Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha - Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha - Ruzyně Vypracovaná jako výstup Výzkumného záměru VÚRV č.0002700602. (Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agro-biodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství). Autor: Ing. Václav Dvořáček, Ph.D. Leden 2006

OPTIMALIZACE OSBORNOVY METODY KVANTIFIKACE BÍLKOVINNÝCH FRAKCÍ ZRNA PŠENICE OZIMÉ (TRITICUM AESTIVUM L.) Vypracovaná jako výstup Výzkumného záměru VÚRV č.0002700602. (Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agro-biodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství). Václav Dvořáček dvoracek@vurv.vz Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2006 http://www.vurv.cz Text: 2005 V. Dvořáček Foto: 2005 M. Procházka Vydáno bez jazykové úpravy ISBN: 80-86555-81-X

Úvod K charakterizaci skladby bílkovin u zrnin existuje celá škála přístupů, které je možno charakterizovat na několika metodicky odlišných a zároveň doplňujících se úrovních: 1. Na základě morfologické struktury (proteinová tělíska, cytoplazmatické proteiny). 2. Pomocí reologických metod (např. podíl a vlastnosti lepku, farinografická hodnocení). 3. Hodnocení frakcionace proteinů zrna z pohledu odlišné rozpustnosti (albuminy, globuliny, prolaminy, gluteliny). 4. Metody elektroforetické a chromatografické (peptidická skladba bílkovinného komplexu). 5. Metody založené na hydrolýze bílkovin (aminokyselinové složení). 6. Kjeldahlova mineralizační metoda (obsah dusíkatých látek). K jedné z nejdéle používaných metod charakterizace bílkovin patří frakcionace bílkovin uvedená v bodě 3. Metoda je založená na postupné separaci bílkovin dle jejich odlišné rozpustnosti navržené Osbornem na začátku minulého století. Albuminy a globuliny jsou extrahovány především slabými vodnými roztoky chloridu sodného. Prolaminy, (v případě pšenice nazývané gliadiny), jsou po odmytí předchozí frakce získány extrakcí ve vodných roztocích alkoholů - nejčastěji etanolu. Gluteliny, (u pšenice nazývané gluteniny), bývají velmi často extrahovány slabými zásadami nebo kyselinami. Nejčastěji publikované vzájemné procentické poměry mezi albuminy-globuliny, gliadiny a gluteniny u pšenice seté jsou v rozmezích 20-25(alb-glo):40-50(gli):35-40(glu) (KRÁLOVÁ 1991; PELIKÁN, LIŠKA 1978; PRUGAR, HRAŠKA 1986; BOJŇANSKÁ 1993). Odlišné rozpustnosti bílkovin využívá řada dalších, např. elektroforetických technik. Znalost poměru těchto složek a jejich specifického složení má obrovský význam jak pro nutriční, tak v případě pšenice ozimé i pro technologickou kvalitu. Nicméně celá řada studií na základě elektroforetické vizualizace těchto frakcí dokazuje, že přechody v rozpustnosti mezi jednotlivými frakcemi nejsou ostré, prolínají se a jsou závislé na extrakčním činidle, jeho teplotě a době extrakce (ŠAŠEK, ČERNÝ 1977; BYERS et al. 1983; MARTINI, KUHN 1999). Velmi často je prokazován přechod těžké frakce HMW(vysokomolekulárních) gluteninů do spektra gliadinů a rovněž překrývání lehčího gluteninového spektra LMW (nízkomolekulárních) s α, β a γ gliadiny v prostředí SDS PAGE (ABDEL AAL et al. 1996). MOSSE a BAUDET (1963) prokázali, že při teplotě 22 C přešlo do první frakce až 50 proteinu zrna. Z toho vyplývá, že poměrně značná část dalších frakcí bílkovin jsou za podmínek vyšší teploty rozpustné i ve vodném roztoku chloridu sodného. Velmi často nacházíme v řadě studií o kvantifikacích bílkovinných frakcí určité metodické odchylky, které však mohou mít zásadní význam pro jejich konečné stanovení a především pro jejich vzájemný poměr. Cílem bylo optimalizovat metodiku Osbornovy frakcionace proteinů pšeničného zrna pro rutinní hodnocení širšího sortimentu u kolekcí pšenice seté v Genové bance. Metodický přístup byl rozdělen do tří samostatných částí (I-III) tak, aby bylo možno posoudit vliv navážky, koncentrace použitých rozpouštědel (I) a externích faktorů (teplota, hrubost mletí a času extrakce) (II a III.) na kvantitativní změny jednotlivých bílkovinných frakcí u pšenice ozimé. Část I Vliv velikosti navážky a koncentrace extrakčních činidel Na základě literárních pramenů byly zvoleny dva často používané typy koncentrací extrakčních roztoků pro gliadiny (60, resp. 70 etanol) a pro gluteniny (0,02M NaOH a 0,1M NaOH) a 2 navážky vzorku (0,5 a 1 g) při jinak obdobném dodržení Osbornova postupu 1

frakcionace (KRÁLOVÁ 1991). Vzorky byly standardně semlety na mlýnku Cyklotec hrubost 0,8mm a vpraveny ve 3 opakováních do 15 ml centrifugačních zkumavek. Albumino-globulinová frakce byla extrahována po dobu 8 h při teplotě 4 C přidáním 5 ml 0,5M NaCl a poté 15 minut centrifugována při 6500 otáčkách. Následovala dvě promytí stejnými objemy téhož extrakčního činidla a 5 minutová centrifugace při stejných otáčkách. Spojené supernatanty byly převedeny do nové zkumavky a na krátkou dobu uskladněny v lednici. Gliadiny byly získány 4 hodinovou extrakcí 60, resp. 70 etanolem za laboratorní teploty, při stejném postupu extrakce, promytí a centrifugace jako v předešlém případě. Gluteniny byly extrahovány 0,02M NaOH, resp. 0,1M NaOH při teplotě 4 C po dobu 4 hodin. Postup extrakce, promytí a centrifugace byl obdobný jako u gliadinů. Spojené supernatanty byly převedeny do nové zkumavky a na krátkou dobu uskladněny v lednici. Stanovení obsahu dusíku v získaných frakcích bylo provedeno na přístroji Kjeltec 2300 uzanční Kjeldahlovou metodou a následným přepočtem pomocí faktoru 5,7 na procento celkové bílkoviny v sušině vzorku (ČSN 560512-12). Získané výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulkách 1 a 2. Velikost navážky (0,5 g, resp. 1g) neměla statisticky významný vliv na obsah prvních dvou hodnocených frakcí (albuminy-globuliny a gliadiny). Rozdíly se pohybovaly na úrovni chyby měření přístroje Kjeltec 2300. V případě obsahu třetí frakce - gluteninů již byly zaznamenány určité výraznější diference, kdy při nižší navážce byla zjištěna její vyšší extrahovatelnost (viz tab.1). Tuto skutečnost je možno vysvětlit tak, že v případě vyšší navážky a při použití uvedených typů centrifugačních zkumavek pravděpodobně dochází v daném sloupci k většímu utužení vzorku. Toto utužení se zřejmě nejvíce projeví právě u třetí separované frakce a je umocněno dvěma předcházejícími cykly trojnásobné centrifugace nezbytnými pro separace předchozích frakcí. U vzorku s nižší navážkou tak při aplikaci extrakčního roztoku dojde k lepšímu styku mezi rozpouštědlem a vzorkem a tedy i k jeho vyšší extrahovatelnosti. Při použití 70 etanolu byl sice zjištěn v průměru o něco vyšší obsah extrahovaných gliadinů, avšak z pohledu dílčích měření a deklarované chyby měření nebyl tento rozdíl významný (tab. 2). Obdobná situace byla i v případě gluteninů a zjištěné rozdíly v obsahu gluteninů použitím odlišných koncentrací NaOH nebyly statisticky průkazné (tab. 2). Tab. 1 Frakcionace bílkovin u dvou odlišných navážek u pšenice seté (odrůda - Ebi) Navážka 1g Navážka 0,5g Opakování Albuminy+globuliny Gliadiny * Gluteniny ** Albuminy+globuliny Gliadiny * Gluteniny ** 1 2,30 2,93 2,00 2,24 2,78 2,97 2 2,03 3,20 2,48 2,21 3,10 2,60 3 2,17 3,14 2,24 2,21 2,85 2,60 Průměr ± sm. odchylka 2,17±0,14 3,09±0,14 2,24±0,24 2,22±0,02 2,91±0,17 2,72±0,21 *Použit 70 ethanol; **použit 0,02M NaOH Tab. 2 Separace gliadinů (etanolová frakce) a gluteninů (frakce NaOH) při odlišných koncentracích rozpouštědel (pšenice setá - Ebi) Navážka 0,5g Opakování Etanol (60) Etanol (70) NaOH 0,02M NaOH 0,1M 1 2,78 2,93 3,09 2,99 2 3,10 3,20 3,22 2,97 3 2,85 3,01 2,73 3,51 Průměr ± sm. odchylka 2,91±0,17 3,05±0,14 3,01±0,25 3,16±0,31 2

Z uvedených výsledků tak vyplývá významný vliv navážky vzorku na obsah gluteninové frakce. Lze konstatovat, že velikost navážky podstatným způsobem ovlivňuje především vzájemné poměry mezi oběma zásobními frakcemi bílkovin (gliadinů a gluteninů). Naopak rozdíly v koncentracích rozpouštědel vlastní extraktivnost bílkovinných frakcí významně neovlivnily. Část II Vliv podmínek extrakce a velikosti částic šrotu Metodické uspořádání vycházelo z poznatků získaných v části I, tzn. především použití nižší navážky vzorku, a bylo zaměřeno na zjištění vlivu doby extrakce, extrakční teploty a velkosti částic (hrubosti) šrotu na výsledný obsah sledovaných bílkovinných frakcí. Ve třech opakováních byly připraveny 3 typy šrotů pšenice seté odrůdy Samanta o velikosti částic: ; 0,8mm; a 0,15mm (homogenní frakce získaná prosevem). Z těchto velikostních skupin šrotů byly ve dvou teplotních (4 C a laboratorní teplota) a třech časových režimech (15 min; 4h; 8h) extrahovány výše uvedeným způsobem tři bílkovinné frakce (albuminy-globuliny: 0,5M NaCl; gliadiny 60 ethanol; gluteniny: 0,02M NaOH). Stanovení obsahu dusíku v získaných frakcích bylo provedeno na přístroji Kjeltec 2300 uzanční Kjeldahlovou metodou a následným přepočtem pomocí faktoru 5,7 na procento celkové bílkoviny v sušině vzorku (ČSN 560512-12). Výsledky statistického hodnocení vlivu sledovaných faktorů na obsah bílkovinných frakcí jsou uvedeny v tabulce 3. Bylo zjištěno, že doba extrakce měla statisticky průkazný vliv na extraktivnost všech sledovaných frakcí bílkovin. Velikost částic (hrubost) vzorku měla statisticky průkazný vliv na obsah albuminů-globulinů a gliadinů. Teplota extrakce hrála významnou roli v případě extrahovatelnosti obou frakcí zásobních bílkovin, gliadinů a gluteninů. S ohledem na tuto statistiku je nutno poznamenat, že průkaznost vlivu hrubosti (homogenity) vzorku byla způsobena odlišnějšími hodnotami třetí - prosevem získané velikostní frakce šrotu (viz. dále). Statistická průkaznost některých interakcí jednotlivých faktorů byla potvrzena pouze u albumino-globulinové frakce (tab. 3). Konkrétní případy jsou zachyceny na grafech 1-3. Z grafu 1 vyplývá, že významný nárůst extraktivnosti frakce albuminů a globulinů v čase byl způsoben extrahováním za laboratorní teploty. Při teplotě 4 C se hodnoty obsahu albuminů a globulinů u šrotů o velikosti 1 a 0,8mm prolínaly. Hlavním důvodem vysoké statistické průkaznosti vlivu hrubosti šrotu byl nižší obsah bílkovin ve šrotu s velikostí částic 0,15mm. Nižší hodnoty obsahu albuminů a globulinů u této frakce lze nejpravděpodobněji vysvětlit jako důsledek jednostranné separace měkčího a tedy jemněji rozdrceného škrobového endospermu od tvrdších partií obalových vrstev zrna bohatších na albumino-globulinovou frakci. Pro reprezentativnější stanovení obsahu frakce albuminů a globulinů je tak především vhodnější použít nízkou teplotu extrakce, v jejímž důsledku se snižuje variabilita ostatních sledovaných faktorů, tzn. doby trvání extrakce a homogenity vzorku. Z grafu č. 2, popisujícího změny v obsahu gliadinové frakce, je zřejmé, že největší podíl na kvantitativních změnách měla doba extrakce, kdy při 15 min. extrakci se hodnoty obsahu gliadinů na celkovou sušinu vzorku pohybovaly kolem 3,25, resp. při 8 hodinové extrakci vykazovaly hodnoty přes 5, což představovalo nárůst o více než 50. Vyšší laboratorní teplota rovněž významně ovlivňovala nárůst obsahu frakce gliadinů. Je zde možno rovněž vypozorovat postupně se zvyšující extraktivnost jemnějších frakcí v závislosti na čase. Vysoké obsahy gliadinů ve velikostní frakci 0,15mm potvrzují výše uvedený předpoklad separace částí zrna s vyšším obsahem bílkovin endospermu, tzn. zásobních frakcí bílkovin. Pro porovnatelnost výsledků stanovení obsahu gliadinů mezi jednotlivými laboratořemi je především nutno ujednotit dobu trvání extrakce. 3

Extrahovatelnost gluteninů byla v rámci opakování nejvíce variabilní a přesné stanovení obsahu této bílkovinné frakce je ve srovnání s oběma předešlými nejkomplikovanější (graf 3). Jak již bylo výše uvedeno, extraktivnost gluteninů byla statisticky průkazně nejvíce ovlivňována dobou trvání a teplotou extrakce. Při teplotě 4 C byl zaznamenán mnohem pomalejší nárůst obsahu této frakce v porovnání s extrakcí za laboratorní teploty, kdy byl obsah této frakce v průměru o 1 vyšší. Časový průběh extrakce byl v obou teplotních režimech obdobný s tím, že kategorie nejjemnějšího šrotu vykazovala největší variabilitu v obsahu gluteninů za jednotlivé extrakční časy. Platí zde obdobné zjištění jako u gliadinů, tzn. že partie šrotu s jemnějšími částicemi je nutno extrahovat po delší dobu. Tab. 3. Statistická průkaznost vlivu sledovaných faktorů na extraktivnost bílkovinných frakcí (ANOVA) Albuminy-globuliny Gliadiny Gluteniny Faktor-frakce F p F p F p Doba extrakce 18,22 0,000 304,74 0,000 19,86 0,000 Hrubost 61,60 0,000 9,50 0,001 1,87 0,168 Teplota 1,45 0,237 19,61 0,000 56,68 0,000 Doba extrakce x Hrubost 0,96 0,439 23,05 0,000 10,95 0,000 Doba extrakce x Teplota 11,61 0,000 0,78 0,467 1,61 0,215 Hrubost x Teplota 7,59 0,002 1,02 0,372 1,32 0,280 Doba extrakce x Hrubost x Teplota 2,07 0,106 2,17 0,092 1,91 0,130 4

Graf 1 Graf 2 Extraktivnost albuminů a globulinů v závislosti na hrubosti mletí, čase a teplotě albuminy a globuliny 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 hrubost Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti 0,8mm teplota: 4 C 0,15mm hrubost 0,8mm teplota: laboratorní 0,15mm čas 15min čas 4h čas 8h gliadiny Extraktivnost gliadinů v závislosti na hrubosti mletí, čase a teplotě 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Vertikální sloupce označují 0,95 interv aly spolehliv os ti 0,5 hrubost: 0,8mm teplota: 4 C 0,15m m hrubost: 0,8mm teplota: Laboratorní 0,15m m čas 15min čas 4h čas 8h Graf 3 gluteniny Extraktivnost gluteni nů v závi slosti na hrubosti mletí, čase a teplotě 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Vert ikální sloupce označují 0,95 interv aly spolehliv osti 0,5 hrubost: 0,8m m teplota: 4 C 0,15mm hrubost: 0,8m m teplota: Laboratorní 0,15mm čas 15min čas 4h čas 8h 5

Část III Vliv vícestupňové extrakce na obsah bílkovinných frakcí Jako testovací materiál byla použita pšenice setá, odrůda Samanta. Změny obsahu bílkovinných frakcí byly sledovány i v závislosti na jednotlivých fázích jejich separace, tzn. byly stanoveny obsahy frakcí získané v průběhu prvního, druhého a třetího promytí vzorku. Byla použita metoda extrakce jednotlivých frakcí jako v části I. a II., navážka 0,5 g a 3 kategorie homogenity šrotu (viz část II), v případě frakce částic 0,8 mm s rozšířením o její filtraci před vlastním stanovením obsahu dusíku. K filtraci byl použit filtrační nástavec s póry 0,45µm. Stanovení obsahu dusíku v získaných frakcích bylo provedeno na přístroji Kjeltec 2300 uzanční Kjeldahlovou metodou a následným přepočtem pomocí faktoru 5,7 na procento celkové bílkoviny v sušině vzorku (ČSN 560512-12). Získané výsledky jsou uvedeny v grafu 4. Bylo zjištěno, že u albuminů-globulinů a gliadinů se postupným promýváním hodnoty jejich obsahu významně snižovaly (3. promytí v rozmezí 0,2-0,4), u gluteninů naopak významně rostly, a to v případě třetího promytí až přes hodnotu 1,8 (viz. graf 4). Gluteniny se tak extrahovaly mnohem pozvolněji a důležitost několikanásobného promytí vzorku (vícestupňové extrakce) se zdá být v jejich případě klíčová. Provedená filtrace extraktu před vlastním stanovením obsahu dusíku neovlivnila obsah albumino-globulinové a gliadinové frakce a hypotéza průkazného snížení jejich obsahu se nepotvrdila. Obsah drobných nerozpuštěných částic supernatantu pronikajících v průběhu každého přepipetovávání roztoku po centrifugaci do nové zkumavky je tak u těchto dvou frakcí nevýznamný (viz. tab. 4.). V případě gluteninů však bylo zaznamenáno ve filtrátu výrazné snížení jejich obsahu oproti nefiltrované kontrole. Bohužel při následných filtracích gluteninové frakce docházelo k silnému zanášení a ucpávání nástavcového filtru, a filtrace tak u gluteninů proběhla pouze v prvním stupni extrakce. Na základě aplikace filtru lze předpokládat, že zjištěná vyšší variabilita obsahu gluteninové frakce v rámci opakování u identických vzorků, jakož i jeho překvapivý nárůst v závislosti na stupni extrakce je důsledkem vyplavování drobných částic supernatantu s již nezanedbatelným podílem obsahu vázaných bílkovin. Tab. 4. Celkový součet bílkovinných frakcí u 3. stupňového promývání a celková suma vyextrahované bílkoviny u jednotlivých kategorií šrotu Hrubost Albuminy+globuliny Gliadiny Gluteniny Suma * ** 3,18 3,97 3,45 10,60 0,8mm 3,27 4,20 3,33 10,80 0,8mm+filtrace 3,06 4,32 2,73 10,11 0,15mm 2,57 4,13 2,39 9,09 *extrakce 4h v 60 ethanolu lab. teplota; **extrakce 4h v 0,02M NaOH- 4 C 6

Graf 4 4,0 3,5 Obsahy bílkovinných frakcí po opakovaném promývání (pšenice setá - Samanta) Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti 3,0 2,5 protein 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 frakce: ALB GLI GLU opakování: 1. promytí frakce: ALB GLI GLU opakování: 2. promytí frakce: ALB GLI GLU opakování: 3. prom ytí hrubost hrubost 0,8mm hrubost(f) 0,8mm hrubost 0,15mm Část IV. Optimalizovaná metodika Podmínky optimálního postupu frakcionace zásobních proteinů pšeničného zrna jsou přehledně uvedeny v tabulce 5. Na základě provedených studií lze formulovat obecnější souhrn: 1. Extraktivnost albuminů a globulinů byla z pohledu vnějších faktorů nejvíce konzervativní a v případě obou velikostních tříd (neprosetých) šrotů byl vliv teploty a extrakčního času na celkovou extraktivnost zanedbatelný. Lze tak především ve srovnání s Osbornovou metodou při teplotě 4 C zkrátit dobu extrakce vzorků na 15 min. 2. Extraktivnost gliadinů byla nejsilněji ze všech bílkovinných frakcí podmíněna dobou extrakce. Byl zjištěn významný trend zvyšující se extraktivnosti u jemnějších šrotů v průběhu času. Striktní dodržování extrakčního času navrženého Osbornem na 4 hodiny se tak jeví jako nezbytné. 3. Gluteniny byly nejvariabilnější frakcí, a to jak z pohledu opakování, tak vlivu velikosti částic šrotu, především v závislosti na době trvání extrakce. S rostoucí dobou extrakce lze pozorovat zvyšující se trend extraktivnosti této frakce u jemnějších šrotů, podobně jako u gliadinů. Problém pro přesné stanovení jejich obsahu představuje především jejich postupná pomalá extrakce. Důvody je možno hledat i v určitém rozrušení zbytkového bílkovinného komplexu několikerým působením předešlých extrakčních roztoků, včetně působení roztoku NaOH. V něm se pak především v průběhu druhých a třetích promyvů koncentruje nejen rozpuštěný protein, ale i velký podíl velmi jemných nerozpuštěných a obtížně sedimentujících částeček s významným podílem proteinu. Z tohoto důvodu by pro přesné získání této třetí frakce byla zřejmě vhodná vyšší centrifugační rychlost a 7

několikastupňová filtrace, která by vyřešila jednak přechod nerozpuštěných částic do roztoku, a jednak ucpávání jednostupňového filtru. 4. Pro rychlý plošný screening obsahu bílkovinných frakcí v kolekcích Genové banky lze především doporučit stanovení obsahu frakcí albuminů-globulinů a gliadinů, jejichž diference nepřekračovaly u identických vzorků deklarovanou chybu analytického přístroje. Pro kvantifikaci obsahu gluteninů (tzv. celkových gluteninů) lze pak doporučit jednoduchý numerický dopočet z rozdílu hrubých bílkovin a prvních dvou bílkovinných frakcí. Souhrnné schéma metodické optimalizace frakcionace bílkovin je zobrazeno v tabulce č. 5. Centrifugace Tab. 5 Optimalizovaná Osbornova metoda frakcionace bílkovin Následné extrakce Navážka a Extrakční roztok Teplota Doba extrakce velikost částic extrakce Albuminy globuliny 5ml 0,5M NaCl 4 C 15min.+ 2 promyvy -5 min. Gliadiny 0,5g / max.0,8mm 4h.+ 2 promyvy - 5ml 60 ethanol 20 C 5 min. Celk.gluteniny Stanovit dopočtem 6500 ot.min-1 6500 ot.min -1 Literatura BOJŇANSKÁ, T. (1993): Zmeny obsahu bielkovinných frakcií roznych odrod ozimej pšenice v závislosti od hnojenia. Rostlinná Výroba 39 (8), 701-711. BYERS, M., MIFLIN, B. J., SMITH, S. J. (1983): A quantitative comparison of the extraction of protein fractions from wheat grain by different solvents, and of the polypeptide and amino acid composition of the alcohol-soluble proteins. J. Sci. Food Agric. 30, 447-462. KRÁLOVÁ, M. (1991): Vybrané metody chemické analýzy půd a rostlin. - Studie ČSAV, č. 12, Academia, Praha, s. 152. MARTINI, A., KUHN, M. (1999): Einfluss der Stickstoffdüngung auf die Zusammensetzung und die Eigenschaften von Dinkelproteinen. Getreide Mehl und Brot 53, 282-290. PELIKÁN, M., LIŠKA, I. (1978): Změny v obsahu bílkovinných frakcí a aminokyselin během dozrávání pšeničného zrna. Rostlinná výroba, 24 (8), 841-846. PRUGAR, J., HRAŠKA, Š. (1986): Kvalita pšenice. Príroda, Bratislava, s. 210. ŠAŠEK, A., ČERNÝ, J. (1977): Biochemická a genetická charakteristika bílkovin pšeničného zrna. Studijní informace, ÚVIZ, 2, s. 63. Poděkování Děkuji Mgr. Světlaně Sýkorové, CSc. za odbornou pomoc při zpracování tohoto textu. 8