UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biofyziky a fyzikální chemie Fytokanabinoidy Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. Hradec Králové, 2008 Klára Petrů
Děkuji RNDr. Michaele Hamerníkové, Ph.D. za námět, ochotu při odborném vedení, rady a připomínky, které mi pomohly při vypracování této diplomové práce. Děkuji také Ing. Ivu Vykydalovi z Policie ČR za dodání vzorků marihuany a všem ostatním, kteří mi byli jakkoliv nápomocni. 2
Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. V Hradci Králové 3
Abstrakt: Název: Fytokanabinoidy Autor: Klára Petrů Vedoucí diplomové práce: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. Katedra: Katedra biofyziky a fyzikální chemie 9 tetrahydrokanabinolová kyselina A ( 9 THCA-A), jeden z hlavních kanabinoidů obsaţený především v čerstvých rostlinách Cannabis sativa L., je prekurzorem psychoaktivního 9 tetrahydrokanabinolu ( 9 THC). Teoretická část práce pojednává o biosyntéze této kyseliny a její nestabilitě, která je hlavním problémem při kvantitativním stanovení 9 THC. Zabývala jsem se českou a evropskou legislativou týkající se Cannabis sativa. Shrnula jsem, ve kterých oblastech práva je stanovení obsahu 9 THC stěţejní. Zároveň jsem shrnula dosavadní poznatky o izolaci 9 THCA-A, která je sice povaţována za neaktivní, ale pravděpodobně z důvodu nestability této látky dosud nebyl proveden systematický výzkum jejích farmakologických a toxikologických vlastností. V experimentální části práce je popsán a vyhodnocen pokus o izolaci THCA-A extrakcí z konopí. 4
Abstract (English version) Title: Phytocannabinoids Author: Klára Petrů Supervisor: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. Department: Department of Biophysics and Physical Chemistry 9 tetrahydrocannabinolic acid A ( 9 THCA-A), one of the main canabinoic compound of the ripe plants Cannabis sativa L., is a precursor of psychoactive 9 tetrahydrocannabinol ( 9 THC). I was dealing with the biosynthesis and degradation of the acid in the theoretical part of the thesis. Instability is the main problem during the quantitative analysis of 9 THC. I was interested in Czech and European legislative concerning Cannabis sativa. I summarized in which scope of low 9 THC analysis is important. I also summarized existing knowledge about 9 THCA-A. The acid is considered inactive so far. There hasn t been made any systematic research of its pharmacological and toxicological properties probably because of instability of the acid. An experiment is described and evaluated in practical part of the thesis. 5
Seznam zkratek THC THCA CBN CBD CBC CBG GC FID HPLC MLPC TLC NMR IR WHO OPL tetrahydrokanabinol tetrahydrokanabinolová kyselina kanabinol kanabidiol kanabichromen kanabigerol plynová chromatografie plamenoionizační detektor vysokoúčinná kapalinová chromatografie středně tlaká kapalinová chromatografie tenkovrstvá chromatografie nukleární magnetická rezonance spektrometrie v infračervené oblasti Světová zdravotnická organizace omamné a psychotropní látky 6
Obsah 1. ÚVOD... 8 2. SOUČASNÝ STAV PROBLEMATIKY... 11 2.1. CHARAKTERISTIKA KONOPÍ SETÉHO... 12 2.1.1. Chemické složení konopí, kanabinoidy... 12 2.1.2. Biosyntéza a degradace kanabinoidů... 15 2. 2. LEGISLATIVA SOUVISEJÍCÍ S KONOPÍM... 19 2. 2. 1. Úvod do legislativy konopí... 19 2. 2. 2. Rozdělení konopí do chemotypů... 28 2. 2. 3. Konopí jako droga... 28 2. 2. 4. Konopí jako lék... 29 2. 2. 5. Konopí technické... 31 2. 3. ANALÝZA KONOPÍ PRO FORENZNÍ ÚČELY... 33 2. 3. 1. Optické metody... 33 2. 3. 2. Tenkovrstvá chromatografie... 33 2. 3. 3. Plynová chromatografie... 34 2. 4. KVANTITATIVNÍ ANALÝZA KANABINOIDŮ Z CANNABIS SATIVA POMOCÍ 1 H-NMR... 35 2. 5. IZOLACE 9 THCA-A... 36 2. 5. 1. Krejčí, Šantavý 1955... 37 2. 5. 2. Mechoulam, Gaoni 1965... 37 2. 5. 3. Korte, Haag, Clausen 1965... 38 2. 5. 4. Yamauchi a kolektiv 1967... 38 2. 5. 5. Mechoulam, Zvi Ben-Zvi 1969... 39 2. 5. 6. Lehmann, Brenneisen - 1991... 39 2. 5. 7. Dussy a kolektiv 2004 7... 39 2. 5. 8. Hazekamp a kolektiv 2004... 40 2. 5. 10. Přehled izolačních metod 9 THCA-A... 42 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 43 3.1. PŘÍSTROJE, CHEMIKÁLIE A OSTATNÍ POMŮCKY... 44 3.1.1. Přístroje... 44 3.1.2. Chemikálie... 44 3.1.3. Ostatní pomůcky... 45 3. 2. PODMÍNKY HPLC ANALÝZY... 45 3. 3. EXTRAKT Z MARIHUANY... 45 3. 4. SLOUPCOVÁ CHROMATOGRAFIE... 46 3. 5. HLEDÁNÍ VHODNÉ MOBILNÍ FÁZE... 46 3. 6. NEPŘÍMÝ DŮKAZ KYSELIN... 47 4. VÝSLEDKY A DISKUSE... 48 4. 1. POZNATKY O BIOSYNTÉZE 9 THCA-A... 49 4. 2. PROBLÉMY SPOJENÉ SE STANOVENÍM OBSAHU 9 -THC... 49 4. 3. DOPAD PRÁVNÍCH NOREM NA POUŢITÍ KANABINOIDŮ PRO LÉČEBNÉ ÚČELY... 50 4. 4. POZNATKY O IZOLACI 9 THCA-A... 50 5. ZÁVĚR... 54 6. LITERATURA... 56 7
1. ÚVOD 8
Konopí a jeho obsahové látky jsou v současnosti velmi diskutovaným tématem v souvislosti s jejich bipolárním charakterem. Jde o nejčastěji uţívanou nelegální látku, velmi rozšířenou i mezi mladistvou populací, uţívající se hlavně v podobě jointů. Na druhé straně má i široký terapeutický potenciál. Předmětem klinických studií jsou stále nové indikace. Pouţití konopí v medicíně je zaměřeno na léčbu symptomů různých nemocí, např. nevolnost v průběhu chemoterapie, ztráta chuti k jídlu u pacientů s AIDS, Parkinsonova choroba, skleróza multiplex, glaukom, nebo chronické bolesti. Přípravky z konopí, zneuţívané i léčivé, jsou povaţovány za nebezpečné drogy kvůli riziku vzniku závislosti a podléhají tedy přísnému dozoru a evidenci. Hlavní psychoaktivní sloţkou konopí (Cannabis sativa L.) je 9 tetrahydrokanabinol ( 9 THC). Obsah 9 THC je kritériem při posuzování trestnosti činů spojených s manipulací s konopím. Má-li konopí nízký obsah 9 THC, jedná se o tzv. technické konopí, u kterého se neprojevují psychoaktivní vlastnosti. Technické konopí nachází uplatnění v různých průmyslových odvětvích. V konopném materiálu se 9 THC objevuje ve své neutrální a kyselé formě. Kyselina 9 tetrahydrokanabinolová ( 9 THCA-A), jeţ je přímým prekurzorem neutrálního 9 THC, je povaţována za neaktivní. Nemá tedy psychoaktivní vlastnosti. Ovšem vlivem běţných externích podmínek se 9 THCA-A velmi snadno přeměňuje na svoji neutrální formu 9 THC, který je nositelem psychoaktivních vlastností. Pro forenzní účely se nejčastěji ke stanovení obsahu 9 THC pouţívá plynová chromatografie (GC). Během analýzy na plynovém chromatografu dochází vlivem vysokých teplot k dekarboxylaci 9 THCA-A na 9 THC. Výsledkem je tedy součet 9 THC původně obsaţeného ve vzorku před analýzou a 9 THC vzniklého během analýzy. Tento součet je v některých evropských státech povaţován za celkové 9 THC a na základě jeho výsledku je soudní praxí rozhodováno. Přeměna 9 THCA-A během GC analýzy není ale plně kvantitativní a můţe během ní docházet k tvorbě rozkladných produktů. Řešením by mohlo být určení jednotlivých mnoţství 9 THC a 9 THCA-A zvlášť a celkového 9 THC docílit jejich součtem ( 9 THCA-A + 9 THC). Zákony České republiky berou v potaz pouze obsah samotného 9 THC. Analýza probíhající na GC uvádí výsledek zahrnující i 9 THC vzniklé přeměnou kyseliny. Dochází tak k navýšení obsahu 9 THC a tudíţ k falešně vyšším hodnotám. 9
Z těchto důvodů by bylo vhodné pouţít analytickou metodu vylučující vliv 9 THCA-A. Avšak skutečnost, ţe 9 THCA-A je labilní i vůči přirozeným vnějším podmínkám a snadno přechází na 9 THC, by měla být zohledněna i českým právem. Výzkum zaměřený na problematiku 9 THCA-A je ztíţen nepříznivou situací ohledně standardu. Ten byl aţ do nedávné doby komerčně nedostupný, nadále však zůstává obtíţně dosaţitelný finančně. Pokusy o snadnou izolaci jsou proto nadále nezbytné. Cíl práce: Cílem rešeršní části bylo: 1. Shrnutí poznatků o biosyntéze a přeměně THCA-A 2. Vypracovat přehled legislativy týkající se Cannabis sativa dopad právních norem na pouţití v průmyslu a lékařství, řešení přestupků a trestných činů v různých evropských zemích 3. Popis metodiky pouţívané ve forenzní analýze vzorků konopí v laboratořích Policie ČR, porovnání s jinými metodikami 4. Přehled metod izolace THCA-A Cíl experimentální části: 1. Izolace THCA-A 10
2. SOUČASNÝ STAV PROBLEMATIKY 11
2. 1. Charakteristika konopí setého 2.1.1. Chemické složení konopí, kanabinoidy Konopí obsahuje přes 420 látek, z nichţ nejzajímavější je skupina dosud 66 popsaných kanabinoidů. Ty se nevyskytují v ţádné jiné rostlině. 1 Samčí i samičí rostliny jsou pokryty trichomy obsahující buňky schopné sekrece. Většinou tvoří více neţ 80% sekrece rostliny. Obecně mohou všechny části rostliny, aţ na semena, obsahovat kanabinoidy. Stopy kanabinoidů nalezené v semenech jsou pravděpodobně pozůstatky kontaminace pryskyřicí. V zásadě není ţádný kvalitativní rozdíl v kanabinoidech obsaţených v různých částech rostliny, existují pouze rozdíly kvantitativní. Největší koncentraci kanabinoidů můţeme nalézt v listenech květů a plodů. Jejich obsah pak klesá v pořadí listy, stonky, kořeny, kde uţ je výskyt velmi nízký. Konopí pěstované venku má zpravidla niţší obsah kanabinoidů neţ rostliny pěstované v interiéru. Pokud se pěstují v umělých podmínkách, můţe být obsah kanabinoidů velmi vysoký. Pryskyřice květních částí pak mohou obsahovat aţ 25-30% kanabinoidů tvořených především THC (ve formě jeho kyselého prekurzoru THCA). Takto vysoká produkce jednotlivého sekundárního metabolitu je v rostlinné říši prakticky nereálná. 1 Hlavním nositelem psychotropního účinku konopí je 9 - tetrahydrocannabinol ( 9 -THC), systematicky 3- pentyl- 6,6,9- trimethyl- 6a,7,8,10a- tetrahydro- 6Hdibenzo [b,d] pyran-1-ol. 9 THC se vyskytuje u všech druhů konopí, a to od stopových mnoţství aţ téměř po 95% ze všech obsaţených kanabinoidů. 2 Neobsahuje ţádný dusíkový atom, a proto se nejedná o alkaloid. To je mezi psychotropními látkami výjimka. 1 K dalším kanabinoidům, které jiţ psychotropní účinky nemají, ale které lze v konopí běţně nalézt, patří kanabidiol (CBD), kanabichromen (CBC) a kanabigerol (CBG). Tyto kanabinoidy včetně 9 - THC mají pentylový postranní řetězec. Uvedené kanabinoidy se mohou vyskytovat i jako propylderiváty, pak nesou označení - kanabidivarin (CBDV), kanabichromevarin (CBCV), kanabigerovarin (CBGV) nebo 9 tetrahydrocannabivarin (THCV). Tyto propylderiváty jsou však méně časté. Strukturní vzorce kanabinoidů jsou znázorněny na obrázku č. 1. 12
V konopí jsou kanabinoidy syntetizovány a akumulovány jako jejich příslušné karboxykyseliny. Kdyţ je rostlina sušena, skladována nebo zahřívána, jsou tyto kyseliny postupně nebo zcela dekarboxylovány na neutrální formy. 2 Obr. č. 1: Strukturní vzorce kanabinoidů OH R O R = H: kanabinol (CBN) R = COOH: kanabinolová kyselina (CBNA) OH R O R = H: 9 - tetrahydrokanabinol ( 9 - THC) R = COOH: 9 - tetrahydrokanabinolová kyselina A ( 9 -THCA-A) OH R O R = H: 8 tetrahydrokanabinol ( 8 THC) R = COOH: kyselina 8 tetrahydrokanabinolová ( 8 THCA) 13
OH R HO R = H: kanabidiol (CBD) R = COOH: kanabidiolová kyselina (CBDA) OH R HO R = H: kanabigerol (CBG) R = COOH: kanabigerolová kyselina (CBGA) OH R O R = H: kanbichromen (CBC) R = COOH: kanabichromová kyselina (CBCA) V různé literatuře se můţeme setkat s různým číslováním strukturních vzorců kanabinoidů (viz obr. č. 2). Vedle prvně popsaného číslování pyranového existuje číslování podle dibenzopyranu, které bylo přijato i Chemical Abstracts, bifenylové a v Evropě hojně pouţívané číslování terpenové. V současné době je nejvíce pouţíváno číslování odvozené od dibenzopyranu 3 a objevuje se i v této práci. 14
Obr. č. 2: Moţnosti číslování kanabinoidů 4 3 5 6 1 2 3 4 5 2 1 6 O 6 1 2 3 5 4 R 8 7 9 10 10a 6a 6 O 5 1 4 2 3 R pyran dibenzopyran 7 3 1 4 5 6 1 2 6 1 2 5 3 4 R 6 5 9 10 4 8 O 2 3 6 1 2 3 5 4 R bifenyl terpen 2.1.2. Biosyntéza a degradace kanabinoidů Prvním meziproduktem spojeným s biosyntézou kanabinoidů v konopí je kyselina olivetolová. Reakcí olivetolové kyseliny s geranyl difosfátem vzniká kanabigerol, respektive kyselina kanabigerolová. Ty jsou výchozí látkou pro ostatní neutrální a kyselé kanabinoidy. To činí z olivetolové kyseliny důleţitý metabolit v biosyntéze kanabinoidů. Biosyntéza olivetolové kyseliny není zcela známa. Vzhledem k chemické struktuře by mohla být syntetizována cyklizací polyketosloučeniny. Tento polyketid je tvořen kondenzací molekuly n-hexanoyl-coa s třemi molekulami malonyl-coa. Kondenzační a cyklizační reakce jsou katalyzovány polyketidsyntázou (viz obr. č. 3). 15
Obr. č. 3: Syntéza olivetolové kyseliny O O - S-CoA n - hexanoyl-coa + HO O O malonyl-coa O - S-CoA O O O O O - S - CoA C 12 polyketid OH COOH OH HO HO olivetolová kyselina olivetol Tato hypotéza vychází z poznatků biosyntézy kyselin v chmelu. Chmel (Humulus lupulus) patří do stejné čeledi jako Cannabis sativa. 4 Kyselina olivetolová v dalším kroku kondenzuje s geranylpyrofosfátem za vzniku kanabigerolu. Kanabigerol je přímým prekurzorem pro CBD, CBC, a jak se v současné době předpokládá, i pro THC (viz obr. č. 4). Ve starších odkazech bylo THC povaţováno za další cyklizační produkt CBD. Nebyla však potvrzena existence enzymu CBD-cyklázy, která by katalyzovala syntézu THC přes CBD. Ostatní kroky jsou katalyzovány příslušnými syntázami. 2 16
Obr. č. 4: Biosyntéza kanabinoidů OH R + OPP HO R = H olivetol R = COOH o. kyselina geranyl pyrofosfát OH R OH R HO O R = H kanabigerol (CBG) R = COOH kanabigerolová kyselina (CBGA) R = H kanabichromen (CBC) R = COOH kanabichromová kyselina (CBCA) OH R OH R HO R = H kanabidiol (CBD) R = COOH kanabidiolová kyselina (CBDA) O R = H tetrahydrokanabinol (delta-9-thc) R = COOH tetrahydrokanabinolová kyselina (delta-9-thca-a) Touto cestou v rostlině vznikají kyselé kanabinoidy pomocí příslušných syntáz. Později jsou kyseliny, které jsou povaţovány za neaktivní, dekarboxylovány neenzymatickými reakcemi během skladování (vlivem tepla nebo světla) nebo kouření na odpovídající, aktivní, neutrální formy. 5 To znamená, ţe psychoaktivní 9 -THC vzniká dekarboxylací kyselého prekurzoru 9 -THCA-A (viz obr. č. 5). Proto uţití marihuany předchází některá z tepelných úprav (kouření, odpařování, vaření, pečení). 17
přeměna [%] Obr. č. 5: Dekarboxylace 9 -THCA-A na 9 -THC OH COOH OH -CO 2 O O 9 -THCA-A 9 -THC Zde nastává problém při určování obsahu 9 -THC pro forenzní účely. V českých poměrech se pro potřeby policie pouţívá převáţně plynově chromatografická metoda, která je zatíţena právě tepelným stresem. Výsledkem takové chromatografie je obsah 9 -THC, který sumárně odpovídá 9 -THC obsaţeném ve vzorku před analýzou a 9 - THC, které vzniklo během analýzy dekarboxylací kyseliny. Marihuana je ovšem podle legislativy ČR posuzována na základě obsahu 9 -THC. Bylo by proto vhodné vyuţít metody, která by vylučovala vliv 9 -THCA-A na stanovení obsahu 9 -THC. Jednou z moţností by mohla být derivatizace kyseliny např. silylací nebo acylací, čímţ by se zabránilo dekarboxylaci. 6 Tepelnému stresu během analýzy se lze také vyhnout pouţitím HPLC, pracující v takovém tepelném programu, který nemá na konverzi kyseliny vliv na rozdíl od GC, kde je 300 C běţnou provozní teplotou. Optimum přeměny 9 -THCA-A na 9 -THC je dosaţeno při teplotě kolem 150 C. Stupeň konverze se pohybuje kolem 70% (viz obr. č. 6). 7 Obr. č. 6: Průběh konverze kyseliny na neutrální 9 -THC 7 80 70 9 -THC 60 9 -THCA-A 50 40 30 20 10 0 100 120 140 160 180 200 teplota [ C] 18
2. 2. Legislativa související s konopím 2. 2. 1. Úvod do legislativy konopí Počátky sahají do roku 1954, kdy Světová zdravotnická organizace prohlásila, ţe konopí a přípravky z něj uţ delší dobu nesplňují svůj účel v medicíně, a proto je prohlásila za obsoletní. Od této chvíle bylo konopí začleněno do mnoha legislativních spisů, coţ vneslo zmatek při jejich výkonu. Pod tlakem záplavy zpráv hlásajících nebezpečnost konopí pro společnost bylo navrţeno zahrnout všechny texty pod jednotnou konvenci. Návrh byl nakonec přijat Organizací spojených národů v roce 1961. Podle Jednotné konvence o návykových látkách jsou konopí a produkty z něj definovány jako nebezpečné návykové látky s vysokým potenciálem zneuţití a bezcenné pro medicínské účely. To způsobilo, ţe bylo konopí povaţováno za nebezpečnou návykovou látku srovnatelnou s velice nebezpečnými opiáty, stejně jako se tradovalo, ţe můţe být přestupnou stanicí k takovým drogám. Od chvíle existence Jednotné konvence bylo v popředí zájmu potenciální nebezpečí zneuţívání konopí. Vyuţití jako vlákna, potraviny či léku bylo zavrhováno. Dnes můţeme pozorovat, jak se nové vědecké názory na konopí pomalu a neochotně začleňují do nové legislativy. Stále nové výsledky studií zkoumajících fyziologické efekty kanabinoidů slibují poskytnutí konopných produktů snad i širšímu okruhu pacientů. 1 Legislativa týkající se konopí a jeho derivátů jako léčiv můţe být rozdělena do dvou kategorií. Za prvé existuje systém, který kontroluje látky v trestní a zdravotní sféře jejich klasifikace, limity pro uţívání a distribuci atd. Za druhé existuje legislativa, která tyto kontroly doplňuje a upravuje infrastrukturu a distribuci těchto produktů zakládání firem, povolení pro pěstitele, kontroly lékařů a lékáren. Doporučeným minimem mezinárodní legislativy jsou Jednotná úmluva o omamných látkách z roku 1961 a Úmluva o psychotropních látkách z roku 1971. Podepisujícím stranám je dovoleno pouţívat více omezujících zákonů a postupů, které jsou podle jejich uváţení nezbytné nebo ţádoucí pro ochranu zdraví lidu. Konopí a pryskyřice z konopí jsou klasifikovány podle seznamu I (Příloha 1 Zákona č. 167/1998 Sb. - o návykových látkách) a seznamu IV (Příloha 3) Jednotné úmluvy o omamných látkách z roku 1961. Extrakty a tinktury z konopí jsou 19
klasifikovány podle seznamu I. THC je podle Úmluvy o psychotropních látkách z roku 1971 zařazen do seznamu I (Příloha 4) a 9 - THC a jeho stereoizomery, včetně dronabinolu, jsou zahrnuty v seznamu II (Příloha 5) této Úmluvy 13 (viz tabulky č. 1 a 2). V roce 2002 ECDD (Expert Committee on Drug Developement) usoudila, ţe by dronabinol měl být přemístěn do seznamu IV Úmluvy z roku 1971. Tento návrh však dosud nebyl schválen CND (Commission of Narcotic Drugs). 8 Tabulka č. 1: Zařazení omamných látek do seznamů Jednotné Úmluvy o omamných látkách z roku 1961 (příloh podle Zákona o návykových látkách) 13 Seznam (příloha) Popis látek Současně zahrnuté kanabinoidy I (1) Jsou to látky s rizikem nebo látky přeměňující se na látky s rizikem zneuţití Konopí a konopná pryskyřice Konopné extrakty a tinktury porovnatelné s konopím, konopnou pryskyřicí, kokainem II (2) Látky 1. způsobující či udrţující závislost ne víc neţ kodein, ale přinejmenším stejně jako dextropropoxyfen 2. měnící se na substance, způsobující či udrţující závislost a představují riziko zneuţití, které není vyšší neţ u kodeinu III (8) Přípravky, které jsou zamýšleny k legitimní léčbě a WHO je nepovaţuje za náchylné ke zneuţití a nemohou být škodlivé IV (3) Látky, které jsou částečně náchylné ke zneuţívání a mohou být škodlivé. Takové riziko se ovšem nevyrovná značným terapeutickým výhodám, které mohou poskytnout pouze látky ze seznamu IV. Konopí a konopná pryskyřice Vysoký stupeň kontroly je vyţadován u skupiny látek ze seznamu IV. Produkce, výroba, export, import, obchod, drţení a uţívání jakékoli z těchto drog mimo mnoţství, jeţ jsou nezbytná pro léčbu a vědecký výzkum, zahrnující klinické studie, je zakázána. 20
Tabulka č. 2: Zařazení psychotropních látek do seznamů Úmluvy o psychotropních látkách z roku 1971 (příloh podle Zákona o návykových látkách) 13 Seznam (příloha) Popis látky Současně zahrnuté kanabinoidy I (4) Látky, jejichţ náchylnost k zneuţití představuje mimořádně závaţné riziko pro THC, specifické izomery a jejich stereoizomery obecné zdraví a ty, které mají velmi omezený, jestli vůbec nějaký, terapeutický účinek II (5) Látky, jejichţ náchylnost k zneuţití představuje značné riziko pro obecné zdraví 9 -THC a jeho stereoizomery (dronabinol) a jeţ mají malé aţ střední terapeutické vyuţití III (6) Látky, jejichţ náchylnost k zneuţití představuje značné riziko pro obecné zdraví a jeţ mají střední aţ velké terapeutické vyuţití IV (7) Látky, jejichţ náchylnost k zneuţití představuje menší, ale stále podstatné riziko, pro obecné zdraví a jeţ mají malý aţ velký terapeutický účinek Předmětem nejpřísnějších kontrol je seznam I. Import, export, výroba, obchod, distribuce a drţení je moţné jen na zvláštní povolení. Taková manipulace je povolena pouze pro výjimečné lékařské účely, a to řádně kvalifikovanou osobou ve státním nebo pověřeném lékařském či vědeckém zařízení. Import, export, výroba, obchod, distribuce látek ze seznamu II, III, IV jsou moţné s povolením, či pod kontrolou. Nicméně lékaři, vyuţívající malé mnoţství látek k léčbě, nemusí mít k takovému uţití schválení vlády. 13 Sporným bodem politiky Evropské unie (EU) je právní postavení konopí pro osobní potřebu, v důsledku toho podléhají právní normy častým obměnám. Trestní zákon a přestupkový zákon byly v České republice novelizovány v roce 1998 (s účinností od roku 1999), a to po období, kdy drţení drog pro osobní spotřebu 21
nebylo pokládáno za trestný čin. Podle novelizovaných právních předpisů je drţení omamných a psychotropních látek (OPL) v mnoţství větším neţ malém hodnoceno jako trestný čin a můţe vést k trestu odnětí svobody aţ na dva roky. V případě drţení malého mnoţství bez úmyslu prodeje se ukládají správní tresty (pokuta nebo výstraha). Další novelizace proběhla v roce 2002, kdy došlo k rozšíření skutkové podstaty trestného činu šíření toxikomanie. Tresty za obchodování s drogami mohou představovat v závislosti na přitěţujících okolnostech i 10 aţ 15 let odnětí svobody. V případě závislých osob, které se dopustí trestného činu souvisejícího s drogami, má soud k dispozici řadu alternativ k trestu odnětí svobody (např. podmíněné odsouzení, obecně prospěšné práce a peněţitý trest). V roce 2004 schválila vláda ČR návrh nového trestního zákoníku, který v zásadě zachovává dosavadní drogové trestné činy, zároveň však přináší některé podstatné změny jako rozdělení sankcí za přechovávání drog (konopné látky rostlinného původu versus ostatní omamné a psychotropní látky). Tento návrh byl definitivně zamítnut Poslaneckou sněmovnou Parlamentu ČR v roce 2006. 9 Právní postavení konopí uţívaného, pěstovaného či drţeného pro vlastní potřebu v různých zemích EU udává tabulka č. 3. Mnoţství větší neţ malé Novela trestního zákona (Zákon č. 112/1998) znovu zavedla trestnost drţení omamných a psychotropních látek pro vlastní potřebu, a to v mnoţství větším neţ malém. Právě toto nejasně vymezené mnoţství OPL přineslo obtíţe při aplikaci práva. O jejich překonání se pokoušel nejprve pokyn policejního prezidenta, dále pokyn nejvyšší státní zástupkyně a judikáty Nejvyššího soudu. Pokyn policejního prezidenta č. 12/1999 stanovuje orientační hodnoty mnoţství většího neţ malého u základních druhů OPL, vyskytujících se na českém drogovém trhu. Větší neţ malé mnoţství marihuany odpovídá 20 cigaretám s 1,5% 9 - THC. Tento pokyn však není závazný pro státní zástupce ani soudce. S ohledem na tuto skutečnost byl v dubnu 2000 vydán pokyn nejvyšší státní zástupkyně č. 6/2000, definující mnoţství větší neţ malé pro potřeby státních zastupitelství. Mnoţství OPL stanovené tímto pokynem je v současné době vyuţíváno taktéţ Policií ČR, neboť se jeví jako přesnější. Jako mnoţství větší neţ malé udává pro hašiš a marihuanu obsah 0,3 g 9 - THC (asi 10 dávek po 30 mg). 22
Tento pokyn Nejvyššího státního zastupitelství však nezavazuje soudce, kteří jsou při svém rozhodování vázáni pouze zákonem. Nejvyšší soud ČR respektuje i individuální aspekty závislosti, proto vydal v roce 2000 judikát, kterým vymezil termín mnoţství větší neţ malé takto: Za mnoţství větší neţ malé ve smyslu 187a odst. 1 trestního zákona je třeba povaţovat takové mnoţství omamné nebo psychotropní látky nebo jedu, které podle ohroţení vyplývajícího pro ţivot a zdraví lidí ze škodlivosti jednotlivých dávek pětinásobně aţ desetinásobně převyšuje běţnou jednorázovou dávku průměrného konzumenta. 10 23
Tabulka č. 3: Právní postavení konopí uţívaného, pěstovaného či drţeného pro vlastní potřebu v různých zemích EU 11 Stát Česká republika Francie Itálie Přestupky a tresty spojené s osobním užíváním Stejně jako u ostatních drog pokud jde o malé mnoţství, jedná se o správní přestupek. Následuje pokuta, či varování od policie. Je-li mnoţství větší neţ malé, jde o kriminální čin, jeţ se trestá aţ dvouletým trestem Stejně jako u ostatních drog uţívání je trestáno pokutou, nebo aţ jedním rokem vězení. Drţení je trestáno aţ 10 lety vězení. Stejně jako u ostatních drog. S konopím spojené přestupky (jako drţení pro osobní potřebu) jsou od druhého přestupku dál trestány správními sankcemi Legislativa Základní právní normy, které upravují drogovou problematiku konopí* Code de la santé publique Art.L.3421-1; Penal Code Art. 222-37; Ministry of Justice Circular of 8 April 2005 DPR 309/90, Art. 75. Hranice stíhání Nejvyšší státní zastupitelství stanovuje mnoţství větší neţ malé přibliţně jako 10 dávek 30mg THC Za první uţití, příleţitostní uţití, kde okolnosti neopravňují k ţalobě, je uděleno varování. Příleţitostní/pravidelní uţivatelé obdrţí příkaz k léčbě ve zdravotním/sociálním zařízení Varování jen za první přestupek u tohoto typu drogy pro vlastní potřebu, za předpokladu, ţe hříšník nemá v úmyslu přestupek opakovat Odlišení od ostatních drog Bez rozdílu Bez rozdílu Dle zákona je varování dáno pro třídu drog, jeţ zahrnuje konopí Poznámky V návrhu nového Trestního zákona existuje odlišení konopí od ostatních látek v případě drţení, ale návrh byl zamítnut v březnu 2006 z neznámých důvodů Francouzský zákon oficiálně nerozlišuje motivy drţení, ale podle Circular 2005 je drţení pro vlastní potřebu trestáno jako spotřeba Varování je uděleno vţdy v případě, jestliţe jiné správní sankce nejsou vhodné Maďarsko Stejně jako u ostatních drog. Drţení malého mnoţství je Penal Code (Act IV of Nad 1g THC jako účinne látky Bez rozdílu 24
Německo Nizozemí přestupek, trestaný aţ 2 roky vězení; u závislých 1 rokem vězení, veřejně prospěšnými pracemi, či pokutou. Trest se promíjí, pokud obţalovaný podstoupí léčebný program Stejně jako u ostatních drog. Přestupky spojené s konopím jsou trestány aţ pěti lety vězení nebo pokutou. Trest můţe být prominut, jde-li o zanedbatelné mnoţství pro vlastní potřebu Drţení jakékoli kontrolované látky je trestný čin, drţení marihuany do 30g se trestá vězením aţ na jeden měsíc, nebo pokutou 2250 Euro, ale malé mnoţství pro vlastní potřebu je beztrestné 1978), s.282, s.282/c; Statutory rule 5/1979 s. 23 BtMG s.29, s.31a; Constitutional Court decision of March 1994 BtMG- Betäubungsmitt elgesetz Opium Act, Art. 3C; Opium Act Directive Trest za drţení konopí určí Ústavní soud. Jednotlivé spolkové země by v ojedinělých případech měly zastavit stíhání, a to jde-li o konopí určené pro vlastní potřebu. Kaţdá spolková země určuje, co povaţuje za zanedbatelné mnoţství Nařízení uvádí, ţe stíhání a vyšetřování drţení marihuany pro vlastní potřebu (do 5g) má nejniţší prioritu. Prodej do 5g jako transakce v koffee shopu není zpravidla vyšetřována (transakce zahrnuje všechen prodej a nákup zprostředkovaný jedním coffee shopem ve stejném dni stejným kupcem) AHOJ-G směrnice Rozhoduje Ústavní soud, v praxi také soudci. Výjimky BtMG jsou aplikovány především u konopí Podle zákona Drţení malého mnoţství jakékoli drogy je trestný čin, ale od ţaloby se upouští v případě, ţe - to neškodí ţádné třetí osobě - nejsou přítomni nezletilí - droga je pro vlastní potřebu - v drţení je pouze zanedbatelné mnoţství Prodej, produkce, drţení mnoţství do 30g je podle zákona trestáno vězením na jeden měsíc a /nebo pokutou 2250 Euro, za drţení více neţ 30g je trestáno aţ čtyřmi roky; za import, export; a dva roky za výrobu, zahrnující pěstování, transport, prodej, skladování 25
Polsko Jako u ostatních drog drţení je kriminální čin, trestán aţ třemi roky vězení, v případě malého mnoţství aţ jedním rokem vězení, podmínkou, nebo pokutou Portugalsko Jako u ostatních drog. Za přestupky spojené s konopím jako je uţívání, koupě, zabavení můţete obdrţet správní sankce Rakousko Jako u ostatních drog. Přestupky spojené s konopím jsou trestány vězením aţ na šest měsíců. Ţaloba můţe být staţena v případech zahrnujících Act on Counteracting Drug Addiction of 29 July 2005, Art.62.1 Law 30/2000, Art.2, n.º 1 SMG, s.35(4) specifikují termíny a podnímky pro prodej konopí v coffee shopu. Max. povolená zásoba konopí je 500g na coffee shop Přestupky spojené s konopím jsou vykládány jako méně závaţné Případy jsou hodnoceny a posuzovány u Komise pro odvykání drogové závislosti. V situacích zahrnujících problematické uţívání /zneuţití marihuany je doporučena léčba a za drţení do 10 denních dávek či do 25g konopí, nebo 5g hašiše můţe být udělena pokuta (Law 30/2000, Art. 2, nº2 and Governmental Decree 94/96) Malé mnoţství jsou 2g THC a míň, to je 10% skutečného limitního mnoţství 20g určeného Nařízením 378/1997. Ţalobci se drţí Doporučení z roku 1980, Bez rozdílu, pokud se zákonů týče. Soud můţe rozhodnout o niţší závaţnosti Dle zákona pokuty jsou různé podle třídy drogy (Law 30/2000, Art. 15, nº4 c) and Art.16) Dle zákona 26
malé mnoţství. Staţení obţaloby spojené s prvním uţitím marihuany je snadnější. Španělsko Jako u ostatních drog přestupky spojené s konopím jako je drţení a uţívání na veřejných místech je trestáno Velká Británie správními sankcemi Přestupky spojené s konopím, jako je drţení, jsou trestány vězením aţ na dva roky. Policie můţe místo ţaloby pachatele varovat a soud můţe udělit pokutu, podmínku, či veřejně prospěšné práce Law 1/1992, Art 25-28. Misuse of Drugs Act 1971 s.5; ACPO Cannabis Enforcement Guidance kdy malé mnoţství odpovídá 10% skutečného. Soudní praxe navrhuje jako trestné drţení zahrnující mnoţství překračující 40g hašiše Uplatňuje se presumpce neviny. Jakmile se ale prokáţe veřejné uţívání, opakování přestupku, jde-li o problém lokální politiky, nebo existuje-li riziko vůči nezletilým, má policie právo k zatčení Bez rozdílu Podle zákona (třídy látek), policejní směrnice (speciálně pro konopí) Tresty za nezákonné obchodování jsou závaţnější u velmi nebezpečných drog nezahrnují marihuanu V lednu 2004 byla marihuana přesunuta do třídy C. Právo policejního zadrţení je v určitých situacích zachováno, ne však obvykle za drţení drogy ze skupiny C. Trestem za drţení se záměrem distribuce zůstává sazba aţ 14 let vězení * Trestní zákon (140/1961 Sb.); Přestupkový zákon (200/1990 Sb.); Zákon o ochraně před alkoholismem a jinými toxikomaniemi (37/1987 Sb.); Příloha k Závaznému pokynu policejního prezidenta č. 39/1998; Závazný pokyn policejního prezidenta č. 12/1999; Příloha č. 1 k Závaznému pokynu policejního prezidenta č. 12/1999 - sazebník pokut za nález drogy s obsahem 9 -THC; zákon č. 466/2004Sb úplné znění zákona č. 167/1998 Sb., o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů 27
2. 2. 2. Rozdělení konopí do chemotypů S obsahem psychoaktivního THC přímo souvisí dělení konopí do jednotlivých chemotypů. Respektive se dělí podle vzájemného poměru THC a CBD. Jiţ v roce 1973 byly popsány tři základní chemotypy: chemotyp vlákno obsah THC < 0,3 % a CBD > 0,5 % chemotyp střední droga obsah THC > 0,3 % a CBD > 0,5 % chemotyp droga - obsah THC > 0,3 % a CBD < 0,5 % 2 2. 2. 3. Konopí jako droga Podle Jednotné konvence (1961) cannabis značí kvetoucí nebo plodící vrcholky konopí (kromě semen a listů, které nejsou doprovázeny vrcholky), ze kterých nebyla extrahována pryskyřice, ale v běţném ţargonu zahrnuje označení cannabis, marihuana nebo hašiš řadu různých přípravků z konopí, známých pod stovkami domácích jmen. Principiální psychoaktivní sloţkou konopí je (-)-trans- 9 -tetrahydrokanabinol ( 9 - THC), který je koncentrován v pryskyřici. Přípravky z listů cannabis, často smíchané s květy z vrcholků rostliny, jsou v různých částech světa nazývány marihuana, kif, dagga, maconha nebo bhang a jsou méně účinné neţ pryskyřičný materiál (hašiš, charas). Marihuana obsahuje 0,001% -5% 9 - THC (obyčejně 0,5% - 2,0% 9 THC). Sinsemilla (marihuana bez semen) obsahuje aţ 8% 9 - THC. Marihuanové cigarety mívají převáţně 10 mg 9 - THC (normální cigareta 5-10 mg 9 - THC). Průměrná dávka při kouření marihuany je 15-20 mg 9 - THC (podle typu osoby se účinek projeví při dávce 1,65 35 mg 9 - THC), při orálním poţití 30-40 mg (podle typu osoby 3,5 66,2 mg 9 - THC). Marihuana je v průměru asi třikrát silnější při kouření neţ při orálním poţití. Při kouření pozorujeme působení po 15 minutách a účinek trvá aţ tři hodiny, po orálním poţití nejdříve za 30 minut a mizí za pět aţ šest hodin. Vykouření 3,5 mg 9 - THC (8,4 mg orálně) vyvolává euforii, jakoţ i změny ve vnímání času a okolí. Vykouření 14 mg 9 - THC (21 mg orálně je doprovázeno znatelnou změnou zrakového a sluchového vnímání, derealizací, depersonalizací a halucinacemi. Při kouření marihuany za optimálních podmínek není 30% 9 - THC z cigaret procesem spalování rozloţeno. Z těchto 30% absorbuje tělo asi 80%. Z mnoţství absorbovaného tělem překročí asi 5% hematoencefalickou bariéru (tj. z 10mg 9 - THC 28
asi 0,12 mg). Účinky marihuany jsou velice pestré, závisí na dávce, individuální reakci, zkušenosti, vlivu okolí a řadě dalších okolností. Dlouhodobé uţívání marihuany (hašiše) můţe vést k závislosti a různým poruchám zdraví. Na marihuanu můţe vzniknout mírná psychická závislost. Protoţe efekt marihuany nebo hašiše závisí na obsahu aktivních látek, toleranci osoby, způsobu podání a dalších faktorech, není moţné přesně udat dávku zdraví škodlivou a ţivotu nebezpečnou. 12 2. 2. 4. Konopí jako lék Po zařazení konopí a THC mezi návykové látky bylo v popředí zájmu ochránit společnost od drogy jakoţto návykové látky, zájem o drogu ve smyslu léčiva byl tím pádem aţ na místě druhém. Teprve aţ odborné publikace některých autorit a klinické studie udávají takové závěry, ţe se začalo o konopí více jednat jako o moţném léčivu. 1 K léčebným účelům se vyuţívají jednotlivé komponenty konopí, a to od samotné sušené drogy po jednotlivé obsahové látky. Jsou to: 1. Canabis herba, resina jakákoli část rostliny Cannabis Sativa L. nebo pryskyřice extrahovaná z horních částí rostliny. 2. Canabis extrakt jakýkoli extrakt, obvykle olej a ostatní preparáty olej částečně obsahující, také znám pod názvem hašišový olej. 3. Kanabinoidy skupina chemických sloučenin, které mají typický kanabinoidní skelet. Zarhnují: - THC, skupinu izomerů obsahující izomer 9 - THC. Mezinárodní nechráněný název pro tento izomer, vyskytující se v kanabis v (-)- trans 9 -THC formě je dronabinol. Chemicky syntetizovaný dronabinol je dostupný pod komerčním názvem Marinol - nabilon (chráněný název Cesamet ) je syntetický kanabinoid, nevyskytující se v přírodě. Jde o ketoderivát THC, není ale jeho stereochemickým izomerem, a proto se na něj nevztahuje zákon o návykových látkách - konopné listy jsou ošetřeny jen lehce Konvencí z roku 1961, to proto, ţe mají porovnatelně niţší obsah THC, a proto mají rozdílné riziko zneuţití. Semena a rostlina nejsou zákonem ošetřeny vůbec. - ostatní v přírodě vyskytující se kanabinoidy, nekontrolované mezinárodními zákony kvůli absenci psychotropních účinků, jsou kanabidiol (CBD), kanabinol (CBN), kanabichromen (CBC) a kanabigerol (CBG). 13 29
Velikost účinků marihuany je vztaţena k obsahu 9 - THC, coţ je farmakologicky i toxikologicky nejvýznamnější sloţka konopí. Farmakologické působení 9 - THC je stereoselektivní. Přírodně se vyskytuje pouze (-)-izomer, který je biologicky 6-100 krát aktivnější neţ jeho zrcadlový (+)-izomer. 14, 8 Působení kanabinoidů na přenos signálu je především inhibiční, coţ ukazuje na jejich moţnou úlohu v léčbě nemocí, kde je vhodná inhibice uvolňování neurotronsmiterů. 14 Nejčastěji jsou vyuţívány jako antiemetika u pacientů podstupujících chemoterapii a jako simulanty chuti k jídlu u pacientů s AIDS. K dalším moţným indikacím patří glaukom, Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza, Tourettův syndrom, zvládnutí křečových a bolestivých stavů. Diskutabilní je antiastmatické, neuroprotektivní a antioxidační působení, efekt na migrénu a epilepsii. 15 Konopné přípravky mohou být podány ústy (orálně, sublinguálně, bukálně), rektálně pomocí čípků, pulmonálně (kouřením, inhalací pomocí vaporizéru, aerosolu či nebulizátoru), intravenózně, topicky (oční kapky), nebo transdermálně. 8 Na trhu existuje několik léčivých přípravků obsahujících léčivou látku kanabinoidního charakteru. Kromě výše zmíněného Marinolu a Cesametu se nově na trhu objevuje přípravek Sativex, orální konopný extrakt ve spreji, testovaný pro tlumení neuropatických bolestí při skleróze multiplex. Sativex obsahuje dronabinol a kanabidiol v poměru 52 : 48. S tímto přípravkem se nakládá podle Jednotné úmluvy o omamných látkách z roku 1961. 8 Dronabinol (Marinol ) se vyrábí v šesti zemích: USA, Izraeli, Německu, Nizozemí, Jihoafrické republice (pod názvem Elevat ) a ve Velké Británii. Do několika zemí se i dováţí. Největšími odběrateli jsou Kanada, Velká Británie, Dánsko, Belgie, Německo a Rakousko. 8 V ČR není registrovaný ţádný léčivý přípravek s obsahem kanabinoidní látky. Teoreticky je moţný dovoz ze země, kde jiţ takový přípravek registrovaný je. Postup dovozu neregistrovaných léků do ČR se řídí Zákonem č. 378/2007 Sb. V případě omamných a psychotropních látek je třeba povolení Inspektorátu Ministerstva zdravotnictví k importu a obdobné povolení musí mít dodavatel k exportu. Mnohé přípravky toto povolení v různých zemích nezískají. Předepisující lékař musí informovat o pouţití neregistrovaného léku Státní ústav pro kontrolu léčiv (SÚKL). Lékárna objedná přípravek u distributora a po jeho získání jej můţe na recept (s 30
modrým pruhem, jedná-li se o Marinol nebo Sativex ) vydat pacientovi. Úhrada přípravku je posuzována revizním lékařem zdravotní pojišťovny. 16 2. 2. 5. Konopí technické Od zemědělců se očekává, ţe budou pěstovat konopí k produkci přírodního vlákna, k produkci organické suché hmoty k technickému nebo energetickému vyuţití a produkci semene určeného jak k přímé spotřebě, tak k získání technického nebo potravinářského oleje. 17 Po vstupu do EU vyvstala státním orgánům povinnost ověřovat obsah THC v odrůdách konopí setého. Stát musí zajistit kontrolu 30% ploch, na nichţ se pěstuje konopí určené k produkci vlákna. 2 Ovšem zakazuje se pěstovat druhy a odrůdy rostliny konopí, které mohou obsahovat více neţ 0,3% látek ze skupiny tetrahydrokanabinoidů. Zároveň mají osoby pěstující konopí na celkové ploše větší neţ sto metrů čtverečních povinnost kaţdoročně předávat místně příslušnému územnímu odboru Ministerstva zemědělství do konce prosince údaje o rozloze pozemků, na nichţ bylo pěstováno konopí, a do konce května odhad rozlohy pozemků, na nichţ bude konopí pěstováno. 18 Metoda stanovení obsahu 9 - THC v konopí pro zemědělské účely se provádí podle nařízení (ES) č. 2316/1999 metodou GC pro kvantitativní stanovení 9 - THC. Je zde popsán odběr vzorků podle toho, zda se jedná o kontrolu produkce konopí určeného na vlákno, nebo zda jde o proces, kdy má být nová odrůda schválena a zapsána na seznam povolených odrůd (viz tabulka č. 4). Tabulka č. 4: Podmínky pro odběr vzorků konopí Postup A Postup B Oblast aplikace Kontrola produkce Zapsání na seznam povolených odrůd Odběry Velikost odebraného 50 rostlin 200 rostlin vzorku na každé kontrolované parcele Odebíraná část rostliny Horních 30 cm Horní třetina kaţdé 31
Doba odběru obsahujících nejméně jedno samičí květenství u kaţdé vybrané rostliny V období od 20. dne po začátku aţ do 10. dne po ukončení kvetení. vybrané rostliny Odebrané vzorky konopí musí být nejpozději do 48 hodin vysušeny při teplotě do 70 C. Poté jsou zbaveny stonků a semen a umlety na polojemný prášek. Takto připravený vzorek se extrahuje hexanem s přídavkem vnitřního standardu skvalenu v ultrazvukové lázni. Po odstředění je moţno supernatant nastřikovat do plynového chromatografu s detektorem FID. Pro analýzu je doporučena nepolární kapilární kolona s 5 % fenylu v methylpolysiloxanové fázi. Kvantitativní vyhodnocení se provede metodou vnitřního standardu. Protoţe bude nutno 30% výměry konopí určeného k produkci vlákna kontrolovat přesně stanoveným způsobem, který určí jednotlivé členské státy (u nás Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský), hledají se nové moţnosti, jak tuto kontrolu zjednodušit, neboť obsah 9 - THC v konopí velmi závisí jak na odebírané části rostliny, tak na době odběru. Běţně se připouští, ţe obsah 9 - THC v samičím květenství je dvakrát aţ čtyřikrát vyšší neţ v listech a dvakrát vyšší neţ v celé horní třetině rostliny. Jeho obsah se mění také v průběhu vegetačního cyklu rostliny. Na počátku cyklu, kdy má rostlina jen listy, se sice obsah 9 - THC postupně zvyšuje, nicméně zůstává nízký. Jakmile začne doba květu, měření prováděné na směsi listů a květenství prokáţe zvýšení obsahu 9 - THC. Od konce květu dochází k dalšímu zvýšení obsahu 9 - THC. Zvýšení obsahu je patrně způsobeno ztrátou části listů, čímţ se zvyšuje podíl květenství na rostlině. Na základě toho lze konstatovat, ţe relativní poměr listů a květenství u rostliny v průběhu vegetačního cyklu má velký vliv na obsah 9 - THC. Z toho vyplývá, ţe kdyţ podmínky odběru vzorků podle postupů A a B nejsou stejné, budou se lišit i výsledky měření obsahu 9 - THC podle pouţitého postupu. Proto je hledáno vhodnější kritérium pro posuzování psychotropního potenciálu konopí. Částečným řešením můţe být návrh nové metody na posuzování obsahu 9 - THC v konopí, který zavádí nový parametr - poměr obsahu 9 - THC /CBD. Tento poměr je pro všechny zelené části rostliny dané odrůdy v průběhu celého vegetačního 32
cyklu prakticky konstantní. Pro konopí chemotypu vlákno byla navrţena hodnota daného poměru menší neţ 0,15. Tím bude zaručeno, ţe obsah 9 - THC v rostlině nepřesáhne v EU povolenou hodnotu 0,2%. Zavedení uvedeného parametru by vedlo ke zjednodušení odběru vzorků a celkovému urychlení kontroly ploch osetých konopím. Aby mohla být nová odrůda zapsána na oficiální seznam autorizovaných odrůd, je zapotřebí stále respektovat postup B v jeho celistvosti. 2 Od roku 1999 jsou v ČR registrovány dvě odrůdy konopí setého - Benico, Juso 11. 2. 3. Analýza konopí pro forenzní účely Metodika vyuţívaná laboratořemi Policie ČR Zabavené vzorky jsou kriminalisty jednotlivých obcí odesílány k posouzení na specializovaná pracoviště v republice Odbor kriminalistické techniky a expertiz (OKTE). Správy OKTE pro jednotlivé kraje jsou v Praze, Plzni, Ústí nad Labem, Českých Budějovicích, Hradci Králové, Brně a Ostravě. Analýza konopí se provádí na oboru chemie, odvětví kriminalistické chemické expertizy. Zde je k zaslanému vzorku na základě poţadované expertizy vypracováno odborné vyjádření. K prozkoumání se vyuţívají optické metody, tenkovrstvá chromatografie (TLC) a plynová chromatografie (GC). Optické metody a TLC slouţí pro předběţnou identifikaci kanabinoidů. Jsou uţitečné při rychlém prověřování vzorků. Pro jednoznačnou následnou identifikaci a kvantifikaci se pouţívá GC. 2. 3. 1. Optické metody Optické metody sestávají z makroskopie a mikroskopie. Podle morfologických znaků je stanoven druh rostliny. 2. 3. 2. Tenkovrstvá chromatografie Příprava vzorku - mnoţství zkoumané látky k extrakci se řídí její formou a celkovým mnoţstvím analyzované látky. V optimálním případě se u marihuany pouţije 10 gramů vrcholových částí rostliny nebo listů, rozmělní se a prosítuje. Rostlinná drť se extrahuje 2 x 100 ml hexanu. Extrakty se spojí, přefiltrují a nechají odpařit při teplotě 50 C. Odparek se rozpustí v 1 ml etanolu. U hašiše se rozetře 1 g vzorku v třecí misce, 33
THC. 12 Plynové chromatografii předchází příprava extraktu. Jeden gram marihuany se extrahuje se 10 ml hexanu, přefiltruje se a extrakt se zahustí na vodní lázni při teplotě 50 C. Analýza probíhá na skleněných deskách, jako mobilní fáze se pouţívá toluen. Se vzorky jsou vţdy nanášeny příslušné standardy. Detekce: - činidlem je 0,5% vodný roztok Fast Blue B (viz obr. č 7). Po uschnutí se deska postříká 0,1M NaOH ( 9 THC po detekci poskytuje červené zbarvení) - pozorování v UV světle vlnové délky 254 nm a 366 nm 12 Obr. č. 7: Fast Blue B - 2 ZnCl 4 N MeO N + OMe N + N Fast Blue B 2 2. 3. 3. Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie je nejcitlivějším testem vyuţívajícím plamenově ionizační detektor (FID) při teplotním programu pohybujícím se od 55 C do 300 C. Touto analýzou je dokázána (ne)přítomnost a téţ obsah psychomimeticky aktivního 9 - extrahuje ve 100 ml n- hexanu (moţno pouţít i cyklohexan) po dobu tří hodin na magnetické míchačce. 100 m se odpipetuje do vialky a pomocí dusíku se odfoukne n- hexan do sucha. Přidá se 1 ml methanolu a protřepe se. Vzorek je tak připravený pro nástřik na kolonu plynového chromatogramu GC. Podmínky GC analýzy: - kolona HP-5, 530 μm ID - nástřik cool on column - detekce FID, teplota 300ºC - nosný plyn helium 19 Kvantifikace probíhá metodou vnitřního standardu. 34
Pokud nejsou vzorky derivatizovány, vysoká provozní teplota CG způsobí dekarboxylaci kyselých kanabinoidů na jejich odpovídající neutrální formy. Aby se předešlo dekarboxylaci, musí být kyseliny derivatizovány, např. silylací nebo vytvořením alkylkarbonátu. 100% derivatizace je ovšem obtíţné dosáhnout. Předpokládá se, ţe se termická degradace (oxidace, izomerizace) můţe projevit v injekčním vstupu a koloně. V případě analýzy 9 THC byly detekovány 8 THC a CBN, degradační produkty 9 THC, jeţ se při jiných analýzách (HPLC, NMR, TLC) neukázaly. 6 2. 4. Kvantitativní analýza kanabinoidů z Cannabis sativa pomocí 1 H-NMR 20 Pro kvantitativní analýzu je široce vyuţívána GC s FID detekcí (viz výše). Touto metodou ovšem není moţné rozlišit neutrální kanabinoidy a jejich kyselé analogy bez předchozí derivatizace. HPLC s UV detekcí je vhodnější, ale je obtíţné separovat jednotlivé komponenty v jednom chromatografickém cyklu. Obě metody jsou vysoce citlivé na nečistoty obsaţené ve vzorku (př. chlorofyly, lipidy), a proto je nutná předchozí purifikace. Zároveň standardy pro zhotovení kalibračních přímek jsou dostupné pouze k některým kanabinoidům. Metoda byla vynalezena pro kvantitativní analýzu čistých kanabinoidů a pro kanabinoidy obsaţené v konopném materiálu bez potřeby předchozí purifikace. Při experimentu byly analyzovány singlety v rozsahu 4,0-7,0 ppm vodíkového ( 1 H-NMR) spektra, ve kterém se nacházely různé signály jednotlivých kanabinoidů. Kvantifikace proběhla výpočtem poměru plochy píku kanabinoidů ku vnitřnímu standardu antracenu. Pro tuto metodu není třeba ţádného kanabinoidního standardu. Umoţňuje rychlou a jednoduchou kvantifikaci kanabinoidů, přičemţ doba trvání analýzy je pouhých 5 minut bez potřeby předchozí purifikace. Experiment 350 mg vzorku sušeného materiálu bylo po dvakráte extrahováno 10 minut v 15 ml směsi metanol/chloroform v poměru 9:1. Extrakci předcházela dvouminutová ultrasonifikace. Oba extrakty byly smíchány a naředěny extrakčním rozpouštědlem na 50 ml. 35
0,5 ml extraktu bylo smícháno s 1 mg antracenu, interním standardem. Vzorek byl odpařen pomocí vakua a znovu rozpuštěn v deuterovaném chloroformu (CDCl 3 ) pro 1 H-NMR analýzu. Protonové signály pro 1 H-NMR spektra jsou nejvíce rozeznatelné v rozsahu 4-7. Vnitřní standard antracen je velice stálá sloučenina s jednoduchým 1 H-NMR spektrem sestávajícím z jednoho singletu, který je pouţit pro kvantifikaci, a dvou kvartetů. Jeho signály se nepřekrývají se signály kanabinoidů. 2. 5. Izolace 9 THCA-A THCA-A versus THCA-B (viz obr. č. 8) Zatímco THCA-A je především produktem ţivé rostliny a prekurzorem THC, THCA-B je neaktivním metabolitem THC, který vzniká v těle po poţití marihuany a její detekce v moči se vyuţívá při drogových testech. Analýzou sušeného konopného materiálu byly zjištěny pouze stopy THCA-B. 21 Obr. č. 8: 9 - THCA-A a 9 - THCA-B OH COOH OH O O COOH 9 -THCA-A trans-(-)- 9 -tetrahydrokanabinolová kyselina A 9 -THCA-B trans-(-)- 9 -tetrahydrokanabinolová kyselina B Přehled izolace 9 THCA První pokusy o izolaci směřují k obecnému oddělení kyselých kanabinoidů. Po rozeznání významu THCA jsou snahy o její izolaci jako individua. Veškerý výzkum týkající se této kyseliny je do jisté míry znesnadněn nedostupností jejího standardu. Od roku 2004 je sice standard komerčně k dostání u firmy Lipomed, ale pro mnoho 36
laboratoří stále zůstává těţko dosaţitelný pro svou vysokou cenu. Najít způsob jak izolovat THCA-A bylo především proto i naším cílem. 2. 5. 1. Krejčí, Šantavý 1955 22 Tento tým při studiích antibakteriální účinnosti Cannabis Sativa izoloval kyselinu kanabidiolovou v krystalickém stavu, a to jako její diacetylderivát. Krejčí se Šantavým extrahovali sušenou drogu do etanolu. Extrakt zahustili ve zredukovaném vakuu z vodní lázně 35 C teplé. Získaný olejovitý odparek rozpustili ve směsi skládající se z destilované vody a petroléteru 1 : 2 a přenesli do dělící nálevky. Vodnou část promyli postupně éterem, chloroformem a směsí etanol-chloroform 1 : 2. Biologické testy ukázaly, ţe antibakteriálně účinné látky se nacházejí pouze ve frakci petroléterové, nepatrně ještě ve frakci éterické. Petroléterický extrakt dále promývali v dělících nálevkách postupně 2 % HCl, vodou, 2 % NaOH a znovu vodou. Zředěný roztok hydroxidu, do kterého přešly látky kyselé povahy, dále čistili protřepáváním v petroléteru. Po okyselení zředěnou kyselinou chlorovodíkovou vypadla bílá klkovitá hmota, dobře rozpustná v éteru. Výtěţkem byla nahnědlá sklovitá hmota, kterou se nepodařilo vykrystalovat z běţných rozpouštědel. Éterický extrakt pomocí anhydridu kyseliny octové a bezvodého octanu draselného acetylovali. Výsledkem byl acylderivát kyseliny kanabidiolové se zachovanými antibakteriálními vlastnostmi. 2. 5. 2. Mechoulam, Gaoni 1965 23 Mechoulam a Gaoni se pokusili o izolaci kyselých kanabinoidů. Výchozí surovinou byl rozmělněný hašiš, který spolu s petroléterem tři hodiny míchali v atmosféře dusíku. Směs poté zfiltrovali a zakoncentrovali. Tento koncentrát třikrát extrahovali do vodného roztoku 2 % NaOH a 2 % Na 2 SO 3. Sesbíraný extrakt okyselili vychlazenou 5 % H 2 SO 4, takto okyselený ho pak vytřepali do éteru. Éterový extrakt promyli NaCl, vysušili a odpařili za sníţeného tlaku. Roztok směsi kyselin a éteru esterifikovali diazometanem a po půl hodině odpařili rozpouštědlo. Kyseliny potom identifikovali pomocí TLC (mobilní fáze pentan/éter 98 : 2). Na chromatogramu byly detekovány skvrny odpovídající metylesterům kyselin kanabinolové, kanabidiolové, kanabigerolové. 37