Isoenzymové rozlišení borovic Pinus mugo Turra a Pinus pseudopumilio (Willk.) Beck

AKTUALITY ŠUMAVSKÉHO VÝZKUMU II str. 151 157 Srní 4. 7. října 2004 Isoenzymové rozlišení borovic Pinus mugo Turra a Pinus pseudopumilio (Willk.) Beck Isozyme differentation of Pinus mugo Turra and Pinus pseudopumilio (Willk.) Beck Jiří Mánek 1, * & Jana Ešnerová 2 1 Správa NP Šumava, 1. máje 260, CZ-38501 Vimperk, Česká republika 2 Fakulta lesnická a environmentální, ČZU Praha, Kamýcká 129, CZ-16521 Praha 6, Česká republika *jiri.manek@npsumava.cz Abstract The genetic structure of two genera from the Pinus mugo complex has been studied based on starch gel electrophoresis of dormant buds. In total 7 populations have been scored. Three subpopulations of Pinus mugo Turra originating from the Giant Mountains (Krkonoše Mts. Northern part of the Czech Republic) and four subpopulations of Pinus pseudopumilio (Willk.) Beck (a stabilized hybrid between P. mugo Turra and P. rotundata Link) originating from the Bohemian Forest peat bogs (Šumava Mts. Southwestn part of the Czech Republic), in particular. The genotypic frequencies at 16 polymorphic enzyme loci of MDH, PGM, SKDH, LAP, FEST, PEROX, DIA, GOT, PEP, and GDH were scored. After our results P. mugo and P. pseudopumilio are clustered into two clearly divorced groups, corresponding with the taxonomic status of these species and/or subspecies. The LAP-A and GOT-A loci are distinguished by specific alleles for hybrid P. pseudopumilio, which did not occur or very weakly in P. mugo, while SKDH-A carries allele unknown for P. pseudopumilio. Occurrence of some PGM, MDH-C, FEST-A and GOT-B alleles might be also considered as species-specific. Impact of genetic drift on small-size and isolated subpopulations of P. pseudopumilio was observed. Key words: Pinus mugo, Pinus pseudopumilio, isozymes, genetic differentiation, genetic diversity, taxonomy, Giant Mountains, Bohemian Forest, Czech Republic ÚVOD Borovice je jedním z nejvíce rozšířených rodů jehličnatých dřevin jak v Evropě, tak na celé severní polokouli (PRAVDIN 1964, CRITCHfiELD & LITTLE 1966). Zahrnuje stromovité i keřovité růstové formy a může růst v absolutně odlišných ekologických podmínkách, včetně extrémů jako jsou hranice tundry, rašeliniště, stepi a hory. Takto široká ekologická valence může příznivě ovlivňovat formování vzniku nových ekotypů borovic (GONCHARENKO et al. 1994). Rozdílné morfologické variety rodu Pinus (sensu lato) se formují do specifických ekotypů a tak vzniká mnoho taxonomických problémů, které se nevyhýbají ani Šumavě. V rámci rodu Pinus byla mnohými autory popsána introgresivní hybridizace, to nejen v rámci České republiky (BUSINSKÝ 1999, BUSINSKÝ & WEGER 1995, HOLUBIČKOVÁ 1965) ale také z mnoha jiných zemí jako např. zemí bývalého sovětského svazu (POLITOV et al. 1999, GONCHARENKO et al. 1995), Polska (SIEDLEWSKA & PRUS-GLOWACKI 1995, BACZKIEWICZ & PRUS-GLOWACKI 1997), Slovenska (KORMUŤÁK 1990, STASKIEWICZ 1993), Švýcarska (NEET- -SARQUEDA 1994), Německa (SCHMID 2000) a Dánska (CHRISTENSEN 1997). Na druhé straně 151

někteří autoři s popisy introgresivních hybridů nesouhlasí a odmítají tuto hypotézu na základě molekulárních márkerů (FILPPULA et al. 1992, NEET-SARQUEDA 1994). Borovice jsou na Šumavě zastoupeny prakticky všemi druhy, které se na území České republiky přirozeně vyskytují. Ze Šumavy jsou tedy známy Pinus sylvestris L., Pinus rotundata Link, Pinus mugo Turra a jejich kříženci Pinus pseudopumilio (Willk.) Beck (P. mugo s.str. P. rotundata), Pinus celakovskiorum A. et Gr. (P. mugo P. sylvestris) tento hybrid je znám i jako P. rhaetica Brüger (CHRISTENSEN 1987, STASKIEWICZ 1993), Pinus digenea Beck. (P. rotundata P. sylvestris), a také trihybridní kombinace P. mugo P. rotundata P. sylvestris (BUSINSKÝ 1999). Pinus uncinata Ramond se na území Šumavy ani celé České republiky přirozeně nevyskytuje a všechny případy takto určeny jsou dle BUSIN- SKÉHO (1999) chybné. Klasifikace použita v našem příspěvku vychází z BUSINSKÉHO (1999). Všechny výše zmíněné případy výskytu jednotlivých druhů i jejich hybridů byly popsány na základě morfologických znaků. Proto se naším výzkumem chceme pokusit o příspěvek k objasnění taxonomie těchto druhů užitím molekulárních genetických márkérů izoenzymů. Prvním krokem našeho projektu je zhodnocení genetické diferenciace mezi nejvíce rozšířenou borovicí na šumavských rašeliništích Pinus pseudopumilio a čistou Pinus mugo Turra. Náš výzkum začal ve druhé polovině roku 2001 v elektroforetické laboratoři Národního parku Šumava v Kašperských Horách a musí být předesláno, že výsledky prezentovány v tomto článku je nutno považovat za první a předběžné. MATERIÁL A METODY Sbíraný materiál V České republice jsou dominantním zdrojem typické zakrslé horské borovice Pinus mugo Turra především oblasti vyšších nadmořských výšek Krkonoš, známé jako ekosystémy tundry nad horní hranicí lesa (SOUKUPOVÁ et al. 1995), kde zakrslá borovice pokrývá více než 2000 hektarů. Na Šumavě roste jen v malých izolovaných ostrůvcích (především na skalnatých vrcholcích, sutích a v karech ledovcových jezer). Toto je hlavní důvod toho, proč byl materiál reprezentující Pinus mugo pro účely této prvotní studie sbírán v Krkonoších a ne na Šumavě. Ze šumavských rašelinišť pak byly sbírány vzorky z Pinus pseudopumilio. Přehled sledovaných lokalit je uveden v Tab. 1. Celkem bylo hodnoceno 269 jedinců ze sedmi populací. Minimální vzdálenost mezi jednotlivými analyzovanými jedinci byla průměrně 30 metrů. Materiál byl sbírán v zimním období v letech 2001 a 2002. V Krkonoších byly hodnocené stromy na stanovišti označeny a většina z nich zaměřena pomocí GPS odběr zde zajistil Botanický výzkumný ústav v Průhonicích. Větve s dormantními pupeny byly před analýzou uloženy v mrazícím boxu při teplotách 18 C po dobu maximálně 6 týdnů. Izoenzymové analýzy Extrakt pro elektroforetickou analýzu byl připraven homogenizací diploidního pletiva dormantních pupenů. Analýzy probíhaly dle prací CONCLE et al. (1982) a CHELIAK & PITEL (1984). Horizontální elektroforéza probíhala na 12 13% škrobovém gelu. Histochemické barvení 11 enzymových systémů probíhalo dle standardních metod (CONKLE et al. 1982, CHELIAK & PITEL 1984, MANCHENKO 1994) s některými úpravami. Hodnocení zymogramů bylo prováděno na základě prací RUDIN (1975, 1977), GULLBERG et al. (1985), PUGLISI & AT- TOLICO (2000) a KONNERT (osobní sdělení). Přehled enzymových systémů, jejichž variabilita byla sledována, je uveden v Tab. 2. 152

Tabulka 1. Přehled sledovaných lokalit, jejich zeměpisná poloha a počet hodnocených jedinců. Table 1. List of investigated populations, their geographic origin and number of scored trees. Označení subpopulace Počet hodnocených jedinců Zeměpisná šířka Zeměpisná délka Nadmořská výška (m n.m.) Původ GM 1 40 50 45 35 15 32 39 1320 Krkonoše GM 2 40 50 45 53 15 32 40 1270 Krkonoše GM 3 40 50 46 43 15 32 53 1390 Krkonoše BF 1 44 48 59 58 13 39 30 920 Šumava BF 2 38 49 01 15 13 31 40 1120 Šumava BF 3 25 49 04 10 13 33 45 1100 Šumava BF 4 42 49 03 10 13 36 30 1060 Šumava Tabulka 2. Přehled sledovaných enzymových systémů s uvedením jejich zkratky a kódu Enzymové komise, používaného pufračního systému a počtu hodnocených lokusů. Table 2. Enzyme systems assayed, their abbreviations, Enzymes Commission codes, number of loci scored, and buffer systems used for electrophoresis. Enzymový systém Zkratka E.C. kód Počet hodnocených lokusů Pufrační systém Diaforáza DIA 1.6.4.3 1 B Fluorescenční esteráza FEST 3.1.1.1 1 B Glutamát dehydrogenáza GDH 1.4.1.2 1 C Glutamát-oxalacetáttransamináza GOT 2.6.1.1 2 C Isocitrát dehydrogenáza IDH 1.1.1.42 1 A Leucin aminopeptidáza LAP 3.4.11.1 2 B Malát dehydrogenáza MDH 1.1.1.37 3 A Fosfoenolpyruvát karboxyláza PEP 4.1.1.31 1 C Fosfoglukomutáza PGM 2.7.5.1 1 A Peroxidáza PX 1.11.1.7 1 B, C Šikimát dehydrogenáza SHDH 1.1.1.25 2 B A kontinuální Tris-citrát ph 7,4 (KONNERT & MAURER 1995) B diskontumuální lithium borát/tris citrát ph 8,1/8,1 (POULIK 1957) C diskontinuální Na borát/tris-citrát ph 8,0/8,7 (POULIK 1957) Statistické analýzy Hodnocení genetické diverzity a alelických frekvencí bylo provedeno pomocí programu BIOSYS-1 (SWOFFORD & SELANDER 1989). Jako parametry genetické struktury byly sledovány následují charakteristiky: průměrný počet alel na lokus, procentické zastoupení polymorfních lokusů, očekávaná a pozorovaná heterozygotnost. Pro porovnání pozorované heterozygotnosti s panmiktickým modelem populace byl počítán Wrightův fixační index (WRIGHT 1922). Hodnoty Neiových genetických vzdáleností byly použity pro vytvoření dendrogramu metodou UPGMA (SNEATH & SOKAL 1973). VÝSLEDKY A DISKUZE V rámci této studie byla hodnoceny genetické rozdíly mezi 7 populacemi zakrslých borovic ze dvou regionů z České republiky. Bylo hodnoceno 11 enzymových systémů skrze 16 interpretovatelných lokusů. Celkem bylo pozorováno 52 alelických variant. 153

Nejvíce variabilní lokusy u obou druhů byly SKDH-A a PEROX-A. Střední úroveň variability byla pozorována u MDH-B a MDH-C a zbývající lokusy vykazovaly nízký stupeň polymorfismu. V dendrogramu Neiových genetických vzdáleností (Obr. 1) můžeme jasně vidět dvě zřetelně oddělené skupiny. Některé lokusy lze považovat za specifické pro jeden nebo druhý druh. Největší rozdíly byly pozorovány ve výskytu alely GOT-A1, která byla pozorována s relativně vysokou frekvencí ve všech populacích P. pseudopumilio, zatímco v populacích P. mugo byla pozorována s velmi malou frekvencí výskytu. Oddělení obou druhů odpovídají i výsledky analýz enzymového systému GOT-A, kde alela A1 byla pozorována s relativně vysokou frekvencí u subpopulací P. pseudopumilio, zatímco u subpopulací P. mugo byla pozorována pouze s malou frekvencí výskytu. Podobné výsledky jsme zaznamenali u alely LAP-A1, která byla nalezena pouze u P. pseudopumilio. Významné rozdíly byly pozorovány i ve výskytu ± druhově specifických alelických frekvencí u SKDH- -A1, MDH-C2, FEST-A3 a GOT-B2. Také enzymový systém PGM ukazuje rozdíly mezi oběma druhy a to při jeho monomorfním výskytu ve všech subpopulacích P. mugo. Genetické parametry populací jsou shrnuty v Tab. 3. Podle hodnot genetických charakteristik se populace P. mugo zdá více vyvážená než populace P. pseudopumilio. Nízký stupeň polymorfismu se projevil zejména u populace BF- 2 z Národního parku Šumava. Výsledek však může být zkreslen nízkým počtem zde hodnocených jedinců, který pravděpodobně nebyl dostatečně reprezentativní pro zachycení celého genofondu. Pokud se podíváme na průměrné počty alel na lokus a čísla polymorfních lokusů, nebyl nalezen žádný signifikantní rozdíl mezi oběma druhy, ale průměrné hodnoty ukazují, že je P. mugo více variabilní. Z hodnocení fixačního indexu, který je pro oba druhy kladný, vyplývá, že P. pseudopumilio má skoro dvojnásobnou hodnotu než P. mugo. Vysoká hodnota fixačního indexu ukazuje nedostatek heterozygotů v populaci v porovnání s panmiktickou populací. Jestliže je borovice lesní částečně samosprašná (LONGAUER et al. 1992, KÄRKKÄI- Tabulka 3. Genetické rozdíly mezi populacemi P. mugo pocházejícími z Krkonoš (GM) a P. pseudopumilio ze Šumavy (BF). mss průměrná velikost vzorku na lokus, mna průměrný počet alel na lokus, ppl procentické zastoupení polymorfních lokusů, H O pozorovaná heterozygotnost, H E očekávaná heterozygotnost, F Wrightův fixační index. Table 3. Genetic variation in population of P. mugo originated in the Giant Mountains (GM) and P. pseudopumilio originated in the Bohemian Forest (BF). mss = Mean sample size per locus; mna = Mean no. of alleles per locus; ppl = Percentage of loci polymorphic; H O = mean observed Heterozygosity, H E = mean expected Heterozygosity, F = Wright s Fixation index. Populace mss *mna ppl H O H E F P. mugo GM 1 39,6 2,6 81,3 0,158 0,223 0,291 GM 2 39,7 2,6 87,5 0,211 0,230 0,083 GM 3 39,6 2,4 75,0 0,196 0,251 0,219 průměrná hodnota Ø 2,53 Ø 81,27 Ø 0,188 Ø 0,235 Ø 0,198 P. pseudopumilio BF 1 44,0 2,8 93,8 0,138 0,209 0,340 BF 2 35,0 2,1 50,0 0,089 0,141 0,369 BF 3 25,0 2,3 75,0 0,135 0,183 0,262 BF 4 42,0 2,5 81,3 0,126 0,176 0,284 průměrná hodnota Ø 2,43 Ø 75,03 Ø 0,122 Ø 0,177 Ø 0,314 lokus je považován za polymorfní, pokud je detekována více než 1 alela 154

Tabulka 4. Neiovy genetické vzdálenosti mezi populacemi. Table 4. Nei s genetic distances between subpopulations surveyed. Populace GM 1 GM 2 GM 3 BF 1 BF 2 BF 3 BF 4 GM 1 GM 2 0,003 GM 3 0,009 0,013 BF 1 0,016 0,019 0,033 BF 2 0,014 0,015 0,029 0,003 BF 3 0,015 0,014 0,035 0,010 0,009 BF 4 0,014 0,016 0,033 0,007 0,005 0,008 GM - 1 GM - 2 GM - 3 BF - 1 BF - 2 BF - 4 BF - 3 0 0.010 0.020 0.030 0.040 Obr. 1. Dendrogram Neiovy genetické vzdálenosti (NEI 1972), vytvořen metodou UPGMA. Fig. 1. Dendrogram constructed on the basis of NEI S (1972) genetic distance by using UPGMA method. NEN et al. 1996), zakrslé borovice budou pravděpodobně také což může vést ke snížení genetické variability. Pro všechny subpopualce P. pseudopumilio na Šumavě jsou charakteristické ostrůvkovité habitaty šumavských vrchovišť uprostřed porostů smrku. Plocha takovýchto ostrůvků někdy nebývá větší než 3 hektary. Ztráta heterozygotnosti u P. pseudopumilio potvrzená vysokou hodnotou Wrightova fixačního indexu (Ø F=0,314) pak může být výsledkem inbrední deprese izolované populace, což dokládá učebnicový příklad genetického driftu, kterýse uplatňuje především v malých populacích. Hodnoty Neiových genetických vzdáleností mezi subpopulacemi jsou uvedeny v Tab. 4. Shluková analýza UPGMA, která je založená na Neiových nestranných genetických vzdálenostech, dokládá malé genetické vzdálenosti mezi subpopulacemi, ale relativně vysoké rozdíly mezi populacemi obou druhů. SHRNUTÍ Ačkoliv mají P. mugo s.str a P pseudopumilio velmi úzký příbuzenský vztah, naše výsledky mohou být interpretovány jako důkaz existence dvou samostatných skupin. Genetický drift trvající po mnoho let hraje důležitou roli v divergenci obou druhů zakrslých borovic, 155

jak bylo ověřeno v naší práci. Proto typický druh šumavských rašelinišť P. pseudopumilio, kříženec mezi P. mugo s.str a P. rotundata, může být považován za stabilizovaného křížence. Nicméně jak bylo předesláno v úvodu příspěvku výzkum šumavských borovic, především P. rotundata, P. sylvestris a P. mugo, bude i nadále pokračovat. LITERATURA BACZKIEWICZ A. & PRUS-GLOWACKI W., 1997: Variability of Pinus mugo Turra clones from Ostry Wierch peat bog. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 66(1): 79 82. BUSINSKÝ R., 1999: Taxonomická studie agregátu Pinus mugo a jeho hybridních populací. Acta Průhoniciana, 68: 123 144. BUSINSKÝ R. & WEGER J., 1995: Genetická analýza jedinců přirozené hybridní populace borovic (Pinus sylvestris Pinus rotundata) na rašeliništi Podkovák metodou elektroforézy izoenzymů modelová studie. Acta Průhoniciana, 62: 47 52. CHELIAK W. M. & PITEL J. A., 1984: Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes from forest tree species. Petawawa National Forestry Institute, Canada, 49 pp. CHRISTENSEN K., 1997: Taxonomie revision of the Pinus mugo complex and P. rhaetica (P. mugo P. sylvestris). Nordic Journal of Botany, 7(4): 383 408. CONKLE M. T., HODGSKISS P.D., NUNNALLY L.L. & HUNTER S.C., 1982: Starch gel electrophoresis of conifer seeds: a laboratory manual. Technical Report PSW 64. USDA Forest Service. CRITCHfiELD W.B. & LITTLE E. L.,1966: Geographic distribution of the Pinus of the world. Miscellaneous Publication. U.S. Department for Agriculture 991, Washington. FILPPULA S., SZMIDT A.E. & SAVOLAINEN O., 1992: Genetic comparison between Pinus sylvestris and Pinus mugo using isozymes and chloroplast DNA. Nordic Journal of Botany, 12: 381 386. GONCHARENKO G.G., SILIN A.E. & PADUTOV V.E., 1994: Intra- and interspecific genetic differentiation in closely related pines from Pinus subsection Sylvestres (Pinaceae) in former Soviet Union. Plant Systematics and Evolution, 194: 39 45. GONCHARENKO G.G., ZADIEKA I.V. & BIRGELIS J.J., 1995: Genetic structure, diversity and differentation of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.) in natural populations of Latvia. Forest Ecology and Management, 72: 31 38. GULLBERG U., YAZDANI R., RUDIN D. & RYMAN N., 1985: Allozyme variation in Scots pine (Pinus sylvestris L.) in Sweden. Silvae Genetica, 34: 193 208. HOLUBIČKOVÁ B., 1965: A study of the Pinus mugo Complex. Preslia, 37: 279 288. KÄRKKÄINEN K., KOSKI V. & SAVOLAINEN O., 1996: Geographical variation in the inbreeding depression of Scots pine. Evolution, 50: 111 119. KONERT M. & MAURER W., 1995: Isozymic investigation on Norway spruce (Picea abies L. Karst) and European Silver fir (Abies alba Mill.): Practical guide to separation methods and zymogram evaluation. German Federal-State methods Working Group Conservation of Forest Gene Resources, 79 pp. KORMUŤÁK A., 1990: Hybridological relationships between some pines of the subgenus Diploxylon. Biológia, 45: 907 915. LONGAUER R., ZHELEV P., PAULE L. & GÖMÖRY D., 1992: The mating system, outcrossing rate and genetic differentiation in natural Scots pine (Pinus sylvestris L.) populations from Bulgaria. Biológia, 47: 539 547. MANCHENKO G.P., 1994: A handbook of detection of enzymes on electrophoretic gels. Boston, 341 pp. NEET-SARQUEDA C., 1994: Genetic Differentiation of Pinus sylvestris L. and Pinus mugo aggr. populations in Switzerland. Silvae Genetica, 43(4): 207 215. NEI M., 1972: Genetic distance between populations. American Naturalist, 106(949): 283 292. POLITOV D. V., BELOKON M. M., MALUCHENKO O. P., BELOKON Y.S., MOLOZHNIKOV V. N., MEJNARTOWICZ L. E. & KRUTOVSKII K.V., 1999: Genetic evodence of natural hybridization between siberian stone pine, Pinus sibirica Du Tour, and dwarf siberian pine, Pinus pumila (Pall.) Regel. Forest genetics, 6(1): 41 48. POULIK M. D., 1957: Starch gel electrophoresis in a discountinous system of buffers. Nature, 180: 1477 1478. PRAVDIN L. F., 1964: Borovice lesní. Variabilita, vnitrodruhová taxonomie a šlechtění. Nauka, Moskva. PUGLISI S. & ATTOLICO M., 2000: Allozyme variation in natural populations of the italian range of Pinus sylvestris L. Forest genetics, 7(3): 221 232. RUDIN D., 1975: Inheritance of glutamate-oxalate-transaminases (GOT) from needles and endosperms of Pinus sylvestris. Hereditas, 80: 296 300. RUDIN D., 1977: Leucine-amino-peptidases (LAP) from needles and macrogametophytes of Pinus sylvestris L. inheritance of allozymes. Hereditas, 85: 219 226. 156

SCHMID J., 2000: DNA- und Isoenzym- Polymorfismem in populationen des Berg-Kieferen-Komplex, Pinus mugo s.l. Ms., PhD. thesis, Der Fakultät für Biolobie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 155 pp. SIEDLEWSKA A. & PRUS-GLOWACKI W., 1995: Genetic structure and taxonomic position of Pinus uliginosa Neumann population from Wielke orfowisko Batorowske iv Stolove Mts. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 64: 51 58. SNEATH P.H.A. & SOKAL R.R., 1973: Numerical Taxonomy: the principles an practice of numerical classification. W.H. Freeman, San Francisko, CA, 573 pp. SWOFFORD D.L. & SELANDER R.B., 1989: BIOSYS-1. A computer program for the analysis of allelic variation in population genetics and biochemical systematics. Illinois Natural History Survey, 43 pp. SOUKUPOVÁ L., KOCIÁNOVÁ M., JENÍK J. & SEKYRA J., 1995: Arctic-alpine tundra in the Krkonoše, the Sudetes. Opera Corcontica, 32: 5 88. STASKIEWICZ J., 1993: Variability of Pinus mugo Pinus sylvestris (Pinaceae) hybrid swarm in the Tisovnica Nature Reserve (Slovakia). Polish Botanical Studies, 5: 33 41. WRIGHT S., 1922: Coefficients of inbreeding and relationship. American Naturalist, 56: 330 338. posl 157