PAXgene Blood RNA Kit Manuál Verze 2 Systém PAXgene Blood RNA se skládá ze zkumavek pro odběr krve (PAXgene Blood RNA Tubes) a diagnostické soupravy k izolaci nukleových kyselin (PAXgene Blood RNA Kit). Systém slouží k odběru, skladování a přepravě krevních vzorků, k stabilizaci intracelulární RNA v uzavřených zkumavkách, stejně jako k následující izolaci a purifikaci intracelulární RNA z plné krve. RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA může být použita při molekulárně diagnostických testech zakládajících se na RT PCR. Charakteristika výkonu systému PAXgene Blood RNA uvedená v tomto manuálu platí pro transkripty genů FOS a IL1B. Uživatel je zodpovědný za stanovení odpovídající charakteristiky výkonu systému PAXgene Blood RNA pro jiné cílové transkripty. Pro diagnostické použití in vitro 762174 1051083CS PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Vyrobeno QIAGEN GmbH pro PreAnalytiX R1 1051083CS Duben 2008
Ochranné známky: PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Soupravy PAXgene Blood RNA Kit nejsou dostupné ve všech zemích; prosím informujte se. Licenční ujednání Použitím produktu vyjadřuje kupec nebo uživatel soupravy PAXgene Blood RNA Kit souhlas s následujícími podmínkami: 1. PAXgene Blood RNA Kit smí být používán výhradně v souladu s Manuálem PAXgene Blood RNA Kit a pouze s komponenty obsaženými v soupravě. PreAnalytiX neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití nebo k začlenění přiložených komponent kitu s komponenty, které nejsou zahrnuty v této soupravě, s vyjímkou případů uvedených v Manuálu PAXgene Blood RNA Kit a dodatečných protokolech dostupných na www.preanalytix.com. 2. Mimo výslovně uvedenou licenci PreAnalytiX neposkytuje žádnou záruku, že tato souprava a/nebo její použití neporušuje práva třetích stran. 3. Tento kit a jeho komponenty jsou licencovány pro jedno použití a nesmí být znovu použity, obnoveny či znovu prodány. 4. PreAnalytiX zvláště vylučuje odpovědnost za jakékoliv jiné licence, vyjádřené či implikované, než výslovně uvedené. 5. Kupec a uživatel kitu souhlasí s tím, že nepodnikne nebo nikomu neumožní podniknout kroky, které by mohly vést nebo usnadnit zakázané skutky uvedené výše. PreAnalytiX může zákazy tohoto Licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, inkl. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tento kit a/nebo jeho komponenty. Pro aktualizovaná licenční ustanovení viz. www.preanalytix.com. 2005 2008 PreAnalytiX GmbH, všechna práva vyhrazena. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Švýcarsko Distributoři PreAnalytiX Produkty PreAnalytiX jsou pro PreAnalytiX vyráběny společností QIAGEN nebo BD a jsou dodávané pro PreAnalytiX společností QIAGEN nebo BD. Produkty nelze objednat u PreAnalytiX GmbH. Adresu Vašeho regionálního distributora PreAnalytiX naleznete na poslední straně.
Obsah Vysvětlení symbolů 4 Obsah soupravy 5 Podmínky skladování 6 Zamýšlený účel použití 6 Omezení použití 7 Kontrola kvality 7 Technická podpora 7 Bezpečnostní informace 7 Úvod 10 Princip a jeho použití 10 Odběr vzorku a stabilizace 10 Manuální purifikace RNA 19 Automatizovaná purifikace RNA 27 Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou 31 Důležité pokyny 32 Používání QIAcube 32 Start QIAcube 32 Instalace protokolu na QIAcube 32 Naplnění QIAcube 34 Protokol: Manuální purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 41 Protokol: Automatizovaná purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 47 Pomoc při řešení problémů 52 Příloha A: Obecné pokyny k zacházení s RNA 54 Příloha B: Určení koncentrace, výtěžku a čistoty celkové RNA 55 Příloha C: Manipulace s PAXgene Blood RNA Tubes 57 Informace o objednání 58 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 3
Vysvětlení symbolů i <N> Obsah postačující k provedení <N> zkoušek Sledujte návod k použití Použitelné do Pro jednorázové použití Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiál Komponenty Počet Sterilizováno ozářením Kunitz jednotky Teplotní rozmezí Horní mez teploty Výrobce Důležité upozornění? EtOH Zapište aktuální datum po přidání ethanolu do láhve Po dodání Přidat Obsahuje Rekonstituováno Deoxyribonukleáza I Ethanol Guanidin isothiokyanát RNase-Free DNase Set Vede k 4 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Obsah soupravy PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalog čís. 762174 Počet příprav 50 BR 1 Pufr k resuspenzi 20 ml BR 2 Vazebný pufr * 18 ml BR 3 Promývací pufr 1* 45 ml BR 4 Promývací pufr 2 (koncentrát) 11 ml BR5 Eluční pufr 6 ml RNFW PK PRC PT Voda prostá RNázy (láhev) Proteináza K (zelené víčko) PAXgene RNA kolonky (červená) 2 ml zkumavky (Processing Tubes) 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml 5 x 10 6 x 50 Hemogard Sekundární BD Hemogard uzávěry 50 MCT RNFD mikrocentrifugační zkumavky (1,5 ml) DNáza l, prostá RNázy (lyofilizovaná) 3 x 50 1 x 10 1500 Kunitz jednotky Pokračování tabulky na druhé straně * Nesmí přijít do kontaktu s desinfekčními prostředky, které obsahují chlorová bělidla (chlornan sodný, NaOCl). Obsahuje sůl guanidinu. Viz bezpečnostní informace na straně 7. Promývací pufr 2 (BR4) se dodává jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96 100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. Kunitz jsou běžně užívané jednotky pro měření enzymatické aktivity DNázy I; definici naleznete na straně 42 nebo 48. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 5
PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalog čís. 762174 Počet příprav 50 RDD Pufr k digesci DNA (bílé víčko) 2 x 2 ml DRB PSC Pufr k resuspenzi DNázy (zkumavka, fialové víčko) PAXgene Shredder kolonky (fialová) PAXgene Blood RNA Kit Manuál (verze 2) 2 ml 5 x 10 1 Podmínky skladování PAXgene RNA kolonky (PRC), PAXgene Shredder kolonky (PSC), proteináza K (PK), a pufry (BR1, BR2, BR3, BR4, a BR5) mohou být skladovány v suchu a při teplotě uvedené na štítku soupravy. RNase-Free DNase Set, který obsahuje DNázu I (RNFD), pufr k digesci DNA (RDD) a pufr k resuspenzi DNázy (DRB), se zasílá při okolní teplotě. Všechny komponenty RNase-Free DNase Setu ihned po dodání uskladněte při teplotě uvedené na štítku. Zamýšlený účel použití PAXgene Blood RNA Kit slouží k purifikaci celulární RNA z plné krve, která byla odebrána pomocí PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). Pomocí tohoto systému, který se skládá z kitu a PAXgene Blood RNA Tubes, získáte ze vzorků plné krve purifikovanou intracelulární RNA, která může být použita v molekulárně diagnostických testech zakládajících se na RT PCR. Pokyny k použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) naleznete v popisu výrobku PAXgene Blood RNA Tubes. Charakteristika výkonu systému PAXgene Blood RNA uvedená v tomto manuálu platí pro transkripty genů FOS a IL1B. Uživatel je zodpovědný za stanovení odpovídající charakteristiky výkonu systému PAXgene Blood RNA pro jiné transkripty. 6 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Omezení použití PAXgene Blood RNA Kit je koncipován jako pomocný prostředek k purifikaci intracelulární RNA z lidské plné krve (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leukocytů/ml) pro diagnostické použití in vitro. Není určen k purifikaci genomické DNA nebo virových nukleových kyselin z plné krve. Vzhledem k tomu, že byl pro stabilizační podmínky uvedené v tomto manuálu validován jen omezený počet RNA transkriptů (transkripty genů FOS a IL1B), nebyla charakteristika výkonu stanovena pro všechny transkripty. Uživatel kitu by měl zhodnotit vlastní data a údaje výrobce, aby určil, zda je validace nezbytná i pro jiné transkripty neuvedené v této dokumentaci. Kontrola kvality Podle ISO certifikovaného systému managementu jakosti společnosti QIAGEN je každá šarže PAXgene Blood RNA Kit testována podle předem stanovených kritérií, aby byla zaručena jednotná kvalita produktu. Technická podpora Technická podpora společnosti QIAGEN ručí za kvalitu vědeckého poradenství našich zákazníků. Naši zkušení vědci jsou Vám a Vašim otázkám ohledně produktů PreAnalytiX vždy k dispozici. Pokud máte otázky ohledně PAXgene Blood RNA Kit, prosím kontaktujte nás. Pro technickou asistenci a další informace kontaktujte prosím Technickou podporu QIAGEN (viz strana 61). Bezpečnostní informace Při práci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Aby se vyloučilo riziko infekce (např. virem HIV nebo hepatitidy B) nebo zranění, noste také při manipulaci s biologickými a chemickými materiály vhodný laboratorní oděv, jednorázové ochranné rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS). V naší online sbírce bezpečnostních listů na www.preanalytix.com/rna_msds je k tomuto kitu a každému komponentu k dispozici příslušný MSDS v souboru PDF, který si můžete prohlédnout a vytisknout. Vazebný pufr (BR2) a promývací pufr 1 (BR3) obsahují guanidin isothiokyanát, který může při kontaktu s chlorovými bělidly vytvářet vysoce reaktivní sloučeniny. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 7
Pokud se rozlije kapalina obsahující vazebný pufr (BR2) nebo promývací pufr 1 (BR3), vyčistěte postižené místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Obsahuje-li rozlitá kapalina potenciálně infekční látky, vyčistěte místo nejprve detergentem a vodou a potom 1 % (v/v) chlornanem sodným. UPOZORNĚNÍ: NEPŘIDÁVEJTE chlorová bělidla nebo kyselé roztoky přímo do odpadu, který vzniká při přípravě RNA. Stabilizační roztok RNA a krevní tekutina z PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) mohou být desinfikovány pomocí 1 jednotky objemu roztoku chlorového bělidla (5 % chlornan sodný) na 9 jednotek objemu stabilizačního roztoku RNA resp. krevní tekutiny. Odpad vznikající při přípravě RNA, např. supernatanty po centrifugačních krocích, by měl být vždy považován za potenciálně infekční. Proto by měl být odpad před likvidací autoklavován nebo spálen, aby byl infekční materiál zničen. Postupujte v každém případě podle platných předpisů a směrnic pro likvidaci. Následující rizikové a bezpečnostní věty (R- a S-věty) platí pro jednotlivé reagencie soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Bezpečnostní pokyny pro použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) naleznete v popisu výrobku PAXgene Blood RNA Tube. Vazebný pufr (BR2) Xn Obsahuje guanidin isothiokyanát: zdraví škodlivý (Xn). R- a S- věty:* R20/21/22-32, S13-26-36-46 Promývací pufr 1 (BR3) Obsahuje ethanol: hořlavý. R-věta:* R10 * R10: Hořlavý. R20/21/22: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. R32: Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. R36/37/38: Dráždí oči, dýchací orgány a kůži. R42/43: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování a při styku s kůží. S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. S22: Nevdechujte prach. S23: Nevdechujte aerosoly. S24: Zamezte styku s kůží. S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. S36: Používejte vhodný ochranný oděv. S36/37: Používejte vhodný ochranný oděv a ochranné rukavice. S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení. 8 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Proteináza K (PK) Xn Obsahuje proteinázu K (z Tritirachium album): senzibilátor, dráždivý. R- a S- věty:* R36/37/38-42/43, S23-24-26-36/37 DNáza I Xn Obsahuje deoxyribonukleázu (bovinní): senzibilátor. R- a S-věty:* R42/43, S22-24-26-36/37 24 hodinové tísňové volání V případě nouze získáte lékařské informace 24 hodin denně (v anglickém, francouzském a německém jazyce) na: Toxikologická informační služba v Mohuči (Giftnotruf der Beratungsstelle bei Vergiftungen in Mainz), Německo Tel: +49-6131-19240 * R10: Hořlavý. R20/21/22: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. R32: Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. R36/37/38: Dráždí oči, dýchací orgány a kůži. R42/43: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování a při styku s kůží. S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. S22: Nevdechujte prach. S23: Nevdechujte aerosoly. S24: Zamezte styku s kůží. S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. S36: Používejte vhodný ochranný oděv. S36/37: Používejte vhodný ochranný oděv a ochranné rukavice. S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 9
Úvod Odběr vzorku krve je u mnoha molekulárně biologických výzkumů celulární RNA prvním krokem. Hlavním problémem je přitom instabilita profilu celulární RNA in vitro. Výzkumy u PreAnalytiX ukázaly, že se počet kopií jednotlivých druhů mrna v plné krvi mohou během přepravy nebo skladování při pokojové teplotě změnit více než tisícinásobně.* Příčinou je rychlá degradace RNA a indukovaná exprese určitých genů po odběru krve. Takové změny RNA profilu znemožňují spolehlivé studie genové exprese. Metoda k zachování profilu exprese RNA během a po odběru krve je tedy pro přesné analýzy genové exprese v lidské plné krvi nezbytná. Princip a jeho použití PreAnalytiX vyvinul nový systém, který umožňuje odběr, stabilizaci, skladování a přepravu vzorků lidské plné krve, a s kterým je možné izolovat intracelulární RNA podle rychlého a efektivního protokolu. Systém vyžaduje použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; USA patenty 6,602,718 a 6,617,170) k odběru krve a současné stabilizaci RNA, a PAXgene Blood RNA Kit k následné manuální či automatizované purifikaci RNA. Manuální i automatizovaný protokol poskytují rovnocenný výkon vzhledem ke kvalitě RNA a výtěžku. Údaje výkonu pro manuální (str. 19 26) a automatizovaný (str. 27 30) protokol jsou obsaženy v tomto manuálu. Odběr vzorku a stabilizace PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) obsahují reagencii, která se zakládá na patentované RNA stabilizační metodě (USA patenty 6.602.718 a 6.617.170). Tato reagencie chrání molekulu RNA před degradací RNázou a redukuje ex vivo změny genové exprese na minimum. PAXgene Blood RNA Tubes pro odběr lidské plné krve zaručují stabilizaci celulární RNA až po 3 dny při 18 25 C (viz obr. 1 a 2, str. 12 a 13) nebo až po 5 dnů při 2 8 C (obr. 3 a 4, str. 14 a 15). V současnosti dostupné údaje ukazují, že je celulární RNA při 20 C nebo 70 C stabilní minimálně po dobu 24 měsíců. Další informace ze studií vyhodnucujících stabilitu po ještě delší dobu získáte u Technické podpory QIAGEN. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, 1883. 10 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Skutečná doba stabilizace RNA se může měnit podle druhů RNA a použité postupné aplikace. Vzhledem k tomu, že byl pro stabilizační podmínky uvedené v tomto manuálu validován jen omezený počet RNA transkriptů (transkripty genů FOS a IL1B), nebyla charakteristika výkonu stanovena pro všechny transkripty. Uživatel kitu by měl zhodnotit vlastní data a údaje výrobce, aby určil, zda je validace nezbytná i pro jiné, zde neuvedené transkripty. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 11
Stabilita RNA v krevních vzorcích při 18 25 C: FOS Skladování (dny) Skladování (dny) Obrázek 1. Krev byla odebrána deseti dárcům a před purifikací celkové RNA uskladněna při 18 25 C po různě dlouhou dobu. Všechny vzorky byly odebrány v duplikátech. Odběr krve a skladování v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), purifikace celkové RNA pomocí PAXgene Blood RNA Kit. Odběr krve a skladování ve standardních odběrových zkumavkách (EDTA jako antikoagulant), purifikace celkové RNA standardní extrakční metodou (s organickými rozpouštědly) a čištění RNA zakládající se na silikátové membráně. Relativní koncentrace FOS transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 C T ). 12 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Stabilita RNA v krevních vzorcích při 18 25 C: IL1B Skladování (dny) Skladování (dny) Obrázek 2. Odběr krevních vzorků a purifikace celkové RNA po uskladnění při 18 25 C proběhly tak, jak je popsáno na obrázku 1. Relativní koncentrace IL1B transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 13
Stabilita RNA v krevních vzorcích při 2 8 C: FOS Skladování (dny) Skladování (dny) Obrázek 3 Krev byla odebrána deseti dárcům a před purifikací celkové RNA uskladněna při 2 8 C po různě dlouhou dobu. Všechny vzorky byly odebrány v duplikátech. Odběr krve a skladování v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), purifikace celkové RNA pomocí PAXgene Blood RNA Kit. Odběr krve a skladování ve standardních odběrových zkumavkách (EDTA jako antikoagulant), purifikace celkové RNA standardní extrakční metodou (s organickými rozpouštědly) a čištění RNA zakládající se na silikátové membráně. Relativní koncentrace FOS transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 C T ). 14 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Stabilita RNA v krevních vzorcích při 2 8 C: IL1B Skladování (dny) Skladování (dny) Obrázek 4 Odběr krevních vzorků a purifikace celkové RNA po uskladnění při 2-8 C proběhly tak, jak je popsáno na obrázku 3. Relativní koncentrace IL1B transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18SrRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 15
Koncentrace a purifikace RNA PAXgene Blood RNA Kit je určen k purifikaci celkové RNA z 2,5 ml lidské plné krve, která byla odebrána do PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Postup je jednoduchý a může být proveden za užití manuální i automatizované procedury (viz diagram). Purifikace RNA začíná v obou protokolech centrifugačním krokem, aby nukleové kyseliny v PAXgene Blood RNA Tube (BRT) sedimentovaly. Pelet se promyje a resuspenduje, následuje manuální nebo automatizovaná purifikace RNA. Oba protokoly v podstatě postupují podle stejných kroků a pracují se stejnými komponenty soupravy. 16 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Manuální postup PAXgene Blood RNA Krev Přidat proteinázu K (PK) a vazebný pufr (BR2) Inkubovat Nanést na PAXgene Shredder kolonku (PSC) Promíchat Převést supernatant průtoku do mikrocentrifugační zkumavky Přidat ethanol Nanést na PAXgene RNA kolonku (PRC) Promýt pelet Navázat celkovou RNA Promýt Resuspendovat Digesce DNA Převést do mikrocentrifugační zkumavky (MCT) Promýt Eluovat Ohřát na 65 C RNA připravená k použití PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 17
Automatizovaný postup PAXgene Blood RNA Krev Přidat proteinázu K (PK) a vazebný pufr (BR2) Inkubovat Promíchat Převést na PAXgene Shredder kolonku (PSC) Přidat ethanol k průtoku Promíchat pelet Převést do zkumavky (PT) a nanést na QIAcube shaker Resuspendovat Nanést na PAXgene RNA kolonku (PRC) Návázat celkovou RNA Promýt Digesce DNA Plně automatizováno na QIAcube Promýt Převést PAXgene RNA kolonku (PRC) Eluovat Zavřít víčko zkumavky (MCT) a převést do QIAcube shaker Ohřát 95 C RNA připravená k použití 18 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Manuální purifikace RNA Resuspendovaný pelet se inkubuje v optimalizovaných pufrech spolu s proteinázou K (PK), aby se navodila proteinová digesce. Dodatečný centrifugační krok přes PAXgene Shredder kolonku (PSC) slouží k homogenizaci buněčného lyzátu a k odstranění zbylých buněčných úlomků. Supernatant průtoku se převede do nové 1,5 ml zkumavky. Přidáním ethanolu se nastaví optimální vazební podmínky a lyzát se nanese na PAXgene RNA kolonku (PRC). Při následné krátké centrifugaci se RNA selektivně naváže na PAXgene silika membránu, kdežto kontaminace jí projdou. Zbylé kontaminace se odstraní mnoha účinnými promývacími kroky. Mezi prvním a druhým promývacím krokem se membrána inkubuje DNázou I (RNFD), aby se odstranily případné navázané zbytky DNA. Po promývacích krocích se RNA eluuje v elučním pufru (BR5) a denaturuje teplem. Celková RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA je vysoce čistá. Při použití manuálního protokolu leží hodnoty A 260 /A 280 mezi 1,8 a 2,2; podíl genomické DNA tvoří u 95% všech vzorků 1,0 % (w/w), jak bylo změřeno pomocí kvantitativní real-time-pcr jedné sekvence genu beta-aktinu. U RT PCR experimentů, při kterých tvořil eluát až 30 % reakčního objemu, nebyly u více než 95 % vzorků RNA zjištěny žádné známky inhibice rozborového systému. Při použití manuálního protokolu je průměrná doba přípravy vzorku (určeno na základě 12 provedených příprav RNA) přibližně 90 minut, přičemž doba manipulace činí cca 40 minut. U více než 95 % zpracovaných vzorků byl dosažen výtěžek RNA o 3 μg z 2,5 ml plné krve zdravých probandů. Protože výtěžky silně závisí na probandech, mohou se jednotlivé výtěžky RNA lišit. Systém PAXgene Blood RNA poskytuje při testování jednotlivých osob reprodukovatelné a opakovatelné výtěžky (viz obrázky 5 a 6 na stranách 20 a 21), stejně jako reprodukovatelné a opakovatelné výsledky RT-PCR (viz obrázky 7 a 8 na stranách 24 a 25), takže je velmi vhodný pro klinicko-diagnostické testy. Obrázek 5 zobrazuje reprodukovatelnost a opakovatelnost systému PAXgene Blood RNA. V dalších studiích byly zkoumány jednak různé šarže souprav PAXgene Blood RNA Kit, jednak vliv laborantů provádějících testy na reprodukovatelnost výtěžku RNA a výsledků Real-Time-RT-PCR. Protože byly pro tyto testy použity sdružené krevní vzorky, a ne vzorky individuálně získané s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), neodráží výsledky těchto pokusů opakovatelnost celého systému, která zohledňuje také rozdíly při odběru krve, nýbrž pouze opakovatelnost přípravy RNA (viz obrázek 6). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 19
Reprodukovatelná a opakovatelná purifikace RNA Proband Průměrný výtěžek RNA (μg/2.5 ml krve) RNA výtěžek (μg/2,5 ml krve) Proband Obrázek 5 Čtyřnásobná stanovení krevních vzorků 14 probandů byla manuálně provedena třemi různými laboranty (A, B, C). Přitom byly použity tři různé soupravy laboratorních přístrojů a jiných pomocných prostředků, přičemž každý laborant používal pro zpracování vzorků vždy jednu a tu samou soupravu přístrojů. Zobrazeny jsou průměrné hodnoty a standardní odchylky výtěžku RNA pro každý replikát vzorku stejného probanda zpracovaného různými laboranty. Dvanáct replikátů krevních vzorků každého z 14 probandů byly zpracovány třemi různými laboranty. Zobrazeny jsou průměrné hodnoty a standardní odchylky výtěžku RNA pro každý vzorek stejného probanda zpracovaného všemi třemi laboranty. U všech vzorků RNA ležel poměr absorbancí A 260 /A 280 v oblasti od 1,8 do 2,2. 20 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Opakovatelnost a reprodukovatelnost výtěžku RNA u různých laborantů a různých šarží soupravy PAXgene Blood RNA Kit za užití sdružených krevních vzorků Soubor probandů CV výtěžku RNA (%) RNA výtěžek (μg/2,5 ml krve) Proband Obrázek 6. Krevní vzorky 30 probandů byly odebrány do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; 12 zkumavek na probanda, tzn. celkově 360 zkumavek). Obsah všech zkumavek od 3 probandů byl sdružen a následně znovu rozpipetován na 36 vzorků. Těchto 36 vzorků na jeden soubor tří probandů bylo manuálně zpracováno třemi různými laboranty. Každý laborant použil pro izolaci RNA tři různé šarže soupravy PAXgene Blood RNA Kit a zpracoval čtyři replikáty z každého z deseti souborů probandů. Výtěžek RNA a standardní odchylka pro každou kombinaci laborant-šarže. Čtyřikrát opakované zpracování krevních vzorků z 10 souborů bylo provedeno třemi různými laboranty (A, B, C) pomocí každé ze tří šarží (1, 2, 3). Zobrazeny jsou průměrné výtěžky (sloupce) a standardní odchylky (chybové úsečky) na jedno čtyřnásobné stanovení ze stejného souboru probandů, pro různé laboranty a šarže soupravy. Variační koeficient (CV) výtěžku RNA na jeden soubor probandů, pro všechny kombinace laborant-šarže (A, B, C); 1, 2, 3); vypočítáno z průměrných výtěžků a standardních odchylek zobrazených na obrázku 6A. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 21
Tabulka 1A. Reprodukovatelnost v rámci každé šarže a každého uživatele Soubor probandů 1 5,1 x 10 6 buněk/ml Soubor probandů 6 6,5 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 9 8,4 x 10 6 buněk /ml Kombinace dat Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Šarže 1, laborant A 8,03 0,42 5 9,55 0,99 10 7,52 0,41 6 Šarže 1, laborant B 7,98 1,17 15 9,38 1,94 21 8,82 1,72 19 Šarže 1, laborant C 7,87 0,45 6 10,71 0,65 6 10,14 1,46 14 Šarže 2, laborant A 7,32 0,98 13 9,78 1,89 19 6,92 0,27 4 Šarže 2, laborant B 6,09 1,04 17 9,82 2,83 29 7,20 0,71 10 Šarže 2, laborant C 6,87 0,31 4 10,37 0,74 7 9,14 1,52 17 Šarže 3, laborant A 7,04 0,90 13 8,96 0,68 8 8,18 0,76 9 Šarže 3, laborant B 6,98 1,22 17 7,73 0,97 13 6,41 0,88 14 Šarže 3, laborant C 8,78 0,89 10 10,59 1,94 18 10,78 0,56 5 Tabulka 1B. Reprodukovatelnost v rámci každého laboranta a mezi všemi šaržemi Soubor probandů 1 5,1 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 6 6,5 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 9 8,4 x 10 6 buněk /ml Kombinace dat Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Laborant A, všechny šarže 7,46 0,85 11 9,43 1,22 13 7,54 0,72 10 Laborant B, všechny šarže 7,02 1,31 19 8,98 2,09 23 7,48 1,50 20 Laborant C, všechny šarže 7,84 0,98 13 10,56 1,15 11 10,02 1,34 13 Soubor probandů 10 10,2 x 10 6 buněk /ml Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) 7,96 0,49 6 8,90 0,76 9 10,22 1,29 13 7,63 1,23 16 7,00 0,56 8 11,56 1,21 10 7,85 0,82 10 8,88 2,17 24 10,88 0,37 3 Soubor probandů 10 10,2 x 10 6 buněk /ml Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) 7,81 0,82 11 8,26 1,54 19 10,89 1,10 10 22 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Tabulka 1C. Reprodukovatelnost v rámci každé šarže a mezi všemi laboranty Soubor probandů 1 5,1 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 6 6,5 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 9 8,4 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 10 10,2 x 10 6 buněk /ml Kombinace dat Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Šarže 1, všichni laboranti 7,96 0,69 9 9,88 1,34 14 8,83 1,63 19 9,02 1,27 14 Šarže 2, všichni laboranti 6,76 0,93 14 9,99 1,84 18 7,75 1,36 18 8,73 2,31 26 Šarže 3, všichni laboranti 7,60 1,27 17 9,09 1,71 19 8,46 1,99 24 9,20 1,80 20 Tabulka 1D. Reprodukovatelnost mezi všemi šaržemi a všemi laboranty Soubor probandů 1 5,1 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 6 6,5 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 9 8,4 x 10 6 buněk /ml Soubor probandů 10 10,2 x 10 6 buněk /ml Kombinace dat Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Průměrný výtěžek (μg) SD (μg) CV (%) Všechny šarže; všichni laboranti 7,44 1,09 15 9,66 1,65 17 8,35 1,70 20 8,99 1,8 20 Detailní analýza 4 souborů probandů. Soubory byly vybrány podle počtu leukocytů a udávají nejvyšší, střední a nejnižší hodnotu normální oblasti množství leukocytů (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leukocytů/ml). Počet leukocytů představuje průměr množství leukocytů tří probandů z jednoho souboru probandů. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 23
Reprodukovatelnost RT-PCR mezi uživately Uživatel Uživatel Obrázek 7 Vzorky RNA izolované v experimentu popsaném v obr. 6 byly použity pro Real-Time-RT-PCR. Relativní koncentrace transkriptů FOS a IL1B byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za užití 18S-rRNA jako interního standardu. Zobrazeny jsou hodnoty všech vzorků, a sice v poměru k hodnotám pro uživatele 1 (10 souborů probandů x 3 šarže soupravy x 4 replikáty = 120 souborů dat pro každý gen) s průměrem (červená linie) a standardní odchylkou (černá úsečka). Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 C T (FOS) a ± 1,93 C T (IL1B)). 24 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Reprodukovatelnost RT-PCR mezi šaržemi Šarže Šarže Obrázek 8 Vzorky RNA izolované v experimentu popsaném v obr. 6 byly použity pro Real-Time-RT-PCR. Relativní koncentrace transkriptů FOS a IL1B byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za užití 18S-rRNA jako interního standardu. Zobrazeny jsou hodnoty všech vzorků, a sice v poměru k hodnotám pro šarži soupravy 1 (10 souborů probandů x 3 uživatelé x 4 replikáty = 120 souborů dat pro každý gen) s průměrem (červená linie) a standardní odchylkou (černá úsečka). Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 C T (FOS) a ± 1,93 C T (IL1B)). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 25
Tabulka 2. Souhrn dat RT-PCR z obrázků 7 a 8 Testovací systém Porovnání dat rozbor FOS/18S rrna rozbor IL1B/18S rrna Průměr ( C T ) ±SD ( C T ) Průměr ( C T ) ±SD ( C T ) Reprodukovatelnost v rámci každého laboranta a mezi všemi šaržemi Všichni laboranti, šarže 1 šarže 1 Všichni laboranti, šarže 2 šarže 2 Všichni laboranti, šarže 3 šarže 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Reprodukovatelnost mezi všemi laboranty a v rámci každé šarže Všechny šarže, laborant A laborant A Všechny šarže, laborant A laborant B Všechny šarže, laborant A laborant C 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 0,44 0,06 0,69 0,31 0,60 0,15 0,71 Laborant: Technický(á) asistent(ka), který(á) provedl(a) experimenty. Šarže: Číslo šarže použitého kitu. SD: Standardní odchylka. Zobrazeny jsou průměry C T hodnot (N = 120) a standarní odchylky dat znázorněných na obrázcích 7 a 8. 26 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Automatizovaná purifikace RNA Příprava vzorku za užití přístroje QIAcube probíhá stejně jako manuální procedura, která umožňuje použití PAXgene Blood RNA Kit pro purifikaci vysoce kvalitní RNA. Více iformací o QIAcube získáte v QIAcube User Manual a na www.qiagen.com/myqiacube. Protokol automatizované purifikace RNA obsahuje dvě části (resp. protokoly) PAXgene Blood RNA Part A a PAXgene Blood RNA Part B s krátkou manuální intervencí mezi oběma částmi. Centrifugovaný, promytý a resuspendovaný pelet nukleové kyseliny (viz Koncentrace a purifikace RNA, str. 16) se přenese z PAXgene Blood RNA Tube (BRT) do zkumavek (PT), které jsou umístěny v termotřepačce na pracovní desce QIAcube. Operátor vybere a spustí protokol PAXgene Blood RNA Part A. QIAcube provede kroky protokolu až po eluci RNA v elučním pufru (BR5). Operátor přenese mikrocentrifugační zkumavky (MCT) obsahující purifikovanou RNA do termotřepačky v QIAcube. Operátor vybere a spustí protokol PAXgene Blood RNA Part B, tepelnou denaturaci provede QIAcube. Průměrná doba přípravy vzorku (určeno na základě 12 provedených příprav) je 125 minut, z toho tvoří manuální manipulace pouze cca 20 minut. U více než 95 % zpracovaných vzorků byl dosažen výtěžek RNA o 3 μg z 2,5 ml plné krve zdravých probandů. Obrázek 19 uvádí výtěžky RNA z 288 vzorků, které byly za užití automatizovaného protokolu zpracovány třemi laboranty se 3 šaržemi soupravy. Protože byly pro tyto testy použity sdružené krevní vzorky, a ne vzorky individuálně získané s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), neodráží tyto výsledky vytěžky RNA očekávané od individuálních vzorků z jednotlivých odběrů. Protože výtežky silně závisí na probandech, mohou se jednotlivé výtěžky lišit (obr. 9). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 27
Výtěžek RNA automatizované zpracování Výtěžek RNA (μg/2.5 ml krve) Obrázek 9 Krevní vzorky 48 různých probandů byly odebrány do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; 6 zkumavek na probanda, celkově 288 zkumavek). Obsah všech zkumavek od 6 probandů byl sdružen a následně znovu rozpipetován na 36 vzorků. Těchto 36 vzorků na jeden soubor 6 probandů bylo zpracováno třemi různými laboranty (A, B, C). Každý laborant použil pro automatizovanou izolaci RNA tři různé šarže (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit a zpracoval čtyři replikáty z každého z osmi souborů probandů. Zobrazeny jsou výtěžky RNA všech jednotlivých vzorků na každou kombinaci operátor-šarže. Přinejmenším 95% vzorků nevykazovalo za užití 30 % eluátu žádnou inhibici RT-PCR. U automatizovaného protokolu nebyly detekovány žádné křížové kontaminace mezi vzorky, tak bylo změřeno kvantitativní real-time RT-PCR sekvencí beta-globinu a FOS transkriptů v RNA negativních vzorcích (voda) spárovaných s RNA pozitivními vzorky (lidská plná krev). RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA a automatizovaného protokolu je vysoce čistá, jak ukazuje nepřítomnost RT-PCR inhibicí (viz výše) a hodnoty A 260 /A 280 mezi 1,8 a 2,2. Genomická DNA je přítomna u 1% (w/w) ve 95% všech vzorků, tak bylo změřeno kvantitativní real-time RT-PCR sekvence genu beta-aktinu. Obrázky 10 a 11 znázorňují hodnoty A 260 /A 280 a relativní genomickou DNA všech 288 vzorků připravených pomocí automatizovaného protokolu se 3 šaržemi a 3 laboranty. 28 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Čistota RNA (hodnoty A 260 /A 280 ) automatizované zpracování Obrázek 10 RNA byla v rámci experimentu popsaném v obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Hodnoty A 260 /A 280 všech jednotlivých vzorků jsou zobrazeny pro každou kombinaci operátor-šarže. Čistota RNA (% kontaminace genomickou DNA) automatizované zpracování Genomická DNA (w/w) (%) Čistota RNA (A 260 /A 280 ) Obrázek 11 RNA byla v rámci experimentu popsaném v obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Zobrazeno je množství genomické DNA (w/w) ve všech jednotlivých vzorcích pro každou kombinaci operátor-šarže. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 29
Automatizovaný protokol purifikace RNA za užití systému PAXgene Blood RNA poskytuje vysoce reprodukovatelné a opakovatelné výsledky RT-PCR, jak je znázorněno na obrázku 12, a je tedy velmi vhodný pro klinicko-diagnostické testy. Reprodukovatelnost RT-PCR mezi automatizovaným a manuálním protokolem Obrázek 12 RNA byla v rámci experimentu popsaném na obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit ve spojení s automatizovaným protokolem. Zároveň byla RNA purifikována z odpovídajících replikátů za užití manuálního protokolu. Relativní hladiny transkriptu FOS a IL1B byly určeny real-time duplex RT-PCR za užití 18S rrna jako interního standardu. Možné rozdíly hladin transkriptů mezi RNA připravenou ze spárovaných krevních vzorků za užití obou extrakčních protokolů (manuální a automatizovaný protokol) byly vypočítány podle C T metody. Jednotlivé C T hodnoty všech párů vzorků (4 replikáty x 8 probandů x 3 šarže kitu x 3 operátoři = 288 párů každého genu) byly vyneseny do jednoho bodu s průměrem (větší body) a standardní odchylkou (černé úsečky). Čárkované linie uvádí ±3x celkovou přesnost rozborů (FOS: 2.34 C T ; IL1B, 1.93 C T ). 30 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou Při manipulaci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS), které získáte u výrobce. Pro všechny protokoly PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; kat. čís. 7642165) Ethanol (96 100%, stupeň čistoty p.a.) Pipety* (10 μl 4 ml) Sterilní pipetovací špičky prosté RNázy, s aerosolovou bariérou jako ochranou před kontaminací Odměrný válec Centrifuga* s výkyvným rotorem a vhodnými adaptéry pro PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) a s rychlostí od 3000 5000 x g Vortex mixer* Drcený led Permanentní fixa pro popisování Pro manuální protokol Mikrocentrifuga* s rotorem pro 2 ml zkumavky a s variabilní rychlostí od 1000 8000 x g Třepací inkubátor* pro inkubace při 55 C a 65 C s variabilní rychlostí mezi 400 a 1400 ot/min, např. Eppendorf Thermomixer Compact nebo ekvivalent Pro automatizovaný protokol QIAcube* (QIAGEN, kat. čís. 9001292 [110 V], kat. čís. 9001293 [230 V]) QIAcube spotřební materiál Špičky s filtrem, 1000 μl (1024) (QIAGEN, kat. čís. 990352) Reagenční láhve, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. čís. 990393) Adaptéry do rotoru (10 x 24) (QIAGEN, kat. čís. 990394) * Ujistěte se, že jsou přístroje pravidelně kontrolovány, udržovány a kalibrovány podle údajů výrobce. Ujistěte se, že jste obeznámeni s pokyny pro zacházení s RNA (příloha A, str. 54). K odměření množství ethanolu, které se přidává ke koncentrátu pufru BR4. Obsaženo také v Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, kat. čís. 990395). PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 31
QIAcube doplňky Stojan na reagenční láhve (QIAGEN, kat. čís. 990390) Držák pro adaptéry do rotoru (QIAGEN, kat. čís. 990392) Nůžky Důležité pokyny Používání QIAcube Ujistěte se, že jste obeznámeni s manipulací s přístrojem QIAcube. Prosím prostudujte si QIAcube User Manual a dodatečné informace dodávané s QIAcube. Prosím věnujte před začátkem automatizovaného PAXgene Blood RNA protokolu zvláštní pozornost bezpečnostním informacím. Start QIAcube Zavřete dvířka QIAcube a zapněte QIAcube pomocí spínače (viz obrázek 13). Zazní pípnutí a objeví se startovací obrazovka. Přístroj automaticky provede zahajovací testy. Instalace protokolu na QIAcube Před prvním během přípravy RNA na QIAcube je potřebný zahajovací protokol instalace. Instalujte oba PAXgene Blood RNA Part A a PAXgene Blood RNA Part B protokoly. Protokoly jsou k dispozici na www.qiagen.com/myqiacube. Musí být staženy na USB flash disk dodávaný s QIAcube a přeneseny do QIAcube přes USB port. USB port, který se nachází za ochranným panelem (viz obrázek 13), umožňuje spojení mezi QIAcube a USB flash diskem (dodávaným s QIAcube). Soubory dat, jako například log či report soubory, mohou být přeneseny přes USB port z QIAcube na USB flash disk. USB port se smí používat pouze pro USB flash disk dodávaný firmou QIAGEN. Nepoužívejte tento port s jinými zařízeními. Neodstraňujte USB flash disk během stahování protokolů, přenosu souborů dat nebo při běhu protokolu. Obsaženo také v Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, kat. čís. 990395). 32 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Přední strana QIAcube Obrázek 13 Dotyková obrazovka Dvířka Sériový port RS232 za ochranným panelem (použití pouze pro specialisty firmy QIAGEN) USB port za ochranným panelem Spínač Odpadní zásuvka PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 33
Naplnění QIAcube Aby se ušetřil čas, může se QIAcube naplnit během jednoho nebo obou desetiminutových centrifugačních kroků (kroky 3 a 5) podle Protokol: Automatizovaná purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), strana 47. Reagenční láhve Opatrně naplňte 4 reagenční láhve QIAcube reagenciemi, které jsou uvedeny v tabulce 3 (láhve naplňte až po vyznačenou rysku). Na láhve a víčka jasně napište názvy pufrů a umístěte je do náležitých pozicí na stojanech na reagenční láhve (viz obrázky 14 a 15). Před každým během na QIAcube se ujistěte, že jsou reagenční láhve naplňené až po vyznačenou rysku (pro naplnění reagenčních lahví by měl být použit objem zbývající v láhvích s pufry původního kitu). Umístěte stojan s naplněnými reagenčními láhvemi na QIAcube pracovní desku, jak je znázorněno na obr. 14 a 15. Před umístěním lahví na pracovní desku se ujistěte, že jste odstranili jejich víčka. Objem pufrů dodávaných s PAXgene Blood RNA Kit (50) vystačí na max. 7 příprav RNA na QIAcube. Více běhům s malým množstvím vzorků by se mělo předejít, aby byl zajištěn dostatečný objem pufrů pro všech 50 zpracovaných vzorků. Tabulka 3. Pozice na stojanu na reagenční láhve Pozice Reagencie 1 Vazebný pufr (BR2) 2 96 100% ethanol 3 Promývací pufr 1 (BR3) 4 Promývací pufr 2 (BR4)* 5 (ponechte prázdnou) 6 (ponechte prázdnou) * Promývací pufr 2 (BR4) se dodává jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96 100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. 34 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Vložení stojanu na reagenční láhve Pozice 1 vazebný pufr (BR2) Pozice 2 96-100% ethanol Proužek pro popis Pozice 3 promývací pufr1 (BR3) Pozice 4 promývací pufr 2 (BR4) Proužek pro popis Pozice 5 Pozice 6 prázdná prázdná Obrázek 14 Schéma pozic a obsahu láhví na stojanu pro reagenční láhve. Vložení stojanu do QIAcube. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 35
Náhled do vnitřní platformy QIAcube Obrázek 15 Víčko centrifugy Centrifuga Třepačka Stojan na reagenční láhve Senzor pro kontrolu pipetovacích špiček Drážky pro umístění mikrocentrifugačních zkumavek Stojan na špičky Kanálky pro likvidaci špiček a kolonek Robotická ruka 36 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Kolonky (PRC, PSC), mikrocentrifugační zkumavky (MCT) a umělohmotné části QIAcube Umístěte 2 stojany na špičky se špičkami s filtry o 1000 μl do QIAcube (viz obrázek 15). Je-li potřeba, stojany doplňte. Používejte pouze špičky o 1000 μl určené pro použití s QIAcube. Popište permanentní fixou adaptéry pro rotor a mikrocentrifugační zkumavky (MCT) pro každý použitý vzorek. Otevřete PAXgene Shredder kolonky (PSC) určené k použití a zcela odstřihněte jejich víčka pomocí nůžek (obrázek 16). Aby mohla robotická ruka přístroje QIAcube správně pracovat, zcela odstraňte (odstřihněte) víčka a umělohmotné části spojující víčko a PAXgene Shredder kolonku (PSC; viz obrázek 16). Jinak nemůže robotická ruka kolonky (PSC, PRC) správně uchopit. Vložte PAXgene RNA kolonky (PRC), PAXgene Shredder kolonky (PSC, bez víček) a popsané mikrocentrifugační zkumavky (MCT) do náležitých pozic do každého popsaného adaptéru, jak uvedeno v tabulce 4 a obrázku 17 (strana 38). Ujistěte se, že jsou víčka kolonek (PRC) a mikrocentrifugačních zkumavek (MCT) stlačena až na dno drážek na okraji adaptéru, jinak se mohou víčka během centrifugace odlomit. Vložení PAXgene Shredder kolonek (PSC) Víčka kolonek (PSC) odstraněná správně Víčka kolonek (PSC) odstraněná nesprávně; část víčka přebývá Obrázek 16 PAXgene Shredder kolonky (PSC) jsou vloženy do střední pozice. Odstřihněte před vložením kolonek (PSC) víčka. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 37
Tabulka 4. Laboratorní materiál v adaptéru Pozice Materiál Pozice víčka 1 PAXgene RNA kolonka (červená, PRC) L1 2 PAXgene Shredder kolonka (fialová, PSC) (odstřihnout víčko před vložením do adaptéru) 3 Mikrocentrifugační zkumavka (MCT)* L3 * Používejte mikrocentrifugační zkumavky (1,5 ml, MCT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit. Obrázek 17 Adaptér má tři pozice zkumavek (1 3) a tři pozice víček (L1 L3). Naplnění centrifugy Vložte sestavené adaptéry do jamek centrifugy, jak je ukázáno na obrázku 18. Při zpracování méně než 12 vzorků musí být rotor centrifugy naplněn paprskovitě (viz obrázek 19), aby zůstal vyvážen. Před začátkem protokolu musí být nasazeny všechny jamky centrifugy, i v případě, že je zpracováváno méně než 12 vzorků. Jediný vzorek nebo 11 vzorků nelze zpracovat. Vkládání do centrifugy Obrázek 18 Vložte sestavené adaptéry do jamek centrifugy. 38 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Plnění centrifugy a třepačky 2 vzorky 3 vzorky 4 vzorky 5 vzorků 6 vzorků 7 vzorků 8 vzorků 9 vzorků 10 vzorků Obrázek 19 Pozice centrifugy a třepačky jsou zobrazeny pro zpracování dvou (2 vzorky) až deseti vzorků (10 vzorků). Jeden nebo jedenáct vzorků nelze zpracovat. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 39
Zkumavky Processing tubes (PT) Vyjměte z drážek mikrocentrifugy všechny zkumavky (PT), které zbyly z předchozích běhů (viz obrázek 15, strana 36). Naplňte zkumavky (PT) množstvím reagencií uvedeném v tabulce 5. Jasně popište zkumavky (PT) názvy reagencií a umístěte je do odpovídajících pozic v drážkách, jak je uvedeno v tabulce 6. Pipetujte uvedený objem pufru k digesci DNA (RDD) do zkumavky (PT) a přidejte uvedený objem základního roztoku DNázy I (RNFD). Směs jemně promíchejte náběrem a následným vypuštěním pipety (opakujte třikrát, za užití pipetovací špičky o 1000 μl). Používejte 2 ml zkumavky (PT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit. Ujistěte se, že pipetujete správný objem uvedený v tabulce 5. Tabulka 5. Požadovaný objem reagencií ve zkumavkách umístěných v drážkách pro mikrocentrifugační zkumavky. Počet vzorků Proteináza K (PK) Objem reagencií potřebný pro uvedený počet vzorků (μl) Inkubační směs DNázy I Eluční pufr (BR5) 2 126 187 (23 DNáza I [RNFD] + 164 RDD) 313 3 170 260 (33 DNáza I [RNFD] + 228 RDD) 399 4 213 334 (42 DNáza I [RNFD] + 292 RDD) 486 5 256 407 (51 DNáza I [RNFD] + 356 RDD) 572 6 299 481 (60 DNáza I [RNFD] + 421 RDD) 658 7 342 554 (69 DNáza I [RNFD] + 485 RDD) 745 8 386 628 (78 DNáza I [RNFD] + 549 RDD) 831 9 429 701 (88 DNáza I [RNFD] + 613 RDD) 918 10 472 774 (97 DNáza I [RNFD] + 678 RDD) 1004 12 558 921 (115 DNáza I [RNFD] + 806 RDD) 1177 Tabulka 6. Drážky pro mikrocentrifugační zkumavky Pozice A B C Obsah Proteináza K (PK) inkubační směs DNázy I eluční pufr (BR5) Nádobka zkumavky (PT)* zkumavky (PT)* zkumavky (PT)* * Používejte 2 ml zkumavky (PT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit. 40 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Protokol: Manuální purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) Důležité pokyny před začátkem Při dodání se ujistěte, že je kit intaktní a nepoškozený, a že nedošlo k úniku pufrů. Nepoužívejte viditelně poškozený kit. Při užívání pipet zkontrolujte, zda je správně nastaven objem a také se ujistěte, že je tekutina zcela nasáta a opět vypuštěna. Aby se zabránilo převedení vzorku do špatné zkumavky či kolonky, měly by být všechny zkumavky a kolonky pečlivě označeny a víčka nadepsána. Označte víčka a trup každé zkumavky (PT, MCT). U kolonek nadepište také sběrnou zkumavku, ve které se eluuje (Processing Tube). Po přidání tekutiny vždy každou zkumavku a kolonku uzavřete. Rozlití tekutiny vzorku nebo pufru během přípravy může snížit výtěžek a čistotu RNA. Pokud není jinak uvedeno, měly by být všechny kroky protokolu (včetně centrifugace) provedeny při pokojové teplotě (15 25 C). Vzhledem k vysoké senzitivitě metod amplifikace nukleových kyselin by měla být k zamezení křížových kontaminací dodržována následující preventivní opatření. Vzorky pipetujte do kolonek (PRC, PSC) tak, aby se nepotřísnil horní okraj kolonky. Mezi pipetovacími kroky vždy vyměňte pipetovací špičky. Používejte špičky s aerosolovou bariérou. Dbejte prosím na to, aby jste se pipetovací špičkou nedotkli membrány v kolonce (PRC, PSC). Mikrocentrifugační zkumavky (MCT) po vortexování nebo ohřívání krátce centrifugujte, aby se odstranily kapky z vnitřní strany víčka. Po celou dobu přípravy noste laboratorní rukavice. V případě kontaktu se vzorkem rukavice ihned vyměňte. Kolonky (PRC, PSC) před vložením do mikrocentrifugy vždy uzavřete. Centrifugujte podle údajů v protokolu. Otevírejte najednou vždy jen jednu kolonku (PRC, PSC) a zabraňte tvorbě aerosolu. PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 41
Pro efektivní paralelní zpracování více vzorků se doporučuje připravit stojan se sběrnými zkumavkami (Processing Tubes, PT), do kterých se po centrifugaci mohou vložit kolonky (PRC, PSC). Použitou sběrnou zkumavku (PT) i s průtokem vyhoďte a vložte nové zkumavky (PT) s kolonkami (PRC, PSC) přímo do mikrocentrifugy. Příprava vzorků před začátkem Krev odeberte do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) podle pokynů v příslušném popisu produktu. V příloze C (na straně 57) naleznete stručný návod k zacházení s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). Po odběru krve inkubujte PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) minimálně 2 hodiny při pokojové teplotě, aby byla zajištěna uplná lýza krevních buněk. Inkubace PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) přes noc může vést k vyšším výtěžkům. Byla-li PAXgene Blood RNA Tube (BRT) po odběru krve skladována při 2 8 C, 20 C nebo 70 C, ponechte ji před začátkem protokolu nejdříve ekvilibrovat na pokojovou teplotu a potom 2 hodiny inkubovat. Přečtěte si bezpečnostní informace na straně 7. Přečtěte si Všeobecné pokyny k zacházení s RNA (příloha A na straně 54). Ujistěte se, že jsou všechny použité přístroje, např. pipety a třepací inkubátory, pravidelně přezkoušeny a kalibrovány podle údajů výrobce. Třepací inkubátor je zapotřebí u kroků 5 a 20. Nastavte teplotu inkubátoru na 55 C. Ve vazebném pufru (BR2) se může po delším skladování vytvořit sraženina. V tomto případě ji rozpust te ohřátím na 37 C. Promývací pufr 2 (BR4) je dodáván jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96 100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. Před prvním použitím RNase-Free DNase Setu připravte základní roztok DNázy I. DNázu I (RNFD; 1500 Kunitz jednotek*) rozpust te v 550 μl pufru k resuspenzi DNázy (DNase Resuspension Buffer; DRB), který je dodáván se soupravou. Dbejte na to, aby při otevření nádobky neunikla žádná DNáza I (RNFD). Rekonstituovaná DNáza I nesmí být vortexována. DNáza I je velmi náchylná k fyzikální denaturaci. Roztok DNázy I promíchejte pouze jemným převracením zkumavky. * Kunitz jednotka je běžně užívaná jednotka pro měření enzymatické aktivity DNázy I; je definovaná jako množství DNázy I způsobující nárůst absorbance při 260 nm (A 260 ) o 0,001 za minutu a mililitr při 25 C a ph 5,0, přičemž je jako substrát použita vysoce polymerní DNA (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 und 363). 42 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008
Současné údaje ukazují, že je rekonstituovaná DNáza I (RNFD) skladovaná při 2 8 C stabilní až 6 týdnů. Pro dlouhodobé skladování DNázy I (RNFD) se doporučuje rozdělit základní roztok na menší alikvoty pro jedno použití (použijte k tomu 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky [MCT] dodávané s kitem, které postačí pro 5 alikvotů) a skladovat při 20 C (až 9 měsíců). Rozmrazené alikvoty se mohou skladovat při 2 8 C až 6 týdnů. Rozmrazené alikvoty znovu nezmrazujte. Při rekonstituci a alikvotaci roztoku DNázy I (RNFD) neopomeňte Všeobecné pokyny k zacházení s RNA (příloha A na straně 54). Provedení 1. Centrifugujte PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 10 minut ve výkyvném rotoru při 3000 5000 x g. Ujistěte se, že byly krevní vzorky minimálně 2 hodiny inkubovány v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) při pokojové teplotě (15 25 C), aby bylo dosaženo úplné lýzy krevních buněk. Rotor musí být vybaven adaptéry pro zkumavky s kulatým dnem. Při používání jiných typů adaptérů se mohou zkumavky během centrifugace poškodit. 2. Následně opatrně odstraňte supernatant dekantací nebo pipetováním. K peletu přidejte 4 ml vody prosté RNázy (RNFW) a uzavřete zkumavku novým bezpečnostním uzávěrem BD Hemogard (dodávaný s kitem). Během dekantace supernatantu dbejte na to, aby se pelet neoddělil od vnitřní stěny, a osušte okraj zkumavky čistým papírovým ručníkem. 3. Pelet resuspendujte vortexováním a centrifugujte 10 minut ve výkyvném rotoru při 3000 5000 x g. Supernatant následně úplně odstraňte a zlikvidujte. Menší buněčné úlomky obsažené před centrifugací v supernatantu nenarušují další průběh protokolu. Naproti tomu může neúplné odstranění supernatantu inhibovat lýzu a zředit lyzát, a tím narušit podmínky pro navázání RNA na PAXgene membránu. 4. Přidejte 350 μl pufru k resuspenzi (Resuspension Buffer; BR1) a vortexujte dokud se pelet plně neresuspenduje. 5. Převeďte vzorek pipetou do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (MCT). K tomu pipetujte 300 μl vazebného pufru (BR2) a 40 μl proteinázy K (PK). Promíchejte (vortexem) cca 5 sekund a inkubujte 10 minut při 55 C v třepacím inkubátoru při rychlosti 400 1400 PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008 43