CETRE OF THE REGIO HAÁ FOR BIOTECHOLOGICAL AD AGRICULTURAL RESEARCH - PLAT BIOTECHOLOGY I OLOMOUC Ivo Frébort 27.04. 2011 This project is jointly financed by the European Regional Development Fund in the framewwork of the Operational Programme Research and Development for Innovations and by the state budget of the Czech Republic
Program přednášky 1. Představení C.R. Haná a projektu OP VaVpI 2. Výzkumné programy C.R. Haná 3. Příprava transgenního ječmene
Project information OP Research and Development for Innovations: CZ.1.05/2.1.00/01.0007 Project budget : 832 938 232 CZK Implementation period: 03/2010 12/2013 Grant recipient: Palacký University in Olomouc Partners: Institute of Experimental Botany, AS CR (IEB) Crop Research Institute (CRI) Investment: 80% of the budget, 4 new buildings for R&D Olomouc-Holice, equipment and research instruments Start-up grant: 20% of the budget, implementation costs, wages, services Human resources: 170 employees in 2013, 80 new position for researchers
Structure of C.R. Haná Council and Board of the Centre Executive Director Ivo Frébort Technical and Economical Department Department of Education and HR Department of Technology Transfer Management Units Scientific Director - Jaroslav Doležel Scientific Board Research Units
Research Units Technology Centre (Palacký University) Department of Protein Biochemistry and Proteomics Department of Biophysics Laboratories for Contract Research Centre of Molecular Biology and Genetics (Palacký University) Department of Growth Regulators Department of Molecular Biology Department of Cell Biology Centre of Plant Structural and Functional Genomics (IEB) Laboratory of Genome Structure of Cereals and Forage Crops Laboratory of Biology of Agronomically Important Traits Laboratory of Cell Structure Proteomics Laboratory of Bioinformatics Centre of Applied Research of Vegetables and Special Crops (CRI) Department of Genetic Resources of Vegetables, Medical Plants and Special Crops Department of Growing and Quality of Vegetables, Medical Plants and Special Crops
Key scientists of the centre Ivo Frébort - Executive Director Palacký University Biochemistry and Molecular Biology Jozef Šamaj Palacký University Cell Biology Miroslav Strnad Palacký University Growth Regulators Jaroslav Doležel Scientific Director Institute of Experimental Botany Structural and Function Genomics Marek Šebela Palacký University Biochemistry and Proteomics Karel Dušek Crop Research Institute Gene Bank of Vegetables and Special Crops
Equipment of the centre Total expected costs 220 mil. CZK Key instruments Laser scanning confocal microscope (07/2010) High-speed flow cytometer and sorter (09/2010) Confocal microscope system for live cell imagining (planned for 2011) Mass spectrometer MALDI-TOF/TOF (planned for 2012) MR spectrometer 500 MHz (planned for 2012) HPLC/MS (planned for 2012) Phytotrons and automated high resolution phenotypic evaluation of plants
Completion of the Faculty of Science (PU) Campus in Holice Centre for Science and Education Zoning approval issued in 11/2008
Investment funds, allocated in the project budget for the new construction infrastructure: Expected total building cost: 530 million CZK from which: technological laboratory equipment cost - 38 million CZK other interior equipment cost - 16 million CZK phytotron chambers cost - 40 million CZK Centre of plant structural and functional genomics Technology centre Centre of molecular biology and genetics Centre of applied research of vegetables and special crops Building permission issued in 11/2009
Investor: Crop Research Institute Building D - Centre of applied research of vegetables and special crops Research departments: Department of Genetic Resources of Vegetables, Medical Plants and Special Crops Department of Growing and Quality of Vegetables, Medical Plants and Special Crops Expected investment cost: 67.570 thousand CZK Floor plan: 2nd level
Investor: Institute of Experimental Botany AS CR Building E Centre of plant structural and functional genomics Research departments: Laboratory of Genome Structure of Cereals and Forage Crops Laboratory of Biology of Agronomically Important Traits Laboratory of Cell Structure Proteomics Laboratory of Bioinformatics Expected investment cost: 151.760 thousand CZK Floor plan: 1st level
Investor: Palacký University Building F2 Technology centre Management unit of the Centre Research departments: Department of Protein Biochemistry and Proteomics Department of Biophysics Laboratories for Contract Research Expected investment cost: 127.270 thousand CZK Floor plan: 2nd level
Investor: Palacký University Building H Centre of molecular biology and genetics Research departments: Department of Growth Regulators Department of Molecular Biology Department of Cell Biology Expected investment cost: 161.740 thousand CZK Floor plan: 1st level
Example of laboratory equipment in new buildings Building H: room 137 Building E: room 312 Building D: room 212 Building F2: room 125
Example of administrative parts equipment Building H: computer room 215 Building F2: conference room 225 Building D: office 205 Building E: common dining room 207
Building works timetable: Completion of the documentation for the building works contractor tender 06/2010 Public tender for the general building works contractor 07-12/2010 Start of building works 01/2011 Consecutive buildings approval processes, putting buildings into operation 07-09/2012 Finish of building works and passing buildings to users 12/2012
Sustainable growth and development CR Haná 2013 CR Haná 2010
Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Palacký University in Olomouc, Czech Republic Výzkumná problematika řešená v rámci centra
Výzkumné programy C.R. Haná Proteinová biotechnologie Vedoucí výzkumného programu: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Chemická biologie a genetika Vedoucí výzkumného programu: prof. Ing. Miroslav Strnad, DSc. ové materiály a metody šlechtění rostlin Vedoucí výzkumného programu: doc. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc. Rostlinné biotechnologie Vedoucí výzkumného programu: prof. RDr. Jozef Šamaj, DrSc. Fytofarma, genetické zdroje zelenin, léčivých, aromatických a kořeninových rostlin (zahájení 1.1.2013) Vedoucí výzkumného programu: Ing. Karel Dušek, CSc.
Proteinová biotechnologie Vývoj metodiky pro identifikaci patogenů rostlin na základě databáze proteinových profilů z hmotnostní spektrometrie Plísně uvnitř pletiv mezibuněčný růst haustoria (výživové orgány) prorůstají mesofyl vlhké počasí jaro, počátek léta obligátní biotrofní rostlinní paraziti infikují zelené části rostlin rychlé šíření = epidemická onemocnění likvidace úrody (víno, chmel, zelenina ) Porovnání spekter - shoda Padlí na povrchu listu mimobuněčný růst pouze haustoria epidermální buňky suché a teplé počasí pozdní léto a počátek podzimu
Proteinová biotechnologie Analýza přírodních látek Vývoj nových metod - stanovení absorpční radikálů (ORAC) kapacity kyslíkových - optimalizace extrakce flavonoidu pro analýzy s buněčnými kulturami eupatorinu - vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci silybinu z Ostropestřce mariánského - vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci eupatorinu v Trubkovci tyčinkovitém - vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci diterpenoidu andrografolidu v Právence latnaté Aplikovaný výzkum - stanovení ORAC sójových výrobků (KALMA k.s.) - stanovení celkového obsahu fenolových látek v extraktech (Fytopharma s.r.o.) - stanovení silybinu v galenických produktech (Fytopharma s.r.o.)
Proteinová biotechnologie Rychlé stanovení vysokoteplotní odolnosti rostlin 10-20 min. měření metoda: detekce fluorescence chlorofylu při kontinuálním ohřevu listů vývoj komerční aparatury ve spolupráci s firmou Photon Systems Instruments (Brno) společný grantový projekt TA ČR - program ALFA Ječmen jarní
Chemická biologie a genetika ový růstový regulátor pro modulaci výnosu zemědělských plodin % of control 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Ozimá řepka 2010 10 µm 50 µm ICYDE Aplikovaná koncentrace
Chemická biologie a genetika Patentová přihláška: Mik, V., Szüčová, L., Doležal, K., Spíchal, L., Galuszka, P., Strnad, M.: Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, nové 6-substituované 9- halogenalkyl puriny. PV 2010-670. Vynález se týká nových derivátů cytokininů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, jejich použití v zemědělství, včetně přípravků obsahujících tyto deriváty Projekt TAČR AGROCYT Výzkum, testování a výroba cílených růstových regulátorů, nových hnojiv a kombinovaných přípravků pro rostlinnou produkci (2011-2016) Řešitelé: Fosfa akciová společnost, Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav experimentální botaniky AVČR, v.v.i. a Agrotest fyto, s.r.o.
Chemická biologie a genetika Plán výzkumné činnosti: Vývoj agonistů a antagonistů regulačních drah (zejména růstové regulátory, přírodní látky a jejich deriváty) Modulace percepce, signalingu, biosyntézy a degradace Studie molekulárních mechanizmů účinku Studie metabolismu, transportu a funkce nových sloučenin Farmakologie a toxikologie těchto derivátů
ové materiály a metody šlechtění rostlin ová strategie analýzy dědičné informace plodin: chromozomová genomika Identifikace 21766 genů ječmene a určení jejich polohy v genomu
ové materiály a metody šlechtění rostlin Izolace genu pro rezistenci pšenice vůči padlí travnímu Lokus QPm-tut-4A = rezistence v celém vegetačním období Rezistentní pšenice Pšenice napadená padlím travním
ové materiály a metody šlechtění rostlin Určení kříženců kostřav a jílků (Festulolium) Identifikace a právní ochrana nových odrůd DA čip typu DArT Studium genetické variability Genetické mapování Křížení pomocí markerů (vazba s agronomicky významnými znaky) odolnosti proti chorobám, mrazuvzdornost)
Rostlinné biotechnologie Signalizace při vývoji a stresu u Arabidopsis Col0 wild type mpk4 mutant Poruchy v mikrotubulárním cytoskeletonu formují se aberantní buňky s mnoha jádry
Rostlinné biotechnologie Plán na další období: Genetická modifikace Claviceps purpurea Zvýšení produkce ergoidních alkaloidů používaných jako terapeutika Spolupráce s TEVA Czech Industries, Opava Funkční proteomika hledání nových proteinů a jejich funkce při stresu Mutanty: mpk4, mpk6, anp2/3, yoda control treatment
Contact information Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research Šlechtitelů 813/21 783 71, Olomouc Holice Czech Republic Phone: +420 585 634 970, +420 585 634 971, +420 585 634 979 E-mail: projekty_eu@upol.cz Web pages: www.cr-hana.eu
Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Palacký University in Olomouc, Czech Republic Preparation of transgenic barley with improved quality
Cytokinins plant growth hormones H H OH H H Isopentenyladenine (ip) Zeatin (t-z) O H 3 C O H H H H H H OH H H Benzyladenine (BA) Kinetin p-topolin (4-OHBA) 2-CH 3 OBA
Regulation of active cytokinin level Cytokinin dehydrogenase (CKX, EC 1.5.99.12) FAD binding domain C ~ 550 aa H CH 2 R H 2 + H 2 O + O CH R H H FAD CKX FADH 2 Cytokinin Adenine Aldehyde ZmCKX1 - maize kernels Malito E. et al., J. Mol. Biol., 27, 1237 (2004) QH 2 Q Final acceptor Q 0 - High rate (k cat ~ 200) Galuszka et al. Eur. J. Biochem. 268, 450 (2001) O 2 - Low rate (k cat < 1.0)
Expression and targeting of CKX in A. thaliana AtCKX2, AtCKX4 AtCKX5, AtCKX6 apoplast PUP Cytokinin receptor cytokinins plastid AtCKX1 AtCKX3 AtCKX7 cytosol vacuole Werner et al., Plant Biol. 8, 371 (2006) Galuszka et al., J. Plant Growth Regul. 26, 255 (2007)
Production of recombinant protein in Pichia pastoris Substrate specificity of Arabidopsis thaliana CKXs 400 relative reaction rates (%) 350 300 250 200 150 100 50 0 AtCKX1 AtCKX2 AtCKX3 AtCKX4 AtCKX5 AtCKX6 AtCKX7 Galuszka et al., J. Plant Growth Regul. 26, 255 (2007)
CKX as a transgene (expression under 35S promoter in tobacco) WT Cytokinin content down to 30 50% HvCKX-M 2x activity WT HvCKX-M Galuszka et al. (2004) Eur. J. Biochem. 271, 3990-4002 ghvckx-s 50x activity - Cytokinins stimulate plant differentiation - Overexpression of CKX causes cytokinin-deficient phenotype - Possible applications in agriculture
Genetic transformation of barley with Agrobacterium tumefaciens - Monocots much more difficult to transform than dicots - A. tumefaciens (supervirulent strain) applied on wounded immature embryo - Acetosyringone added to stimulate the infection - Difficult plant regeneration from calli, fine tuning of cytokinin and auxin needed
Increase of cereal plant yield Transgenic barley with silenced CKX WT HvCKX1 silenced line Increased level of cytokinins in aleurone layer WT HvCKX1 silenced line Relative specific CKX activity in roots 1.0 0.50 ± 0.12 Relative HvCKX1 transcript level 1.0 0.31-0.59 Mass of 1.000 grains 26.6 g 32.5 g Zalewski W., Galuszka P., et al., J. Exp. Bot. 61, 1839-1851 (2010)
Constitutive overexpression of CKX in barley (pbract vector, ubiqutin promoter, ZmCKX1 gene) significantly enhanced root system delayed development of the aerial part sterility and earlier onset of senescence Mrízová et al., J. Biotechnol., submitted
Root specific promoters - Promoters from dicots are often not active in monocots - Promoters from monocots often work in dicots - PHT and RAF promoters cloned from barley, tested in Arabidopsis - bglu promoter cloned from maize PHT promoter - Promoter of phosphate transporter gene - Expression in root-hair and elongation zone RAF promoter - Promoter of the root abundant factor - Expression in root tip and vascular bundles PTH/GUS RAF/GUS bglu promoter - β-glucosidase promoter - Expression in roots bglu/gus Gu et al., Plant Cell Rep., 2006
Transgenic barley plants T0 generation 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Transgenic barley plants T1 generation 1 2 3 1 2 3 1 2 3
www.cr-hana.eu Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research (ERDF project CZ.1.05/2.1.00/01.0007), Olomouc, CZ Petr Galuszka Hana Pospíšilová Katarína Mrízová Ludmila Ohnoutková John Innes Centrum, orwich Research Park, orwich, UK Wendy Harwood