MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE Současné možnosti kryoprezervačních metod Bakalářská práce Brno 2011 Lenka Skoumalová Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Helena Nejezchlebová PhD.
Prohlášení: Souhlasím s uložením této bakalářské práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a využitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, že převzaté informace budou řádně citovány a nebudou využívány komerčně. Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala zcela samostatně za použití uvedených odborných článků a literatury.... Datum Podpis
Poděkování: Ráda bych poděkovala paní RNDr. Heleně Nejezchlebové PhD. za ochotu, cenné rady a odborné vedení a pomoc při vypracování mé bakalářské práce.
OBSAH: 1. Úvod... 7 2. Asistovaná reprodukce... 8 2.1. Obecné charakteristiky metod reprodukční medicíny... 8 2.1.1. In vitro fertilizace (IVF)... 8 2.1.1.1. Oplození oocytů ve zkumavce... 9 2.1.1.2. Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI)... 9 2.1.1.3. PICSI... 9 2.1.1.4. IMSI... 9 2.1.2. Kultivace embryí... 10 2.1.3. Embryotransfer (ET)... 10 2.1.4. Asistovaný hatching... 10 2.1.5. Preimplantační genetická diagnostika... 10 3. Kryoprezervace... 11 3.1. Důvody kryoprezervace... 11 3.2. Kryoprotektiva... 12 3.2.1. Vlastnosti a rozdělení kryoprotetiv... 12 3.2.1.1. Pronikající penetrující kryoprotektiva... 13 3.2.1.2. Nepronikající nepenetrující kryoprotektiva... 13 3.2.2. Koncentrace kryoprotektiv... 13 3.2.3. Čas expozice a teplota mrazícího roztoku... 14 3.2.4. Kryoprotektivní protein (AFP)... 14 3.2.4.1. Působení AFP/AFGP... 14 3.2.5. Chemická toxicita kryoprotektiv... 14 3.3. Metody kryoprezervace... 15 3.3.1. Pomalé mrazení... 15 3.3.2. Rychlé mražení vitrifikace... 16 3.3.3. Nejpoužívanější nosiče a metody pro vitrifikaci... 16 3.3.3.1. OPS (Open Pulled Straw) metoda... 16 3.3.3.2. Cryoloop (Nylonloop) vitrifikace... 17 3.3.3.3. Microdrop vitrifikace... 18 3.3.3.4. Minimum volume cooling (MVC)... 18
3.4. Nežádoucí účinky mražení... 19 3.4.1. Útvary z ledových krystalů... 19 3.4.1.1. Buněčná dehydratace... 19 3.4.1.2. Mechanický stres... 19 3.4.1.3. Teplotní šok... 19 3.5. Kryoprezervace gamet... 20 3.5.1. Kryoprezervace oocytů... 20 3.5.1.1. Pomalé zmrazování... 20 3.5.1.2. Vitrifikace... 21 3.5.2. Kryoprezervace spermií a spermatu... 21 3.5.2.1. Kryoprotektiva a míšení se spermatem... 22 3.5.2.2. Materiály pro uchování směsi zředěného spermatu... 22 3.5.2.3. Pomalé mrazení... 23 3.5.2.4. Vitrifikace... 23 3.5.2.5. Uskladnění kryoprezervovaného spermatu... 24 3.5.2.6. Tání kryoprezervovaného spermatu... 24 3.6. Kryoprezervace ovariální tkáně... 25 3.6.1. Pomalé mražení ovariální tkáně... 25 3.6.2. Vitrifikace ovariální tkáně... 25 3.7. Kryoprezervace testikulární tkáně... 26 3.8. Kryoprezervace embryonálních kmenových buněk... 27 3.9. Kryoprezervace embryí... 28 3.9.1. Kryoprezervace zygot ve stádiu prvojader... 28 3.9.2. Kryoprezervace dělících se embryí... 29 3.9.3. Kryoprezervace blastocyst... 29 3.10. Kryoprezervace zvířecích embryí... 29 4. Kryonika... 31 5. Závěr... 33 6. Seznam použité literatury... 34
Abstrakt Kryoprezervační metody jsou různorodé a využívají je především kliniky asistované reprodukce k mrazení různých typů tkání. Aby se snadněji proniklo do tématiky práce, počáteční kapitoly zahrnují výčet a charakteristiky základních technik asistované reprodukce, z nichž nejznámější a nejvýznamnější je in vitro fertilizace. Následující část práce se zaměřuje na hlavní důvody kryoprezervace, popis mrazících medií a nejběžnějších mrazících technik. Kryoprezervace se provádí dvěma základními technikami - pomalým mrazením a vitrifikací. Provedení obou metod je spojeno s určitými riziky pro zmrazovanou tkáň. Hrozí zde poškození buněk ledovými krystaly a intoxikace tzv. kryoprotektivy, látkami obsaženými v mrazícím mediu. Nejčastěji se kryoprezervace provádí pro zachování plodnosti ze zdravotních nebo praktických důvodů. Stěžejní část práce je věnována popisu kryoprezervačních metod pro lidské gamety, lidská a zvířecí embrya, pro ovariální a testikulární tkáň a kmenové buňky. Jsou zde také zahrnuty informace, které se týkají výhod a nevýhod metod pomalého mrazení a vitrifikace pro příslušnou tkáň. Závěr práce obsahuje zmínku o kryonice - metodě, se kterou je spojeno mnoho etických otázek. Abstract The contemporary possibilities of cryopreservation methods The cryopreservation methods are disparate and they are used mainly by the Clinics of Assisted Reproduction to freeze different types of tissues. For better understanding of the thesis, the starting parts include the list and the characteristics of the basic assisted reproduction techniques, from which in vitro fertilization is the most known and significant. The following parts are focused on the basic reasons for cryopreservation, the description of freezing media and the description of the most common cryopreservation techniques. The most common cryopreservation techniques are slow freezing and vitrification. Both methods are connected with some risks for freezed tissue. The cells can be damaged by the crystal ice formation or be intoxicated by cryoprotectors, which are contained in the freezing medium. In most cases, cryopreservation is performed to preserve fertility for medical or practical reasons. The main part of this thesis is concentrated on the description of cryopreservation methods for the human gametes, human and animal embryos, ovarian and testicular tissue and stem cells. The information about the advantages and the disadvantages of slow freezing or vitrification for propriate tissue are mentioned there. Ending part contains the mention about cryonics, the method connected with a lot of ethical questions.
1. Úvod Termín kryoprezervace všeobecně znamená mrazení a uchovávání biologického materiálu pod bodem mrazu. Podle definice jde o udržení biologických tkání ve vitálním stavu při velmi nízkých teplotách. Jedná se zde o jakousi pozastavenou živost tkání. Všechny chemické reakce, biologické procesy a fyzikální intracelulární a extracelulární aktivity jsou pozastaveny kvůli teplotě -196 C, kterou navozuje tekutý dusík (Bakhach, 2009). Kryobiologie a kryoprezervace se rozvinula asi v 50. letech 19. století. Spermie byly prvními kryoprezervovanými buňkami. V následujících letech byla poprvé provedena kryoprezervace embryí a ovariální tkáně a v současné době se výzkum orientuje především na úspěšnou kryoprezervaci oocytů. Předpokládá se, že mrazení oocytů v budoucnu úplně nahradí kryoprezervaci embryí (Nagy et al., 2009). Obecně nejčastěji kryoprezervovaným materiálem jsou lidské gamety, lidská či zvířecí embrya nebo části tkáně reprodukčních orgánů. Zmrazování se provádí hlavně při asistované reprodukci, protože právě v klinikách a centrech asistované reprodukce probíhají procesy umělého oplození a manipulace s lidskými gametami a embryi, které je třeba uchovat. Ve výzkumných pracovištích se provádí i zmrazování embryonálních kmenových buněk, což je výhodné pro regenerativní medicínu. Všechny kryoprezervační metody jsou založeny na podobných postupech, pro jednotlivé buňky a tkáně se však jejich provedení liší. V mrazících protokolech jsou používány různé typy kryoprotektiv. Ta slouží k odvodnění zmrazovaného vzorku, aby nedošlo ke vzniku ledových krystalů a osmotických změn uvnitř buněk. Další postup mrazení se odvíjí podle toho, zda se kryoprezervace provádí metodou tradičního pomalého mrazení nebo metodou vitrifikace. Každá z těchto metod vyžaduje specifický postup, použití specifických kryoprotektiv a má své výhody i nevýhody. Při obou metodách se vzorky nakonec uskladní v tekutém dusíku v Dewarových nádobách a v době, kdy budou znovu potřebné, se provede jejich rozmrazení. Pokud vzorky nejeví známky poškození vzniklého při mrazení nebo roztátí, mohou být použity pro další aplikace. Kryoprezervace je velmi úzce spojena s etickými záležitostmi. Mrazení embryí je v některých zemích (Itálie, Německo) zcela zakázáno (Stachecki et al., 2004). Nejvíce eticky problematickou metodou mrazení je kryonika. Jedná se o mrazení lidského mozku nebo celého lidského těla. Názory na tuto tématiku jsou rozporuplné jak mezi vědci, tak mezi širokou veřejností a proto je o tomto tématu zmínka pouze na konci práce. 7
2. Asistovaná reprodukce V současné době se poruchy plodnosti týkají přibližně každého sedmého páru a jejich počet stále roste. Pro léčení těchto problémů se používají techniky asistované reprodukce (ART), které zaznamenaly enormní rozvoj. Základem asistované reprodukce je manipulace s pohlavními buňkami a s embryi, a dále in vitro fertilizace (mimotělní oplození). Ostatní techniky asistované reprodukce dnes představují již celou škálu diagnostických a terapeutických klinických i laboratorních metod. Úspěšnost léčby těmito metodami překročila úspěšnost přirozené reprodukce, která se podle statistik pohybuje kolem 25 % (Crha & Žáková, 2010). In vitro fertilizace (IVF) představuje nejúčinnější léčebný postup pro pacientky, které mají problémy s otěhotněním. V některých zemích překročil počet narozených dětí po in vitru fertilizaci již 10 %. V České republice se narodí po proceduře in vitro fertilizace asi 4 % dětí. Dlouholetá zkušenost založena na vědeckém výzkumu se odráží v dosažených výsledcích, které jsou srovnatelné s vedoucími pracovišti světa (Crha & Žáková, 2010). 2.1. Obecné charakteristiky metod reprodukční medicíny 2.1.1. In vitro fertilizace (IVF) Umělé oplození, takzvaná in vitro fertilizace je nejúčinnější metodou léčby neplodnosti. Základní princip IVF je odběr oocytů a jejich oplození spermiemi v laboratorním prostředí. Na začátku se provádí injekce folikulostimulačního hormonu (FHS) a ta vede v ženských vaječnících k růstu folikulů a dozrávání většího množství vajíček. Zralá vajíčka jsou poté odebrána v celkové anestézii punkcí pod ultrazvukovou kontrolou. Ve stejný den partner pacientky odevzdá sperma ve sterilní nádobce. Získaná vajíčka jsou oplozena zpracovanými spermiemi (u nichž byl stanoven spermiogram) a vyvinutá embrya se dále kultivují (přechovávají) mimo tělo ženy. Po 2 až 5 dnech kultivace se nejkvalitnější embrya transferují (přenesou) do dělohy ženy. Zbylá kvalitní embrya lze zmrazit metodou kryoprezervace a uchovat pro pozdější použití (Crha & Žáková, 2010). 8
2.1.1.1. Oplození oocytů ve zkumavce Klasická a nejjednodušší metoda umělého oplození spočívá v přidání spočítaného množství spermií do zkumavky k oocytům. Metoda se však provádí tehdy, pokud byl stanoven kvalitní spermiogram a spermie jsou zralé, životaschopné, pohyblivé a jsou schopny snadno proniknout přes zona pellucida (glykoproteinový obal vajíčka) do vajíčka (Žáková, 2010). 2.1.1.2. Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI) Použití mikromanipulačního zařízení a oplození metodou ICSI je nutné provést v případě nízkého počtu spermií, při jejich nízké pohyblivosti nebo u spermií získaných mikrochirurgicky z varlete nebo nadvarlete. Zařízení je složeno z mikroskopu a mikromanipulátorů, které jsou ovládány pomocí elektrických joisticků a hydraulického systému. S jednotlivými vajíčky a spermiemi se pracuje pomocí skleněných mikropipet. Metoda spočívá v přímé injekci jediné spermie do připraveného oocytu (Žáková, 2010). Obr. č. 1: Intracytoplazmatická injekce spermie (Vitrolife, 2010) 2.1.1.3. PICSI Nejnovější metoda, která byla odvozena z ICSI, je technika PICSI. Jedná se o selekční metodu, při níž se používají pouze spermie, které jsou specificky vybrány vazbou na gel hyaluronan. Hyaluronan je látka obklopující vajíčko, která se podílí na vazbě vajíčko-spermie. K oplodnění spermie se tedy používají pouze spermie se schopností specifické vazby na oocytární komplex (Žáková, 2010). 2.1.1.4. IMSI IMSI je další novou odvozenou metodou ICSI. Jedná se o intracytoplazmatickou injekci spermie selektovanou morfologicky při zvětšení 6000 krát. Provádí se především v případech opakovaných neúspěchů po IVF a opakovaných potratech bez zjevné příčiny, nebo nízké (<25%) či žádné fertilizaci oocytu po ICSI (Žáková, 2010). 9
2.1.2. Kultivace embryí Oplozením vajíček vznikají embrya, která jsou druhý den přenesena na čtyř-jamkové misky, v nichž jsou kultivována až do 5. dne. Od 3. dne je prováděna prodloužená kultivace. Podle vývojových stádií jsou embrya překládána do jamek obsahujících různá media. Stádia v různých dnech: 1. den zygota, 2. den čtyř-buněčné stádium, 3 den osmibuněčné stádium, 4. den 10 až 12tibuněčné stádium, 4 den - morula, 5. den blastocysta. (Žáková, 2010). 2.1.3. Embryotransfer (ET) Embryotransfer je metoda přenosu vyvinutých embryí do dělohy ženy. V současné době se přenáší 2 až 3 embrya, například blastocysta a morula nebo 2 blastocysty. Embrya jsou přenesena do kapky s mediem, dále nasáta do transferové soupravy a poté vpravena do dělohy (Žáková, 2010). 2.1.4. Asistovaný hatching Asistovaný hatching je mikromanipulační technika, která se provádí na embryích před transferem. Princip spočívá v šetrném otevření obalu embrya (zony pellucidy) pomocí 2 mikropipet. Dojde tak k vytvoření otvůrku, který umožní snazší uvolnění embrya ze zona pellucida a jeho zahnízdění v děložní sliznici. Indikací této metody je věk pacientky nad 35 let, zesílená zona pellucida patrná v mikroskopu, opakované nedosažení těhotenství po transferu kvalitních embryí nebo zvýšená hodnota FSH pacientky (Žáková, 2010). 2.1.5. Preimplantační genetická diagnostika Další zavedenou technikou je preimplantační genetická diagnostika, která je nabízena párům, u nichž hrozí přenos závažné genetické vady na potomky. Metoda spočívá v odběru a genetickém vyšetření jedné až dvou blastomer, které byly odebrány z embrya ve stádiu 8-10 buněk. Blastomera je fixována a předána genetikům. Na základě jejich vyšetření jsou pro transfer vybrána pouze ta embrya, u nichž byla vyloučena genetická zátěž (Žáková, 2010). 10
3. Kryoprezervace 3.1. Důvody kryoprezervace Kryoprezervace je soubor metod, které se používají především pro zachování plodnosti. Mnoho mužů a žen trpí rozličnými chorobami, jejichž léčba ohrožuje reprodukční potenciál. Především však u žen existuje mnoho rizik a nemocí, které by mohly poškodit jejich reprodukční orgány a ohrožují tak ženskou plodnost. Kryoprezervace oocytů, embryí nebo ovariální tkáně je pro ženy v podstatě jedinou možností pro zachování jejich reprodukčních schopností. Jinými důvody kryoprezervace jsou různé sociální a praktické potřeby. Následující text obsahuje výčet některých z důvodů kryoprezervace ženských oocytů, embryí nebo ovariální tkáně: 1) Kryoprezervace embryí se provádí při asistované reprodukci, získají-li páry větší počet oocytů a vyvinutých embryí, než je třeba. Tato embrya mohou být se souhlasem páru zamražena pro budoucí použití (Nagy et al., 2009). 2) Kryoprezervace oocytů je prováděna pro zachování plodnosti mladých žen, jejichž nemoc vyžaduje systematickou proti-nádorovou nebo jinou gonádotoxickou léčbu (Nagy et al., 2009). Pouze ve Spojených státech je každý rok více než polovině milionu žen diagnostikován invazivní nádor. Okolo 50 000 těchto žen je stále reproduktivního věku a mnoho z nich ještě nemá založené rodiny a nemá ani děti (Rao et al., 2004). Při nádorových terapiích dochází prakticky vždy k poškození gonád a ke ztrátě reprodukčních schopností. Kryoprezervace oocytů nebo ovariální tkáně se provádí ještě před zahájením nádorové léčby pacientky. Zmražené vzorky mohou být použity v budoucnu, pokud se pacientka uzdraví. 3) Kryoprezervace oocytů nebo samotné ovariální tkáně je výhodná také před oboustrannou ovariektomií (odnětí vaječníku) nebo před ozářením některé části vaječníku. Protože obě metody patří mezi inovační techniky, volbu jedné z nich určuje hlavně aktuální situace jako je typ nemoci, typ léčby a možnosti uchování vzorku. V optimálním případě je navržena jak kryoprezervace oocytů tak ovariální tkáně (Lucena et al., 2006). 4) Pacientky, které téměř nereagují na ovariální stimulaci, jsou také kandidátky na kryoprezervaci oocytů (Lucena et al., 2006). 5) V poslední době je třeba zachovat plodnost i mladým ženám, které trpí těžkými endometriózami (Elizur et al., 2009). 11
6) Vitrifikace oocytů (viz kapitola č. 3.5.1.2.) se uplatňuje v případě nedostupnosti spermií v čase přijetí oocytů. Bývá totiž často potíž s nekvalitními semennými vzorky a spermie jsou neschopné života a tedy i neschopné oplozovat (Lucena et al., 2006). 7) Uchování oocytů si vyžadují i velmi speciální lékařské situace (např. uchování matčiných oocytů pro dceru s oocyty postiženými Turnerovým syndromem). (Gidoni et al., 2008). 8) Jiným důvodem pro kryoprezervaci je přání odložit mateřství na jiné období, např. při budování kariéry nebo při absenci vhodného partnera (Kuwayama et al., 2005). 9) Zdaleka nejdůležitější příčinou kryoprezervace oocytů v dnešní době je dárcovství oocytů. V dohledné budoucnosti bude bankovnictví s lidskými oocyty soutěžit se spermabankami a v této oblasti bude řešit všechny sociální a možné finanční následky (Nagy et al., 2009). 3.2. Kryoprotektiva 3.2.1. Vlastnosti a rozdělení kryoprotetiv Vznik velkého množství krystalů uvnitř buněk během procesu mrazení může způsobit jejich poškození až smrt. Před zmrazením tkáně je nutné odstranit co největší množství intracelulární vody a snížit rozsah intracelulární krystalizace, avšak pouze do takové míry, aby buňka neztratila svoji životaschopnost. Pro tyto účely se při metodách kryoprezervace používají tzn. kryoprotektiva. Rozdělujeme je na dvě skupiny: 1) penetrující (pronikající) kryoprotektiva jejich část vstupuje do buněk a vytlačuje molekuly vody. 2) nepenetrující (nepronikající) kryoprotektiva jejich část zůstává mimo buňky a vodu z intracelulárních prostor vysává osmoticky. (Ostró et al., 2009). V závislosti na dřívějších experimentech na myších embryích došlo k odhalení faktu, že media pro kryoprezervaci by měla obsahovat nejméně jedno propustné a jedno nepropustné kryoprotektivum. Tato směs by měla být rozpuštěna ve fosfátu nebo v lepším případě v N-(2- hydroxyethyl)piperazinu-n -(2-ethansulfonové kyselině) (=HEPES), která slouží jako ochranné medium. Nejlépe bývá směs doplněna ještě proteiny (hovězí sérový albumin, nebo vaječný žloutek). Jiné výzkumy dokazují, že použití dvou propustných kryoprotektiv je vhodné pro snížení specifické toxicity každého z nich (Ostró et al., 2009). 12
3.2.1.1. Pronikající penetrující kryoprotektiva Nejpoužívanějším pronikajícím kryoprotektivem je ethylenglykol. Bylo zjištěno, že pro myší embrya a blastocysty je málo toxický a rychle difunduje skrz zona pellucida a přes membrány. (Kasai et al., 1992). Dimethylsulfoxid (DMSO) je druhé nejběžnější kryoprotektivum. Směs 1:1 DMSO a ethylenglykolu je více propustná, než je propustnost jednotlivých komponent a při použití tohoto směsného media bylo dosaženo vynikajících procent přežití vzorků a dalšího rozvoje embryí (Nagy et al., 2009). Všeobecně vzato jsou výhodnější kryoprotektiva, která pronikají do buněk rychle. Zkracují totiž expoziční dobu a minimalizují buněčné smrštění. Během rozmrazení rychle difundují z buněk a buňky jsou schopny dříve získat svůj původní objem a tím se uchránit před osmotickým poškozením (Ostró et al., 2009). Nedávné studie demonstrovaly unikátní ochranný vliv DMSO na membrány buněk během kryoprezervace. Existuje však i jeho potencionální mutagenní vliv. Žádného konečného stanoviska v tomto ohledu nebylo zatím dosaženo. Bylo pouze zjištěno, že některé nežádoucí vlivy mohou být spojeny se stopovými nečistotami rozpuštěnými v DMSO. Tyto nové informace stále vyžadují důkazy, protože žádná jiná zpráva nepotvrdila škodlivý vliv DMSO na savčí embryologii. Přesto by se do budoucna za DMSO měla najít vhodná náhrada. (Larman et al., 2007). 3.2.1.2. Nepronikající nepenetrující kryoprotektiva Jako nepronikající kryoprotektiva se používají sacharoza a trehaloza. Trehaloza byla v mnoha publikacích uvedena jako kryoprotektivum nadřazené sacharoze. Nicméně, rozdílnost bývá obvykle minimální. V praktickém použití je sacharoza nejpoužívanější součást mrazícího media (Nagy et al., 2009). 3.2.2. Koncentrace kryoprotektiv Při používání vitrifikačních metod (viz kapitola 3.3.2.) je třeba vysoké koncentrace kryoprotektiv, která potlačí tvorbu krystalů ledu. Některá kryoprotektiva však účinkují při vysokých koncentracích toxicky, buď chemickým, nebo osmotickým způsobem. Aby se minimalizoval toxický účinek kryoprotektiv, mohou být přidány polymery. Ty jsou nepenetrující, zůstávají v prostoru okolo buněk a současně redukují ostatní kryoprotektiva. Lze také použít kombinaci obou kryoprotektiv v ekvimolárních množstvích (Ostró et al., 13
2009). Nejčastěji se používá kombinace ethylenglykolu (ET) a dimethylsulfoxidu (DMSO) (Ishimory et al., 1992). 3.2.3. Čas expozice a teplota mrazícího roztoku Aby bylo dosaženo co nejmenší toxicity kryoprotektiva bez ztráty jeho účinnosti, je třeba co nejvíce zkrátit čas expozice oocytů nebo embryí v mrazícím roztoku. Mezi prevencí toxického poškození a intracelulární krystalizace musí být však rovnováha. Pro snížení toxicity a pro větší pravděpodobnost přežití se doporučuje dvoustupňový postup. Embrya či oocyty by měly být vystaveny primárně nižší koncentraci mrazícího roztoku a následně přeneseny do roztoku s konečnou koncentrací kryoprotektiva (Ostró et al., 2009). 3.2.4. Kryoprotektivní protein (AFP) Kryoprotektivní proteiny (AFPs Antifreeze Proteins) a kryoprotektivní glykoproteiny (AFGPs Antifreeze Glycoproteins) jsou látky obsažené ve tkáních a krvi arktických ryb. Scholander et al. (1957) zjistili při studii těchto ryb, že se jedná o faktor zamezující zmrazení. De Vries & Wohlschlag (1969) zjistili, že jde o protein, který se u ryb vyskytuje ve vysokých koncentracích a chrání je před zmrznutím. 3.2.4.1. Působení AFP/AFGP Na rozdíl od mnoha jiných roztoků, složky AFP a AFGP kineticky snižují teplotu, při níž se tvoří ledové krystaly takovým způsobem, který zamezí teplotnímu šoku. Díky tomu mohou ryby přežívat ve vodě, která je chladnější, než je bod tuhnutí jejich krve a tělních tekutin. Tyto proteiny modifikují růst ledových krystalů nebo jejich růstu předcházejí a mají také schopnost zastavit rekrystalizaci. Tím chrání buněčné membrány před poškozením indukovaným chladem (Madura et al., 2000). Tyto mnohostranné vlastnosti AFP lze potencionálně využít v medicíně a průmyslových oblastech, kde je třeba dlouhodobě uchovávat biologický materiál (Fletcher et al., 1999). 3.2.5. Chemická toxicita kryoprotektiv Chemická toxicita kryoprotektiv je spojena se 2 efekty. První je chemické působení na buňky před kryoprezervací a druhý je způsobení osmotických změn v mrazícím roztoku. Při pomalém mrazení (viz kapitola 3.3.1.) jsou obvykle používány nízké koncentrace kryoprotektiv. Koncentrace kroprotektiv užívaných při vitrifikaci je však vysoká. Pro odhad 14
toxicity kryoprotektiv je nezbytné zvážit buněčnou propustnost pro každé kryoprotektivum. Vysoká permeabilita může u buněk před mrazícími a rozmrazujícími procesy způsobit osmotický stres. Rychlost prostupování kryoprotektiv je také přísně závislá na teplotě. Hlavní faktory ovlivňující toxicitu kryoprotektiv tedy jsou: koncentrace, expoziční teplota, a doba mrazení (Chian & Quinn, 2010). Kryoprotektiva ve směsi spolu mohou interagovat navzájem nebo interagují s důležitými buněčnými molekulami. Tím se projeví další účinky kryoprotektiv na buňky oproti použití jediného kryoprotektiva. Zdali dojde ke snížení toxicity smísením dvou nebo více kryoprotektiv v mrazícím roztoku je stále zkoumáno (Chian & Quinn, 2010). 3.3. Metody kryoprezervace 3.3.1. Pomalé mrazení Pomalé mrazení je tradiční kryoprezervační metoda, při níž se vzorky nejprve upravují a jejich zmrazení probíhá pečlivě a pomalu. Vzorky jsou před zmrazením postupně odvodňovány kryoprotektivními roztoky s narůstající koncentrací kryoprotektiva. Obvykle jsou zde používána kryoprotektiva o nižší koncentraci než při vitrifikaci. Pejety se vzorky jsou po odvodnění nějakou dobu udržovány při teplotách 6-8 C. Nakonec jsou vzorky chlazeny na teploty pod bodem mrazu. Tento postup se provádí proto, aby nedošlo k tvorbě vnitrobuněčných ledových krystalů (Son & Tan, 2009). Nejkritičtější moment pro buňky během mrazení je přechodná teplotní zóna (-15 až -60 C). Po překonání tohoto teplotního rozmezí jsou vzorky uskladněny při teplotě -196 C v tekutém dusíku. Při metodách pomalého mrazení lze vzniku ledových krystalů částečně zabránit, ale přesto je zde riziko jejich tvorby značně vysoké. Aby se udržela správná rovnováha mezi faktory, které by mohly vést ke zničení buněk ledovými krystaly, je třeba ponechat pomalému mrazení alespoň 90 minut. Během rozmrazovacího procesu se může objevit ledová rekrystalizace, která často způsobuje nová kryoporanění. Lze tomu zabránit rychlým ohřátím vzorku (Son & Tan, 2009). Tradiční postupy pomalého mrazení jsou užívány k mrazení lidských oocytů a všech druhů lidských embryí. Klinicky zcela vyhovujících výsledků nebývá vždy dosaženo a navíc jsou poměrně různé. Metody pomalého mrazení kromě toho vyžadují drahé vybavení a mnoho času. Pomalé mrazení je proto v klinikách asistované reprodukce stále častěji nahrazováno vitrifikačními postupy (Son & Tan, 2009). 15
3.3.2. Rychlé mražení vitrifikace Vitrifikace je ultrarychlá chladící technika, která vyžaduje vysokou koncentraci kryoprotektiv. Tato metoda trvá několik sekund a nevyžaduje specializované drahé vybavení. Fyzikální definice vitrifikace je sklovité, průhledné, bezledové zpevnění vodného roztoku v teplotách pod nulou, ne díky krystalizaci ledu, ale díky extrémnímu zvýšení viskozity během chlazení. Buňky jsou umístěny v kryoprotektivu a poté okamžitě ponořeny do tekutého dusíku. Voda je převážně nahrazena kryoprotektivem. Dosažená chladící rychlost je mezi 15 000-30 000 C.min -1 a voda je transformována přímo z kapalné fáze do skelné - vitrifikované fáze. Žádná forma ledových krystalů nemůže při této metodě poškodit buňky (Son & Tan, 2009). Pro dosažení vitrifikace je třeba pracovat s velmi malým objemem vzorku a použít rapidně rychlé ochlazení. Vysoká rychlost zmrazování však vyžaduje použití kryoprotektivního roztoku o vysoké koncentraci. Roztok sice sníží krystalizační procesy v buňce, ale může mít velmi nežádoucí toxické účinky. Hlavním cílem vitrifikačních metod je proto vyvážit maximální rychlost zmrazování a minimalizovat koncentraci kryoprotektiva (Ostró et al., 2009). 3.3.3. Nejpoužívanější nosiče a metody pro vitrifikaci Na uskladnění oocytů nebo embryí během procesu zmrazování, skladování a rozmrazení používá většina vitrifikačních postupů klasické francouzské pejety. Mají ohraničenou nejvyšší rychlost ochlazování a zahřátí na méně než 2 000 C.min -1. Aby byla dosažena vyšší rychlost při zmrazování a minimalizoval se objem zmrazovaného vzorku, byly postupně zaváděny různé typy nosičů. Jedná se o nové techniky vitrifikace, které příznivě ovlivňují výsledky kryoprezervace lidských oocytů a embryí u druhů, které jsou citlivé na poškození mrazem (Ostró et al., 2009). Prvním použitým nosičem byla měděná síťka pro elektronovou mikroskopii (Martino et al., 2000). Vitrifikovaný roztok plně adheruje na povrch síťky a bezpečně fixuje vzorek na jejím povrchu během skladování a následujícím rozmrazení. Vodivost kovové síťky také zvyšuje rychlost ochlazení a rozmrazení vzorku (Ostró et al., 2009). 3.3.3.1. OPS (Open Pulled Straw) metoda Open pulled straw je technologie, která využívá jako nosiče nové typy pejet, které jsou 16
vytažené nad teplem, jsou otevřené a mají oproti klasickým pejetám o polovinu zúžené lumen i tloušťku stěny. Po nasátí embryí kapilárním efektem se objem media sníží z původních 5 µl na méně než 1 µl a je dosažena velmi vysoká rychlost (více než 20 000 C. min 1 ) ochlazování a zahřívání roztoku s embryi. Open pulled straw pejety umožňují pouze krátký kontakt embrya s vysoce koncentrovanými kryoprotektivy (méně než 30 sekund nad 180 C) a tím zabraňují toxickému a osmotickému poškození embrya. Tato metoda se ukázala jako velice úspěšná například při zmrazování extrémně citlivých prekompaktních stádií embryí vyprodukovaných in vitro. Výhody oproti tradičnímu zmrazování jsou: a) ekvilibrační čas není dlouhý b) řízené zmrazovací zařízení není při této metodě potřebné c) zabraňuje se tvorbě krystalů ledu uvnitř buněk během zmrazování (Ostró et al., 2009). Nevýhodou OPS metody je možné riziko kontaminace vzorku, pokud je vitrifikační medium v přímém kontaktu s tekutým dusíkem. Toto riziko lze snížit filtrováním tekutého dusíku na bakterie a plísně (0,2 µm filtr). Filtrace je provedena tak, že se umístí zúžený konec OPS pejety do standardní pejety a uzavře se její konec (Ostró et al., 2009). I přesto však může během ekvilibrace dojít ke škodlivým účinkům a osmotickému poškození vzorků vysoce koncentrovanými kryoprotektivy (Leoni et al., 2003). Obr. č. 2: OPS pejety (URL x) (Minitube International, 2009) 3.3.3.2. Cryoloop (Nylonloop) vitrifikace Technika cryoloop vitrifikace byla poprvé popsána roku 1999. Její princip spočívá v tom, že se skupina embryí ponechá ve vitrifikačním roztoku číslo 1 po dobu 60 sekund a poté je přenesena do vitrifikačního roztoku číslo 2 s konečnou koncentrací. V něm je skupina ponechána po dobu 30 sekund. Tím se získají embrya připravená na vitrifikaci. Malou pipetou jsou přenesena na tenkou vrstvu nosiče, který byl vytvořen z nylonové smyčky a je ponořen do vitrifikačního media č. 2. Na nilonové smyčce je utvořen velmi pevný film roztoku, který 17
je schopen na svém povrchu oocyty či embrya udržet. Roztok má minimální objem a rychlost ochlazení může dosáhnout extrémních hodnot (až 700 000 C.min 1 ). Z vitrifikačního media jsou embrya ihned přenesena do tekutého dusíku v Dewarových nádobách (Ostró et al., 2009). Touto metodou lze zmrazovat oocyty nebo embrya také v parách tekutého dusíku (Larman et al., 2006) Obr. č. 3: Nylonloop vitrifikace (Vitrolife, 2010) 3.3.3.3. Microdrop vitrifikace Microdrop vitrifikaci poprvé zavedl Landa & Teplá (1995) u myších embryí a později byla úspěšně použita u nezralých oocytů, zygot a embryí hovězího dobytka. Je to metoda, která využívá maximální rychlosti zmrazování a minimálního objemu zmrazovacího roztoku (1-2 µl). Nejjednodušeji se dá provést přímým kápnutím buněk do tekutého dusíku (Ostró et al., 2009). 3.3.3.4. Minimum volume cooling (MVC) Technika minimum volume cooling (MVC 19) je podobná principu microdrop vitrifikace. Buňky ponořené do vitrifikačního media o minimálním objemu se přenesou na pevný film nosiče a ponoří se přímo do tekutého dusíku. Tento princip využívá také technika hemi-straw system, kde slouží jako nosič otevřená a seříznutá pejeta (Ostró et al., 2009). 18
3.4. Nežádoucí účinky mrazení 3.4.1. Útvary z ledových krystalů Lze si snadno představit, k jakému buněčnému poškození dojde, spadnou-li teploty z + 37 C na -196 C. Dojde při tom ke ztrátě až 95 % nitrobuněčné vody. Buňky jsou stlačeny a deformovány, protože se sníží jejich elektrolytická koncentrace v extracelulárním a intracelulárním mediu. Vznikají v nich útvary z ledových krystalů (Rubinsky, 1989). Během procesu krystalizace je část roztoku stále v kapalném stavu a stává se víc a víc koncentrovanou. Proces pokračuje do chvíle, než se ustálí termodynamická rovnováha mezi krystalickou a kapalnou fází. Poté se proces krystalizace zastaví. Množství krystalů, které se zformují při dané teplotě, závisí tedy na počátečním složení roztoku (Bakhach, 2009). K ovládnutí procesu krystalizace je důležité znát kinetiku ledových útvarů jak v intracelulárním tak v extracelulárním mediu (Bakhach, 2009) 3.4.1.1. Buněčná dehydratace Důsledkem ledových krystalů v extracelulárním prostoru je změna chemického složení a zvýšení iontové koncentrace extracelulární kapaliny. Koncentrační gradient se tvoří mezi intracelulárním a extracelulárním prostorem. To způsobuje, že se rozpuštěná látka dostává dovnitř buňky a voda ven. Membrána se tedy chová jako polopropustná a buňky reagují na chlad snížením obsahu cytoplazmatické vody. Tato buněčná dehydratace je zřetelná při nízkých teplotách (Mazur, 1963). 3.4.1.2. Mechanický stres Extracelulární ledové útvary deformují buňku a pro buňku v tu chvíli nastává mechanický stres. Krystalové útvary oddělují buňky do kanálů, které obsahují zbytkovou kapalinu. Jak teploty klesají, průměr kanálů se scvrkne a buňky se postupně deformují víc a víc (Rapatz & Menz, 1966). 3.4.1.3. Teplotní šok Ostrá změna teplot během chlazení může sama o sobě způsobit buněčné poranění, dokonce i v případě, že ledové krystaly nejsou přítomny. Jedná se o termický šok. Šok se objevuje mezi teplotami + 37 C a + 15 C, ale také mezi teplotami 0 C a -80 C. Poranění buněčné membrány se projeví stahem různých jejích součástí. Poranění jsou spojena se změnami 19
aniontového složení extracelulárního media, zvláště změnou složení acetátů, chloridů, nitrátů, jodidů a sulfátových aniontů. Teplotní šok se snižuje přidáním kryoprotektivních činidel a specifických fosfolipidů (fosfatidylserin) v kombinaci s kontrolovaným pomalým mrazením (Bakhach, 2009). Jako jiné zničující vlivy mechanické povahy pro buňky považujeme vniknutí plynových bublinek do útvarů v intracelulárním prostoru. Dále pak osmotické vlivy spojené se splynutím ledových krystalů během tání. Intracelulární ledové krystaly mohou zůstat neškodné, jestliže se jejich rozšíření kontroluje (Bakhach, 2009). 3.5. Kryoprezervace gamet 3.5.1. Kryoprezervace oocytů Počátek kryoprezervace oocytů je zaznamenán až v prvním desetiletí 21. století (Nagy et al., 2009). Kryoprezervace oocytů je atraktivní možností pro zachování ženské plodnosti. Tato procedura nevyžaduje náročnou operaci a mohou být při ní použity dobře testované postupy IVF. První těhotenství z kryoprezervovaných oocytů bylo ohlášeno v roce 1986. Do roku 2004 se narodilo ze zmrazených oocytů asi 100 dětí (Chen, 1986). Jednou z nevýhod ochlazení oocytů je riziko předčasného vylití kortikálních granulí z oocytu. Po něm následuje zona hardening, neboli ztvrdnutí zona pellucida. Toto ztvrdnutí může nepříznivě ovlivnit oplodňovací proces (Matson et al., 1997). Změna zabrání průniku spermie do zona a překáží uvolnění embrya ze zona pellucida. Tyto problémy ale mohou být překonány intracytoplazmatickou injekcí spermie a pomocí asistovaného hatchingu (Tucker et al., 1996). Nejnovější studie prokazují stále lepší životnost oocytů po roztátí a vyšší míru následných těhotenství (Barritt et al., 2007). Vývojové schopnosti lidských kryoprezervovaných oocytů bývají v této době srovnatelné s vlastnostmi čerstvých sourozeneckých oocytů (Coticchio et al., 2007). Kryoprezervace oocytů je tedy stále častěji využívanou metodou v IVF centrech a stává se obrovskou výzvou pro lidskou reprodukční kryobiologii. V současnosti se pro tento typ kryoprezervace vyvíjí nové mrazící techniky a postupy (Tao & Del Valle, 2008). 3.5.1.1. Pomalé zmrazování Pomalé mrazení lidských oocytů je metoda, která přináší na poli reprodukční medicíny 20
přijatelné výsledky. Závažnou nevýhodou této procedury je především doba, po kterou jsou oocyty vystaveny účinkům kryoprotektiv. Rychlost chlazení by měla být při tomto procesu na jednu stranu malá, aby došlo k dehydrataci a nevznikalo vnitrobuněčné mrazení. Na druhou stranu by měla být dost velká, aby nebyly vzorky intoxikovány kryoprotektivy. Nedávné studie potvrdily, že pomalé mrazení a rychlé roztátí minimalizuje tvorbu ledových krystalů uvnitř buňky a nedochází k tak rapidnímu buněčnému poškození (Fabbri et al., 1988). Oocyty jsou obvykle ochlazovány k -7 C rychlostí -1 C.min -1. Dále se chladí až k -30 C rychlostí -0.3 C.min -1 a poté se teplota nechá volně klesat k -50 C. Následuje ponoření do tekutého dusíku. Celá mrazící procedura trvá asi 3 hodiny. Nejčastěji používanými kryoprotektivy jsou dymethylsulfoxid (DMSO), glycerin, ethylenglykol, propylenglykol a přídavky sacharózy (Tao & Del Valle, 2008). 3.5.1.2. Vitrifikace Dalším možným způsobem kryoprezervace oocytů je vitrifikace. Vitrifikace oocytů se stává nejrozšířenější metodou užívanou IVF centry a tato technologie se neustále vyvíjí (Nagy et al., 2009). Vitrifikace využívá vysokých koncentrací kryoprotektiv (pronikajícího ethylenglykolu a DMSO v kombinaci s nepronikající sacharozou) a velmi rychlého chlazení (-1 500 C.min -1 ), při němž se nestihnou vytvořit ledové krystaly. Rychlé snížení teplot může kromě toho zmírnit tepelnou zátěž pro oocyty a redukovat jejich poškození chladem. Z těchto důvodů byly poslední technologie navrženy tak, aby co nejvíce zvýšily rychlost chlazení. Používají se tedy nosiče s co nejnižším objemem. Do těchto technologií zahrnujeme měděné mřížky pro elektronovou mikroskopii, open-pulled pejety, Cryotop, skleněné kapiláry nebo mrazící smyčky (Tao & Del Valle, 2008). Navzdory pokrokům ve vitrifikaci není doposud zcela přesně znám potenciální škodlivý vliv této metody na oocyty. Vysoké koncentrace ethylenglykolu a dimethylsulfoxidu jsou spojeny s vyšší toxicitou a mohou způsobit osmotické poškození (Luvoni et al., 2000). 3.5.2. Kryoprezervace spermií a spermatu Od té doby, co byla úspěšně představena technika in vitro fertilizace, se ukázalo nutné používat kryoprezervované sperma. Pro příjemkyni je tak zaručena minimalizace rizik přenosu infekcí a virových nákaz jako je žloutenka typu B nebo C (Fleming, 2009). Během let byly rozvinuty rozmanité metody pro kryoprezervaci spermatu. Jedná se o mrazení v suchém ledu, mrazení v páře tekutého dusíku, kontrolované pomalorychlostní mrazení a vitrifikace (Fleming, 1997). Při těchto metodách se používá řada kryoprotektiv, aby 21
nedošlo k poškození buněk ledovými krystaly během zmrazovacího - rozmrazovacího cyklu. Důležitý je také správný výběr obalu a metod pro uskladnění vzorků spermatu, protože je třeba snížit riziko křížové kontaminace mezi vzorky (Fleming, 2009). Celý proces kryoprezervace spermatu se spoléhá na efektivní metody ředění spermatu kryoprotektivy, balení směsi zředěného spermatu, vlastní mrazící proceduru a bezpečné uskladnění kryoprezerovaného materiálu. Každý krok závisí na přesném použití specifického vybavení a materiálu (Fleming, 2009). 3.5.2.1. Kryoprotektiva a míšení se spermatem V dnešních postupech mrazení spermií se používají pouze 2 typy kryoprotektivních činidel, která slouží jako zřeďovací media: a) žloutkový citrát v glycerolu (glycerol představuje kryoprotektivní činidlo) (Matheson et al., 1969) b) modifkované Tyrodovo medium obsahující glycerol a sacharozu jako kryoprotektivní činidla (Mahadevan & Trounson, 1983). Preferovány jsou preparáty založené především na Tyrodově mediu. Kryoprotektivní činidla jsou obvykle přidávána k ejakulátu při pokojové teplotě, pomalu a při konstantním vířením směsi. Tento postup se provádí z toho důvodu, aby se zabránilo potencionálnímu zničení spermatu při změně jeho objemu nebo vlivem samotného kryoprotektiva. Směs se nechá vířit 10 minut, čímž se získá přiměřený čas pro pronikající kryoprotektiva ke vstupu do buněk a pro dokončení změn v objemu spermií (Fleming, 2009). 3.5.2.2. Materiály pro uchování směsi zředěného spermatu Obvykle jsou používány pouze tři typy obalů při kryoprezervaci lidského spermatu: kryozkumavky nebo ampule, pejety a stříkačky. Existují však i různé nevýhody těchto tří typů obalů. Kryozkumavky lze lehce sterilně naplnit a udrží maximálně 1.0 ml směsi spermatu s kryoprotektivy. Uskladnění v nádržích s kapalným dusíkem je příliš objemné a tato technika se dá provést pouze s malým množstvím spermatu. Umístění a uložení kryostříkaček je efektivnější, ale na druhou stranu náchylné na kolísání teplot během skladování. Šroubovací zkumavky nemají příliš těsné uzávěry a je tedy běžné, že tekutý dusík proniká do nádob a během roztávání hrozí roztržení buněk. Jsou proto doporučovány sekundární obaly, ale v praxi je jejich využití obtížné (McLaughlin, 2002). Uskladnění spermatu v tradičních 0.25 ml nebo 0.5 ml je nejběžnější. Pejety jsou dostupné v různých barvách a tedy vhodné pro lehkou identifikaci jednotlivého materiálu. 22
(McLaughlin, 2002). Obr. č. 4: Semen Straw: Clear, 0.5 ml 2,500/bag (Minitube International, 2009) 3.5.2.3. Pomalé mrazení Při této metodě probíhá mrazení pejet či ampulí chladící rychlostí o -1 C.min -1 z pokojové teploty až k teplotě 5 C. Následuje rychlost -10 C.min -1, která ochladí vzorky až na teplotu -85 C. Poté jsou pejety umístěny do nádrží s tekutým dusíkem (McLaughlin, 2002). 3.5.2.4. Vitrifikace Isachenko a kol. jsou průkopníci nových metod vitrifikace spermatu. V roce 2003 demonstrovali, že sperma by mohlo být úspěšně kryoprezervováno za absence kryoprotektiv, a to přímým ponořením měděných kryolop nosičů naplněných spermatickou suspenzí do tekutého dusíku (Nawroth et al., 2002). Tímto postupem se daří zabránit cytotoxickým vlivům, které jsou způsobeny vysokou koncentrací kryoprotektiv. Tání vitrifikované suspenze spermatu probíhá v rozprouděném horkém médiu. Vitrifikace používají kryolop nosiče, 20 µl kapky, open-pulled pejety. Standardní pejety jsou poměrně účinné, ale nejvhodnější pro kryoprezervaci jsou pejety oddělující sperma od tekutého dusíku (Isachenko et al., 2005). Použití pejet je doporučováno i z důvodů vyhnutí se možným křížovým kontaminacím mezi kryoprezervovanými vzorky spermatu pacientů (McLaughlin, 2002). 23
3.5.2.5. Uskladnění kryoprezervovaného spermatu Kryoprezervované vzorky spermatu jsou typicky uskladněny uvnitř různě barevných tubiček nebo pohárcích pro snadnou pozdější identifikaci. Tato balení jsou obvykle uskladněna v nádržích s tekutým dusíkem - Dewarových nádobách. V současné době se však stává atraktivnější uskladňování v lednicích s plynnou fází kapalného dusíku. Tato možnost se totiž vyhýbá křížové kontaminaci vzorků spermatu, která by mohla nastat vlivem kontaktu s tekutou fází (McLaughlin EA, 2002). Obr. č. 5: Dewarovy nádoby na uskladnění kryoprezervovaného materiálu (Minitube International, 2009) 3.5.2.6. Tání kryoprezervovaného spermatu Aby byl celý proces kryoprezervace spermií efektivní a nedošlo při roztávání k nějakým nežádoucím účinkům, je třeba nechat vzorky spermií prudce roztát. Tající techniky jsou rozmanité a mohou být uplatněny bez ohledu na mrazící techniky (Taylor et al., 1982). 24
3.6. Kryoprezervace ovariální tkáně Kryoprezervace vaječníkové tkáně se v klinikách asistované reprodukce uplatňuje stále častěji a probíhá podobnými postupy jako kryoprezervace oocytů (Tao & Del Valle, 2008). Nezralé oocyty v prvotních folikulech ve vaječníkové kůře jsou méně citlivé na poškození kryoprezervací. Jsou malé, nevyvinuté, s málým množstvím organel, žádnou pellucidou, a relativně metabolicky klidné a nediferencované (Nugent et al., 1997). Proto je kryoprezervace tkáně vaječníkové kůry s primárními folikuly navrhována jako další z možností pro zachování plodnosti (Donnez et al., 1998). Nové poznatky v rozvoji této metody vzbudily zájem a procedura se stala také potenciálním prostředkem pro uchování plodnosti pacientek při riziku předčasného vaječníkového selhání (Donnez et al., 1998). Také pro vaječníkovou tkáň platí rizika spojena s kryoprezervací. Hrozí zde především poškození toxickými kryoprotektivy a rizika tvorby vnitrobuněčného ledu (Tao & Del Valle, 2008). 3.6.1. Pomalé mražení ovariální tkáně Běžný postup pomalého mrazení ovariální tkáně je následující: po 20 30 minutové inkubaci kousků vaječníkové tkáně v mrazících nádobách s 1.5 M ethylenglykolem a 0.1 M sacharozou dojde k ochlazení na -7 C rychlostí -2 C.min -1. Dále probíhá chlazení až k -40 C rychlostí -0.3 C.min -1 Teplota poté volně klesá až k -100 C a následuje uskladnění v tekutém dusíku. Při rozmrazování jsou ampulky ponořeny do 37 C vodní lázně a kousky tkáně vyprané v kryoprotektivním mediu ethylenglykolu o snižující se koncentraci (1.5, 1.0, 0.5, 0 M) (Tao & Del Valle, 2008). 3.6.2. Vitrifikace ovariální tkáně Vitrifikace ovariální tkáně je úspěšně používanou metodou IVF centry. Tato procedura zajišťuje přijatelné výsledky a kryoprezervované vzorky po roztátí vykazují jen nepatrné změny v morfologii a malá kryoprezervační poškození (Isachenko et al., 2003). Kryoporanění však i u tohoto procesu hrozí. Vitrifikace probíhá rychlostí -1,500 C.min -1 (Rall et al., 1985). Vzorky jsou uskladněny v tekutém dusíku. Po roztátí tkáně se předpokládá její transplantace zpět do vaječníků, kde bude vývoj oocytů pokračovat. Často při této metodě dochází ke zmenšení folikulární hmoty v zamrzlé - rozmrazené tkáni ve srovnání s jejím objemem v čerstvé vaječníkové tkáni (Migishima et al., 2006). Proto je zpětná transplantace problémová. 25
3.7. Kryoprezervace testikulární tkáně Během posledních několika desetiletí se stále zvyšuje počet dětí, které přežívají zhoubný nádor. Mnoho z nich bojuje s pozdějšími zdravotními následky léčby, z nichž nejzávažnější je neplodnost. K léčbě zhoubných nádorů se totiž používají terapie, které jsou ve většině případů gonadotoxické. (Wyns et al., 2008). Kryoprezervace testikulární tkáně je pravděpodobně jediné možné východisko pro prepubertální chlapce, kteří musejí tento typ léčby podstoupit. Nemají v tomto věku ještě vyvinuté žádné sperma ani zralé spermie, které by mohly být kryoprezervovány a zachovány. Spermatogeneze totiž začíná až v pubertálním věku (Wyns & et al., 2008). Možnost kryoprezervace testikulární tkáně se tedy nabízí rodičům prepubertálních chlapců s nedávno diagnostikovanými zhoubnými nádory jako možnost pro uchování jejich plodnosti. Hned zpočátku by se mělo zvážit, zdali léčba opravdu způsobí neplodnost. Ideálně by měla být tato otázka zodpovězena ještě před počátkem terapie, aby mohla být tkáň včas odebrána a kryoprezervována. Ve chvíli, kdy by chtěl jedinec založit rodinu, tato tkáň by byla rozmrazena a zárodečné buňky zpětně implantovány do pacientových varlat, kde by pokračovalo jejich zrání. Zrání implantovaných buněk by mohlo také probíhat in vitro. Vyvinuté spermie by bylo možno použít pro ICSI nebo pro implantaci zpět do varlat. (Wyns et al., 2007). V oblasti kryoprezervace testikulární tkáně byl proveden významný pokrok ve zvířecím výzkumu. Pro člověka je tato metoda stále však pouze experimentální (Wyns et al., 2008). Otázka, zda by kryoprezervovaná testikulární tkáň mohla nebo nemohla být klinicky využita pacienty v budoucnu, není jasně zodpovězena. Tato metoda je zatím ve vývinu a chlapci, kteří již podstoupil kryoprezervaci testikulární tkáně, jsou v současnosti nejvíce 15 let staří. Jejich testikulární tkáň jim nebyla zatím zpětně transplantována a není tedy jasné, zda bude spermatogeneze probíhat nebo ne (Wyns et al., 2008). V této proceduře se jako kryoprotektivní činidlo používá dimethylsulfoxid (DMSO) o koncentraci 0,7 mol/l, doplněný sacharozou o koncentraci 0,1 mol/l a lidským sérovým albuminem (HSA) o koncentraci 10 mg/ml. Kousky tkáně jsou umístěny v 1 l mrazícího media při 4 C v 2 ml mrazících ampulkách (Ginsberg et al., 2009). Mrazení se provádí v pomalém programovatelném mrazícím zařízení (Wyns et al., 2008). 26
3.8. Kryoprezervace embryonálních kmenových buněk Zájem o lidské embryonální kmenové buňky se stále více rozvíjí. Kmenové buňky mají značný potenciál pro buněčnou terapii a regenerativní medicínu. Aby se tento pozoruhodný potenciál mohl využít, byly vyvinuty optimální kryoprezervační metody pro kryoprezervaci pluripotentních buněk. Možnost dlouhodobého uchování těchto buněk by zajistila jejich snadnější přenos mezi výzkumnými centry a vědeckými pracovišti a usnadnilo by se jejich rozšíření a využití (Holm et al., 2010). Lidské embryonální kmenové buňky jsou velice citlivé na kryoprezervaci a kryoporanění a využití mrazících metod je pro ně značně omezené. Přesto byly prováděny studie s mnoha kryoprezervačními procesy, které by buňky umožnily zachovat (Holm et al., 2010). V procedurách jsou používána propustná i nepropustná kryoprotektiva a mrazící protokol neobsahuje žádná xenobiotika. Tím je docíleno zvýšení počtu buněk, které přežijí. Ve vzácných případech může procento přežitých buněk dosáhnout až 90 % (Holm et al., 2009). Jako kryoprotektivní činidla se používají media obsahující 10% dimethylsulfoxid (DMSO), který umožňuje mrazení většího množství buněk v jedné ampulce. Počet přežitých a nediferencovaných buněk je však po roztátí většinou nízký a buňky buď umírají, nebo se diferencují. Z dalších kryoprezervačních metod je také široce využívána vitrifikace, ale při ní je velmi těžké udržet buňky v tekutém dusíku sterilní. Proto byly vyvinuty speciální bezpečnostní pejety. Ty však dovolují vitrifikaci pouze malého počtu buněk (Holm et al., 2010). Kryoprezervační metody pro mrazení lidských embryonálních kmenových buněk se tedy soustředí především na nalezení nejvhodnějších systémů, které umožňují mrazení většího množství buněk. Buňky poté slouží pro výzkumné účely a pro klinické dlouhodobé uchování. Metody nevyžadují specifické mrazící aparatury (Holm et al., 2010). 27
3.9. Kryoprezervace embryí Kryoprezervace embryí je významnou metodou asistované reprodukce. Cílem kryoprezervačních postupů je zajistit vysoké procento přežitých a životaschopných lidských embryí po rozmrazení (Son & Tan, 2009). Pro kryoprezervaci embryí se zatím ve větší míře používají tradiční metody pomalého mrazení. Vitrifikační metody přinášejí značné komplikace. Nejzávažnější z nich je intoxikace vysoce koncentrovanými kryoprotektivy nebo kontaminace tekutým dusíkem. Přesto během posledních let významně vzrostl o vitrifikaci embryí zájem. Je tedy pravděpodobné, že vitrifikace embryí v blízké budoucnosti zcela nahradí metody pomalého mrazení (Son & Tan, 2009). Nejproblémovější otázkou zůstává, v jakém vývojovém stádiu je nejlepší embryo kryoprezervovat, protože mrazení jakéhokoliv stádia s sebou nese určité nevýhody (Ménézo et al., 2004). U embryí ve stádiu zygoty nejsou objasněné vývojové schopnosti, a proto není jednoduché tato stádia mrazit. V buňkách rýhujících se embryí existují po roztátí poškozené blastomery. Ty se objevují současně s těmi nepoškozenými a mohou způsobit porušení embrya. Úspěšnost implantací těchto embryí je nižší, než implantace neporušených vzorků (Edgar et al., 2000). Je poměrně výhodné kryoprezervovat blastocysty, protože obsahují větší množství malých stejnocenných buněk. Pokud při kryoprezervaci dojde ke ztrátě některé z nich, důsledky jsou méně zničující, než pro ostatní stádia embryí (Son & Tan, 2009). 3.9.1. Kryoprezervace zygot ve stádiu prvojader Nejběžnější osvědčená metoda pro kryoprezervaci lidských oplodněných zygot (2 pronuclei (PN)) bylo donedávna pomalé mrazení (Damario et al., 2000). Po roztátí a následném embryotransferu pronukleárních embryí bylo zaznamenáno už mnoho úspěšných těhotenství. Na druhou stranu se při této metodě objevují často i nízké nebo kolísavé počty přežitých embryí. Procento úspěšně kryoprezervovaných embryí v 2 PN stádiu metodou pomalého mrazení je však obecně vyšší, než kryoprezervace embryí časně se rýhujících (Damario et al., 2000). V roce 2002 byly ohlášeny i úspěšné vitrifikace 2 PN embryí s procentem přežití až 93 % (Jelinkova et al., 2002). 2 PN stádia embryí jsou schopna dobře odolávat vitrifikaci a vitrifikační techniky použité na tato stádia embryí přináší stále lepší výsledky ve srovnání s metodami pomalého mrazení (Son & Tan, 2009). 28