Proteinové znaky dětské leukémie identifikované pomocí genových expresních profilů

Transkript

1 Proteinové znaky dětské leukémie identifikované pomocí genových expresních profilů M.Vášková a spol. Klinika dětské hematologie a onkologie 2.LF UK a FN Motol Childhood Leukemia Investigation Prague

2 Průtoková cytometrie v diagnostice dětské leukémie AML T ALL (zralá B vs.) BCP ALL prob ALL call praeb ALL Mejstříková et al., Haematologica 2010 CD19+CD10neg CD19+CD10+ iigmneg CD19+CD10+ iigmpoz + exprese aberantních molekul, stanovení DNA ploidie (DNA indexu)

3 Genotypové podskupiny dětské ALL B prekursorová ALL Zralá B ALL T ALL Pui et al., N ENGL J MED, 2004

4 Pui et al., Blood 2012

5 Genové expresní profily dětské ALL Yeoh et al., 2002, Ross et al. 2003,.. geny korelující s imunofenotypovými a genotypovými podskupinami, odpovědí na léčbu, rezistencí na léčebné přípravky, odlišující maligní buňky od nemaligních

6 Výběr nových proteinových znaků pro průtokovou cytometrii Proteiny korelující s genotypem, rizikem relapsu, odpovědí na léčbu odlišující maligní a nemaligní buňky analýza autorů naše reanalýza dat FC testování v případě dostupné protilátky protilátka nedostupná ověření pomocí RQ-PCR příprava vlastní protilátky

7 Reanalýza primárních dat cutoff pro každý gen CD44 prediktory negativity x% y% % pacientů nad cutoff, negativní nekorelující geny prediktory pozitivity 80 % pacientů nad cutoff, TEL/AML1 pozitivní CD Vášková et al., Leukemia 2005

8 Identifikace TEL/AML1 pozitivních pacientů pomocí exprese CD44 a CD27 CD44 (Pgp-1): receptor pro kyselinu hyaluronovou (%) CD27 (TNFRSF7): tumor necrosis factor receptor superfamily T buňky, NK buňky, paměťové B buňky, časné prekurzory B buněk (%) n=526

9 PCR TEL/AML1 negativní pacienti Žaliová et al., Pediatr Blood Cancer 2011: TEL/AML1-positive patients lacking TEL exon 5 resemble canonical TEL/AML1 cases Tel_ex5/Aml1_ex2/ : Tel_ex4/Aml1_ex : Tel_ex4/Aml1_ex2 Ostatní negativní pacienti společné genetické změny?

10

11 Hledání OPÁLu C. Willman et al, Albuquerque, NM, USA 100 OPAL-1 (Outcome Predictor in Acute Leukemia 1) % pacientů nad cutoff, relaps % patientů nad cutoff, bez relapsu OPAL1

12 prediktor TEL/AML1 TEL/AML1 100 % patientů nad cutoff, negativní OPAL1 % patientů nad cutoff, pozitivní

13 SEC-MAP Size-exclusion Chromatography - Microsphere-based Affinity Proteomics umoţňuje detekci více neţ 1700 proteinů v buněčném lyzátu 1 izolace proteinů 2 značení proteinů biotinem 3 rozdělení proteinů na chromatografické koloně 4 imunoprecipitace chromatografických frakcí se SEC-MAP array 5 detekce proteinů pomocí streptavidinu-pe 6 měření na průtokovém cytometru 7 analýza protein G Goat anti Mouse PROTEIN-BIOTIN Mouse anti Human STREPTAVIDIN - PE Wu, Antibody array analysis with label-based detection and resolution of protein size. Mol Cell Proteomics 2009 Slaastad, Multiplexed immuno-precipitation with 1725 commercially available antibodies to cellular proteins. Proteomics 2011 Stuchly, An automated analysis of highly complex flow cytometry-based proteomic data. Cytometry A 2012

14 Drebrin Podle expresních profilů má nízká exprese předpovídat vyšší riziko relapsu a špatnou odpověď na léčbu Podle FC korelace s TEL/AML1 podle SEC-MAP BCP ALL vyšší exprese neţ AML n=20 n=66 Vášková et al., Leukemia Research 2011

15 Další metody pro verifikaci proteinové exprese Průtoková cytometrie: CD27, CD44, CD135, CD49f, CD99, CD103, TNFRR2, ICOSL, IL10RB, CD97 Potvrzení korelace pomocí RQ-PCR a následná příprava protilátky: Drebrin, OPAL1, ARHGEF4, CLIC5, DDIT4L, PCLO, LARGE probíhající: SEC-MAP plánovaná: buněčná analýza hmotnostní cytometrií verifikace a další biologické informace v širším kontextu

16 Poděkování O. Hrušák E. Mejstříková T. Kalina V. Kanderová D. Černá J. Stuchlý M. Kováč P. Volná M. Ţaliová J. Zuna J. Trka J. Starý V. Hořejší T. Brdička P. Angelisová J. Špička K. Drbal F. Lund-Johansen

17 Le Bien, Blood 2000 Loken, Blood 1987 prob Loken I preb I Loken II preb II immature B Loken III CD19+CD10+ : cytoplasmic IgM TdT RAG-1 highcd10 CD34, cytoplasmic VpreB V H J H rearranged L chain rearranged leukemias TELAML1 others large cells (FSc) CD20 Vášková et al., Tissue Antigens 2007

18

19 Size-exclusion Chromatography FPLC = fast protein liquid chromatography 670 kda 10 kda 24 frakcí

20 automatická detekce populací kuliček definice proteinových forem čárový graf kvantifikace