Eva Benešová Genetika
Význam nukleotidů - Energetický metabolismus (oběh energie). - Propojení odpovědi buňky na hormony a další stimuly. - Komponenty enzymových kofaktorů a dalších metabolických intermediátů. - Uchování a přenos genetické informace. (Tvoří složky nukleových kyselin (NK): DNA deoxyribonukleová RNA ribonukleová Aminokyselinové sekvence proteinů a nukleotidová sekvence RNA jsou specifikovány nukleotidovou sekvencí DNA.
Funkce DNA a RNA DNA funkce: uchování a přenos genetické informace (DNA obsahuje i sekvence jen s regulační funkcí signály o začátku a konci genu, iniciační body pro replikaci apod.) RNA různé funkce: ribozomální RNA = rrna složka ribozomů (na nich probíhá syntéza proteinů) messenger RNA = mrna meziprodukty nesoucí genetickou informaci z 1 či více genů k ribozomu (tj. kódují AMK sekvenci 1 či více polypeptidů) transfer RNA = trna překlad informací z mrna do sekvence AMK - další funkce: regulační a katalytické
Struktura nukleotidů Nukleotidy a NK mají charakteristické báze a pentózy. Nukleotidy mají 3 složky: a) Dusíkatou bázi b) Pentózu c) Fosfát Nukleosidy mají 2 složky: a) Dusíkatou bázi b) Pentózu
Dusíkaté báze Deriváty purinu a pyrimidinu. -Bazické, téměř planární sloučeniny. -Konjugované všechny nukleotidové báze absorbují UV světlo a NK jsou tedy charakteristické silnou absorpcí u 260 nm. DNA i RNA obsahují A i G. DNA i RNA obsahují C. DNA dále obsahuje T, RNA obsahuje U.
Pentózy v NK DNA: 2 - deoxy - D - ribóza RNA: D ribóza Obě ve formě - furanózy
Deoxyribonukleotidy DNA
Ribonukleotidy RNA
Fosfodiesterová vazba. Vyskytuje se mezi následnými nukleotidy v NK. Stejná u DNA i RNA. 5 - fosfátová skupina jednoho nukleotidu se váže ke 3 hydroxylové skupině dalšího nukleotidu. Konvence: struktura jednoho řetězce NK je psána s 5 koncem vlevo a 3 koncem vpravo. 5 konec chybí mu nukleotid na 5 pozici 3 konec chybí mu nukleotid na 3 pozici Vzniká tak páteř DNA, tvořená fosfátovými a pentózovými zbytky dusíkaté báze jsou napojeny jako postranní řetězce. Fosfátová skupina je negativně nabitá!!
Interakce mezi bázemi. Vodíkové vazby (můstky). Komplementární asociace bází resp. řetězců NK A T (či U) G C Tím je umožněna duplikace genetické informace. DNA je dihelix (sekundární struktura) 2 vazby Hydrofilní kostra je orientována ven, báze jsou uvnitř dihelixu. Řetězce jsou navzájem antiparalelní. 3 vazby Ve struktuře je patrný velký a malý žlábek. Separace řetězce je tím těžší, čím větší je poměr párů GC : AT. z knihy: D.L.Nelson, M.M.Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, W.H.Freeman&Co., New York, 2005
Model struktury naznačuje mechanismus předávání genetické informace. Replikace struktury: a) Separace obou řetězců. b) Syntéza komplementárního řetězce pro každý ze řetězců starých, které slouží jako templáty semikonzervativní replikace. Formy DNA B-forma: pravotočivá 10 bází / otočka nejběžnější A-forma: pravotočivá 11 bází / otočka Z-forma: levotočivá 12 bází / otočka pouze 1 žlábek
Terciální struktura DNA - nadšroubovice DNA stočená do dvoušroubovice Další stočení již dvoušroubovicovitě stočené DNA nadšroubovice = superhelix DNA nevyznačující se nadšroubovicovitým vinutím = relaxovaná. z knihy: D.L.Nelson, M.M.Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, W.H.Freeman&Co., New York, 2005 DNA topoisomerasy Enzymy umožňující přechod dsdna z 1 prostorového uspořádání do druhého a to tak, že přeruší vlákno DNA, umožní daný přechod a vlákno opět spojí. Typ I přeruší 1 řetězec Typ II přeruší oba řetězce (tzv. gyrasy) Ritter, P.: Biochemistry; A Foundation, Brooks/Cole Publishing Company, Pacific Grove, CA 1996
1. chromatida, 2. centromera, 3. krátké rameno chromatidy, 4. dlouhé rameno chromatidy http://cs.wikipedia.org/ wiki/chromozom (29.4.2010) Geny a chromozomy Genom úplná genetická informace organizmu soubor všech chromozomálních genů daného organizmu. Gen úsek molekuly DNA obsahující informaci pro syntézu funkčního biologického produktu (polypeptidu či RNA se strukturní či katalytickou funkcí). Chromozom útvar tvořený DNA a bazickými proteiny (histony), obsahující základní genetický materiál buňky. Biologický druh obsahuje pro něj typickou sadu chromozomů. Lidská somatická buňka obsahuje 46 chromozomů. Centromera sekvence DNA zajišťující během buněčného dělení vazbu proteinů, které váží chromozom k mitotickému vřeténku nezbytné pro dělení chromozomálních setů do dceřinných buněk. Telomery úseky na koncích eukaryotních chromozomů, napomáhají stabilizaci obsahují repetitivní sekvence. Neprobíhá u nich obyčejná replikace, tyto sekvence přidává telomerasa.
Struktura chromozomu Chromatin Sestává z vláken obsahujících protein a DNA. DNA je zde těsně asociována s proteiny (histony), které balí DNA a uspořádávaní ji do strukturních jednotek = nukleosomů. Histony malé bazické proteiny (velký podíl Arg a Lys) eukaryotní organizmy obsahují 5 tříd histonů. Ovinutí DNA kolem histonů zkracuje molekulu DNA cca 7x. Celkové zkrácení v chromozomu je ovšem asi 10 000x.
Centrální dogma reverzní transkripce Triplet nukleotidů v DNA určuje 1 AMK v polypeptidovém řetězci.
Replikace Semikonzervativní proces. Obousměrný proces (oba konce počátečního očka mají aktivní replikační vidličku). Tři fáze: iniciace, elongace a terminace. Počátek replikace. Prokaryota 1 počátek replikace Eukaryota více počátků na 1 chromozom Nový řetězec je vždy syntetizován ve směru 5 3 (templát je čten ve směru 3 5 ). Semidiskontinuální proces. (Aby oba řetězce mohly být syntetizovány ve směru 5 3.) Jeden řetězec (opožďující se) je syntetizován po krátkých úsecích Okazakiho fragmenty (spojuje DNA ligasa). Druhý (vedoucí) je syntetizován kontinuálně. DNA helikasa rozvíjení komplementárních řetězců DNA. z knihy: D.L.Nelson, M.M.Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, W.H.Freeman&Co., New York, 2005
DNA polymerasy Enzymy (transferasy) katalyzující prodlužování polydeoxyribonukleotidových řetězců, a to komplementárně dle příslušných templátů. Replikace : DNA - dependentní (závislá) DNA polymerasa (polydeoxyribonukleotid) n + dntp (polydeoxyribonukleotid) n+1 + PP i Tyto enzymy nejsou schopné samy zahájit syntézu řetězce, umí připojovat až na již dříve nasyntetizovaný počátek řetězce (enzym primasa) tj. primer s volným 3 koncem. Většinu primerů tvoří oligonukleotidy RNA. (Primer je následně odstraněn účinkem DNA-polymerasy I, která zároveň dosyntetizovává i chybějící část řetězce DNA. (Prokaryota mají přímo enzym RNasu, který odstraňuje primer.)) Opravné čtení schopnost jen některých DNA polymeras v případě špatného připojení je pohyb DNA polymerasy inhibován a exonukleasovou aktivitou je chybný nukleotid odstraněn.
Elongace Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce. 1. a) Primasa syntetizuje RNA primer (10 až 60 nukleotidů) k němu DNA polymerasa začíná připojovat další nukleotidy vedoucí řetězec. b) Stejný průběh při syntéze opožďujícího se řetězce až do okamžiku než je dosaženo již dříve syntetizovaného Okazakiho fragmentu. Vzniká opět nový primer v blízkosti replikační vidličky. Celý proces probíhá velmi koordinovaně oba řetězce jsou syntetizovány 1 molekulou DNA-polymerasy III. Primery RNA jsou DNA polymerasou I nahrazovány za DNA. Ligasa spojuje Okazakiho fragmenty.
Terminace K terminaci dochází na specifických sekvencích. Vazba Tus (protein terminus utilization substance). Inhibice helikasy a zastavení postupu vidlice. Postreplikační úpravy Methylace! Methylací označena vlastní DNA možnost rozeznání staré (původní, templátové) DNA od nově syntetizované a tím například možnost opravy chyb.
Transkripce Překlad ds DNA do ss RNA (komplementární k jednomu řetězci). Selektivnější proces než replikace v daném čase se transkribují jen některé geny dle potřeb organizmu. Kódující sekvence mohou být na obou řetězcích. Specifické regulační sekvence značí začátek a konec DNA segmentu pro transkripci a určují, který řetězec má sloužit jako templát. Hlavní enzym DNA-dependentní-RNA-polymerasa.
DNA dependentní RNA polymerasa 4 podjednotky: - stabilita komplexu - vazba ribonukleotidů na polymer - vazba k DNA - vazba k promotoru Nemá 3 5 exonukleasovou aktivitu (proofreading), proto při transkripci dochází častěji k chybám než při replikaci. Nepotřebuje primer! K iniciaci dochází ve chvíli, kdy se na specifickou sekvenci DNA (promotor) naváže RNA polymerasa. Směr syntézy 3 5
Iniciace a elongace transkripce 1. vazba podjednotky na komplex 2. vazba holoenzymu na oblast nad promotorem 3. posun polymerasy na promotor 4. rozpoznání sekvence, rozvolnění DNA řetězců 5. vazba ATP na holoenzym, syntéza řetězce RNA 6. po spojení prvních cca 4 nukleotidů odpadá podjednotka http://web.virginia.edu/heidi/chapter31/chp31frameset.htm (28.4.2010)
Terminace transkripce 1. závislá na faktoru - faktor se váže na charakteristické sekvence DNA, postupuje směrem k polymerase. Po zastavení RNA polymerasy na terminárotu (opět daná sekvence na DNA), dojde ke kontaktu, uvolní se RNA a následně i polymerasa - za spotřeby ATP 2. nezávislá na faktoru - po rozpoznání terminační sekvence dojde k tvorbě vlásenky, polymerasa se zastaví a komplex se rozpadá na DNA, RNA a polymerasu
Posttranskripční modifikace u eukaryot Nově syntetizovaná molekula je pouze primární transkript. Dochází u ní k: a) sestřihu (Odstranění intronů a propojení exonů do souvislé sekvence.) b) modifikaci 5 konce (čepička) c) modifikace 3 konce (polyadenylace) Všechny tyto kroky se odehrávají v jádře. Žádná z těchto modifikací neprobíhá u prokaryot!! (Velmi těsné propojení procesů tanskripce a translace téměř současný průběh.)
Translace Překlad 4 písmenné řeči NK do 20 písmenné řeči proteinů. Proces syntézy proteinů je veden pomocí mrna. Kodon: triplet nukleotidů kódující danou AMK Při translaci jsou tyto triplety čteny postupně. Jeden specifický první kodon určuje čtecí rámec (každá DNA má tři čtecí rámce). V rámci jednoho genu se kodony nepřekrývají.
Genetický kód 61 kodonů kóduje AMK. 3 kodony jsou terminační. AUG iniciační kodon (Met) UAA, UAG, UGA terminační stop kodony Degenerace kódu: 1 AMK může být kódována více než 1 kodonem. 1 kodon NEMŮŽE specifikovat více než 1 AMK.
trna párování kodonu mrna s antikodonem trna místo pro připojení AMK na trna V antikodonu často obsažen inosinát (obsahuje neobvyklou bázi = hypoxantin), který se páruje s A, U i C. sekundární struktura jetelový list terciární struktura písmeno L http://commons.wikimedia.org/wiki/file:di sodium_inosinate.png (29.4.2010)
Ribozomy Proces translace probíhá na ribozomech. (rrna v komplexu s proteiny) Eukaryotní x prokaryotní ribozomy. E.coli v buňce více než 15000 ribozomů Sekundární struktura 16S a 5S rrna.
Aktivace AMK v cytosolu vazba na t-rna na úkor energie ATP trna + AMK + ATP aminoacyl-trna + AMP + PP i katalyzuje aminoacyl-trna syntetasa (ligasa) (každý enzym je specifický pro 1 AMK a 1 či více odpovídajících trna) t-rna s vázanou AMK je označována jako nabitá.
Translace souhrn směr syntézy : Od N konce k C konci směr čtení mrna: 5 3 Voet G, Voetová JG: Biochemie, Victoria Publishing, Praha 1995
Iniciace translace (E.coli) AUG specifikuje N-koncový Met ten přistupuje a) ve formě formylmethioninu (u bakterií) b) ve formě methioninu (u eukaryot) Ribozom obsahuje 3 vazebná místa pro trna P (peptidyl site, P-vazebné místo) váže peptidyl trna A (aminoacyl site, A-vazebné místo) váže aminoacyl trna E exit site (pro odstup nenabitých trna) IF iniciační faktor (proteiny) 16S-rRNA částečně komplementární k Shine-Dalgarno sekvenci (cca 10 nukleotidů před startovním kodonem na mrna) rozeznání iniciačního kodonu. energie dodána z GTP pouze zde přímo vazba do P místa vznik iniciačního komplexu
Elongace translace účast elongačních faktorů dodání energie ve formě GTP 1. krok 2. krok 3. krok vazba nové aminoacyl-trna do A místa vznik peptidové vazby posun ribozomu o jeden kodon po mrna
Terminace translace Signalizace terminačním kodonem (1 ze 3) na mrna. Uvolnění řetězce z ribozomu pomocí terminačních (uvolňovacích) faktorů RF (rozeznávají UAA, UAG nebo UGA). Po syntéze je mnoho proteinů určeno pro speciální lokaci v buňce. Jeden z mechanismů pro cílení zahrnuje peptidovou signální sekvenci, obvykle na N-konci nově syntetizovaného proteinu.
Svinování a posttranslační modifikace Během translace či po ukončení translace dochází ke svinutí řetězce do nativní 3D struktury. Vodíkové můstky, van der Waalsovy interakce, iontové a hydrofobní interakce vznik 3D struktury z lineární genetické informace. Před či po svinutí mohou proběhnout různé modifikace. Posttranslační modifikace tvorba disulfidových můstků fixace struktury (2 Cys) fosforylace AMK Ser, Thr, dočasné i trvalé hydroxylace AMK Pro, Lys methylace AMK Lys karboxylace, amidace, acetylace, adenylace glykosylace N-glykosid na Asn O-glykosid na Ser, Thr, Tyr odolnost proti proteolýze, zvýšení rozpustnosti, zvýšení konformační stability, funkce při specifickém rozpoznávání vznik příčných vazeb amidové vazby Glu-Lys limitovaná proteolýza odštěpení N-konce, rozdělení na víc řetězců připojení kofaktorů spojování v nadmolekulové celky