Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů

Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů Absolventská práce Michal Kučera Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková Datum odevzdání práce: Datum obhajoby: Praha 2013

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval samostatně a všechny použité prameny jsem uvedl podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 2013 Podpis

Děkuji Mgr. Ivaně Malíkové za odborné vedení absolventské práce. Mé poděkování patří i všem zaměstnancům CHL a TC a mojí rodině, která mě po celou dobu studia podporovala.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

ABSTRAKT Kučera Michal Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 57 stran Stanovení hladiny nízkomolekulárního heparinu je důležité vyšetření při monitorování léčby nízkomolekulárním heparinem. Sledování léčby LMWH pomocí stanovení jednotek inhibice FXa je vhodné zejména u obézních, v graviditě, nebo u osob s renálním selháním. Cílem naší práce bylo zavedení nové metodiky pro stanovení aktivity anti Xa, výběr a příprava tří rozdílných kalibračních materiálů, porovnání měření při použití rozdílných kalibračních křivek, zhodnocení metody a jejího využití pro diagnostiku. Metodika: Aktivita anti Xa byla stanovena pomocí kitu COAMATIC Heparin, Chromogenix, Biophen Heparin 3 a Biophen Heparin (LRT), Hyphen BioMed, Francie, optický analyzátor BCS XP, Siemens, SRN. Byly použity firemní kalibrátory pro stanovení aktivity anti Xa Hyphen BioMed a připravené kalibrátory z nízkomolekulárních heparinů enoxaparinu (Clexane) a dalteparinu (Fragmin). Výsledky: Provedli jsme 130 stanovení aktivity anti Xa všemi metodami za použití všech kalibrátorů. Zároveň jsme vyhodnotili výsledky kontroly kvality a variační koeficienty referenční metody při mezilaboratorním porovnání. Z naměřených dat jsme zjistili, že optimální je využití kitu s reagenciemi připravenými za standardních podmínek firmou a při použití univerzálního firemního kalibrátoru. Při použití připravovaných kalibrátorů je nutné použít jako diluční médium poolovanou plasmu dárců, aby byla zajištěna dostatečná hladina antitrombinu v reakční směsi. Při stanovení jednotek inhibice anti Xa bylo dosaženo hodnot, které spolu dobře korelují. Závěr: Hladinu nízkomolekulárního heparinu lze spolehlivě stanovit pomocí všech porovnávaných kitů za předpokladu, že je použit vhodný kalibrátor, ev kalibrátor s vhodným dilučním médiem pro danou metodu. Klíčová slova: Nízkomolekulární hepariny, inhibice F Xa, aktivita anti Xa, analyzátor BCS XP, kalibrátory, faktor, inhibitor, aktivátor, kontrola kvality

ABSTRAKT Kučera Michal Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů Anti Xa activity determination using different calibrators Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 57 stran In meiner Abschlussarbeit Die Feststellung der Aktivität Anti Xa mit der Anwendung verschiedener Kalibratoren konzetriere ich mich auf mein Ziel, den Spiegel des niedermolekularen Heparins festzustellen. Für dieses Ziel war wichtig die Untersuchung beim Monitorring der Behandlung mit niedermolekularem Heparin. Die Verfolgung der Behandlung LMWH mit Hilfe von Inhibitionseinheiten F Xa eignen sich vor allem bei den Personen mit Übergewicht, Gravidität oder bei den Menschen mit Nierenversagen. Das Ziel meiner Abschlussarbeit war die Einführung der neuen Methodik für die Aktivität Anti Xa, die Auswahl und die Vorbereitung drei verschiedener kalibrierten Materialien, den Vergleich der Messungen mit verschiedener Kurven, die Auswertung dieser Methode und ihre Ausnutzung für die Diagnostik. Die Ergebnisse: Ich stelle 130 Mal Aktivität Anti Xa mit Hilfe allen Methoden mit Kalibratoren fest. Ich werte die Ergebnisse der Qualität und verschiedenen Koeffizienten aus. Ich vergleiche die Methoden unter Laboratorien. Aus den erworbenen Daten stelle ich fest, dass die Ausnutzung des Kits mit Reagenzien, die unter Standartbedingungen von einem universellen Firmenkalibratoren vorbereitet werden, optimal ist. Zum Schluss betone ich, dass der Spiegel des niedermolekularen Heparins zuverlässig mit Hilfe allen verglichenen Kits mit geeigneten Kalibratoren, eventuell mit Kalibratoren mit geeignetem Dilutionsmedium für diese Methode feststellen kann. Schlüssel Wörte: Niedermolekularen Heparins, Inhibition F Xa, Aktivität Anti Xa, Kalibratoren, Faktor, Ergebnisse der Qualität

Obsah Úvod... 9 1 Fyziologie hemostázy... 10 1.1 Hemostáza (srážení krve)... 10 1.1.1 Hemostáza od narození do dospělosti... 10 1.1.2 Složky podílející se na hemostáze... 11 1.1.3 Mechanismy hemostatických procesů... 11 1.2 Tvorba primární hemostatické zátky... 11 1.3 Plazmatický koagulační systém... 12 1.4 Koagulační faktory... 12 1.4.1 Popis a funkce plazmatických koagulačních faktorů... 12 1.5 Vlastní proces koagulace... 15 1.6 Fibrinolytický systém... 16 1.7 Inhibitory koagulace a fibrinolýzy... 17 1.7.1 Inhibitory plazmatického koagulačního systému... 17 1.7.2 Inhibitory fibrinolýzy... 19 1.8 Inhibitory s nespecifickými vazbami... 20 1.9 Antikoagulační léčba... 21 1.10 Nepřímé inhibitory trombinu... 21 1.11 Heparin... 21 1.12 Nízkomolekulární hepariny-přípravky... 23 1.13 Sledování aktivity LMWH... 26 2 Praktická část... 27 2.1 Odběr vzorku... 27 2.2 Metody pro sledování anti Xa aktivity... 27 2.3 Analyzátor BCS XP... 29 2.4 Nastavení nové metody... 29 2.5 Provedení kalibrace... 29 2.6 Kontrola kvality... 31 2.6.1 Interní kontrola kvality... 31 2.6.2 Mezilaboratorní porovnání... 32 2.6.3 Externí kontrola kvality... 33 2.6.4 Nejistota měření... 33 2.7 Kontrolní soubor... 33 3 Zpracování naměřených dat... 34

3.1 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Clexane (HypClex)... 34 3.2 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Fragmin (HypFrag)... 35 3.3 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Coamatic heparin (ChrLMWH)... 36 3.4 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Clexane... 37 3.5 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Fragmin... 38 Diskuze... 39 Závěr... 41 Seznam použité literatury... 42 Seznam zkratek... 43 Seznam obrázků... 45 Seznam tabulek... 46 Seznam grafů... 47 Přílohy... 48

Úvod Proces krevního srážení probíhá v organismu fyziologicky při porušení cévní stěny. Jde o systém koagulačních plazmatických, cévních i buněčných faktorů, které musí být v rovnováze, jinak by mohlo docházet ke stavům se sklonem ke krvácení nebo naopak k nadměrnému srážení krve. Oba tyto stavy jsou život ohrožující, proto je hlavním úkolem hematologické laboratoře tyto stavy odhalovat a následně kontrolovat jejich léčbu. Mezi rutinně prováděná vyšetření v rámci poruch hemostázy patří stanovení KO a zejména počtu krevních destiček, protože je důležitý pro vstupní data při vyšetření primární hemostázy. Z koagulačních vyšetření se nejčastěji provádí PT, APTT, TT, AT, D-Dimery. Ke speciálním vyšetřením patří např. stanovení PC, koagulačních faktorů a testy pro hodnocení účinnosti antikoagulační léčby. Léčba jak krvácivých, tak trombotických stavů musí být kontrolována, aby nedošlo k závažným komplikacím, které by nemocného mohli poškodit. Stanovení hladiny nízkomolekulárního heparinu je důležité vyšetření při monitorování léčby nízkomolekulárním heparinem. Sledování léčby LMWH pomocí stanovení jednotek inhibice FXa je vhodné zejména u obézních, v graviditě, nebo u osob s renálním selháním. 9

1 Fyziologie hemostázy 1.1 Hemostáza (srážení krve) Hemostáza je schopnost organismu zastavit krvácení. Jedná se o proces, na kterém se podílí řada mechanismů s odlišnými vstupy a účinky. Hemostáza je složitý mechanismus spojený s celou řadou pozitivních a negativních zpětných vazeb. (1) U zdravého člověka by se krev za normálních okolností srážet neměla. Proces hemostázy nastává nejčastěji při poranění nebo porušení cévní stěny, kdy krev vytéká na povrch kůže nebo sliznice. Organismus ihned začíná krvácení zastavovat a obnovuje průchod poraněnou cévou. (2) Srážení krve může nastat za určitých okolností i bez narušení celistvosti cévní stěny, to vede k různým komplikacím. Tato porucha krevního srážení může nastat v souvislosti s jinou chorobou, nepříznivým stavem nebo vrozenými defekty. Procesy krevního srážení se liší podle toho, zda hemostatické mechanismy probíhají v arteriální nebo venózní části cévního řečiště. V artériích se uplatňují při vzniku trombu především ateromatózní změny stěny cévní. Dochází k poruše funkce a poškození endotelu a následně dochází ke zvýšené vazokonstrikci cév, k tvorbě destičkové krevní sraženiny a k proniknutí zánětlivých buněk do cévní stěny. V žílách mají svou důležitou úlohu inhibitory plazmatických koagulačních faktorů, které brání nárůstu krevní sraženiny. (1) 1.1.1 Hemostáza od narození do dospělosti Vývoj hemostázy v organismu prochází různými stádii. Fetální a neonatální hemostáza Vyznačuje se nevyzrálostí s velmi malou rezervní kapacitou při odpovědi na různé podněty. Koagulační proteiny placentární bariérou neprochází. Tvorba koagulačních proteinů začíná v plodu okolo 10. týdne, koncentrace stoupá s pokračujícím těhotenstvím. U zralého novorozence jsou hodnoty faktorů K dependentních a faktorů kontaktu na 1/3 až 1/2 oproti hodnotám dospělých. Po 6 měsících od narození se začínají hodnoty ustalovat a jsou téměř totožné s hodnotami dospělých. Koncentrace fibrinogenu odpovídá hladině dospělých, má však sníženou schopnost polymerace. 10

Hemostáza dětského věku V dětském věku jsou hodnoty K dependentních faktorů a faktorů kontaktu přibližně o 20% nižší. Koncentrace faktorů V, VIII, XIII a vwf se téměř neliší od hodnot dospělých. Rozdíl mezi hemostázou v dětském věku a hemostázou dospělých je v rovnováze, která je velmi křehká a mírné rozkolísání může vést k závažným komplikacím. Rozkolísání rovnováhy vede spíše ke krvácivým komplikacím než k trombózám. Hemostáza pozdního věku Nad 50 let a více se viditelně zvyšuje koncentrace některých faktorů (fibrinogen, F VIII, F VIIa). Naopak u některých faktorů koncentrace klesá (protrombin, F X, antitrombin). K významnému zvýšení u starších lidí dochází u molekulárních markerů aktivace koagulace a fibrinolýzy (F IX, X, I, II, D dimery). (1) 1.1.2 Složky podílející se na hemostáze Cévní stěna Krevní destičky Plazmatické koagulační faktory (aktivátory, inhibitory, složky fibrinolýzy) Pro bezproblémové srážení krve je důležitá optimální funkce všech těchto složek. Na odbourávání přebytečné krevní sraženiny se podílí fibrinolytický systém. 1.1.3 Mechanismy hemostatických procesů K zástavě krvácení dochází vazokonstrikcí a dalšími na sebe navazujícími pochody. Začíná se tvořit primární hemostatická zátka, která se aktivací dalších procesů zpevní. 1.2 Tvorba primární hemostatické zátky Neaktivní krevní destičky mají v krevním řečišti oválný diskoidní tvar. Na normální nepoškozenou cévní stěnu trombocyty nereagují. (1) Tvorba primární hemostatické zátky začíná adhezí destiček, kdy destičky přilnou k poškozenému místu pomocí přichycení jejich receptorů glykoproteinové povahy ke kolagenovým vláknům. Trombocyty se zvětší a změní tvar, dochází k aktivaci destiček. Z plazmatických látek se podílí vwf., který tvoří můstek mezi destičkovou membránou a subendotelovými strukturami. Důležitou součástí adheze je též fibrinogen a Ca 2+. Dalším procesem tvorby zátky je agregace trombocytů, kdy se destičky začínají shlukovat. Zde se 11

uplatňují faktory trombin, tromboxan a faktor aktivující destičky (PAF). V této fázi je primární cévní zátka velice křehká a reverzibilní a to k zastavení krvácení nestačí. Kompletní hemostatická zátka (sekundární nebo fibrinová) vznikne až po zpevnění fibrinovými vlákny, tato reakce je nevratná. Vznik fibrinu je dán vzájemným působením plazmatických faktorů. Poslední fází aktivace je retrakce koagula, kdy dochází ke smrštění fibrinových vláken pomocí kontraktilního systému trombocytu. Proces tvorby cévní zátky je tím ukončen a průchodnost poškozené cévy je obnovena. (2) 1.3 Plazmatický koagulační systém Cílem tohoto systému je vznik nerozpustného fibrinu. Nejdříve dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin, dále na fibrinové monomery, které polymerují. Aktivací F XIII (F XIIIa) se polymery fibrinu propojují kovalentními vazbami a tím vznikne nerozpustný fibrin. Tvoří vláknitou síť, která zachycuje krevní buňky. (1) 1.4 Koagulační faktory Většina faktorů se tvoří v játrech a některé potřebují k syntéze vitamín K. Většina faktorů se v plazmě vyskytuje v nízkých koncentracích, s výjimkou F I a F II. Faktory jsou především glykoproteiny v podobě proenzymů a kofaktorů. Mezi serinové proteázy se řadí F II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein. Po rozštěpení se projevují enzymatickou aktivitou. Faktory V a VIII se po rozštěpení chovají jako kofaktory. Fibrinogen tvoří substrát pro trombin, který jej štěpí. (1) 1.4.1 Popis a funkce plazmatických koagulačních faktorů Fibrinogen (F I) Fibrinogen je glykoprotein, nachází se v plazmě a v granulích krevních destiček. Vzniká v játrech. Molekula fibrinogenu tvoří dimer, který je složen ze 3 párů polypeptidových řetězců α, β a γ. Vzájemně se vážou disulfidickými můstky. Fibrinogen je substrátem pro trombin, ale i pro plazmin. Podporuje agregaci krevních destiček pomocí interakce s destičkovými receptory. Fibrinogen se řadí mezi proteiny akutní fáze. Protrombin (F II) Protrombin se skládá z 532 aminokyselin a syntetizuje se v játrech za přítomnosti vitamínu K. V důsledku protrombinázy se přeměňuje na trombin (F IIa). Funkcí trombinu je 12

přeměna fibrinogenu na fibrin, aktivace F IX a F XIII, krevních destiček, napomáhá tvorbě a sekreci t-pa. Trombin má dále uplatnění v procesech zánětu a hojení. Tkáňový faktor (TF, F III) TF se označuje jako membránový protein, který je prezentován na povrchu řady buněk. Je obsažen v membránách endoplazmatického retikula. Extrahuje se z tkáně s největší aktivitou v mozku, v plicích, placentě, ale i v jiných orgánech. Za zdroj TF v cirkulující krvi jsou považovány monocyty. TF se nevyznačuje enzymatickou aktivitou a při kontaktu s krví slouží jako vysoce příbuzný receptor pro F VIIa a s pomocí vápenatých iontů tvoří komplex [TF. VIIa]. Tento komplex dále vyvolává přeměnu F X na F Xa. Klinický význam TF je významný u hyperkoagulačních stavů a u trombotických nemocí. Kalcium (F IV) Ionty vápníku jsou důležité pro většinu reakcí v hemostáze. Nejmenší koncentrace potřebná pro hemokoagulaci je 0,5 mmol/l. Faktor V (PROAKCELERIN) F V je glykoprotein, který se syntetizuje v játrech a megakaryocytech. Je obsažen v plazmě a v α-granulích krevních destiček. Složením je podobný F VIII. Faktor VI F VI je součástí membránových fosfolipidů krevní destičky. Dříve se označoval jako destičkový faktor 3. Faktor VII (PROKONVERTIN) Jedná se o glykoprotein složený z 406 aminokyselin. F VII se řadí mezi serinové proteázy. Proteolyticky se štěpí na F VIIa. K aktivaci dochází za přítomnosti určitých faktorů, např. trombinu, F IXa, Xa, XIa. F VIIa má velmi slabý účinek. Enzymatický potenciál F VIIa se projeví až v komplexu s TF. Faktor VIII (ANTIHEMOFILICKÝ FAKTOR A) F VIII je glykoprotein (β globin) složený z 2332 aminokyselin. V plazmě je vázán do komplexu s vwf. Aktivní F VIII funguje jako bílkovinný kofaktor ve vnitřní cestě 13

aktivace protrombinu, při tvorbě komplexu tenázy, potřebné k ativaci F X. Nefunkčnost nebo nedostatek F VIII může vést ke krvácivým defektům, které jsou příznačné pro hemofilii A. Faktor IX (CHRISTMAS FAKTOR) Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, tvoří se v játrech za pomoci vitamínu K. Aktivovaný F IX vytváří komplex vnitřní cesty aktivace přeměny protrombinu na trombin a ta aktivuje F X na F Xa. Nefunkčnost nebo nedostatek F IX může vést ke krvácivým defektům, které jsou příznačné pro hemofílii B. Faktor X (FAKTOR STUARTA-PROWEROVÉ) Je to dvouřetězcový glykoprotein, který se syntetizuje v játrech za účasti vitaminu K. Aktivace F X se uskutečňuje za pomoci komplexu tenázy nebo za účasti komplexu [VIIa. TF. PL. Ca 2+ ]. Aktivovaný F X je obsažen v enzymatickém koagulačně aktivním komplexu protrombinázy a ta má schopnost přeměnit protrombin na trombin. Faktor XI (ROSENTHALŮV FAKTOR) Je to glykoprotein, který je přítomen v krvi ve formě zymogenu serinové proteázy. Jeho aktivace probíhá při tzv. kontaktní fázi plazmatického koagulačního procesu. F XI má vysokou přilnavost k aniontovým povrchům (sklo, celit, kaolin) a je vyvazován na povrch krevní destičky. Faktor XII (HAGEMANŮV FAKTOR) Jde o glykoprotein tvořící se v játrech a řadící se mezi serinové proteázy. Vyskytuje se v plazmě i v séru. Aktivuje se při porušení cévní stěny, aktivačním povrchem může být např. sklo, kaolin, celit, dextran, kůže, kloubní chrupavka a jiné. Faktor XII zasahuje vedle koagulace především do systému imunologických. Faktor XIII (FAKTOR STABILIZUJÍCÍ FIBRIN) Je obsažen v plazmě, ale i v buňkách (trombocyty, megakaryocyty, monocyty), placentě nebo játrech. 50% celkové aktivity F XIIIa je obsaženo v krevních destičkách. Syntéza probíhá v podobě tetrameru nebo dimeru podle místa výskytu. Aktivace faktoru XIII je výsledkem hydrolýzy vyvolané trombinem. Důležitou funkcí F XIIIa je stabilizace fibrinové sraženiny. (1) 14

1.5 Vlastní proces koagulace Cílem koagulace je zástava krvácení, spočívá v generaci trombinu a vytvoření pevného fibrinového vlákna. Dosáhne se toho postupnou regulovanou kaskádovitou enzymatickou reakcí. Vnější cesta K aktivaci zevního systému je potřeba tkáňový faktor (TF), který se uvolňuje např. v případě poranění. K aktivaci koagulace dochází poté, co se F VII dostane do kontaktu s TF. Komplex TF/F VII přímo aktivuje F X na F Xa za přítomnosti vápenatých iontů. Komplex TF/ F VIIa dále aktivuje F IX a zasahuje tak i do vnitřní cesty. (3) Vnitřní cesta K aktivaci vnitřní cesty dochází kontaktem F XII a F XI s aktivním povrchem. Podle novějších poznatků mají větší význam faktory kontaktu v aktivaci systému kalikreinu, kininu a komplementu a koagulační komplexy se tvoří pouze na površích buněk. (3) Společná cesta F Xa společně s F V, Ca 2+ a fosfolipidy destiček vytváří protrombin nebo protrombinový komplex a ten vyvolá přeměnu protrombinu na trombin. Vzniklý trombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin a dochází též k aktivaci F V, F VIII, F XIII a trombocytů. Vznikají monomery fibrinu, které postupně polymerizují a spojením řetězců vzniká fibrinová síť. Působením F XIIIa se fibrin stabilizuje a vzniká nerozpustný fibrin. (2) 15

Obrázek 1: Schéma koagulační kaskády Zdroj : (M. Pecka, Fyziologie a patofyziologie hemostázy, 2004, strana 66) 1.6 Fibrinolytický systém Funkcí fibrinolytického systému je odstranění krevní sraženiny a obnovení průtoku krve. Fibrinolytický systém představuje složitou síť aktivátorů a inhibitorů propojenou množstvím vazeb, které zajišťují regulaci rovnováhy v systému. Zvýšení fibrinolytických vlastností může vést ke krvácení, naopak snížení může vyvolat trombotické stavy. Důležitou jednotkou fibrinolytického systému je plazmin, který vzniká aktivací plazminogenu a jeho funkcí je rozpuštění krevní sraženiny. Na aktivaci plazminogenu na plazmin se podílejí aktivovaná forma F XII, t-pa a u-pa. Fibrinolýzu kontrolují a regulují inhibitory a to jsou PAI a α 2 -antiplazmin. (2) Plazminogen Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, který se tvoří v játrech ve formách Glu- a Lyzplazminogen. Vyskytuje se i v eozinofilech a ledvinách. Lyz- plazminogen vytváří menší molekulu než Glu- plazminogen a má také kratší biologický čas. Plazminogen je prekurzorem plazminu, který jako serinová proteáza aktivuje lýzu fibrinové složky krevní sraženiny. 16

Plazmin Plazmin je serinová proteáza, která štěpí některé proteiny koagulačního systému (fibrinogen, fibrin ve všech podobách, F II, V, VIII a další). Schopností plazminu je aktivace F VII a XII, stimulace agregace krevních destiček a aktivace mediátorů v systému komplementu. Hlavní funkcí plazminu je rozpouštění fibrinového koagula. (1) Obrázek 2: Schéma fibrinolytického systému Zdroj : (wiki.lfp-studium.cz, staženo 28.3.2013) 1.7 Inhibitory koagulace a fibrinolýzy 1.7.1 Inhibitory plazmatického koagulačního systému Trombin je proteolytický enzym, který se po dobu srážení krve vytváří v nadbytku. To znamená, že po vytvoření krevního koagula musí být tvorba trombinu inhibována, aby srážení krve nepokračovalo. Inhibici nepodléhá jen trombin, ale i ostatní složky podílející se na krevním srážení. Inhibitory tohoto systému jsou v klidovém stavu obsaženy v plazmě v malém množství. V plazmatickém koagulačním systému jsou nejdůležitější 2 inhibitory a to Antitrombin (AT) a α 2 makroglobulin. V plazmě se vyskytují ve velmi vysokých koncentracích. AT s pomocí kofaktoru heparinu II odpovídá za 80% koagulační aktivity. Antitrombin (AT) Jedná se o jednořetězcový α- 2 -glykoprotein. Skládá se z 424 aminokyselin a syntetizuje se v játrech. Rovněž byl objeven v endotelových buňkách. AT je nejvýznamnějším inhibitorem 17

serinových proteáz. Hlavní funkcí je inhibice trombinu a plazmatických enzymů, kdy vznikne komplex, který je vylučován v MFS. Vznik komplexu může být urychlen za pomoci navázání heparinu nebo proteoglykanů z endotelových buněk. Reakce s trombinem v přítomnosti heparinu Hepariny se vyskytují na povrchu endotelových buněk a může nastat jejich uvolnění ze žírných buněk. Vazba heparinu s AT je vratná, heparin, který se uvolní z komplexu je schopný vytvořit komplex s další látkou. Hepariny jsou mukopolysacharidy a mají různě vzájemný vztah k AT. Heparin, který má sekvenci pentasacharidu je schopen vytvářet komplex s AT, jiné formy tuto schopnost nemají. Následuje konformační změna AT, která vede až k tisícinásobnému zvětšení jeho antiproteázového účinku. Heparinový kofaktor II (HC II) HC II je glykoprotein, který se řadí mezi inhibitory serinových proteáz. Je lokalizován na cévním endotelu, tvoří se v játrech. Skládá se z 480 aminokyselin. Na rozdíl od AT je aktivita HC II namířena výhradně proti trombinu. HC II se uplatňuje v inhibici trombinu až při poklesu hladiny AT pod 30%. Systém proteinu C Tento systém je tvořen proteinem C, proteinem S a trombomodulinem. Společně s AT a TFPI se řadí mezi nejúčinnější inhibiční systém hemostázy. Systém proteinu C má schopnost inaktivovat různé faktory (F VIIIa a Va), díky tomu reguluje tvorbu trombinu. Protein C (PC) Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, který se syntetizuje v játrech za pomoci vitamínu K. V menší míře vzniká i v endotelu. Skládá se z 461 aminokyselin. Po následném rozštěpení je molekula PC složena ze 2 polypeptidových řetězců, z těžkého a lehkého. Dohromady jsou propojeny disulfidickými můstky. Lehký řetězec je důležitý pro napojení se na fosfolipidový povrch a pro připojení proteinu S. Na těžkém řetězci je umístěno katalytické místo. Přibližně 10% PC zůstává v plazmě ve formě jednořetězcové. PC se aktivuje nejlépe na povrchu cévních endotelií, kde je navázán trombomodulin. Aktivovaná forma PC má důležitou funkci, s pomocí fosfolipidů a Ca 2+ štěpí a inaktivuje faktory neenzymového charakteru navázané na membráně (F Va a VIIIa). 18

Protein S (PS) PS je jednořetězcový glykoprotein, který se tvoří v játrech. Při jeho tvorbě je důležitý vitamín K. Tvoří se i v endoteliálních buňkách a megakaryocytech. PS se vyskytuje buď vázaný na specifický receptor nebo ve dvou dalších formách a to vázaný nebo volný. Jedná-li se o vázanou formu, nedochází k navázání na APC a inhibuje F Xa. U volné formy dochází k navázání na APC. Důležitou vlastností PS je jeho afinita k fosfolipidovým povrchům v přítomnosti Ca 2+. PS jako kofaktor APC usnadňuje vazbu APC k fosfolipidovým povrchům trombocytů a endotelií. Trombomodulin Trombomodulin je transmembránový glykoprotein, který se vyskytuje na cévním endotelu se schopností vázat trombin. Vyvázaný trombin přichází o svůj koagulační účinek a následně dochází k aktivaci PC. Slouží jako kofaktor pro aktivaci PC trombinem. 1.7.2 Inhibitory fibrinolýzy Uplatňují se při lokalizaci a inhibici fibrinolytických dějů. Alfa 2 -Antiplazmin Je obsažený v plazmě v nadbytku a váže volný nadbytečný plazmin. Jedná se o glykoprotein, který vzniká v játrech. Řadí se mezi proteinázy serinového typu. Je vysoce afinitní k vazebnému místu pro lysin na plazminu. Tlumí navázání plazminogenu na fibrin, může inaktivovat F XIIa, XIa, Xa, trombin, u-pa nebo t-pa. Inhibitory aktivátorů plazminogenu (PAI) Existují prozatím tři typy přirozených inhibitorů tkáňového aktivátoru plazminogenu. Jsou to PAI-1, PAI-2, PAI-3. PAI-1 Lidská forma patří mezi serinové proteázy. Vzniká v megakaryocytech, hepatocytech a endoteliálních buňkách. Strukturou se řadí mezi glykoproteiny. Funkcí PAI-1 je inhibice obou aktivátorů plazminogenu (t-pa, u-pa). Při vazbě na fibrin je proces inhibice urychlen. PAI-1 se řadí také mezi tzv. proteiny akutní fáze. 19

PAI-2 Funkcí PAI-2 je pouze inhibice u-pa. Jeho koncentrace je zvýšená v průběhu těhotenství. PAI 3 Je přítomen i v řadě tělních tekutin. Po vazbě na heparin inhibuje řadu proteáz (APC, F IIa, IIa v komplexu s TM, u-pa, t-pa). Trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy (TAFI) TAFI se řadí mezi tzv. metalokarboxypeptidázy. Jsou to enzymy, které mají za úkol hydrolýzu C- koncového řetězce peptidu. Obsahují atom zinku, který je důležitý pro jejich správnou funkci. TAFI se řadí mezi glykoproteiny, tvoří se v játrech a skládá se z 401 aminokyselin. TAFI se aktivuje trombinem, plazminem nebo trypsinem. TAFI hraje klíčovou úlohu v interakci mezi prokoagulačními, antikoagulačními a fibrinolytickými systémy. 1.8 Inhibitory s nespecifickými vazbami Do této skupiny se řadí: alfa 2 -makroglobulin, alfa 1 -antitrypsin a C1-inhibitor. Alfa 2 -makroglobulin Vzniká v játrech, kde ho vytváří hepatocyty. Je tvořen též makrofágy. Alfa 2 -makroglobulin je obsažen v plazmě, ale i mimo cévní systém. Uplatní se tehdy, jsou-li zásoby ostatních inhibitorů zcela vyčerpány. Alfa 1 -antitrypsin Jedná se o glykoprotein, který vzniká v játrech. Jeho funkce spočívá v inhibici F Xa a APC. Hlavní funkcí je tlumení proteáz slinivky břišní a leukocytů. C-1 inhibitor Syntéza probíhá v játrech. Je to glykoprotein přítomný v α granulích krevních destiček a uvolňuje se v průběhu aktivace trombocytů. Vyznačuje se inhibicí F XIIa, XIa, kalikreinu, plazminu a zasahuje též do systému komplementu. V přítomnosti heparinu je účinek silnější. (1) 20

1.9 Antikoagulační léčba Cílem antikoagulační léčby je zabránění vzniku sraženiny tím, že brání vzniku trombinu a následující přeměně fibrinogenu na fibrin. Při antikoagulační léčbě nedochází k aktivaci koagulačních faktorů, tím že zabraňuje vzniku plnohodnotných faktorů. Může dojít též k zesílení účinku AT k nepřímému vyvázání trombinu nebo F Xa. Hlavním záměrem antikoagulační léčby je co nejrychlejší dosažení stabilní účinné léčebné dávky, udržení této dávky v terapeutických mezích a vyloučení významnějšího předávkování antikoagulačním působkem. (1) 1.10 Nepřímé inhibitory trombinu Při antikoagulační léčbě napomáhají i tzv. nepřímé inhibitory trombinu. Tyto inhibitory potřebují látku, která jim umožní se připojit k molekule trombinu. Mezi složky, které toto připojení umožní, se řadí heparin. Heparin za pomoci pentasacharidové sekvence zesiluje účinek vazby na trombin. (4) 1.11 Heparin Heparin je antikoagulační látka živočišného původu. Objeven byl v roce 1916 McLeanem, který ho izoloval z jater. V organismu je obsažen ve většině tkání, nejvíce v játrech, plicích a kůži. Tvoří se v žírných buňkách a endoteliích. Koncentrace v plazmě se vymezuje pod 0,15 µg/ml plazmy. Heparin je vylučován játry. Patří do skupiny látek zvané glykozaminoglykany, do této skupiny se řadí i heparan sulfát aj. Heparin působí proti skrytému srážení krve a má vliv na metabolismus kostí, lipidový metabolismus, účastní se různých imunologických reakcí (protialergický, protizánětlivý účinek), disponuje ochranou funkcí při popáleninách či intoxikaci. Hlavním úkolem heparinu je jeho antikoagulační činnost, kdy jeho hlavní funkcí je inhibice trombinu a F Xa. Jeho působení proti F IIa a F Xa je závislé na ATIII. Heparin má také vliv na primární hemostázu, fibrinolytický systém a systém plazmatických inhibitorů. V lékařské praxi se využívají dvě formy heparinu. Jedná se o formu nefrakciovanou (UFH) a frakciovanou (LMWH). (5) 21

Obrázek 3: Injekční forma heparinu Zdroj: http://www.maafirm.com/library/dallas-fort-worth-personal-injury-attorney-heparin-harmful-drug.cfm, (staženo 21.3.2013) Nefrakciovaný heparin (UFH Unfrakcioned heparin) UFH je heterogenní směs polysacharidových řetězců o různé molekulové hmotnosti. Hodnoty se pohybují v rozmezí od 3000 do 40 000 daltonů. Přibližně jedna třetina řetězců UFH obsahuje pentasacharidovou sekvenci, která se váže na AT. Dlouhé molekuly řetězců UFH se vážou na různé bílkoviny v plazmě, také na trombocyty, endotelové buňky a makrofágy. To značně ovlivňuje specifitu protisrážlivého účinku. Při podávání UFH je potřeba hladinu častěji monitorovat a podle toho aktuálně měnit dávkování UFH. Nevýhodou UFH je neschopnost inaktivovat trombin vázaný na fibrin. (1) Nízké léčebné dávky UFH: monitorují se pomocí APTT a TT. U dávek se předpokládá, že čas koagulačního testu je přímo úměrný koncentraci heparinu v plazmě nemocného. Vysoké léčebné dávky UFH: využívají se při heparinizaci krve u mimotělních oběhů, které nelze měřit pomocí APTT. V těchto situacích sledujeme léčbu heparinem aktivovaným koagulačním testem (ACT). (4) Nízkomolekulární heparin (LMWH Low molecular weight heparin) Vzniká enzymatickým štěpením z UFH. Molekulová hmotnost je přibližně 4 500-6000 Daltonů. U LMWH je stejně jako u UFH protisrážlivý účinek způsoben potlačením tvorby trombinu. V přítomnosti AT dochází k zesílení účinku LMWH pro inhibici F Xa. Kratší heparinové řetězce, které obsahují méně než 18 monosacharidových jednotek, kterých je ve směsi 50-75%, nejsou schopné vázat AT i trombin současně a proto trombin neinhibují. To vede k tomu, že inaktivace trombinu je menší než inaktivace F Xa. (1) 22

LMWH nemá téměř žádný vliv na globální testy. Výhodou je menší vazba na plazmatické bílkoviny, bílkoviny uvolňované aktivovanými trombocyty a endotelovými buňkami a menší vazba na makrofágy. Léčba nízkomolekulárními hepariny se sleduje pomocí aktivity anti Xa. (6) Obrázek 4: Rozdíl mezi UFH (a) a LMWH (b) Zdroj: (www.sciencedirect.com, staženo 28.3.2013) 1.12 Nízkomolekulární hepariny-přípravky Vyrábí se celá řada nízkomolekulárních heparinů s různým počtem sacharidových jednotek. K nejznámějším patří Clexane, Fraxiparin, Fragmin nebo Zibor. Clexane Clexane se vyrábí ve formě injekčního roztoku. Obsahuje enoxaparin sodný, který patří do skupiny nízkomolekulárních heparinů. Hlavní funkcí Clexanu je zabránit tvorbě krevních sraženin v krvi a neumožnit zvětšování krevních sraženin, které již vznikly. Clexane se užívá 23

v následujících situacích (k zabránění tvorby krevní sraženiny) např. u nestabilní anginy pectoris, kdy srdce nedostává potřebné množství krve, dále u pacientů, kteří prodělali velkou operaci nebo jsou připoutáni na lůžko z důvodu nemoci, po prodělání srdečního záchvatu, k zabránění vzniku sraženiny v hadičkách dialyzační aparatury (u lidí s poruchou ledvin). Clexane je určen k léčbě mladistvých a dospělých pacientů. Clexane se neužívá u pacientů, kteří mají alergii na nějakou jeho složku nebo na heparin či jeho některé frakce, dále u pacientů, kterým se snadno tvoří modřiny, mají střevní nebo žaludeční vředy nebo po prodělání cévní mozkové příhody z důvodu krvácení do mozku. Clexane se nesmí užívat společně s UF heparinem. Při užívání léků jako warfarin, aspirin, clopidogrel, prednisolon aj. je nutné tuto skutečnost oznámit lékaři, před zahájením léčby Clexanem. Před zahájením léčby by se lékař měl také dozvědět, jestli je žena těhotná. Při kojení by se Clexane neměl užívat. Clexane obsahuje enoxaparinum natricum o koncentraci 10 000 anti Xa-IU v 1 ml injekčního roztoku. (7) Obrázek 5: Clexane Zdroj: (http://www.okazii.ro/sanatate-altele/clexane-0-4-ui-anti-xa-0-4ml-a60518986#, staženo 21.3.2013) Fraxiparine Vyrábí se ve formě injekčního roztoku. Obsahuje Nadroparinum calcicum. Koncentrace je 9500 IU anti Xa v 1 ml roztoku. Fraxiparine se řadí mezi nízkomolekulární hepariny s MW 4 300 daltonů. Fraxiparine se nasazuje při léčbě pacientů s tromboembolickými poruchami, dále jako prevence krevního srážení při hemodialýze, u léčby nestabilní anginy pectoris. Lék mohou užívat mladiství nad 14 let a dospělí lidé. Přípravek se nesmí užívat: u alergie na nadroparin, při trombocytopeniích po nadroparinu, u aktivního krvácení, střevní a žaludeční vředy, mozkové příhody s krvácením do mozku, endokarditidy, těžké poškození ledvin. Nedoporučuje se užívat společně s Fraxiparinem 24

kyselinu acetylsalicylovou. Způsob podání je podobný jako u Clexanu, u hemodialýzy je způsob aplikace odlišný. Lék se nesmí podávat intramuskulárně. (8) Obrázek 6: Fraxiparine Zdroj: (http://www.docsimon.cz/zbozi/fraxiparine-inj-10x-0-3ml, staženo 21.3.2013) Fragmin Fragmin je další z řady nízkomolekulárních heparinů. Přípravek obsahuje dalteparin sodný. Vyrábí se depolymerizací heparinu sodného kyselinou dusičnou ze sliznice prasečích střev. MW je přibližně 5000 daltonů. Dalteparin sodný účinně potencuje inhibici faktoru Xa. Má menší účinek na funkci trombocytů než heparin a má malý účinek na primární hemostázu. Fragmin se využívá na léčbu akutní trombózy hlubokých žil a plicní embolie. Slouží k prevenci při srážení krve v mimotělním systému při hemodialýze. Využívá se i k léčbě nestabilní anginy pectoris a non-q infarktu myokardu. Fragmin se nepodává pacientům s alergiemi na hepariny, s akutními žaludečními vředy, krvácením do mozku, endokarditidou a poruchou CNS. U dětí se léčba musí sledovat, monitoruje se hladina anti Xa a správný způsob dávkování. Fragmin nepodáváme intramuskulárně. Přípravek není prokazatelně škodlivý pro těhotné ženy a nemá tak negativní účinek na zdraví plodu ani novorozence. (9) 25

Obrázek 7: Fragmin Zdroj: (http://www.pfizerinjectables.ca/en/product/15/37/fragmin/2-500-iu-2-ml-syringe/0/1, staženo 21.3.2013) 1.13 Sledování aktivity LMWH Aktivitu všech výše uvedených nízkomolekulárních heparinů je možné sledovat pomocí dvou základních principů. Chromogenní princip Chromogenní princip využívají metody Coamatic Heparin, Biophen heparin (LRT) a Biophen heparin 3. Principem stanovení aktivity anti-xa je působení AT III-heparinového komplexu na nadbytek čištěného F Xa, který je do reakce přidáván ve standardním množství a následné měření zbytkového F Xa. U fotometrických metod se stanovuje amidolytická aktivita F Xa za pomoci specifického chromogenního substrátu. Výsledek stanovení se vyjadřuje v jednotkách IU/ml, který se získá odečtením hodnot z kalibrační křivky. (5) Koagulační princip Tento princip využívá koagulační metoda Pefakit PiCT. U koagulačních metod se po přidání plazmy a Ca 2+ za přítomnosti substrátové plazmy měří koagulační aktivita zbytkového F Xa. Pefakit PiCT, nebo-li protrombinázou indukovaný koagulační čas je funkční test pro kvantitativní stanovení antikoagulační aktivity LMWH a pentasacharidu v plazmě. Princip této metody spočívá ve smíchání reagentu, který obsahuje dané množství F Xa, fosfolipidů a enzym hadího jedu specificky aktivující F V (RVV-V) se vzorkem plazmy. V následné inkubaci (180 sekund) dochází k inhibici F Xa komplexem AT*heparin, který je přítomný ve vzorku. Následně nastává proces rekalcifikace, při kterém dochází ke vzniku protrombinázového komplexu a sleduje se doba do vytvoření koagula. 26

2 Praktická část 2.1 Odběr vzorku Odběr a příprava vzorků pro stanovení LMWH Provádíme do plastových nebo silikonovaných skleněných zkumavek s 1 dílem citrátu sodného a 9 díly čerstvě odebrané venózní krve. Zkumavku poté pečlivě a pomalu promícháme. Následně centrifugujeme 10 min při 3000 ot/min při 15-25 C. Pro stanovení LMWH je nutné léčeným pacientům odebírat vzorek po 3 až 4 hodinách po aplikaci LMWH s.c.. Plazma se musí zpracovat do 2 hodin od separace. 2.2 Metody pro sledování anti Xa aktivity COAMATIC Heparin Principem tohoto testu je stanovení aktivity anti-xa pomocí komplexu AT*heparin, který je tvořen v plazmě. První reakcí je tvorba komplexu AT*heparin, kdy je následně k tomuto komplexu přidáván F Xa v nadbytku. Tvoří se nový komplex F Xa*AT*heparin a zbytkový F Xa, který štěpí substrát za uvolnění pna. Uvolněný pna je nepřímo úměrný hladině heparinu ve vzorku, při 405 nm. Substrát se skládá z chromogenní směsi (Suc-Ile-Glu γpip Gly-Arg-pNA), detergentu a manitolu. F Xa je vyroben z hovězí směsi, Tris pufru, EDTA, NaCl a dextran sulfátu. Při této metodě se musí vzorky ředit 1:3 fyziologickým roztokem. Ředí se kontroly, standardy a plazma. Analyzátor ředění provádí automaticky. Naředěné vzorky se v analyzátoru inkubují 120 sekund při 37 C, posléze se přidá substrát a probíhá další inkubace 120 sekund při 37 C. Po změření získáme absorbanci a výsledek z kalibrační křivky. Kalibrační křivka je sestavena za pomoci standardu, plazmy s heparinem o známé koncentraci a normální plazmy. Optimální rozsah měření je v rozmezí od 0,00-1,00 IU/ml. Hodnoty neléčených pacientů se pohybují od 0-0,02 IU/ml. Hodnoty přesahující 1,0 IU/ml je doporučeno naředit 1:2 poolovanou plazmou a znovu proměřit. Podle kritických mezí stanovených v SOP je potřeba všechny hodnoty nad 1,0 IU/ml hlásit na oddělení. (10) BIOPHEN HEPARIN (LRT) Jedná se o chromogenní test, který slouží k monitorování antikoagulační léčby LMWH. Metoda se může provádět za pomoci analyzátoru, ale i manuálně. Reagencie obsažené v soupravě jsou v tekutém stavu. Principem metody je vytvoření komplexu AT*heparin, kdy tento komplex disponuje silnou inhibiční aktivitou pro F IXa, Xa a trombin. Biophen Heparin 27

(LRT) je kinetická metoda založená na tlumení specifického množství F Xa testovaným heparinem v přítomnosti endogenního AT a hydrolýzou F Xa specifického substrátu zbylým F Xa. Tím dojde k inaktivaci ze substrátu pna. Uvolněné pna je přímo úměrné zbytkovému F Xa. Mezi koncentrací heparinu a vzniklým zbarvením, stanovovaným při 405 nm je nepřímá úměra. V soupravě jsou obsažené 2 reagencie. První reagencií je chromogenní substrát (SXa-11), 4 lahvičky po 7,5 ml. Druhou reagencií je hovězí F Xa, 4 lahvičky po 7,5 ml. Reagencie se skladují při teplotě 2-8 C. Výsledné koncentrace LMWH se odvozují z kalibrační křivky. Pro LMWH je test lineární do 2 IU/ml anti Xa. Před zavedením metody je důležitá kalibrace a kontrola kvality. Každému prvnímu měření musí předcházet analýza kontrolních vzorků. K soupravě Biophen heparin (LRT) je i sada kalibrátorů. V této sadě je pět hladin LMWH. Hladiny koncentrací jsou: 0, 0,4, 0,8, 1,2 a 1,6 IU/ml LMWH. Výsledná kalibrační křivka se tudíž pohybuje v rozmezí od 0 do 1,6 IU/ml. Před použitím musíme každý kalibrátor naředit destilovanou vodou (1 ml) a pečlivě promíchat. Variabilitou šarží se přesné koncentrace kalibrátorů mohou nepatrně měnit. Poslední částí sady Biophen je set kontrol (Biophen control low kit a Biophen control kit). Kontroly obsahují lidskou plazmu o různých koncentrací LMWH a slouží ke kontrole kvality. Hladiny kontrol jsou 0,25, 0,50, 0,80 a 1,20 IU/ml. Stejně jako kalibrátory i kontroly ředíme 1 ml destilované vody a důkladně promícháme. (11) BIOPHEN HEPARIN 3 Biophen heparin 3 je chromogenní metoda, založená na stejném principu jako metoda Biophen heparin (LRT). Liší se v přípravě reagencií. Sada obsahuje 3 lahvičky specifického substrátu F Xa a 3 lahvičky hovězího F Xa. Obě reagencie jsou lyofilizované. Musíme je proto rekonstituovat 3 ml destilované vody a následně důkladně promíchat. Reagencie specifického substrátu F Xa obsahuje manitol. Kalibrátory nízkomolekulárních heparinů jsou důležité pro zavedení nové metody a kontroly pro ověření správnosti a přesnosti. Před každou analýzou se musí nejprve provést měření kontrolních vzorků. Analyzátor si pipetuje vzorky automaticky. Rozmezí hodnot u léčených pacientů se pohybuje od 0-1,5 IU/ml. Při používání stejných reagencií, ale odlišných šarží, může docházet k mírným odchylkám a výkyvům. Z tohoto důvodu je nutné pro každou novou šarži vytvořit novou kalibrační křivku. (12) 28

2.3 Analyzátor BCS XP Všechna měření, která jsem prováděl a použil jsem je v této práci, byla provedena na analyzátoru BCS XP firmy Siemens. BCS XP je vysokokapacitní, automatický analyzátor, pomocí kterého měříme kvantitativní testy specifických parametrů v plazmě. BCS XP pracuje na principu měření rozptylu světla (turbidimetrie). Slouží ke stanovení imunologických, aglutinačních a chromogenních testů. Analyzátor si měřené zkumavky nebo reagencie identifikuje podle příslušného čarového kódu, který je zkumavce nebo lahvičce s reagencií přidělen. Díky tomu je zajištěna ochrana proti záměně vzorků nebo reagencií. Analyzátor obsahuje dva pipetory, které zajišťují pipetování všech vzorků a reagencií, chladící boxy pro reagencie vyžadující chlazení a prostory pro rotorové kyvety, kde probíhá pipetování, inkubace a vlastní měření. Analyzátor automaticky vyhodnocuje měřené výsledky a odesílá je do laboratorního informačního systému (LIS). Funkcí je i správa referenčních křivek a šarží pro jednotlivé reagencie. 2.4 Nastavení nové metody Pro přípravu nové metody za použití připravovaného kalibrátoru jsme museli vytvořit nový pracovní protokol pro analyzátor BCS XP, kde jsme museli nastavit pro každý typ kalibrátoru všechny parametry pro reagencie, pipetování jednotlivých objemů vzorků a reagencií, optimální podmínky měření, vyhodnocení a odečtení výsledků z kalibrační křivky. Sestavené pracovní protokoly metod (MKBiophenClex a MKBiophenFrag) jsou uvedeny v příloze č. 1, 2. 2.5 Provedení kalibrace Kalibrace je nutná pro kvantitativní vyhodnocení měření, je důležité mít kalibrační křivku pro každý test, kde se vyhodnocuje aktivita nebo koncentrace. Kalibrační křivka se dá vytvořit za pomoci připravené kalibrační plazmy, standardní plazmy nebo pomocí kalibračního setu. Po nastavení vstupních parametrů jsme vložili do analyzátoru všechny potřebné reagencie a standardy. Kalibrace byla provedena automaticky a po vytvoření nové křivky jsme zkontrolovali měření pomocí kontrol. Provedení kalibrace pomocí firemních kalibrátorů Použili jsme sadu kalibrátorů soupravy Biophen heparin calibrator, které se dají použít pro metody Biophen heparin (LRT), Biophen heparin 3 nebo Coamatic heparin. Kalibrátory jsou 29

již připravené lyofilizované s danou koncentrací a před použitím je potřeba je naředit 1 ml destilované vody. Následně se musí důkladně promíchat a poté inkubovat 30 min. při pokojové teplotě za občasného promíchání. V soupravě jsou kalibrátory o pěti různých koncentracích. Sestrojená křivka je uvedena v příloze č. 3. Tabulka 1: Firemní kalibrátory Firemní kalibrátor Koncentrace LMWH (IU/ml) CAL 1 (0 IU/ml) 0 CAL 2 (0,4 IU/ml) 0,38 CAL 3 (0,8 IU/ml) 0,77 CAL 4 (1,2 IU/ml) 1,14 CAL 5 (1,6 IU/ml) 1,50 Provedení kalibrace (Clexane) Clexane o koncentraci 10 000 IU/ml jsme naředili na 10 IU/ml. Smíchali jsme 10 µl koncentrovaného Clexanu s 10 ml destilované vody. Z naředěného Clexanu jsme si připravili kalibrační řadu o různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky. Předpokládali jsme lineární závislost křivky. Společně s přípravou kalibrátorů jsme si připravili i kontroly (50 µl + 950 µl plazmy dárců). Popis přípravy kalibrátorů z Clexanu je zaznamenán do tabulky. Kalibrační křivka je uvedena v příloze č. 4. Tabulka 2: Kalibrace Clexanu Normální plazma Clexane 10 IU/ml Koncentrace heparinu U/ml 500 µl (neředěné) 0 µl 0 980 µl (50x ředěné) 20 µl 0,2 960 µl (25x ředěné) 40 µl 0,4 940 µl (16,5x ředěné) 60 µl 0,6 920 µl (12,5x ředěné) 80 µl 0,8 900 µl (10x ředěné) 100 µl 1,0 880 µl (8x ředěné) 120 µl 1,2 840 µl (6,3x ředěné) 160 µl 1,6 30

Provedení kalibrace (Fragmin) Fragmin jsme připravili naředěním 25 000 IU/ml na 25 IU/ml. K 10 µl koncentrovaného Fragminu jsme přidali 10 ml destilované vody. Z tohoto připraveného roztoku jsme vytvořili kalibrační řadu. Po analýze jsme získáli kalibrační křivku Fragminu. Kalibrační křivka je uvedena v příloze č. 5. Tabulka 3: Kalibrace Fragminu Normální plazma Fragmin 25 IU/ml Koncentrace heparinu U/ml 500 µl (neředěné) 0 µl 0 980 µl (50x ředěné) 20 µl 0,5 960 µl (25x ředěné) 40 µl 1,0 940 µl (16,5x ředěné) 60 µl 1,5 920 µl (12,5x ředěné) 80 µl 2,0 900 µl (10x ředěné) 100 µl 2,5 880 µl (8x ředěné) 120 µl 3,0 840 µl (6,3x ředěné) 160 µl 4,0 2.6 Kontrola kvality Je založena na analytických metodách s přesně dokumentovanou správností, nízkou citlivostí na rušivé vlivy a přesností. Dodatečná kontrolní měření je možné vkládat mezi jednotlivými měřeními. Tato měření mohou být prováděna kdykoliv. 2.6.1 Interní kontrola kvality Firemní kontroly Použili jsme sadu kontrolních plazem o přesných koncentracích pro metody Biophen heparin (LRT) a Biophen heparin 3. Sady Biophen LMWH control low a Biophen LMWH control plazma zahrnují 4 různé koncentrace (0,25, 0,50, 0,80 a 1,20 IU/ml). Firemní kontroly jsou přímo navrženy pro kontrolu kalibračních křivek, které byly vytvořeny pro stanovení nízkomolekulárních heparinů v lidské plazmě. Nejsou-li výsledky kontrol v optimálním rozmezí, výsledky měřené série mohou být chybné a stanovení se musí opakovat. 31

Tabulka 4: Přehled firemních kontrol v soupravě Biophen LMWH kontroly LMWH koncentrace Přijatelné rozmezí (IU/ml) (IU/ml)-příklad C1 0,25 0,17-0,33 C2 0,50 0,40-0,60 C3 0,79 0,69-0,89 C4 1,25 1,10-1,40 Připravované kontroly Pro vlastní vytvořené metody s připravenými kalibrátory (Clexane, Fragmin) jsem si musel připravit kontroly, které sloužily pro kontrolu získané kalibrační křivky. Pro Clexane jsem zhotovil dvě kontroly (0,2 a 0,6 U/ml) pro fragmin (0,5 a 1,0 U/ml). 2.6.2 Mezilaboratorní porovnání Pokud laboratoř provádí stejné měření na více analyzátorech, je vhodné tyto přístroje porovnat mezi sebou v určitých časových intervalech. Jeden z analyzátorů je určen jako referenční a k němu jsou následně vztahovány výsledky ostatních měření. Toto mezilaboratorní porovnání jsme provedli na třech přístrojích BCS XP umístěných na různých úsekách koagulační laboratoře. Vybrali jsme 5 pacientských vzorků o různých koncentracích LMWH změřených na referenčním analyzátoru a následně jsme vzorky proměřili na ostatních analyzátorech a porovnali. Výsledkem jsou variační koeficienty, které jsem zpracoval do tabulky. Celkové výsledky jsou uvedeny v příloze č. 6. Tabulka 5: Rozmezí variačních koeficientů Rozmezí hodnot Rozmezí variačních koeficientů 0-0,29 13,34-23,52 0,30-0,45 2,64-15,93 0,46-0,60 4,41-11,69 0,61-1,0 8,49-8,49 32

2.6.3 Externí kontrola kvality INSTAND Externí kontrola kvality je organizována institucí INSTAND Společnost pro podporu kvality v lékařské laboratoři. Kontrolu kvality stanovení aktivity anti Xa laboratoř zajišťuje dvěma cykly kontrol za rok (Haemostasis 281 LMWH). V každém cyklu jsou vyšetřeny dva dodané vzorky plazmy a na základě dodání správných výsledků je vystaven certifikát s platností 12 měsíců. Vzorky je možno analyzovat více metodikami. (13) Referenční metoda (HypLMWH), ke které jsem vztahoval výsledky svých měření, byla ověřena touto externí kontrolou kvality s 98% úspěšností za poslední dva roky. 2.6.4 Nejistota měření Nejistota je definovaná jako údaj, který charakterizuje rozsah, v němž se výsledek měření odůvodněně nachází. Pro kontrolní materiály používané na koagulačních analyzátorech nejsou definovány nejistoty cílové hodnoty. Nejistotu měření tedy vyjadřujeme (13, 14) jako koeficient variace mezilehlé preciznosti zjištěný laboratoří. 2.7 Kontrolní soubor Soubor byl tvořen 30 jedinci (15 mužů a 15 žen), kterým byl s.c. aplikován nízkomolekulární heparin, v 80% to byl přípravek Clexane. Normální hodnoty anti Xa nejsou definovány rozdílně pro muže a ženy, proto jsou všechny výsledky uváděny společně. 33

aktivita anti Xa IU/ml 3 Zpracování naměřených dat Naměřená data byla zpracována v aplikaci Microsoft Office Excel 2010. 3.1 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Clexane (HypClex) Tabulka 6: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Clexane Referenční metoda (IU/ml) Kalibrace Clexane (IU/ml) PRŮMĚR 0,33 0,34 MEDIÁN 0,28 0,26 MIN 0,00 0,00 MAX 1,10 1,18 KORELACE 0,994 Graf 1: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Clexane 1,4 Hyphen vs. Clexane 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Hyp.LMWH Clexane Lineární (Clexane) 0,2 0-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 číslo vzorku 34

aktivita anti Xa IU/ml 3.2 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Fragmin (HypFrag) Tabulka 7: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Fragmin Referenční metoda (IU/ml) Kalibrace Fragmin (IU/ml) PRŮMĚR 0,33 0,42 MEDIÁN 0,28 0,33 MIN 0,00 0,00 MAX 1,10 1,43 KORELACE 0,993 Graf 2: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Fragmin 1,6 Hyphen vs. Fragmin 1,4 1,2 1 0,8 0,6 Hyp.LMWH Fragmin Lineární (Hyp.LMWH) 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 číslo vzorku 35

aktivita anti Xa IU/ml 3.3 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody Coamatic heparin (ChrLMWH) Tabulka 8: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic heparin Referenční metoda (IU/ml) Coamatic heparin (IU/ml) PRŮMĚR 0,33 0,40 MEDIÁN 0,28 0,37 MIN 0,00 0,00 MAX 1,10 1,22 KORELACE 0,980 Graf 3: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic heparin 1,4 Hyphen vs. Coamatic heparin 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Hyp.LMWH Coamatic Lineární (Hyp.LMWH) 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 číslo vzorku 36