MIKROPROPAGACE SORBUS DOMESTICA L. PRO LESNICKOU PRAXI II ZAKOŘEŇOVÁNÍ A AKLIMATIZACE V PODMÍNKÁCH EX VITRO Hana PRKNOVÁ, Jaroslav KOBLIHA Česká zemědělská univerzita, Fakulta lesnická a dřevařská, Kamýcká 1176, CZ 165 21 Praha 6 Suchdol, e-mail: prknova@knc.czu.cz, kobliha@fld.czu.cz PRKNOVÁ, H., KOBLIHA, J.: Micro propagation of Sorbus domestica L. for forestry practice II. Lesn. Čas. Forestry Journal, 55(1): 47 52, 2009, 3 fig., ref. 8. Original paper. ISSN 0323 10468 Multiple shoot cultures of true service tree (Sorbus domestica L.), derived from a zygotic embryo, were used for sampling of stem microcuttings. As documented with a single clone, one-step procedure of rooting and acclimatization under ex vitro conditions was successfully applied with no need for using agar-rooting media supplemented with auxin. A practice to obtain fitted plantlets for forest nurseries is described in detail. Repeated experiments, conducted in a greenhouse from February to August 2007 were highly successful when rate of synchronous rooting and acclimatization approached always 100%. Key words: microcutting, micropropagation, ex vitro rooting, Sorbus Z orgánových kultur jeřábu oskeruše (Sorbus domestica L.), odvozených ze zygotického embrya, byly získávány mikrořízky k experimentům. Na jednom užitém klonu bylo doloženo, že není potřeba agarového zakořeňovacího média s auxinem a lze provést současné zakořenění a aklimatizaci v podmínkách ex vitro. Je detailně popsán postup k získání rostlinek použitelných pro lesní školky. Opakované pokusy v době od února do srpna 2007 byly velmi zdařilé a synchronní tvorba kořenů a aklimatizace měla úspěšnost blízkou 100 %. Klíčová slova: mikrořízek, mikropropagace, zakořeňování ex vitro, Sorbus 1. Úvod a problematika Jeřáb oskeruši (Sorbus domestica L.) je možné množit orgánovou kulturou, poskytující mikrořízky. Zakořeňování mikrořízků je všeobecně nejslabším článkem vegetativního množení dřevin tímto způsobem, jenž je u některých stromů na překážku využití mikropropagace v lesnické praxi. Jeřáb oskeruše je schopný tvořit kořenové výmladky, ale není to normální způsob jeho rozmnožování. Regenerace mikrořízků z kultur in vitro v rostlinky schopné růst v přirozených substrátech proto je otázkou a je předmětem této studie. Podnětem ke zde popsanému experimentování byly studie, podle nichž se u některých dřevin zdařilo zakořeňování mikrořízků ex vitro bez předešlé speciální zakořeňovací subkultury in vitro. Aklimatizace a zakořenění tudíž probíhaly současně (MCCLELLAND et al. 1990, CHANON et al. 1997, MONTEUUIS et al. 1998). V průběhu práce na této studii se objevil další článek na podobné téma, avšak bohatší o zvláště pozoruhodný poznatek, pro nějž musí být zmíněna i v diskusi (TOMSONE et al. 2007). 2. Materiál a metody Materiálem pro experimenty byly asi 2 3 cm dlouhé vrcholové i osové mikrořízky pocházející z kultur popsaných v části I. Šlo o jeden klon juvenilního materiálu. Mikrořízky byly jednak z aktivně rostoucích kultur, jednak z kultur podrobených skladování v chladu a
temnu. Skladované kultury byly na 22 týdnů úplně pozastaveny v růstu, ale morfologicky neměly žádné příznaky dormance. Byly tedy zelené a normálně olistěné. Mikrořízky byly vyjmuty z lahviček a omyty vodou. Byly zakořeňovány v nesterilních podmínkách za použití komerčně dodávaného práškovitého stimulátoru AS-1 (výrobce: firma Hü-Ben Čerčany, ČR), jehož aktivní složkou je stabilní syntetický auxin kyselina α-naftyloctová a jako synergicky působící látka je přidávána kyselina nikotinová. Stimulátor byl použit dle návodu: Vlhké konce mikrořízků byly jednorázově vnořeny do pudru, aby na nich ulpěl (obr. 1). Substrát k řízkování byl složen z přeseté rašeliny a expandovaného vermikulitu 3 : 1. Nebyl žádným způsobem sterilizován. Zpočátku řízky potřebují vzduch nasycený vlhkostí, a proto se substrát plní ve vrstvě 3 cm do uzavíratelných průsvitných nádob o rozměrech 18 18 6 cm. Fungicidy byly uplatněny způsobem běžným v zahradnické praxi, tj. po nařízkování byla provedena zálivka přípravkem Previcur 607 SL v koncentraci 0,1 % a po týdnu byl ještě aplikován Topsin M 70 WPv koncentraci 0,1 % jako postřik na listy (Přehled 2008). Od třetího týdne probíhalo pozvolné otužování vůči nižší vzdušné vlhkosti pootvíráním nádoby. Po zakořenění a aklimatizaci k nižší vzdušné vlhkosti byly rostlinky přesazeny do květníků, do substrátu složeného z 1,25 l jemně přeseté kompostní zeminy + 0,25 l bílého písku zrnitosti cca 1 mm a 0,1 l moučky z dolomitického vápence pro zahradnické účely. Pro zakořeňování, pokud se provádí jako při uvedených experimentech ve skleníku při přirozené délce dne, je vhodné období od února do srpna. V této době je vhodný běžný tzv. poloteplý skleník. Dle záznamů automatiky využitého skleníku v Botanické zahradě Liberec (ČR) se v této době teploty prostředí běžně pohybují regulované teploty mezi 15 C v noci a 20 C ve dne. Za teplejších letních dnů vlivem větrání odpovídají venkovním podmínkám a dosahují až kolem 30 C. Skleník má automatické stínění fungující jakmile dojde k přímému oslunění. Světelné poměry jsou tedy proměnlivé a celkově splňují průměrné světelné nároky hemisciofytů. Uvedený experiment se současným zakořeňováním a aklimatizací byl do doby sepsání této zprávy pětkrát zopakován (v době od února do srpna 2007), za použití sérií po 30 mikrořízcích. Sazenice v květnících se dále pěstují běžnými zahradnickým a školkařskými metodami, avšak první zimu, než zdřevnatí, musí být umístěny ve studeném skleníku s nastaveným minimem 4 C. 3. Výsledky Zahradnická práce s mikrořízky se v ničem neliší od běžné práce s bylinnými (měkkými) řízky dřevin (obr. 1). Bylo prověřeno, zda mikrořízky pocházející z kultur podrobených chladnému období, jsou připraveny k rychlému růstu, a proto i dobrému zakořenění. Opak se projevil, když bylo již několik hodin po nařízkování pozorována rychle postupující hniloba, navzdory chemickému ošetření proti množárenským mykózám. Procento přeživších kořenících rostlinek bylo tak bezvýznamné, že tento způsob řízkování byl zamítnut jako nevhodný. Nadále je proto používáno mikrořízků přímo z rostoucích orgánových kultur, jakmile dosáhnou délky vhodné k manipulaci. Za listy jsou úžlabní pupeny, a proto osové řízky koření stejně dobře jako řízky vrcholové. První kořeny se objevují skoro synchronně za 2 týdny a od té doby mají být rostlinky již otužovány (obr. 2). Neuvádíme statistické vyhodnocení, protože bylo zjištěno, že při použití kvalitních, nikoli zcela slabých a příliš krátkých (méně než 2 cm) mikrořízků a opatrném otužování se výsledek současného zakořeňování a aklimatizace k volnému ovzduší pokaždé blíží 100 % úspěšnosti. Pro lesnickou praxi je důležitá také kvalita sazenic. Je doložena detailní fotografií (obr. 3).
Obr. 1 Mikrořízky ošetřené stimulačním pudrem AS-1, dne 10. srpna 2007 Fig. 1 Microcuttings treated by stimulating powder AS-1, on August 10 th, 2007 Obr. 2 Mikrořízky o 14 dní později Fig. 2 The microcuttings 14 days later
Obr. 3 Mikrořízky zakořeňované ode dne 10. srpna 2007 a přezimované ve studeném skleníku se vyvinuly v sazenice schopné vysazení na venkovní záhon. Dokumentováno dne 14. dubna 2008 Fig. 3 The microcuttings rooted from August 10 th, 2007 and hibernated in a cool greenhouse. Plantlets are fitted to outdoor conditions. Documented on April 14 th, 2008 4. Diskuse Mikrořízek je subtilní rostlinná část, oproti obyčejnému bylinnému řízku také zchoulostivělá mikroklimatem uvnitř kultivační skleničky. Také jeho fyziologická konstituce je zvláštní, neboť je i po vyjmutí z kultury in vitro ovlivněn přijatým exogenním cytokininem, fungujícím při mikropropagaci jako promotor proliferace. Účinek cytokininu je, pokud se týká potřeby zakořenit mikrořízek, antagonistický auxinům. Obvyklou praxi je převedení kultur in vitro na sterilní zakořeňovací kultury. Ty obsahují některý z auxinů (ponejvíce IBA) a někdy i další substance, jako je aktivní uhlí rozptýlené v agarovém médiu aj. Vyčkává se na vytvoření kořenů, a teprve potom dochází k přenosu a aklimatizaci k podmínkám ex vitro. V případě S. domestica se také dosud postupovalo tímto komplikovaným způsobem (ARRILLAGA et al. 1991, MIKO et al. 2004). Zde popsané experimenty se týkají jen jednoho k pokusům použitého klonu a vliv genetické variability nebyl zkoumán. V této souvislosti ovšem přitom nelze automaticky předpokládat, že genetická variabilita musí mít podstatný vliv. Bylo publikováno pozoruhodné zjištění, že podle experimentů s 28 odrůdami šeříku (Syringa L.) při mikropropagaci závisela sice úspěšnost iniciální i multiplikační fáze na odrůdě, ale úspěšnost zakořeňování mikrořízků ex vitro se u různých odrůd nelišila (TOMSONE et al. 2007). Výsledky popsané v předešlé kapitole, zakořeňování Sorbus domestica v podmínkách ex vitro, platí za předpokladu dodržení metodiky. Bylo pracováno s juvenilním materiálem; primárním explantátem pro multiplikaci bylo zygotické embryo. Experimenty byly prováděny s jediným náhodně zvoleným klonem. To může být podstatné, a proto poznatky nelze
zevšeobecňovat, dokud nebudou provedena opakování pokusů s větším počtem klonů, vzešlých i z jiných matečných stromů. Zakořeňování mikrořízků v nesterilních podmínkách lze podle experimentů s Prunus avium Kristiina podpořit každodenním kropením mikrořízků 0,5 mm roztokem kyseliny askorbové (VASAR 2003). V případě Sorbus domestica však bylo zakořeňování rychlé a spolehlivé i bez takového ošetření. Poděkování Příspěvek vznikl v rámci řešení projektu NAZV: QH81160 Ekonomická efektivnost šlechtění lesních dřevin. Literatura 1. ARRILLAGA I., MARZO T. et SEGURA J., 1991: Micropropagation of juvenile and adult Sorbus domestica L. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 27: 341 348. 2. CHANON A. M., KAMALAY J. C. et JOURDAN P., 1997: Micropropagation of juvenile and mature American elms from stem sections. Proceedings 11th Central Hardwood Forest Conference, March 23 26, 1997, Columbia, p. 242 250. 3. MCCLELLAND M. T., SMITH M. A. L. et CAROTHERS Z. B., 1990: The effects of in vitro and ex vitro root initiation on subsequent microcutting root quality in three woody plants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 23: 115 123. 4. MIKO M., GAZO J. et BIROŠČÍKOVÁ M., 2004: In vitro klonové množenie genetických zdrojov jarabiny oskorušovej (Sorbus domestica L.) z územia Slovenska. Acta Fytotech. Zootech., 7: 85 89. 5. MONTEUUIS O., BON M.-C. et GOH D. K. S., 1998: Teak propagation by in vitro culture.- Bois et Forêts des Tropiques 1998/256: 43 53. 6. Přehled registrovaných přípravků na ochranu rostlin 2008. Česká společnost rostlinolékařská, Praha, 350 pp. 7. TOMSONE S., GALENIECE A., AKERE A., PRIEDE G. et ZIRA L., 2007: In vitro propagation of Syringa vulgaris L. cultivars. Biologija, 53/2: 28 31. 8. VASAR V., 2003: Effect of ascorbic acid and citric acid on ex vitro rooting and acclimatization of Prunus avium L. microshoots. Acta Hort., p. 251 254. Summary Microcuttings of true service tree (Sorbus domestica L.) without roots, produced by means of in vitro cultures, were rooted and acclimatized in ex vitro conditions. Soil mixture of 3 parts of peat and 1 part ov vermiculite was prepared into plastic boxes. The microcuttings were treated by a powder stimulator (AS-1 containing auxins) and digged into soil. They were protected by a fungicide (Previcur 607 SL in 0.1% concentration) and covered by a translucent lid. Rotts were observed 2 weeks later. The cuttings should be acclimatized to lower air moisture thereafter. We achieved repeatedly nearly 100% success making experiments with a single clone. According to our experience microcuttings from in vitro cultures inhibited in cool dark conditions in a refrigerator must be activated by normal temperature and light conditions prior to transfer out of flasks. Translated by authors Revised by Z. AL-ATTASOVÁ