit všechny druhy buněk, vyskytujících se v krvi. Transplantace kostní dřeně, kde se vyskytují tzv. hematopoetické kmenové buňky, se s obrovským úspěchem již řadu let používá např. pro léčbu leukemie. Poté, když Henry Becquerel a Marie Curie objevili radioaktivní záření, se postupně odhalilo, že toto záření poškozuje rychle se dělící buňky. Nejdříve působí onemocnění buněk bílé a červené krevní

řady (hematopoetický systém). Tato pozorování vedla k objevu hematopoetické kmenové buňky. Teoreticky i prakticky může jediná hematopoetická kmenová buňka zcela obnovit krevní systém myši (Osawa a spol., 1996). Skutečnost, že u dospělých existují kmenové buňky, je zajímavá; mnohem zajímavější je však to, že možnosti kmenových buněk nejsou omezeny zdrojem, ze kterého byly získány. Řada překvapujících pozorování ukázala například, že svaly a krev mohou být získány z kmenových buněk nalezených v jiných tkáních (Jackson a spol., 1999, Gussoni a spol., 1999). Se všemi genetickými znaky a protokoly pro rozpoznávání hematopoetických kmenových buněk bude možné v krátké době potvrdit nebo vyvrátit tvrzení, že přesně ty samé kmenové buňky mohou u člověka vytvořit celý krevní systém stejně tak jako příčně pruhované svaly nebo dokonce buňky nervové. Nedávné pokusy na myších nasvědčují tomu, že hematopoetické kmenové buňky mohou vytvářet elementy centrální nervové soustavy (Mezey a spol., 2000). Zdá se, že kmenové buňky dospělých mohou mít stejné možnosti vývoje jako embryonální kmenové buňky, dostanou-li správný pokyn. Víme však jen málo o tom, jak mohou kmenové buňky při svém vývoji překonávat hranice a jakým způsobem je můžeme nasměrovat vybraným směrem. Embryonální kmenové buňky Inspirováni výzkumem teratomů vědci brzy zjistili, že v průběhu raného vývoje myší se objevuje období, ve kterém mají určité buňky embrya nápadnou schopnost zakládat velmi rozsáhlou skupinu různých buněčných druhů. Tyto rané embryonální kmenové buňky mohou být z embrya odebrány a pomnoženy v laboratorních podmínkách; vrátíme-li je do vyvíjejícího se embrya zpět, tak se účastní vzniku všech tkání myši, včetně zárodečné linie (Brook and Gardner, 1997). Tyto buňky se označují jako pluripotentní (z latinského plures = několik). Rozdíl mezi pluripotentní ranou embryonální kmenovou buňkou a totipotentní zygotou je ten, že raná embryonální kmenová buňka může dávat vzniknout pouze buňkám, které jsou součástí samotného embrya. Jiným typem pluripotentní buňky jsou embryonální zárodečné buňky, které pocházejí z pozdějšího období vývoje, ve kterém se oddělí buňky zárodečné linie. Embryonální kmenové a embryonální zárodečné buňky se vyskytují i u člověka a posledních několik let je možné i jejich pěstování v laboratorních podmínkách (Thompson a spol., 1998, Reubinoff a spol., 2000). Embryonální kmenové buňky myší je možné rozpoznat podle jejich schopnosti přispívat k vývoji všech tkání embrya. Na celém světě je však zakázáno pokoušet se vytvářet lidi z lidských embryonálních kmenových buněk, proto musí být tyto buňky definovány jinak. Lidské embryonální kmenové buňky bývají získávány z nadbytečných embryí, která jsou produkována na klinikách umělého oplodnění. Ve velmi časné fázi vývoje, ve které je embryo tvořeno zhruba tisícem buněk, mohou být odděleny a růst ve tkáňových kulturách. Mohou in vitro vytvářet mnoho odlišných druhů buněk a tak jsou také definovány - jako pluripotentní buňky ve tkáňových kulturách. Výzkum a kultivace myších embryonálních kmenových buněk a jejich vracení zpět do vyvíjejících se embryí může přinést poznatky o základních zákonitostech pro budoucí buněčnou terapii. Jaká je však motivace pro práci s lidskými embryonálními kmenovými buňkami? Obecně jsou pro to dva hlavní důvody. Prvním důvodem je možnost tyto buňky využít k výzkumu vlastností specifických pro časné fáze vývoje člověka. Druhým důvodem je, že embryonální kmenové buňky vytvářejí somatické buňky: pestrou škálu

buněk, které se nemohou obnovovat a ze kterých se skládá lidské tělo. Studiem embryonálních kmenových buněk můžeme získat hlubší porozumění průběhu obnovy buněk lidského těla. Možnost využít tyto znalosti při léčbě je veliká a sahá od produkce nových neuronů pro léčbu pacientů s Parkinsonovou chorobou až po poznání procesů na molekulární úrovni, které řídí vývoj nádorů. Nervové kmenové buňky Co se vlastně v posledních několika letech minulého tisícíletí ale stalo? Padlo staré dogma, že neurogeneze v CNS savců je výhradně uskutečňována během embryonálního vývoje a v časném postnatálním období. Sice již Altman a Das publikovali v r. 1965 práci, ve které nalezli DNA syntézu (inkorporaci značeného thymidinu) v nervových buňkách dospělých potkanů, ale nedostatek specifických protilátek pro značení a diferencování buněk zpochybňoval jejich závěr, že se skutečně jedná o neurony. V následující části tohoto přehledu se soustředíme na nervové kmenové buňky a jejich využití pro buněčnou terapii. Teprve studie, které prokázaly neurogenezi (vytváření nových neuronů) u primátů a nakonec i v lidském mozku (Eriksson a spol., 1998), vedly k definitivní změně v našem názoru o postnatálním ukončení neurogeneze a o možnostech obnovy či náhrady nervové tkáně (Gage, 2000). Dalším převratným zjištěním byl průkaz nervových kmenových buněk v dospělém mozku. Již Reynolds a Weiss (1992) ukázali, že z dospělého savčího mozku, lze vykultivovat populaci buněk, které mají vlastnosti buněk kmenových, totiž jsou multipotentní a schopné se samy neustále obnovovat a jestliže je indukována diferenciace, vyvinou se všechny tři hlavní druhy nervových buněk - neurony, astrocyty a oligodendrocyty (Reynolds a Weiss, 1996). Takové kmenové buňky byly nedávno izolovány i z dospělého lidského mozku (Johansson a spol., 1999). Myšlenka vývoje vhodné strategie jak stimulovat neurogenezi v případě např. neurodegenerativních onemocnění nebo poranění mozku a míchy (Gage, 1998, Dunnett a Bjorklund, 1999, Svendsen a Smith, 1999) se proto okamžitě stala zajímavou nejen pro vědecké pracovníky, ale i pro lékaře a průmyslovou sféru. Kde jsou kmenové buňky? Jakmile byly kmenové buňky prokázány v dospělém savčím mozku, byl zahájen výzkum, kde jsou tyto buňky a mohou-li za určitých podmínek putovat do dalších oblastí mozku, kde je jich třeba. Kmenové buňky se v mozku nacházejí ve stěnách komor, kde se vyskytuje jedna vrstva tzv. ependymálních buněk. Blízko této vrstvy ependymálních buněk se nachází tzv. subventrikulární zóna, která již obsahuje tři rozdílné buněčné populace, nezralé neurony, astrocyty a další rychle proliferující typ buněk (Doetsch a spol., 1997, Bruni, 1998, Chaisson a spol., 1999, Doetsch a spol., 1999). Serie experimentů v laboratoři Friséna a spol. (Johanson a spol., 1999) ukazují, že jsou to ependymální buňky dospělého mozku i míchy, které jsou multipotentní, samy se obnovují in vitro a z nichž se generují neurony olfaktorického bulbu in vivo. Po poranění vznikají ze spinálních ependymálních buňek astrocyty, které přispívají k vytváření buněčné jizvy. Všeobecně se dnes uzavírá, že jsou to jak ependymální buňky, tak subventrikulární astrocyty, které mají vlastnosti kmenových buněk. Není jasné, zda jsou to dvě nezávislé populace kmenových buňek, nebo zda mají společný původ v ependymálních buňkách.

Neurony vznikají v tzv. subventrikulární zóně (SVZ) mezi vrstvou ependymových buněk (E) vystýlajících vnitřní stěnu mozkových komor (V) a striatem (S). Buňky migrují podél tzv. rostrálního migračního proudu do čichového bulbu (viz šipka). V SVZ vznikají z rychle se dělící populace buněk (oválné buňky) nezralé migrující neurony (neuroblasty, tmavé buňky v horní části nákresu SVZ. Astrocyty, hvězdicovité buňky v dolní části nákresu SVZ, slouží buď jako nezávislé kmenové buňky, nebo jako přechodná populace mezi ependymovými buňkami a progenitory. (Obr. 1) Obr. 1 - Model tvorby neuronů z ependymových kmenových buněk laboratorního potkana. Možnosti a nástrahy klinického použití Významným důvodem pro výzkum kmenových buněk je možnost jejich použití pro terapii buněčnými náhradami. Jak již bylo řečeno, manipulace s hematopoetickými kmenovými buňkami je důležitým nástrojem klinické medicíny a lidské hematopoetické kmenové buňky jsou významnou součástí transplantátů kostní dřeně používaných k léčbě nemocných leukemií. V tomto čísle časopisu vydávaného Centrem buněčné terapie a tkáňových náhrad se zabýváme možnostmi buněčné terapie na úrovni pohlavních buněk. Přestože stále ještě neumíme rozpoznat příslušnou kmenovou buňku, umíme in vitro pěstovat buňky tvořící kůži a tím zachraňovat životy obětem popálenin prostřednictvím transplantace kůže. Cukrovka může být léčitelná, pokud vypěstujeme z kmenových buněk buňky vytvářející inzulin a transplantujeme je do slinivky břišní diabetiků. Jaterní insuficienci pravděpodobně budeme moci léčit pomocí kultivovaných hepatocytů. Léčba onemocnění mozku je také možná, ale k tomu, aby bylo možné léčit buněčnými náhradami, ještě povede delší cesta. Dnes je sice zřejmé, že transplantujeme-li kmenové buňky CNS do vyvíjejícího se nebo dospělého myšího mozku, mohou se diferencovat na neurony i glie, zůstává však otázka jak nejlépe docílit, aby se správně a funkčně včlenily do tkáně (mozku nebo míchy) hostitele. Takto transplantované buňky mohou být schopny napravit onemocnění mozku způsobená ztrátou neuronů. Tato myšlenka je nejlépe propracována pro Parkinsonovu chorobu, kdy byly již buňky embryonální úspěšně využity u několika stovek pacientů. Povzbudivé experimenty totiž ukazují, že kmenové buňky fetálního mozku mohou být použity k náhradě některých mozkových funkcí u nemocných s Parkinsonovou chorobou (Olanow a spol., 1996). Chceme-li používat buněčné transplantace v praxi, potřebujeme mít přístup a zdroje vhodných buňek. Například neurony pro léčbu Parkinsonovy choroby je možné získat z mozku plodů, ale praktické i etické překážky nám brání tento zdroj buněk používat. Umíme nyní vytvářet vhodné neurony - produkující dopamin - z myších kmenových buněk centrálního nervového systému (Studer a spol., 1998). Kmenové buňky CNS však rychle ztrácejí schopnost diferencovat se na dopamin produkující neurony. Nejen u těchto, ale i u jiných typů buněk

se může stát, že nebude možné vypěstovat kmenové buňky v dostatečném počtu pro transplantaci. Je též otázkou výzkumu jak zajistit nejvyšší produkci dopaminu z transplantátu, který může v mozku v důsledku operace vyvolat obrannou reakci, která způsobí kolem transplantátu vytvoření nepropustné bariéry složené z gliových buněk. Naše pokusy na modelu Parkinsonovy choroby u potkana ukázaly, že nejvhodnějším přístupem bude mikrotransplantace v několika bodech, ať už se bude jednat o buňky fetální nebo kultivované buňky kmenové (Reum a spol, 2000). Pluripotentní embryonální kmenové buňky mají oproti tělovým kmenovým buňkám důležitou výhodu: mohou být bez omezení pěstovány ve tkáňové kultuře. Může se ukázat jednodušší získat některé potřebné buňky (třeba dopamin tvořící neurony pro léčbu Parkinsonovy nemoci) kultivací embryonálních kmenových buněk a podnícením jejich diferenciace na žádané druhy buněk. Zatím víme jen málo o lidských embryonálních kmenových buňkách, ale ze tkáňových kultur myších embryonálních kmenových buněk je možné získat mnoho odlišných typů buněk. Použijeme-li správnou kombinaci podnětů, jako jsou například růstové faktory, mohou se myší embryonální kmenové buňky in vitro diferencovat na oligodendrocyty (Brustle a spol., 1999) - buňky, které chybí u nemocných s roztroušenou sklerózou - i na buňky, které odumírají při Parkinsonově chorobě (Lee a spol., 2000). Oligodendrocyty mohou být u lidí získány i z méně eticky sporných zdrojů, než jakými jsou lidské embryonální kmenové buňky. Možná, že existují i jiné cesty jak získat dostatek dospělých kmenových buněk pro lékařské účely. Při studiu nádorů byla objevena řadu genů, které mohou ovlivnit růst buněk. Je možné připravit "nesmrtelné buňky", které se neomezeně množí v kultuře a přitom po injekci zvířeti u něj nevytvářejí nádory. Mnoho druhů kmenových buněk může být učiněno nesmrtelnými, vložíme-li do nich geny podporující jejich růst; takové buňky si stále ponechávají schopnost diferenciace a mohou se po transplantaci začlenit do hostitelových tkání. S používáním nesmrtelných buněk je však spojeno určité riziko - nelze totiž zatím vyloučit, že se z nich vyvinou buňky nádorové. Zmíněné riziko je možné obejít například tím, že do buněk při přenosu genů, které je mají učinit nesmrtelnými, vpravíme i gen pro "buněčnou sebevraždu", který může být aktivován podáním nějaké látky pokusným zvířatům. Podobné strategie dovolují ovlivnit počet transplantovaných nesmrtelných buněk a tato technologie se stává užitečnou i pro klinické použití. Genetická manipulace není omezena jen na embryonální kmenové buňky. V nedávno uveřejněné studii (McCreath a spol., 2000) byly geny ovčích fibroblastů pozměněny rekombinací a jejich jádra byla přenesena do vajíček, jejichž jádra byla předtím odstraněna. Těmto vajíčkům bylo umožněno vyvinout se a daly tak vzniknout ovcím, jejichž genetická výbava obsahovala požadovanou změnu. Výhody genetické modifikace hospodářských zvířat mohou zahrnovat vytvoření druhu dobytka, který nebude vytvářet protein, který je základem bovinní spongiformní encefalopatie (BSE). Náhrada buněk se dostává do centra pozornosti současné medicíny a některé výsledky zde popsané jsou pouhým začátkem. Využití těchto buněk nemusí být pouze buněčné opravy a náhrady. Kmenové buňky se například mohou volně pohybovat tkáněmi a mohou být využity ke sledování a zabíjení nádorových buněk (Benedetti a spol., 2000). Dalším z výsledků výzkumu kmenových buněk může být objev mechanizmu umožňujícího nasměrovat vývoj kmenových buněk přítomných v našem těle požadovaným směrem, bez nutnosti je izolovat a pomnožit. Zmíněná manipulace kmenovými buňkami může být po klinické i etické stránce lepší než postupy, při kterých jsou hostiteli transplantovány buňky, které byly pomnoženy v laboratoři. Tak např. nové neurony stále vznikají v oblastech

hipokampu a bulbus olfactorius, i když ve velmi malém množství. Hipokampus je důležitý pro formování paměti a je často poškozen např. během stárnutí. Mohou být vyvinuty proto metody jak regulovat a zvýšit tvorbu nových neuronů v hipokampu (Cameron a McKay, 1999) nebo jak zajistit jejich migraci ze subventrikulární zóny do jiných oblastí mozku. V budoucnosti může být tento přístup použit i pro propagaci kmenových buněk z hipokampu nebo z míchy (Palmer a spol., 1999), např. pomocí fibroblastového růstového faktoru-2. Tak může dojít k řešení řady neurologických problémů; náhrada neuronů v mozku pomocí diferenciace kmenových buněk centrální nervové soustavy může být kruciálním faktorem při léčbě po poranění mozku a míchy. Nejsou to však pouze různé růstové faktory, ale i jednoduché extracelulární signály, které působí na proteiny buněčné membrány a mohou nasměrovat krevní i mozkové kmenové buňky k určitým osudům (Anderson, 1997, McKay, 1997, Cory, 1999). Návrat funkce po míšním poranění - konec údělu žít pouze na dýchacím přístroji nebo na vozíčku? Tato provokativní otázka dnes trápí vědce a rodiny pacientů na celém světě. Proto bychom se chtěli blíže zmínit o možnosti užít buněčnou terapii a tkáňové náhrady pro terapii míšního poranění. Na tomto tak palčivém onemocnění, které vede k trvalé invaliditě, často dětí a mladých osob, a pro něž dnes často nemáme prakticky žádnou úspěšnou léčbu, si ukážeme příklad, kam spěje výzkum. Je však zřejmé, že bychom měli uvážit a zkusit všechny možné cesty jak těmto pacientům pomoci a že se budeme musit možná oprostit od některých předsudků. Po poranění míchy dnes stojíme u čtyř nesmírně závažných problémů, které budeme muset řešit současně s případnou transplantací buněk. Je to: 1. zabránit okamžité reakci tkáně na poranění, tj. buněčné smrti a vytvoření gliální jizvy, 2. potlačit inhibiční vlastnosti mikroprostředí CNS, které normálně brání regeneraci v CNS a naopak podpořit růstový potenciál axonů a poškozených neuronů, 3. porozumět tomu jak správně nasměrovat rostoucí axony, aby bylo obnoveno funkční propojení, 4. vytvořit optimální podmínky pro přežívající tkáň. Všechny tyto otázky jsou dnes intenzivně zkoumány. Tak např. byly nalezeny inhibiční molekuly, které mají vztah k oligodendrocytům a jejich myelinovým pochvám, dokonce byl právě identifikován s myelinem spojený gen zvaný Nogo, který u potkanů i u člověka blokuje axonální vrůstání do poškozené tkáně (Chen a spol., 2000, GradPre a spol., 2000, Prinjha a spol., 2000). Bylo provedeno i mnoho pokusů, které užívaly metodu implantace periferních nervů, nebo různých jiných vodičů a lepidel pro usnadnění míšní regenerace. V neposlední řadě jsou to i pokusy strukturálně nahradit a simulovat mikroprostředí nervové tkáně, které by jednak usnadnilo vrůstání a propojování buněk a axonů, a dále by zabraňovalo vytvoření astrogliotické jizvy. Takový je i přístup, na kterém nyní dále pracujeme v Centru buněčné terapie a tkáňových náhrad, kdy využíváme na modelu poranění míchy u potkana vhodné implantované hydrogely a provádíme se zvířaty intenzivní rehabilitaci (Woorly a spol., 1999). Zdá se, že transplantované nervové kmenové buňky mohou potenciálně nahradit ztrátu buněk po poranění míchy, rekonstituovat neuronální okruhy a tak propojit dráhy pod a nad míšní lézí. Jinou možností je intraspinální transplantace geneticky modifikovaných kmenových buněk, které produkují faktory, které zabraňují buněčné smrti a podporují regeneraci. Takové pokusy byly provedeny na potkanech s míšním poraněním a ukázaly, že transplantované buňky v poraněné míše přežívají, migrují do hostitelské tkáně a vedou k regeneraci axonů a k návratu motorických funkcí (Kalyani a spol., 1998, Liu a spol., 1999). Snad kombinace výše uvedených přístupů povede ke klinickému využití.

Etika a zákony Pochybnosti vzrůstají zejména ze skutečnosti, že mnoho užitečných kmenových buněk je odvozeno z embryí nebo plodů. Přestože ve většině případů by byla tato embrya jinak vyřazena, zůstává otázka, zda je odebírání kmenových buněk z embryí ospravedlnitelné. Na druhou stranu slibuje tato technologie veliké úspěchy při léčbě různých nemocí. Existují různé alternativy, například svalové kmenové buňky dospělých myší mohou zakládat různé linie buněk. Jejich vývojový potenciál může však být menší než u embryonálních kmenových buněk a je obtížné je izolovat a kultivovat. Legislativa v současném světě odráží toto dilema: V Německu zakazují zákony o reprodukční medicíně extrakci kmenových buněk z lidského embrya. Ve Spojených Státech nesmí být použity federální fondy k financování výzkumů, které používají lidské pluripotentní kmenové buňky získané z tkání lidských plodů nebo embryí. Hlavní federální agentura (National Institute of Health) v současnosti přezkoumává své směrnice týkající se této záležitosti. Návrh zákona, který je v současnosti probírán komisí Senátu, navrhuje legislativu, která by povolila výzkumníkům financovat získávání lidských embryonálních kmenových buněk z federálních fondů. V čase psaní tohoto článku nebylo o tomto návrhu zákona ještě hlasováno. Výzkum lidských embryonálních kmenových buněk podporovaný ze soukromých zdrojů není ve Spojených Státech zakázán. Parlament ve Velké Británii právě schválil návrh vlády, aby bylo povoleno klonování lidských embryonálních buněk za účelem rozvinutí nových léčebných procesů. Současně však vláda navrhla, aby proces klonování probíhal pouze při splnění mnoha přísných podmínek. Předpokládá se nutnost získání licence pro výzkum embryonálních kmenových buněk a souhlas dárce vajíčka a spermatu. Návrh zahrnuje četné zákazy, např. spojení lidské a dospělé somatické buňky s vajíčkem jakéhokoliv zvířecího druhu či tzv. reprodukční klonování (implantace embrya vytvořeného technikou přenosu buněčného jádra do dělohy ženy). Francouzské zákony o bioetice nedovolují výzkum prováděný na lidských embryích, ale poslední zápis, který byl odhlasován generálním shromážděním Conseil d'etat, doporučuje, aby byl pro účely zkoumání kmenových buněk povolen výzkum na embryích. Tato otázka bude projednávána později tento rok. Literatura 1. Altman, J. & Das, G.D. (1965) Autoradiographic and histological evidence of postnatal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol., 124: 319-335 2. Anderson, D.J. (1997) Cellular and molecular biology of neural crest cell lineage determination. Trends Genet., 13: 276-280 3. Benedetti, S., Pirola, B., Pollo, B., Magrassi, L., Bruzzone, M.G., Rigamonti, D., Galli, R., Selleri, S., Di Meco, F., De Fraja, C., Vescovi, A., Cattaneo, E. & Finocchiaro, G. (2000) Gene therapy of experimental brain tumors using neural progenitor cells. Nature Med., 6: 447-450 4. Brook, F.A. & Gardner, R.L. (1997) The origin and efficient derivation of

embryonic stem cells in the mouse. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94: 5709-5712 5. Bruni, J.E. (1998) Ependymal development, proliferation, and functions: a review. Microsc. Res. Tech., 41: 2-13 6. Brustle, O., Jones, K., Learish, R., Karram, K., Choudhary, K., Wiestler, O.D., Duncan, I.D. & McKay, R.D. (1999) Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinated transplants. Science, 285: 754-756 7. Cameron, H.A. & McKay, R.D. (1999) Restoring production of hippocampal neurons in old age. Nature Neurosci., 2: 894-897. 8. Chen, M.S., Huber, A.B., van der Haar, M.E., Frank, M., Schnell, L., Spillman, A.A., Christ, F. & Schwab, M.E. (2000) Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature, 403: 434-439 9. Chiasson, B.J., Tropepe, V., Morshead, C.M. & van der Kooy, D. (1999) Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci., 19: 4462-4471 10. Cory, S. (1999) Immunology: wavering on commitment. Nature, 401: 538-539. Doetsch, F., Caille, I., Lim, D.A., Garcia-Verdugo, J.M. & Alvarez-Buylla, A. (1999) Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell, 97: 703-716 11. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J.M. & Alvarez-Buylla, A. (1997) Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J. Neurosci., 17: 5046-5061 12. Dunnett, S.B. & Björklund, A. (1999) Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease. Nature, 399(suppl): A32-A39 13. Eriksson, P.S., Perfilieva, E., Björk-Eriksson, T., Alborn, A.M., Nordborg, C., Peterson, D.A. & Gage, F.H. (1998) Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat. Med., 4: 1313-1317 14. Gage, F.H. (1998) Cell therapy. Nature, 392(suppl): 18-24 15. Gage, F.H. (2000) Mammalian neural stem cells. Science, 287: 1433-1438 16. GradPre, T., Nakamura, F., Vartanian, T. & Strittmatter, S. (2000) Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein. Nature, 403: 439-444 17. Gussoni, E., Soneoka, Y., Strickland, C., Buzney, E., Khan, M., Flint, A.F., Kunkel. L.M. & Mulligan, R.C. (1999) Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature, 401: 390-394 18. Jackson, K.A., Mi, T. & Goodell, M.A. (1999) Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96: 14482-14486 19. Johansson, C.B., Momma, S., Clarke, D.L., Risling, M., Lendahl, U. & Frisén, J. (1999) Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell, 96: 25-34 20. Johansson, C.B., Svensson, M., Wallstedt, L., Jansom, A.M. & Frisén, J. (1999) Neural stem cells in the adult human brain. Exp. Cell Res., 253: 733-736 21. Kalyani, A.J., Piper, D., Mujtaba, T., Lucero, M.T. & Rao, M.S. (1998) Spinal cord neuronal precursors generate multiple neuronal phenotypes in culture. J. Neurosci., 18: 7856-7868

22. Lee, S.-H., Lumelsky, N., Studer, L., Auerbach, J.M. & McKay, R.D. (2000) Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Biotechnol., 18: 675-679 23. Liu, Y., Kim, D., Himes, B.T., Chow, S.Y., Schallert, T., Murray, M., Tessler, A. & Fischer, I. (1999) Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote regeneration of adult rat rubrospinal axons and recovery of forelimb function. J. Neurosci., 19: 4370-4387 24. McCreath, K.J., Howcroft, J., Campbell, K.H., Colman, A., Schnieke, A.E. & Kind, A.J. (2000) Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. (2000) Nature, 405: 1066-1069 25. McKay, R. (1997) Stem cells in the central nervous system. Science, 276: 66-71. Mezey, E., Chandross, K.J., Harta, G., Maki, R.A. & McKercher, S.R. (2000) Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science, 290: 1779-1782 26. Morrison, S.J., Shah, N.M. & Anderson, D.J. (1997) Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell, 88: 287-298 27. Olanow, C.W., Kordower, J.H. & Freeman, T.B. (1996) Fetal nigral transplantation as a therapy for Parkinson's disease. Trends Neurosci., 19: 102-109 28. Olshausen,F., Reum, T., Mazel, T., Voříšek, I., Morgenstern, R. & Syková E. (2000) Extracellular diffusion in the striatum of 6-OHDA-lesioned and grafted rats. Soc. for Neurosci. Abstracts, 26: 870 29. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. & Nakauchi, H. (1996) Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science, 273: 242-245 30. Palmer, T.D., Markakis, E.A., Willhoite, A.R., Safar, F. & Gage, F.H. (1999) Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS. J. Neurosci., 19: 8487-8497 Adresa ke korespondenci: Prof. MUDr. E. Syková, DrSc. Ústav neurověd UK 2.LF V úvalu 94 150 00 Praha 5 Buněčná terapie na úrovni samičích a samčích pohlavních buněk 1,2,3 Fulka, J. Jr., 1 Syková, E., 2 Mrázek, M., 2 Teplá, O., 3 Krylov, V., 4 Kopská, T., 4 Fulková, H., 4 Mrkvan, T., 1,3 Křen, R., 1,5 Motlík, J. 1 Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, 2LF UK, V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 2 Centrum asistované reprodukce ISCARE IVF, Hloubětínská 3/13, 198 00 Praha 9

4 Přírodovědecká fakulta UK, Viničná 7, 128 44 Praha 2 5 Ústav fyziologie a genetiky zvířat ČAV, 277 21 Liběchov Souhrn Mikromanipulační techniky nacházejí široké uplatnění při studiu časné embryogeneze savců, produkci identických jedinců dělením embryí nebo přenosem jader a v asistované reprodukci u lidí. Náš článek je stručným přehledem a úvahou o možnosti využití těchto technik pro buněčné terapie u lidí. Summary The applications of cell therapies in mammalian germ cells. Fulka, J., Jr., Syková, E., Mrázek, M., Teplá, O., Krylov, V., Kopská, T., Fulková, H., Mrkvan, T., Křen, R., Motlík, J. Micromanipulation techniques are widely used in early embryonic studies, for the production of identical twins by embryo splitting or by nuclear transfer and/or in human assisted reproduction. Our contribution discusses their potential use for cell therapies in humans. Narození ovce Dolly v roce 1996 (Wilmut a spol., 1997) po přenosu jádra somatické buňky do enukleovaného oocytu, produkce klonovaných jedinců skotu (Kato a spol., 1998), myší (Wakayama a spol., 1998), koz (Baguisi a spol., 1999) a prasat (Poleajeva a spol., 2000) vyvolalo četné diskuze o využití těchto technik u lidí. K tomu jistě přispěla i zpráva o narození opice Tetry po separaci blastomer časného embrya (Chan a spol., 2000), ustavení linií embryonálních kmenových buněk z lidských embryí (Thompson a spol., 1998, Shamblott a spol., 1998) a v neposlední řadě i překvapivé výsledky týkající se tkáňově specifických kmenových buněk. Je však nezbytné poznamenat, že i přes povzbudivé výsledky není řada postupů spolehlivě zvládnuta, a tím je dána i nezbytnost dalšího intenzivního výzkumu, než budou možné aplikace u lidí. Problémem jsou často i otázky etické, především v souvislosti s využitím nadbytečných embryí získaných po oplození in vitro pro ustavení linií lidských embryonálních kmenových buněk, ale i s případnými terapeutickými přenosy jader. Přes naději, kterou nové přístupy přinášejí pro léčení některých chorob u lidí, je zřejmé, že tyto postupy musí být natolik spolehlivě zvládnuty, aby se vyloučila veškerá možná rizika, která je mohou doprovázet (Fulka, Jr. a spol., 2000). Vznik embrya a časný embryonální vývoj Embryo schopné normálního vývoje vznikne za přirozených podmínek pouze po penetraci spermie do oocytu. Předtím však musí obě gamety projít řadou pochodů, jejichž hlavním cílem je haploidizace genomu meiotickým zráním. Cytoplazma embrya pochází v podstatě výhradně z oocytu. Proto jsou pro úspěšný vývoj embrya velmi důležité i cytoplazmatické pochody, kterými prochází oocyt těsně před penetrací spermie. Finální část přípravy oocytu pro oplození probíhá in vivo po vzestupu hladin LH, nebo in vitro po izolaci oocytů

z folikulů a jejich kultivaci za vhodných podmínek. U oocytů proběhne rozpad jádra (GVzárodečný váček) a chromozomy zkondenzují. Po jejich uspořádání v metafázi I následují anafáze a telofáze I, kdy však k pólům vřeténka putují bivalenty. Polovina bivalentů je vydělena mimo oocyt jako první pólové tělísko, druhá část je uspořádána do metafáze II. K vlastní redukci na haploidní počet dojde až po oplození, kdy v anafázi II dochází k separaci chromatid a vyloučení jejich poloviny mimo oocyt ve formě druhého pólového tělíska. Po oplození jak chromozomy spermie, tak i oocytu dekondenzují, utvoří se samčí a samičí prvojádro a po proběhnutí S-fáze (replikace DNA) jsou chromozomy uspořádány do první mitotické metafáze, po které následuje rozdělení embrya do dvou stejně velkých blastomer. Následující dělení představují stádia 4 a 8 blastomer. V obou stádiích jsou blastomery jednotlivých embryí stejně velké a předpokládá se, že u nich dosud nedochází k determinaci toho, jaké linie budou následně tvořit. K tomu dojde až při kompakci embrya, kdy mizí mezibuněčné prostory, některé blastomery jsou uloženy uvnitř embrya, zatímco další je obklopují. Zcela evidentní je diferenciace ve stádiu blastocysty, kdy jsou patrné dvě odlišné populace buněk - embryoblast (ICM - inner cell mass), který se jako shluk buněk nachází uvnitř dutiny embrya (blastocoel), a trofektoderm, buňky ohraničující tuto dutinu. Z embryoblastu vzniká vlastní embryo, z trofektodermu pak plodové obaly. Jak bude uvedeno dále, stádia od GV do blastocysty představují velmi vhodné objekty pro buněčné terapie. Produkce identických jedinců separací buněk časného embrya Pokusy, při kterých byla např. zničena jedna z blastomer dvoubuněčných embryí, dokázaly, že zbývající blastomera se dále vyvíjí až do stádia blastocysty a po implantaci do narození nového jedince. Ostatně i identická dvojčata u lidí vznikají pravděpodobně tím, že se od dvoublastomerního embrya každá z blastomer vyvíjí nezávisle. Na tomto základě se uvažovalo o tom, že by se separací blastomer časného embrya mohla produkovat identická dvojčata, čtyřčata atd. Tuto představu dovedl do praktického využití v podstatě až Willadsen (1979), který separoval blastomery dvoubuněčného embrya, přenesl je do hostitelských zón pellucid a následně v agarových blocích do vejcovodů přechodných příjemců. Za 4-5 dnů po přenosu byly bloky z vejcovodů vypláchnuty a embrya ve stádiu blastocysty přenesena definitivním příjemcům. Narození několika párů identických dvojčat dokázalo vysokou efektivitu postupu. Tento postup byl pak následně aplikován i na další druhy, identická dvojčata skotu produkovala i naše laboratoř. Cílem těchto pokusů byla především zvýšená produkce zvířat kvalitního genotypu. Další pokusy vedly k zjednodušení metody, navíc se pak ukázalo, že i rozdělení embrya v pozdějších stádiích na dvě poloviny přináší uspokojivé výsledky. S počtem dalších dělení - na čtvrtiny atd. - efektivnost metody drasticky klesala a celý postup přestal být později prakticky používán. Nový zájem vyvolala publikace o narození opice Tetry (Chan a spol., 2000), která vznikla ze dvou blastomer izolovaných z osmibuněčného embrya. Cílem těchto pokusů není produkce identických dvojčat (čtyřčat). Předpokládá se ale, že by se jedna polovina embrya nechala vyvíjet až do narození, zatímco druhá část by byla využita k ustavení linií embryonálních kmenových buněk. Ty by pak mohly být po diferenciaci přeneseny již narozenému jedinci s určitou chorobou nebo defektem. Vzhledem k tomu, že by kmenové buňky byly geneticky totožné, nedošlo by k jejich odmítnutí hostitelským organizmem. Z tohoto pohledu se jeví celý postup jako velmi perspektivní pro modelové pokusy. Úvahy o tom, že by i u lidí mohla být jedna polovina embrya použita jako potenciální zdroj

embryonálních kmenových buněk pro budoucnost, jsou lákavé, ale byly z důvodů etických zásadně odmítnuty. Přenosy jader Genom jedince je ustaven po oplození v první mitotické metafázi, kdy dochází ke sloučení chromozomů jak od matky, tak i od otce. Další dělení (až na linie zárodečných buněk) probíhají mitoticky - tím je původní informace kopírována do dceřiné buňky. V průběhu vývoje však dochází u buněk k další diferenciaci podle toho, jakou přebírají funkci. Klonování mělo původně zodpovědět otázku, zda a za jakých podmínek můžeme jádro dediferencovat tak, aby po přenosu znovu zabezpečilo vývoj až po narození nového jedince, který bude v podstatě kopií dárce jádra. Počáteční pokusy využívaly pro přenos jádra blastomery časného embrya, které byly fúzovány s enukleovanými oocyty (zygotami). Jako model byla výhradně používána myš. Tyto pokusy byly natolik neúspěšné, že výsledky vedly k závěru, že je klonování savců biologicky nemožné. V roce 1986 však Willadsen publikoval sdělení, že se mu podařilo naklonovat ovce přenosem jader blastomer 8-16 buněčných embryí do enukleovaných oocytů metafáze II. Jeho výsledky byly potvrzeny narozením klonovaných telat a následně i mláďat dalších druhů. V dalších letech byla pro přenos používána jádra z pozdějších vývojových stádií a nakonec i jádra již narozených jedinců (Wilmut a spol., 1997). Metody produkce klonů K vyprodukování klonu potřebujeme dvě buňky - oocyt v metafázi II a danou buňku, jejíž jádro chceme přenášet. Z oocytu však nejdříve musíme odstranit vlastní genetický jaderný materiál (chromozomy). Tento krok nazýváme enukleace, enukleovaný oocyt se nazývá cytoplast (Obr. 1a,b). Obr. 1a, b - Enukleace savčího oocytu. Fixační pipeta (prázdná šipka) udržuje oocyt ve stabilní pozici. Enukleační pipetou (plná šipka) odsáváme chromozomy, které se nacházejí pod prvním pólovým tělískem (tenká šipka). Jádra přenášíme do cytoplastu buď jejich přímou injekcí, nebo fúzí buňky s cytoplastem. V druhém případě označujeme celou buňku s jádrem jako "karyoplast". Přenos jádra je delikátní záležitost. Především jde o objekty velmi malé (oocyt?100µm), které jsou navíc

značně náchylné k poškození. Přenosy jader však nemusí vždy znamenat to, že bude vytvořena kopie již narozeného jedince. V podstatě lze použít k přenosu jádra: a/ velmi časného embrya, nebo kultivovaných buněk embryoblastu (ICM - inner cell mass) Tento postup se používal především v počátcích, např. osmiblastomerní embryo bylo rozděleno na jednotlivé buňky (8), jejichž jádra byla přenesena do enukleovaných oocytů. Pokud zrekonstruovaná embrya (blastomery) nebyla opět použita jako zdroj karyoplastů, byl počet jedinců, kteří se teoreticky mohli narodit, dán počtem blastomer časného embrya (8). Později byla pro přenos použita i jádra z buněk kultivovaných embryoblastů (ICM), avšak s nepoměrně nižším úspěchem. Využití této techniky se předpokládalo především pro multiplikaci embryí od vynikajících jedinců. Úspěšnost tohoto postupu byla velmi vysoká (Loi a spol., 1998). b/ fetální fibroblasty izolované z plodů ve stáří 2-3 měsíců Úspěšné použití embryonálních fibroblastů jako karyoplastů bylo publikováno současně se zprávou o narození ovce Dolly. Výhodou je, že počet fibroblastů není v podstatě omezen: lze je snadno kultivovat a geneticky modifikovat. Využití se předpokládá pro tvorbu transgenních klonovaných jedinců. c/ buňky již narozeného jedince Pro přenos je použito jádro buňky již narozeného jedince, a proto v podstatě víme, jak bude klonovaný jedinec vypadat. Původní předpoklad počítal především s tvorbou kopií vynikajících jedinců zvířat, záchranou ohrožených druhů zvířat a množením transgenních jedinců. Stejný výčet variant bychom mohli poskytnout ohledně cytoplastů, nicméně je obecně akceptováno, že nejoptimálnější jsou především cytoplasty vzniklé enukleací oocytů v metafázi II (Fulka, Jr. a spol., 1996, 1998, 2001). Nízká efektivnost klonování, zejména při využití somatických buněk jako karyoplastů, jasně dokazuje, že řada aspektů souvisejících s úspěchem při přenosech jader zůstává velmi nejasná. Výše uvedený přehled také dokazuje, že klonování nepředstavuje pouze produkci kopií již narozených jedinců. Metody přenosů jader a tím i jejich účel závisí na zdroji jader a především na tom, k čemu má postup sloužit. V zásadě však klonování dělíme na: a/ reprodukční - které vede k narození nového jedince b/ terapeutické - které by mělo sloužit především pro tvorbu embryonálních kmenových buněk. V další části se budeme detailněji problematikou embryonálních kmenových buněk zabývat, zejména pak v souvislosti s terapeutickým klonováním. Jak jsme již uvedli, evidentní diferenciace buněk embrya je patrná ve stádiu blastocysty, kdy jsou zřejmé dvě populace buněk - trofektoderm a embryoblast. Z embryoblastu vzniká vlastní embryo (mezoderm, ektoderm, endoderm). Počet buněk embryoblastu je však omezen a dlouho se nedařilo je kultivovat tak, aby neztratily svoje "univerzální" vlastnosti - pluripotenci. Až v roce 1981 publikovaly dvě skupiny vědeckých pracovníků zprávy, že se jim buňky daří kultivovat in vitro tak, že množením neztrácejí své původní charakteristiky. To lze ověřit především tím, že se tyto buňky (ES, angl. embryonic stem cells) přenášejí do hostitelských embryí a u narozených zvířat se analyzuje jejich participace na tvorbě tkání (důležité je zastoupení v gonádách). Snahy o ustavení linií ES buněk u hospodářských zvířat nelze dosud označit za úspěšné. O to překvapivější byly zprávy z roků 1998 a 2000, které uvádějí, že se třem skupinám na světě podařilo ustavit linie lidských embryonálních (zárodečných) kmenových buněk. Pro ověření pluripotence nelze pochopitelně přenášet tyto buňky do lidských zárodků, nicméně charakteristiky a

možnost diferenciace na různé tkáně in vitro svědčí o tom, se příliš neliší od ES buněk myši. I když proces cílené diferenciace ES buněk není dosud spolehlivě zvládnut, předpokládá se na základě jejich značné spontánní diferenciační verzatility jejich využití v humánní medicíně. Linie ES buněk je možné získat z nadbytečných embryí z klinik asistované reprodukce, není však zcela jasné, zda by tyto buňky byly imunologicky kompatibilní s příjemcem. Z tohoto důvodu se uvažuje o tzv. klonování terapeutickém, které by v žádném případě nevedlo k narození nového jedince, ale "pouze" k tvorbě embryí, z nichž by byl izolován embryoblast, který by byl použit následně k ustavení linií ES buněk. Celý postup by pak vypadal následovně: Pacient s určitou nemocí by daroval svoje buňky, jejichž jádro by bylo přeneseno do oocytu. Rekonstruovaná embrya by se nechala vyvíjet až do stádia blastocysty, ze kterých by byl izolován embryoblast pro tvorbu linií ES buněk. Po jejich namnožení na dostatečný počet by se u nich indukovala diferenciace na požadovaný typ tkáně, která by byla následně dárci jádra přenesena. Výše uvedený postup je však jen jednou z uvažovaných variant. Zdá se, že pro tvorbu ES buněk by mohla být využita jakákoliv embrya, neboť u nich dosud nedochází k expresi povrchových antigenů, a tak by tělo příjemce nemuselo poznat, že jde o cizí buňky. Teoreticky by mohly být využity i linie partenogenetických ES buněk. U myší bylo dokázáno, že se tyto buňky prioritně podílejí na tvorbě jen určitých tkání. Otevřena je i otázka využití somatických kmenových buněk (tkáňově specifických), které rovněž vykazují určitou verzatilitu. V současné době je velmi těžké rozhodnout, která z cest bude nejperspektivnější. Buněčná terapie na úrovni samčích a samičích pohlavních buněk V závěrečné části našeho příspěvku bychom se chtěli zaměřit na buněčné terapie v asistované reprodukci. Cílem není přehled o technikách, které jsou v současné době používány - IVF, ICSI, ROSI atd. Tyto postupy svým způsobem buněčné terapie nepředstavují a jde u nich zpravidla o získání samčí zárodečné buňky, která je následně injikována do oocytu. Náš přehled se bude týkat postupů, při kterých je defektní samičí buňka "opravena" - např. nahrazena defektní cytoplazma, nebo transformována na plnohodnotnou buňka samčí tak, aby po injekci do oocytu byl zabezpečen plnohodnotný vývoj. Konečným produktem meiotického zrání samičích a samčích buněk by měly být gamety, jejichž spojením vznikne embryo, jehož vývoj plnohodnotně probíhá až do narození nového jedince. Tato kritéria splňují pohlavní buňky většiny druhů savců, u lidí však situace začíná být kritická. Nelze předpokládat, že se tento stav v budoucnosti zlepší - spíše naopak. V současné době se problémy spojené s fertilitou týkají až 20% dvojic, většinu z nich lze řešit oplozením in vitro, intracytoplazmatickými injekcemi spermií (ICSI) nebo dokonce náročnějšími postupy. I přes dosažené úspěchy zůstává řada případů, které uvedené techniky vyřešit nedokáží. V této souvislosti se uvažuje o využití dalších postupů - buněčných terapií, které by měly pomoci ve většině zbývajících případů a navíc vést např. k eliminaci nemocí zapříčiněných vlivem mitochondriálního genomu. Současně by ale měly tyto postupy umožnit snadnější, z hlediska etického přijatelnější, produkci embryí s následným využitím při ustavení embryonálních kmenových buněk, které by byly využity pro buněčné terapie.

Samčí pohlavní buňky K defektům spermatogeneze může v podstatě dojít v jakékoliv fázi vývoje spermií. Výsledkem je buď minimální počet spermií v ejakulátu, nebo jejich totální absence. Určitým řešením může být jejich získávání z nadvarlete nebo po testikulární biopsii. V některých případech jsou i tyto přístupy neúspěšné, nicméně z varlete jsou získány jiné buňky - prekurzory spermií. Jejich inkubace s testosteronem a FSH po 48 hodin vede k jejich transformaci na spermatidy ve stádiích Sb1 až Sd, které již mají haploidní počet chromozomů. Po jejich injekci do oocytů v metafázi II dochází k dekondenzaci chromatinu, tvorbě samčího prvojádra a normálnímu vývoji embrya až do narození zdravého potomstva. Není dosud známo, zda po ošetření dochází pouze k transformaci již haploidních buněk, nebo je akcelerována meióza z diploidních stádií. V naší laboratoři jsme ověřovali výše uvedený postup a můžeme jen potvrdit jeho účinnost. Transformované spermatidy však u nás dosud do oocytů injikovány nebyly. Další terapie, která je uvažována jako teoretické řešení pro absolutní absenci samčích zárodečných buněk (např. Sertoli cells only syndrome), je produkce gamet haploidizací somatických buněk. Vlastní haploidizaci lze zatím dosáhnout pouze transplantací somatické buňky do nezralého enukleovaného oocytu, který následně projde prvním a druhým meiotickým zráním. Přenášená jádra musí být ve stadiu G2. Druhou alternativou je přenos jádra ve stádiu G2 do enukleovaného oocytu metafáze II a následná aktivace. V obou případech se počet chromozomů sníží na polovinu, není však dosud známo, zda je rozdělení ekvivalentní. Po aktivaci by se u prvojader zablokovala replikace DNA a prvojádro by se přeneslo do partenogeneticky aktivovaného oocytu. Výše uvedené údaje jsou však zatím velmi předběžné. Samičí pohlavní buňky Stejně jako spermatogenezi provází i oogenezi řada defektů, jejichž výsledkem je nedostatečná produkce oplození schopných oocytů, oocytů morfologicky abnormálních nebo oocytů s určitými defekty (mtdna). K narůstání výskytu různých komplikací přispívá i to, že se rozhodnutí mít potomstvo odkládá do stále pozdějšího věku ženy. Je jasně dokázáno, že tím se snižuje kvalita oocytů, což se projevuje např i odlišnou morfologií meiotického vřeténka v průběhu zrání a následně pak vyšším výskytem chromozomálních abnormalit. Karyotyp některé z blastomer časného embrya není spolehlivým ukazatelem, neboť je známo, že časná humánní embrya jsou často mozaikou různých karyotypů a i omezený počet normálních blastomer zabezpečí kompletní vývoj. Stejně jako u samčího pohlaví se při totální absenci oocytů uvažuje o haploidizaci somatických buněk přenosem do enukleovaných oocytů dárce. Výsledkem by měl být "haploidní" oocyt, který by byl následně oplozen spermií partnera. Problémem by mohla být mitochondriální DNA, která by výhradně pocházela z cytoplazmy dárce oocytu. V tomto případě by byla vyžadována přísná kontrola, zda tato mtdna nemůže následně zapříčinit určité choroby. Z etického hlediska by daný postup neměl představovat vážný problém. V řadě zemí je dárcovství oocytů povoleno. Injekce cytoplazmy do embryí (zygot) s určitým vývojovým defektem jsou již v současné době používány v případech, kdy se embrya po předchozích ošetřeních opakovaně z

neznámých důvodů nevyvíjela. Do těchto embryí je injikována cytoplazma z dárcovských oocytů. V řadě případů došlo k výraznému zvýšení vývojového potenciálu takto ošetřených zygot - včetně narození zcela normálních dětí. Ekvivalentním řešením by mohl být přenos zárodečných váčků z defektních oocytů do enukleovaných normálních oocytů nezralých (Obr. 2). Obr. 2 - Přenos zárodečných váčků do enukleovaných nezralých savčích oocytů. Plná šipka - enukleovaný oocyt (cytoplast), prázdná šipka - karyoplast (zárodečný váček), který je následně přenesen do cytoplastu elektrickými pulzy. Stejně tak by mohly být přenášeny chromozomy metafáze II. Jak bylo uvedeno výše, defekty mtdna mohou být příčinou vážných nemocí. Řešením by mohl být přenos prvojader z defektních embryí do enukleovaných aktivovaných oocytů (v podstatě dárcovství cytoplazmy). Ve výčtu dalších alternativ bychom mohli pokračovat, buněčné terapie v této oblasti mají značný rozsah (využití při záchraně samičích pohlavních buněk např. před chemoterapií či lokálním ozářením vaječníku, záchrana normálních blastomer z abnormálně se vyvíjejících embryí atd.). Jisté je, že využití výše uvedených technik a postupů může velmi rychle vést k řešení některých problémů infertility, navíc pak s ohledem na další buněčné terapie jistě tyto postupy mohou přispět k snadnější a snad i eticky akceptovatelnější produkci linií humánních embryonálních kmenových buněk. Pochopitelně jako u dalších buněčných terapií existuje i zde řada dosud nedořešených a nezodpovězených otázek. Závěr Buněčné terapie představují velmi perspektivní přístup k léčení řady chorob a defektů v humánní medicíně v rozsahu, který můžeme v současné době jen velmi těžko odhadnout. Včetně určitých rizik, které s sebou nové postupy mohou nést, je nezbytné vzít v potaz i otázky etické. Námi uvedený přehled není výčtem všech možností, ale jen náznakem toho, kde by mohly být terapie aplikovány. Diskuze nad riziky a etickými otázkami by si navíc vyžádala další samostatný článek. Podporováno z programu výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. projektu LN00A065. Literatura

1. Baguisi, A., Behboodi, E., Melican, D.T., Pollock, J.S., Destrempes, M.M., Cammuso, C., Williams, J.L., Nims, S.D., Porter, C.A., Midura, P., Palacios, M.J., Ayres, S., Denniston, R.S., Hayes, M.L., Ziomek, C.A., Meade, H.M., Godke, R.A., Gavin, M.G., Overstrom, E.W. & Echelard, Y. (1999) Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nature Biotechnol., 17, 456-461 2. Chan, A.W.S., Dominko, T., Luetjens, C.M., Neuber, E., Martinowich, C., Hewitson, L., Simerly, C. & Schatten, G.P. (2000) Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science, 287, 317-319 3. Fulka, Jr., J., First, N.L. & Moor, R.M. (1996) Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor. BioEssays, 18, 835-840 4. Fulka, Jr., J., First, N.L., Loi, P. & Moor, R.M. (1998) Cloning by somatic cell nuclear transfer. BioEssays, 20, 847-851 5. Fulka, Jr., J., Syková, E., Fulková, H. & Motlík, J. (2000) Klonování reprodukční a terapeutické. Vesmír, 79, 127-129 6. Fulka, Jr., J., Loi, P., Ledda, S., Moor, R.M. & Fulka, J. (2001) Nucleus transfer in mammals: how the oocyte cytoplasm modifies the transferred nucleus. Theriogenology, v tisku 7. Kato, Y., Tani, T. Sotomaru, Y., Kurokawa, K., Kato, J., Doguchi, H., Yasue, H. & Tsunoda, Y. (1998) Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, 282, 2095-2098 8. Loi, P., Ledda, S., Fulka, Jr., J., Cappai, P. & Moor, R.M. (1998) Development of parthenogenetic and cloned ovine embryos: effect of activation protocol. Biol. Reprod., 58, 1177-1187 9. Polejaeva, I.A., Chen, S.H., Vaught, T.D., Page, R.L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y., Boone, J., Walker, S., Ayares, D., Colman, A. & Cambell, K.H.S. (2000) Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 407, 86-90 10. Shamblott, M.J., Axelman, J., Wang, S., Bugg, E.M., Littlefield, J.W., Donovan, P.J., Blumental, P.D., Huggins, G.R. & Gearhart, J.D. (1998) Derivation of pluripotent stem cells from culture human primordial germ cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95, 13726-13731 11. Thomson, J.A., Itskowitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergel, J.J., Marshall, V.S. & Jones, J.M. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1145-1147 12. Wakayama, T., Perry, A.F.C., Zuccotti, M., Johnson, K.R., & Yanagimachi, R. (1998) Full term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 394, 369-374 13. Willadsen, S.M. (1979) A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins. Nature, 277, 298-300 14. Willadsen, S.M. (1986) Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, 320, 63-65 15. Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. & Campbell, K.H.S. (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385, 810-813. Adresa pro korespondenci: