STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

Transkript

1 STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM ANTIOXIDAČNÍ KAPACITA RŮZNÝCH DRUHŮ MASA (drůbeží, rybí) Princip metodiky: Analyzátor Photochem je určen pro stanovení antioxidační kapacity vybraných komodit rostlinného i živočišného původu a krevní plasmy. Analýza je založená na fotochemiluminescenci, která je využita pro stanovení antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných ve vodě (ACW) a antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných v tucích (ACL) a umožňuje kvantifikaci antioxidačního stavu. Princip měření je založen na produkci volných radikálů optickou excitací fotosensitivního roztoku (je součástí setu pro analýzu). Tyto radikály jsou částečně eliminovány reakcí s antioxidanty ve vzorku. Zbylé radikály vyvolávají luminiscenci, která je detekována detektorem a využita pro stanovení antioxidační kapacity vzorku. Výsledky jsou kvantifikovány srovnáním s kalibrační křivkou a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu (využitého ke kalibraci) a to Troloxu (analog vitaminu E) pro ACL antioxidanty a jako ekvivalenty kyseliny askorbové pro ACW antioxidanty. Výsledky jsou vyhodnoceny softwarem PCLSoft a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu v nmol/l, případně v μmol/l spolu s relativní směrodatnou odchylkou (RSD) vyjádřenou v procentech. STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH VE VODĚ (ACW) Složení setu pro stanovení ACW: - Činidlo R1 diluent (sample solvent, ředidlo) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R2 reaction buffer (pufr) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R3 fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC 1

2 - Činidlo R4 standard kyselina askorbová - uchováván při -20 ºC Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo. Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. - příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1 - příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů kyseliny askorbové v rozmezí 0,2 2,5 nmol (to je 2 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární regrese. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Pro stanovení antioxidační kapacity vzorků mase je možné využít různé matrice (maso hovězí, vepřové, kuřecí, nebo rybí). Nevýhodou hovězího a vepřového masa je vyšší podíl šlach, které někdy komplikují homogenizaci vzorku. Nejvhodnější matricí se jeví jako maso kuřecí, která ale rychleji podléhá procesu kažení a s tím souvisejícím úbytkem antioxidantů. Maso rybí je vhodnou matricí, ale je nutné zde počítat s vyšším obsahem tuku. U rybího masa je vhodné odebírat svalovinu z boku, jako filet, bez kostí a tu potom použít pro homogenizaci. Vzorky je nutné zhomogenizovat na homogenizátoru s deionizovanou vodou (nejčastěji v poměru 1:3). Homogenát se odstřeďuje 4000ot/20 min. Odebere se supernatant, 2

3 který se dále používá pro vlastní analýzu. Je možné supernatant používat neředěný, nebo dle potřeby naředit 10-50x. (Pro oddělení lipidové fáze se nejčastěji využívá chloroform, který se následně odpaří a získá se vodní fáze). Dále pokračujte dle tabulky: Činidlo [ml] R1 R2 R3 R5 Vzorek Slepý vzorek 1,5 1 0, Kalibrace 1,5-X 1 0,025 X (0,002-0,025) Měření 1,5-Y 1 0,025 0 Y 0 VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R 2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků extraktů masa vyjádřeny jako ekvivalenty kyseliny askorbové v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 2-3x a slepý do ustálení přístroje. STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH V TUCÍCH (ACL) Složení setu pro stanovení ACL: - Činidlo R1 diluent (sample solvent, ředidlo) METHANOL - Činidlo R2 reaction buffer (pufr) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R3 fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC - Činidlo R4 standard Trolox = ve vodě rozpustný analog vitaminu E - uchováván při -20 ºC 3

4 Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo. Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. - příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1 - příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů Troloxu v rozmezí 0,2 2,5 nmol (to je 2 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární regrese. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Pro stanovení antioxidační kapacity vzorků mase je možné využít různé matrice (maso hovězí, vepřové, kuřecí, nebo rybí). Nevýhodou hovězího a vepřového masa je vyšší podíl šlach, které někdy komplikují homogenizaci vzorku. Nejvhodnější matricí se jeví jako maso kuřecí, která ale rychleji podléhá procesu kažení a s tím souvisejícím úbytkem antioxidantů. Maso rybí je vhodnou matricí, ale je nutné zde počítat s vyšším obsahem tuku. U rybího masa je vhodné odebírat svalovinu z boku, jako filet, bez kostí a tu potom použít pro homogenizaci. Pro stanovení antioxidační kapacity ACL jsou vzorky extrahovány spolu s organickým rozpouštědlem. Po odpaření rozpouštědla je vhodné vzorek zamrazit dusíkem (pod tlakem), aby nedocházelo ke ztrátám antioxidantů (tento způsob úchovy je možné využít i pro vzorky 4

5 ke stanovení antioxidační kapacity ACW). Lipidový extrakt ze svaloviny (cca 11 mg) je následně rozpuštěn v 1 ml methanolu a 0,4 ml n-hexanu (extrakt z lososa je v množství cca 100 mg rozpuštěn v 1 ml n-hexanu). Dále pokračujte dle tabulky: Činidlo [ml] R1 R2 R3 R5 Vzorek Slepý vzorek 2,3 0,2 0, Kalibrace 2,3-X 0,2 0,025 X (0,002-0,025) Měření 2,3-Y 0,2 0,025 0 Y 0 VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R 2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků extraktů masa vyjádřeny jako ekvivalenty Troloxu v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 2-3x a slepý do ustálení přístroje. 5

6 Obr. 1. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACW antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E). Obr. 2. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACL antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E). 6

7 Obr. 3. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) kyseliny askorbové, stanovení ACW. Obr. 4. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) Troloxu, stanovení ACL. 7