ANNUUS L.) BEE POLLEN

MORPHOLOGIC AND SPECTROSCOPIC ANALYSIS OF SUNFLOWER (HELIANTHUS ANNUUS L. BEE POLLEN Andriy Synytsya, Alla Synytsya, Roman Bleha, Ján Brindza, Radovan Ostrovský, Jana Čopíková, Janka Nôžková ABSTRACT The aim of this work was morphologic and spectroscopic analysis of bee pollen samples originated from sunflower (Helianthus annuus L.. Difference in composition of monofloral sunflower bee pollen in comparison with original flower pollen was detected by FTIR, FT NIR and Raman spectra. Difference in colour was determined by diffuse reflectance VIS spectroscopy and by calculation of colour parameters. Obtained results confirmed that vibration spectroscopic methods are sensitive to sample composition. Fructose detected by FTIR and Raman in bee pollen samples is originated from sunflower nectar. Raman and Vis spectra confirmed the presence of specific carotenoids reflecting botanical origin of the raw flower pollen. Well resolved clusters of flower pollen and bee pollen samples were evident from the CIE L * a * b * colour diagram. Keywords: sunflower (Helianthus annuus L., flower and bee pollen, vibration spectroscopy, diffuse reflectance VIS spectroscopy, colour estimation ÚVOD Slunečnice roční (Helianthus annuus L. rod Helianthus, čeleď Asteraceae patří mezi nejvýznamnější olejniny. V současnosti se pěstuje po celém světe. Největší světové pěstovatele jsou Ruská federace, Ukrajina, Argentina a Francie. Slunečnicové soukvětí poskytuje nejen nektar ale rovněž dostatečné množství květového pylu. Vear et al. (1990 při studiu hybridů určili průměrný počet pylových zrn z jednoho soukvětí v rozsahu 26 387 42 087 pylových zrn.vzhledem k tomu že opylováni květů zabezpečuji včely, je i vhodným zdrojem včelího obnožkového pylu (Seiler, 1997. Obnožkový (včelí pyl se skládá ze směsi květového pylu s nektarem a včelími výměšky (Qian et al., 2008; Almeida-Muradian et al., 2005; Silva et al., 2006. Tento včelařský produkt je zdrojem volných aminokyselin a bílkovin, tuků a mastných kyselin, jednoduchých cukrů a polysacharidů, řady antioxidačních látek, zejména kyseliny askorbové, karotenoidů a flavonoidů (Qian et al., 2008; Almeida- Muradian et al., 2005; Gonzalez-Martín et al., 2007; Gonzales-Paramas et al., 2006; Silva et al., 2006; Tomas-Lorente et al., 1992; Ohta et al., 2007; Di Paola-Naranjo et al., 2004. Vibrační spektroskopické metody jsou běžně používané ke strukturní analýze biologického materiálu, nevyžadují zvláštní přípravu vzorků a vylučují faktory vedoucí ke zkreslení výsledků (chemická a termální degradace, vymizení složek během přípravy a extrakce a pod.. FTIR a Ramanova spektroskopie poskytují informace o chemickém složení květových pylů a je užitečná při jejich strukturní analýze a identifikaci (Ivleva et al., 2005; Gottardini et al., 2007; Pappas et al., 2003. Slunečnicový květový pyl má výrazné žluto-oranžové zbarvení díky přítomnosti karotenoidů. Tyto látky mají biologický význam, zejména antioxidační aktivitu. Karotenoidy z různých zdrojů mají červeno-žluté, oranžové až červené zbarvení. Barvu pylové hmoty lze stanovit na základě reflektančních spekter ve viditelné oblasti (obvykle 380 770 nm. Reflexní spektrofotometry slouží k rutinnímu měření barvy a poskytují výsledky blízké vizuálnímu vjemu. Při reflexním měření se zjišťuje poměr odraženého monochromatického světla ke světlu dopadajícímu; následujícím krokem je transformace naměřených spekter do systému barevnosti CIE L * a * b *. Tato práce je věnovaná analýze souborů květových a obnožkových včelích pylů ze slunečnice roční (Helianthus annuus L. pomocí vibračních spektroskopických metod a spektroskopického stanovení barvy. Obrázek 1 Variabilita tvaru a zbarvení vybraných včelích pylových obnožek slunečnice roční (Helianthus annuus L. znázorněna pomocí plnoautomatické makrolupy Zeiss Discovery V12. Foto: Alexej Oravec 2009 MATERIÁL A METODY Vzorky květového (KP a obnožkového včelího (VP pylu ze slunečnice roční (Helianthus annuus L. byly získané z různých lokalit Slovenské republiky. Morfometrická analýza včelích pylových obnožek byla provedena na 6 vybraných hybridech. V pokusech byly použity 94 100 náhodně vybraných obnožek z každého hybrida. Hmotnost obnožek (mg byla určena pomoci analytických vah. Výška (mm, šírka (mm a plocha obnožek (mm 2 byly naměřeny pomoci automatické makrolupy Zeiss Discovery V12 s digitálních obrazových ročník 5 308 mimoriadne číslo, február/2011

Obrázek 2 SEM obrazy (zvětšeni 78, 321, 1410 a 4250 včelí pylové obnožky a jednotlivých pylových zrn slunečnice roční (Helianthus annuus L. záznamů obnožek a použitím softwaru pro obrazovou analýzu Zeiss AxioVision 4.7.1 (modul Automatic Measurement. Pravost pylových zrn na obnožkách byla určena pomoci elektronového mikroskopu ZEISS EVO LS 15. FTIR spektra vzorků pylů byla změřena na FT-IR spektrometru Nicolet 6700 (Thermo Scientific, USA v KBr tabletě v rozsahu vlnočtů 400 4000 cm -1 (střední IČ oblast MIR a 400 4000 cm -1 (blízká IČ oblast NIR s rozlišením 2 cm -1 ; počet skenů byl 64 (MIR a 100 (NIR. Měření FT Ramanovych spekter v rozsahu 150 4000 cm -1 bylo provedeno pomocí FT Raman spektrometru Equinox 55/S (Bruker, USA vybaveným křemenným děličem světla a Ge detektorem chlazeným tekutým N2. Byl použit Nd:YAG laser emitující záření při λ = 1064 nm a výkonem 250 mw. Pro každý vzorek bylo použito průměrné spektrum z 1054 skenů změřený ve skleněné lahvičce při 25 C s rozlišením 4.0 cm -1. Difúzně reflektanční Vis spektra (% R byla naměřena na UV-Vis spectrofotometru UV4 (UNICAM, Velká Británie, nástavec Labsphere pro měření reflexních spekter. Rozsah měření 380 800 nm, šířka štěrbiny 4 nm, rychlost skenování 240 nm min -1, datový interval 2 nm, počet skenů 10. Všechna spektra byla exportována do tabulkového formátu pro další zpracování pomocí softwarů Origin 6.0 (Microcal Origin, USA a Excel 2003 (Microsoft, USA. Spektra byla vyhlazena pomocí FFT filtru, 5 10 bodů; Vis spektra byla převedena do jednotek log(1/r. Spektra v jednotkách absorbance nebo log(1/r byla normalizována podél osy Y v rozsahu 0 až 1. Sety upravených spekter v tabulkovém formátu byla exportována do softwaru Statistica 9.0 (Statsoft, USA, kde byly vypočteny hodnoty popisné statistiky a provedena vícerozměrová statistická analýza. VÝSLEDKY A DISKUZE Na obrázku č. 1 jsou zřejmé rozdíly ve tvaru a zbarvení jednotlivých včelích pylových obnožek. V tabulce č. 1 jsou uvedeny výsledky statistické analýzy jejich plochy, šířky a výšky. Koeficient variability v (% se určil střední stupeň variability znaku pro plochu a střední až vysoký stupeň variability znaku pro šířku a výšku. Výsledky potvrzují významnou variabilitu těchto parametrů nejen mezi druhy, ale rovněž v rámci druhů. Na obrázku č. 2 je vidět jak jsou pylová zrna uspořádána v obnožce a znázorněna jejích ročník 5 309 mimoriadne číslo, február/2011

916 707 963 868 821 630 1263 1075 519 421 1655 1454 1443 1192 1130 1005 Intenzita 1604 1156 1527 0,005 0,004 květový pyl včelí pyl rozdíl 0,003 0,002 0,001 0,000 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Vlnočet (cm -1 Obrázek 3 Ramanova spektra vzorků květového a včelího pylu ze slunečnici roční (Helianthus annuus L. morfologie. Je zřetelná směs pylových zrn slunečnice roční stmelená nektarem a včelími výměšky. Na obrázku jsou zobrazené shluky pylových zrn a detail jednoho pylového zrna. Na základě morfologických znaků slunečnicového pylu lze určovat stupeň homogenity včelích pylových obnožek. FT Ramanova spektra slunečnicového KP a VP v rozsahu 250 1800 cm -1 jsou uvedena na obrázku č. 3. Nejintensivněji Ramanovy pásy odpovídají skeletovým vibracím aromatických a alifatických složek pylů. Pásy kolem 1655 a 1602 cm -1 mohou být příspěvkem ν(c=o bílkovin a ν(c=c polyfenolů. Píky při 1005, 1156 a 1526 cm -1 odpovídají vibracím C-CH 3, CC a C=C vazeb β-karotenů (Schulz et al., 2005. První pík má navíc výrazný příspěvek vibrace Phe kruhu bílkovin (Ancenbacher a Strauch, 1979. Pás 1443 cm -1 odpovídá vibracím CH 2, CH 3 skupin různého původu. Porovnaní Ramanovych spekter KP a VP ze slunečnice vedlo k závěru, že řada pásů VP kolem 1454, 1263, 1075, 916, 868, 821, 707, 630, 519 a 421 cm -1 jsou charakteristické pro amorfní fruktosu, hlavní cukernou složku nektaru (Soderholm et al., 1999. Na obrázku č. 4 jsou zobrazena FTIR spektra slunečnicového KP a VP v rozsahu 400 4000 cm -1. Řada pásů při 2925, 2854, 1464 a 721 cm -1 (vibrace CH 2 skupin a další pás kolem 1741 cm -1 (valenční vibrace C=O esterů potvrzují přítomnost tuků (Guillén a Cabo, 1997. Dva intenzivní pásy kolem 1547 cm -1 (amid II a 1660 cm -1 (amid I jsou důkazem bílkovin (Barth, 2007. Oblast 1200 1500 cm -1 obsahuje řadu pásů, obzvláště deformačních vibrací CH, NH, OH vazeb, vibrace amid III bílkovin, rovinné deformační vibrace sacharidů a ν(coc esterů. Interpretace jednotlivých pásů je složitá vzhledem k jejich vzájemnému překrývání. Oblast 900 1200 cm -1 obsahuje pásy valenčních vibrací CO, CN a CC sacharidů, bílkovin a tuků. Pásy KP kolem 899 a 835 cm -1 ukazuje na přítomnost celulosy a pektinu, složek buněčných stěn pylového zrna. Pásy VP při 781, 818, 870, 1059 a 1151 cm -1 jsou typické pro amorfní fruktosu, která pochází z květového nektaru (Ibrahim et al., 2006. Na obrázku č. 5 jsou znázorněny FT NIR spektra KP a VP slunečnice roční (Helianthus annuus L. v oblasti 4000 10000 cm -1. Přiřazení NIR pásů je uvedeno na tomto obrázku. Je zřejmě, že pásy tuků a bílkovin jsou výraznější v případě KP a pásy vody a cukrů v případě VP (Robert a Cadet, 1998; Workman a Jerome, 1996; Weyer, 1985; Šašić a Ozaki, 2000, což koreluje s výsledkem FTIR a Ramanovych spekter. ročník 5 310 mimoriadne číslo, február/2011

3383 1059 870 818 781 1151 1039 835 899 721 536 3606 2854 2925 1396 1236 1282 1319 1171 1120 957 3010 1547 1518 1464 995 1741 Absorbance 1660 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 KP 0,4 VP 0,2 0,0 rozdíl -0,2 4000 3500 3000 2500 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Vlnočet (cm -1 Obrázek 4 FTIR spektra vzorků květového (KP a včelího (VP pylu ze slunečnici roční (Helianthus annuus L. Na obrázku č. 6 je výsledek měřeni Vis spekter (380 800 nm KP a VP slunečnice roční (Helianthus annuus L. v jednotkách log(1/r po normalizaci. Spektra se výrazně liší v oblasti 525 650 nm, což je způsobeno vlivem vody a cukrů. Normalizace Vis spekter vedla k eliminaci šedé škály a ke zvýraznění jednotlivých odstínů. Na obrázku č. 7 je vidět barevné rozdělení vzorků slunečnicových KP a VP. Na grafu odstínů {a *,b * } (obrázek č. 7 vlevo se od sebe výrazně oddělily dva shluky (KP a VP podle jejich barevnosti. Slunečnicové pylů se nachází v červeno-žlutém kvadrantu, oblast žluto-oranžových odstínů. Osa L * popisuje jas naměřených barev (obrázek č. 7 vpravo. Vzorky se rozdělily podél osy jasu na 2 shluky světlejších KP a tmavších VP. ZÁVĚR Vibrační spektroskopické metody (FT-IR, FT Raman a FT-NIR jsou citlivé na rozdíly v chemickém složení vzorků. S jejich pomocí byla prokázána přítomnost bílkovin, sacharidů, tuků a barviv ve vzorcích květových a obnožkových včelích pylů ze slunečnice. Difúzně reflektanční VIS spektrometrie byla účinná při rozdělení vzorků na základě jejich zbarvení. Dále vliv nektaru a včelích výměšků na vjem barviv (karotenoidů vedl k rozdělení shluků slunečnicových KP a VP na základě analýzy Ramanovych a Vis spekter a při porovnáni parametrů CIE L * a * b *. LITERATURA ALMEIDA-MURADIAN, L. B., PAMPLONA, L. C., COIMBRA, S, BARTH, O. M., 2005. Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets. In Journal of Food Composition and Analysis, roč. 18, 2005, s. 105-111. ANZENBACHER, P., STRAUCH, B., 1979. Use of Raman spectroscopy for studying biological macromolecules. In Chemické listy, roč. 73, 1979, s. 496 516. BARTH, A., 2007. Infrared spectroscopy of proteins. In Biochimica et Biophysica Acta, roč. 1767, 2007, s. 1073 1101. DI PAOLA-NARANJO, R. D., SÁNCHEZ-SÁNCHEZ, J., GONZÁLEZ-PARAMÁS, A. M., RIVAS-GONZALO, J. C., 2004. Liquid chromatographic mass spectrometric analysis of anthokyanin composition of dark blue bee pollen from Echium plantagineum. In Journal of Chromatography A, roč. 1054, 2004, s. 205-210. GONZALEZ-MARTÍN, I., HERNANDEZ-HIERRO, J. M., BARROS-FERREIRO, N., NARCIS, S. C., GARCIA- VILLANOVA, R. J., 2007. Use of NIRS technology with a remote reflectance fibre-optic probe for predicting major components in bee pollen. In Talanta, roč. 72, 2007, s. 998-1003. GONZALEZ-PARAMAS, A. M., BAREZ, J. A. G., MARCOS, C. C., GARCIA-VILLANOVA, R. J., SANCHEZ, J. S., 2006. HPLC-fluorimetric method for analysis of amino acids in products of the hive (honey and bee-pollen. In Food Chemistry, roč. 95, 2006, p. 148-156. GOTTARDINI, E., ROSSI, S., CRISTOFOLINI, F., BENEDETTI, L., 2007. Use of Fourier transform infrared (FT- ročník 5 311 mimoriadne číslo, február/2011

2 (OH (OH + (OH 2 (C=O amid A + amid II log(1/r (=CH + (C=C 5785 5697 5149 4827 4624 4258 4331 4165 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 květový pyl včelí pyl rozdíl 2 as 2 s (OH + (HOH 4756 as + s + -0,2 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 Vlnočet (cm -1 Obrázek 5 FT NIR spektra vzorků květového a včelího pylu ze slunečnici roční (Helianthus annuus L. IR spectroscopy as a tool for pollen identification Aerobiology, roč. 23, 2007, s. 211 219. GUILLÉN, M. D., CABO, N.,1997. Infrared spectroscopy in the study of edible oils and fats. In Journal of the Science of Food and Agriculture, roč. 75, 1997, s. 1 11. IBRAHIM, M., ALAAM, M., EL-HAES, H., JALBOUT, A. F., DE LEON, A., 2006. Analysis of the structure and vibrational spectra of glucose and fructose. In Eclétic Química, São Paulo, roč.31, 2006, s.15-21. IVLEVA, N. P., NIESSNER, R., PANNE, U., 2005. Characterization and discrimination of pollen by Raman microscopy. In Analytical and Bioanalytical Chemistry, roč. 381, 2005, s. 261 267. OHTA, S., FUJIMAKI, T., UY, M. M., YANAI, M., YUKIYOSHI, A., HIRATA, T., 2007. Antioxidant hydroxycinnamic acid derivatives isolated from Brazilian bee pollen. In Natural Product Research, roč. 21, 2007, s. 726-732. PAPPAS, C., TARANTILIS, P. A., HARIZANIS, P. C., POLISSIOU, M., 2003. New method for pollen identification by FT-IR Spectroscopy. In Applied Spectroscopy, roč. 57, 2003, s. 23-27. QIAN, W. L., KHAN, Z., WATSON, D. G., FEARNLEY, J., 2008. Analysis of sugars in bee pollen and propolis by ligand exchange chromatography in combination with pulsed amperometric detection and mass spectrometry In Journal of Food Composition and Analysis, roč. 21, 2008, s. 78-83. ROBERT, C., CADET, F., 1998. Analysis of near-infrared spectra of some carbohydrates. In Applied Spectroscopy Reviews, roč. 33, 1998, č. 253 266. SCHULZ, H., BARANSKA, M., BARANSKI, R., 2005. Potential of NIR-FT-Raman spectroscopy in natural carotenoid analysis. In Biopolymers, roč. 77, s. 212 221. SEILER, G. J., 1997. Anatomy and morphology of sunflower. In: Sunflower Technology and Production. Agron. 35. s. 67-111. Ed. Schneiter, A.A. SILVA, T. M. S., CAMARA, C. A., LINS, A. C. S., BARBOSA-FILHO, J. M., DA SILVA M. S., FREITAS, B. M., DOS SANTOS, F. A. R., 2006. Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke. In Journal of Food Composition and Analysis, roč. 19, 2006, s. 507-511. SODERHOLM, S., ROOS, Y. H., MEINANDER, N., HOTOKKA, M., 1999. Raman spectra of fructose and glucose in the amorphous and crystalline states. In Journal of Raman Spectroscopy, roč. 30, 1999, s. 1009-1018. ŠAŠIĆ, S., OZAKI, Y., 2000. Band assignment of nearinfrared spectra of milk by use of partial least-squares regression. In Applied Spectroscopy, roč. 54, s. 1327 1338. TOMAS-LORENTE, F., GARCIA-GRAU, M. M., NIETO, J. L., TOMAS-BARBEAN, F. A., 1992. Flavonoids from Cistus ladanifer bee pollen. In Phytochemistry, roč. 31, 1992, s. 2027-2029. VEAR, F., PHAM-DELEGUE, M., TOURVIEILLE DE LABROUHE, D., MARILLEAU, R., LOUBLIER, Y., LE MÉTAYER, M., DOUAULT, P., PHILIPPON, J. P., 1990. ročník 5 312 mimoriadne číslo, február/2011

log(1/r Genetical studies of nectar and pollen production in sunflower. In Agronomie, roč. 10, 1990, s. 219 231. WEYER, L. G., 1985. Near-infrared spectroscopy of organic substances. In Applied Spectroscopy Reviews, roč. 21, 1985, s. 1 43. WORKMAN, J. R., JEROME, J., 1996, Interpretive spectroscopy for near infrared. In Applied Spectroscopy Reviews, roč. 31, 1996, s. 251 320. 1,0 0,8 Poděkování: Práce vznikla za podpory MSMT ČR (projekt č. CEZ: MSM6046137305 a MSM6046137307 a MŠ SR projektu Excelentní centrum ochrany a využiti agrobiodiverzity ECOVA, ITMS 26220120015, na základe podpory operačního programu Výzkum a vývoj financovaného z Evropského fondu regionálního rozvoje. Kontaktní adresa Mgr. Andriy Synytsya, Ph.D. Ústav chemie a technologie sacharidů, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika. Tel.: +420 220 443 116, E-mail: sinicaa@vscht.cz 0,6 0,4 VP Mgr. Alla Synytsya, Ph.D. Ústav analytické chemie, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika. Tel.: +420 220 444 106, E-mail: sinical@vscht.cz 0,2 0,0 KP 400 450 500 550 600 650 700 750 800 (nm Obrázek 6 Difúzně reflektanční Vis spektra vzorků květového pylu (KP a včelího pylu (VP slunečnice roční (Helianthus annuus L. b* 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30-10 květový pyl včelí pyl Obrázek 7 Barevný diagram vzorků květového a včelího pylu slunečnice roční (Helianthus annuus L. a* L* 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 Roman Bleha. Ústav chemie a technologie sacharidů, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika. Tel.: +420 220 443 116, E-mail: Roman.Bleha@vscht.cz Doc. Ing. Ján Brindza, CSc. Katedra genetiky a šľachtenia rastlín. Inštitút ochrany biodiverzity a biologickej bezpečnosti, Fakulta agrobiologie a potravinových zdrojů, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Trieda Andreja Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika. Tel.: +421 376 414 787, E-mail: Jan.Brindza@uniag.sk 76 Nitra Slovakia, Email: name@domainname.sk Ing. Radovan Ostrovský, Inštitút ochrany biodiverzity a biologickej bezpečnosti, Fakulta agrobiologie a potravinových zdrojov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Trieda A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Tel.: +421 376 414 787, E-mail: Radovan.Ostrovsky@uniag.sk Prof. Ing. Jana Čopíková, CSc. Ústav chemie a technologie sacharidů, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika. Tel.: +420 220 443 114, E-mail: copikovj@vscht.cz Ing. Janka Nôžková PhD., Katedra genetiky a šľachtenia rastlín. Fakulta agrobiologie a potravinových zdrojov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Trieda A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Tel.: +421 376 414 787, E-mail: Janka.Nozkova@uniag.sk ročník 5 313 mimoriadne číslo, február/2011