Úvod... 3 Cíl práce.. 4 1. Obecné problémy stresu u rostlin... 5. 2. Biologická kontrolní agens u rostlin. 6

Obsah Úvod... 3 Cíl práce.. 4 1. Obecné problémy stresu u rostlin.... 5 2. Biologická kontrolní agens u rostlin. 6 2.1 Počátky využití mikroorganizmů k biologické kontrole. 6 2.2 Bakterie podporující rostlinný růst. 7 2.2.1 Biohnojiva a biopesticidy... 10 2.3 Mechanismy půdní biologické kontroly rostlinných nemocí...... 10 2.3.1 Konkurenční kolonizace kořene... 11 2.3.1.1 Vzájemné vlivy rostlin a rhizobakterií.. 11 2.3.1.2 Kořenová kolonizace a místně specifická rekombináza 11 2.3.1.3 Využití kořenových výměšků a kořenového slizu u PGPB... 12 2.3.2 Biologická kontrolní aktivita zprostředkovaná syntézou alelochemikálií.. 12 2.3.2.1 Konkurence o železo a role sideroforů.. 12 2.3.2.2 Antibióza a antibiotika.. 13 2.3.2.3 Produkce lytických enzymů.. 14 2.3.2.4 Detoxifikace a degradace faktorů virulence.. 14 2.3.3. Indukovaná systematická rezistence a systematická získaná rezistence... 15 3. Nejdůležitější rody bakterií podporujících rostlinný růst. 17 3.1 Pseudomonas.. 17 3.2 Serratia.... 20 3.3 Streptomyces... 21 3.4 Burkholderia... 23 3.5 Bacillus.... 24 3.6 Paenibacillus... 26 3.7 Delftia.. 27 3.8 Stenotrophomonas... 28 3.9 Azospirillum.... 29 3.10 Rhizobium.. 29 3.11 Azotobacter... 30 3.12 Ralstonia... 30 1

3.13 Lactobacillus a bakterie mléčného kvašení.. 30 4. Supresivní a napomáhající půdy... 31 5. Bakterie v biologické kontrole významných nemocí rostlin. 32 5.1 Take-all nemoci... 32 5.2 Crown gall nemoci.. 34 6. Genetické modifikace a genetické inženýrství rostlin.. 36 Diskuze. 39 Závěr 41 Seznam literatury 42 2

Úvod Bakterie jsou jednobuněčné organizmy prokaryotického typu. Z evolučního hlediska tvoří jednu ze tří domén života na Zemi (Rosypal a kol. 2003). Není asi místa na naší planetě, kde by nebyly bakterie. Nejvíc je jich v půdě a ve vodě, velmi mnoho je jich v tělech a na tělech jiných organizmů, rostlin, živočichů i člověka, a mnoho je jich ve vzduchu. Váhově představují asi polovinu živé hmoty na Zemi. Vyskytují se i v tak extrémních podmínkách prostředí, kde jiné formy života už nenajdeme. Jejich koncentrace je ovšem různá v různých prostředích, a i v tomtéž prostředí kolísá v širokém rozmezí a v závislosti na řadě okolností (Kaprálek 2000). Bakterie žijící v půdě vytvářejí přirozená společenstva. Ovlivňují úrodnost půdy a kořenovou výživu rostlin. Některé rozkládají zbytky rostlinných a živočišných těl a přeměňují je na látky, které jsou asimilované vyššími rostlinami (Rosypal a kol. 2003). Množství bakterií v půdě se řádově odhaduje v rozmezí desítek milionů až několik miliard na 1 g půdy (Dobiáš a kol. 2003). Rostliny se během svého růstu v přírodních podmínkách setkávají s různými druhy půdních mikroorganizmů. Některé z těchto mikroorganizmů jsou prospěšné pro rostliny, jiné jsou škodlivé. Pomocí stimulace rostlinného růstu nebo snižováním půdních rostlinných patogenů dochází k vytváření vzájemných vztahů mezi rostlinami a bakteriemi prospěšnými pro rostliny (Persello-Cartieaux a kol. 2003). Prospěšné půdní bakterie volně žijící v rhizosféře jsou označovány jako bakterie podporující rostlinný růst (PGPB). Nachází se ve spojení s kořeny různých rostlin (Han a kol. 2004). 3

Cíl práce Cílem této práce je zpracovat problematiku biologických kontrolních mechanismů bakterií v životním prostředí, se zaměřením na kontrolu rostlinných patogenů. Práce se zabývá bakteriemi podporujícími rostlinný růst (PGPB) a mechanismy jejich antagonistického působení proti patogenům. Součástí práce je i zpracování přehledu nejdůležitějších rodů uplatňujících se jako biologické kontrolní agens, zmíněny jsou ekologicky nejvýznamnější nemoci potlačované pomocí těchto bakterií. Práce je také doplněna o problematiku prospěšných půd, které mají speciální vlastnosti k potlačování patogenů, a problematiku genetických modifikací, které by mohly vyřešit problém kolísajících účinků bakterií při používání v běžných půdách. 4

1. Obecné problémy stresu u rostlin Rostliny jsou v průběhu svého života vystaveny velmi proměnlivým podmínkám vnějšího prostředí. Ty mohou nejen zpomalovat jejich životní funkce, ale také poškozovat jednotlivé orgány a v krajním případě vést i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí závažně ohrožující rostlinu označujeme jako stresové faktory (stresory). Termín stres je obvykle používán pro souhrnné označení stavu, ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů. Problematika stresu u rostlin je komplikovaná díky přisedlému způsobu života, který neumožňuje únik před působením stresorů, ale také tím, že u rostlin je mnohem větší mezidruhová variabilita i heterogenita vnějšího prostředí. Ta se projevuje značným kolísáním fyzikálně-chemických parametrů rostlinných buněk i v průběhu normálního fungování (Procházka a kol. 2003). Obr. 1 Přehled nejdůležitějších stresových faktorů, se kterými se rostliny setkávají (Procházka a kol. 2003). Fyzikální mechanické účinky větru nadměrné záření (UV, viditelné) extrémní teploty (horko, chlad, mráz) Abiotické faktory nedostatek vody (sucho) nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie) Chemické nedostatek živin v půdě nadbytek iontů solí a vodíku v půdě toxické kovy a organické látky v půdě toxické plyny ve vzduchu Biotické faktory herbivorní živočichové (spásání, poranění) patogenní mikroorganizmy vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitismus) 5

Půdní patogeny patří do několika různých skupin: bakterie, houby nebo hlístice. Přebývají v půdě v krátkých nebo dlouhých periodách. Mohou přežívat na rostlinných zbytcích nebo se chovají jako klidové organizmy, dokud se k nim nedostanou kořenové výměšky a neumožní jim růst. Tyto patogeny dokáží uniknout konkurenci s dalšími mikroorganizmy pomocí penetrace do kořenů. Zůstávají buď uvnitř rostliny do její smrti nebo putují ven z rostliny a infikují další části kořenů nebo kořeny dalších rostlin. Rostliny infikované půdními patogeny trpí například kořenovou hnilobou, černáním kořene, vadnutím, zakrněním nebo opadáváním semenáčků. Půdní patogeny mohou mít ničivé účinky na polích i ve sklenících, v industrializovaných i rozvojových zemích (Haas a Défago 2005). 2. Biologická kontrolní agens u rostlin Úroda zeleniny, ovoce, květin i bavlny je často zničena houbovými i bakteriálními nemocemi. Používání moderních chemických prostředků, například metylbromidu, ke kontrole půdních patogenů, však způsobuje závažné ekologické problémy. Tyto problémy by mohly být vyřešeny pomocí biologických kontrolních agens, která jsou bezpečnější alternativou. Nevýhodou těchto agens jsou rozdíly mezi používáním in vitro a jejich úspěšnou aplikací na polích, způsobené půdní nestejnorodostí, výkyvy teploty, množstvím živin, půdní strukturou, ph, přítomností toxických chemikálií, přítomností dalších mikrobiálních druhů a dalšími faktory, které ovlivňují mikrobiální a houbový růst, přežívání a účinnost. Obecně platí, že krátce po zavedení bakteriálních biologických kontrolních agens do půdy začne bakteriální populace postupně klesat (Bashan 1998, Zohar-Perez a kol. 2005). 2.1 Počátky využití mikroorganizmů k biologické kontrole V roce 1960 vědci, hlavně ze Sovětského Svazu, používali bakterie ke zvýšení úrodnosti. Jako bakteriální hnojiva používali Azotobacter a Bacillus spp. Domnívali se, že ke zvýšení úrodnosti dochází díky asociativní fixaci dusíku a rozpouštění fosfátů (Maier a kol. 2000). V roce 1963 se konalo mezinárodní sympozium nazvané Ekologie půdních rostlinných patogenů úvod do biologické kontroly ( Ecology of soil-borne plant pathogens - prelude to biological control ). Vědci se domnívali, že antagonistické mikroorganizmy 6

mohou soutěžit s patogeny, zvláště pomocí produkce antibiotických složek. V půdě tato antibiotika mohou zasahovat do vývoje patogenů, například během klíčení spor nebo na počátku kořenové infekce. Toto vysvětlení bylo zajímavé, o spoustě mikroorganizmů se totiž vědělo, že jsou výborní producenti antibiotik in vitro (například Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas spp.). Již kolem roku 1920 byly určité důkazy o tom, že antibiotika jsou produkována v půdě, ale nikdo je nespojoval s biologickou kontrolní aktivitou. V roce 1956 Wright popsal, že Trichoderma viridae, houba používaná k biologické kontrole, produkuje zjistitelné množství protihoubového antibiotického gliotoxinu v upravených půdách. Rozhodující role antibiotik v biologické kontrole kořenových chorob však zůstává neobjasněna ze tří důvodů: 1. Šance detekce environmentálně významných antibiotik jsou mnohem lepší v rhizosféře než v malém množství půdy, protože mikrobiální aktivity jsou 10-krát až 1000-krát vyšší v okolí rostlinných kořenů než v běžné půdě. Antibiotika navíc adsorbují na půdní částice. 2. Bylo potřeba více citlivých technik, jako například účinná kapalinová chromatografie (HPLC), aby mohla být provedena separace a detekce antibiotik. 3. K pochopení vztahů mezi antibiotiky a biologickou kontrolní aktivitou je nezbytné vytvořit mutanty biologických kontrolních kmenů, které specificky postrádají produkci antibiotik (Haas a Défago 2005). V roce 1980 vzniklo označení rhizobakterie podporující rostlinný růst (PGPR = plant growth-promoting rhizobacteria) a škodlivé rhizosférické mikroorganizmy (DRMO = deleterious rhizosphere microorganisms) (Maier a kol. 2000). 2.2 Bakterie podporující rostlinný růst Bakterie podporující rostlinný růst (PGPB = plant growth-promoting bacteria) jsou spojeny s mnoha, ale ne se všemi, rostlinnými druhy a jsou obvykle přítomny v různých životních prostředích. Široce studovaná podskupina PGPB jsou PGPR - rhizobakterie podporující rostlinný růst, bakterie, které osídlují povrch kořene a vytváří vzájemné vztahy s rhizosférou. Některé z těchto PGPR mohou také vstupovat dovnitř kořene a zde tvořit endofytní populaci. Mnohé z nich jsou schopny překročit endodermis, přecházet z kořenové kůry do cévního systému a následně prospívat jako endofyté ve stonku, listech, hlízách a dalších orgánech. Rozsah endofytické kolonizace v orgánech a pletivech hostitelské rostliny odráží schopnost bakterií se selektivně adaptovat na specifické ekologické niky. Úzké spojení 7

mezi bakteriemi a hostitelskými rostlinami se vytváří bez poškození rostliny (Compant a kol. 2005). Obr. 2 Vlevo luskoviny pěstované s PGPR, vpravo luskoviny pěstované bez PGPR. Bakterie podporující rostlinný růst způsobují prodlužování kořene a větší počet kořenových vlásků (www.tau.ac.il/~ecology/virtau/5-evgeniy_a/evgeniy.htm). PGPR konkurenčně osídlují rostlinné kořeny a stimulují rostlinný růst a/nebo redukují výskyt rostlinných nemocí (Haas a Défago 2005). PGPR jsou běžně používány jako očkovací látky pro zlepšení růstu a úrody zemědělských plodin, ačkoliv kontrola této selekce PGPR druhů je velmi obtížná (Khalid a kol. 2004). Aby měly PGPR prospěšné účinky pro rostliny, musí být přítomny na kořenech v dostatečném počtu. Rozhodující úroveň kolonizace, které musí být dosaženo, se odhaduje na 10 5-10 6 CFU (colony forming units) na kořenech v případě Pseudomonas spp. Odhaduje se, že kořeny jsou v přirozených podmínkách kolonizovány 10 8-10 9 aerobních bakterií, z nichž 0,1-1% tvoří biologické kontrolní druhy rodu Pseudomonas. Uměle naočkované PGPR mohou zpočátku kolonizovat kořeny v 10 7-10 8 CFU, ale tato hladina vždy během pár týdnů poklesne (Haas a Défago 2005). 8

Obr. 3 Vzájemné vztahy mezi biologickými kontrolními PGPR, rostlinami, patogeny a půdou. Tyto prvky se ovlivňují navzájem prostřednictvím biotických a abiotických signálů, mnoho z nich je stále neobjasněných. ISR = indukovaná systematická rezistence (Haas a Défago 2005). Existuje teorie, že rychle rostoucí rhizobakterie mohou potlačovat houbové patogeny pomocí konkurence o zdroje uhlíku a energie. Ačkoliv je dokázáno, že rhizobakteriální populace jako celek může působit proti houbovým patogenům v půdě a účinné biologické kontrolní PGPR musí být schopny konkurence o živiny v rhizosféře, je obtížné si představit, že 1% rhizobakterií může potlačovat rostlinné nemoci (Haas a Défago 2005). 9

2.2.1 Biohnojiva a biopesticidy Existují PGPR, označované jako biohnojiva. Zde se uplatňují mechanismy jako fixace dusíku, rozpouštění fosfátů, produkce fytohormonů, například auxinů a cytokininů, a nestálé růstové stimulátory, například etylen a 2,3-butandiol. Další PGPR se často nazývají biopesticidy. Tyto PGPR většinou patří do rodu Pseudomonas nebo Bacillus spp. Jsou antagonisty kořenových patogenů (Haas a Défago 2005). 2.3 Mechanismy půdní biologické kontroly rostlinných nemocí Navzdory různým ekologickým nikám, volně žijící rhizobakterie a endofytické bakterie využívají některé shodné mechanismy k podpoře rostlinného růstu a ke kontrole fytopatogenů (Hallman a kol. 1997, Compant a kol. 2005). Mechanismy biologické kontroly zprostředkované PGPB jsou: Konkurence o ekologické niky nebo substráty Produkce inhibičních alelochemikálií Indukovaná systematické rezistence (ISR = induction of systematic resistance) a systematická získaná rezistence (SAR = systematic acquired resistence) (Compant a kol.2005) Rozdělení mechanismů biologické kontroly zprostředkované PGPB: Přímé účinky: zvýšené zásobování živinami a produkce fytohormonů Nepřímé účinky: produkce antibiotik, produkce železitých chelátových sideroforů a indukce mechanismů rostlinné rezistence (Persello-Cartieaux a kol. 2003) Přímé mechanismy u PGPR mohou být demonstrovány za nepřítomnosti rostlinných patogenů nebo dalších rhizosférických mikroorganizmů. K demonstraci nepřímých mechanismů je nutná přítomnost rostlinných patogenů, zahrnují schopnost PGPR redukovat škodlivé účinky těchto patogenů na výnosech plodin (Nelson 2004). 10

2.3.1 Konkurenční kolonizace kořene 2.3.1.1 Vzájemné vlivy rostlin a rhizobakterií Složení rhizobakteriální populace je závislé na rostlinných druzích a na rozdílech ve složení a množství kořenových výměšků. Kořenové výměšky poskytují rhizosférickým mikroorganizmům živiny bohaté na uhlík, jako jsou organické kyseliny (například citrát, malát, sukcinát, pyruvát, fumarát, oxalát, acetát) a cukry (například glukóza, xylóza, fruktóza, maltóza, sacharóza, galaktóza, ribóza). Tyto živiny jsou nepostradatelné, na rozdíl od proměnlivého množství vyskytujících se α-aminokyselin, nukleobazí a vitamínů (například thiaminu a biotinu). Schopnost rhizobakterií využívat organické kyseliny a zdroje uhlíku ovlivňuje konkurenční vztahy v rhizosféře. Vědci se domnívají, že specifické interakce probíhají při počátečních kontaktech rhizobakteríí s kořeny. Důkaz o tomto tvrzení může být pozorován u některých bakteriálních mutantů se sníženou schopností kořenové kolonizace. Rozsáhlý výzkum kolonizačnědefektních mutantů Pseudomonas spp. ukázal, že schopnost využívat malát a sukcinát jsou v podmínkách rhizosférické kompetence důležitější, než schopnost využívat glukózu a fruktózu. Chemotaxe, pohyb pomocí bičíků, lipopolysacharidová (LPS) struktura, vnější membránový protein OprF a pili jsou také důležité pro konkurenční kolonizaci kořene (Haas a Défago 2005). Z bakteriálních lipopolysacharidů, zvláště O-antigenní řetězce mohou přispět ke kořenové kolonizaci, ačkoliv důležitost LPS v této kolonizaci může být druhově závislá. Z pilů je důležitý typ IV, uplatňující se také při adhezi zvířecích a lidských patogenů na eukaryotické buňky. Tento typ pilů hraje roli v rostlinné kolonizaci u endofytických bakterií, například u Azoarcus sp. (Compant a kol. 2005). 2.3.1.2 Kořenová kolonizace a místně specifická rekombináza Bakteriální vlastnosti vedoucí k účinné kořenové kolonizaci se nemusí vyskytovat trvale. Uplatňuje se zde rekombinace DNA řízená místně specifickou rekombinázou. U některých PGPB je účinná kořenová kolonizace spojena se schopností buněk produkovat tuto místně specifickou rekombinázu. Přenos místně specifického rekombinačního genu z rhizosféricky kompetentní P. fluorescens do rhizosféricky nekompetentního kmene zvýší schopnost kolonizace kořenové špičky (Compant a kol. 2005). 11

2.3.1.3 Využití kořenových výměšků a kořenového slizu u PGPB Kořenové výměšky jsou primární zdroj živin pro rhizosférické mikroorganizmy. PGPB jsou dobře přizpůsobené k jejich využití. V kořenových výměšcích jsou cukry a aminokyseliny, avšak tyto látky nejsou potřebné při kolonizaci kořene. Konkurenční kolonizace kořene je ovlivněna polyaminy, jako je putrescin, spermin a spermidin. PGPB řídí rychlost příjmu těchto látek. Jejich vysoké titry mohou zpomalit bakteriální růst a snížit schopnost bakterií konkurenčně kolonizovat kořeny. Kořenový sliz také nabízí použitelný zdroj uhlíku pro PGPB, důležitý při konkurenční kolonizaci (Compant a kol. 2005). Při kolonizaci kořene je rozhodující schopnost mikrobů soutěžit o živiny dostupné v semenech a o kořenové výměšky. Kořenové výměšky mohou být rozpoznány, využity a zpracovány rhizobakteriemi jako živiny a signály, nebo působí jako toxiny (Persello- Cartieaux a kol. 2003). 2.3.2 Biologická kontrolní aktivita zprostředkovaná syntézou alelochemikálií Kolonizace rostlin PGPB a ochrana rhizosférických nik je závislá na produkci bakteriálních alelochemikálií, včetně železitých chelátových sideroforů, antibiotik, pesticidních těkavých látek, lytických enzymů a detoxifikačních enzymů (Compant a kol. 2005). 2.3.2.1 Konkurence o železo a role sideroforů Železo je esenciální růstový prvek pro všechny žijící organizmy. Nedostatek dostupného železa v půdě a na povrchu rostlin vyvolává konkurenci o tento prvek. V podmínkách s nízkou koncentrací železa produkují PGPB nízkomolekulární látky - siderofory, které přednostně získávají železité ionty (Compant a kol. 2005). Dostupnost železa ovlivňuje mnoho metabolických procesů bakterií. Změny v dostupnosti železa, které jsou i nejsou přidruženy s okamžitými a zjistitelnými změnami ve velikosti populace, ovlivňují způsobilost bakteriálního kmene (Loper a Henkels 1999). Ačkoliv různé bakteriální siderofory se liší svou schopností získávání železa, důležité je, že zbavují prostředí tohoto esenciálního prvku, který se stává nedostupným pro patogenní houby. Houbové siderofory mají totiž nižší afinitu k železitým iontům. Některé PGPB kmeny 12

jsou ještě důslednější a získávají železo z heterogenních sideroforů produkovaných jinými společně se vyskytujícími mikroorganizmy (Loper a Henkels 1999, Compant a kol. 2005). Biosyntéza sideroforů je řízena železosenzitivními Fur proteiny, všeobecnými regulátory GacS a GacA, sigma faktory RpoS, PvdS a FpvI, N-acetyl laktony homoserinu a místně specifickými rekombinázami (Cornelis a Matthijs 2002, Ravel a Cornelis 2003, Compant a kol. 2005). Syntézu sideroforů ovlivňuje velké množství faktorů životního prostředí, včetně ph, hladiny železa a forem železitých iontů, přítomnost dalších stopových prvků a přiměřené zásobování uhlíkem, dusíkem a fosforem ( Compant a kol. 2005). 2.3.2.2 Antibióza a antibiotika Antibióza je inhibice nebo ničení jednoho organizmu pomocí metabolitů produkovaných jiným organizmem. PGPB mohou produkovat silné růstové inhibující sloučeniny, které jsou účinné proti široké skupině mikroorganizmů. Takové sloučeniny se nazývají širokospektrální antibiotika. Na druhé straně, některé metabolity jako bakteriociny jsou účinné jen proti specifické skupině mikroorganizmů. Antagonisté, kteří produkují antibiotika, mají konkurenční výhodu v zabírání určitých nik a v zabezpečování substrátů jako potravinových zdrojů, protože jejich antibiotika potlačují růst nebo rozmnožování dalších mikroorganizmů. Antibióza může být také účinný mechanismus k ochraně klíčících semen. Mnoho antibiotik vytvářených antagonisty není produkováno proti specifickým patogenům. Také specifický antagonista nemusí produkovat stejná antibiotika v různých podmínkách vnějšího prostředí. Někteří antagonisté produkují několik biologicky aktivních sloučenin, které jsou účinné proti různým rostlinným patogenům (Trigiano a kol. 2003). Rozmanitost antibiotik je velká, patří sem látky jako 2,4-diacetylfluoroglucinol (DAPG), amfizin, oomycin A, fenazin a další produkované Pseudomonas spp. (Nielsen a Sorensen 2003, Compant a kol. 2005), oligomycin A, kanosamin, zwittermicin A a xantobacin produkované Streptomyces, Bacillus a Stenotrophomonas spp. (Hashidoko a kol. 1999, Compant a kol. 2005). Regulační kaskáda antibiotik zahrnuje GacA/GacS nebo GrrA/GrrS, RpoD a RpoS, N-acetyl laktony homoserinu a pozitivní autoregulaci (Chancey a kol. 1999, Compant a kol. 2005). Syntéza antibiotik je těsně spojena s celkovým metabolickým stavem buňky, který je ovlivňován dostupností živin a dalšími podměty z vnějšího prostředí, jako jsou minerály, zdroj a zásoba uhlíku, ph, teplota a další parametry (Duffy a Défago 1999). Stopové prvky, 13

hlavně zinek, a zdroje uhlíku ovlivňují genetickou stabilitu/nestabilitu bakterií a ovlivňují jejich schopnost produkovat sekundární metabolity (Compant a kol. 2005). Mnoho kmenů produkuje více sekundárních antimikrobiálních metabolitů. Podmínky favorizující určitou látku mohou působit příznivě na produkci další látky (Duffy a Défago 1999). To zabezpečí různý stupeň flexibility pro antagonistické bakterie, které čelí proměnlivým vnějším podmínkám (Compant a kol. 2005). Syntézu antibiotik také ovlivňují biotické podmínky, jako například růst a vývoj rostliny. Biologická aktivita DAPG je navozena jen ve výměšcích starších rostlin (Picard a kol. 2000). Důležitou roli hraje také genotyp hostitelské rostliny (Compant a kol. 2005). 2.3.2.3 Produkce lytických enzymů Lyze houbových buněk a degradace jejich buněčných stěn je pravděpodobně následek produkce enzymů degradujících buněčnou stěnu bakteriemi, a to i v případě, že ve stejnou dobu jsou produkována antibiotika (Whipps 2001). Mezi nejvýznamnější lytické enzymy patří chitinázy, proteázy, laminarinázy. Stejně jako u sideroforů a antibiotik, regulaci produkce lytických enzymů, především proteáz a chitináz, řídí GacA/GacS (Natsch a kol. 1994, Compant a kol. 2005) nebo GrrA/GrrS regulační systém (Compant a kol. 2005). Chitináza produkovaná Serratia plymuthica C48 inhibuje klíčení spór a prodlužování klíčících hyf u Botrytis cinerea (Frankowski a kol. 2001, Compant a kol. 2005). Schopnost produkce extracelulárních enzymů je považována za klíčovou u Serratia marcescens při působení jako antagonista proti Sclerotium rolfsii (Compant a kol. 2005) a u Paenibacillus sp. kmene 300 a Streptomyces sp. kmene 385 potlačujících Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum. Extracelulární chitinázy a laminarinázy syntetizované Pseudomonas stutzeri způsobují hnití a rozklad mycelia u Fusarium solani (Lim a kol. 1991, Compant a kol. 2005). 2.3.2.4 Detoxifikace a degradace faktorů virulence Další mechanismus biologické kontroly je detoxifikace faktorů virulence u patogenů (Compant a kol. 2005). Některé biologické kontrolní agens mohou detoxifikovat albicidin, toxin produkovaný Xanthomonas albilineans. Detoxifikační mechanismus, do kterého patří produkce proteinů dočasně blokuje toxiny u Klebsiella oxytoca a Alcaligenes denitrificans. Několik 14

mikroorganizmů, včetně kmenů Burkholderia cepacia a Ralstonia solanaceum může hydrolyzovat kyselinu fusarovou, fytotoxin produkovaný různými kmeny rodu Fusarium. Některé PGPB potlačují quorum sensing (QS) systémy patogenů degradací autoindukovaných signálů. Tím blokují expresi virulentních genů (Compant a kol. 2005). Buňky spolu často komunikují přes sekreci, absorpci, nebo rozpoznáváním malých signálních molekul. V mnoha případech se uplatňuje mechanismus známý jako quorum sensing. Hromadění quorum sensing signálních molekul slouží ke zjišťování hustoty bakteriální populace. Když dosáhnou prahové úrovně, dochází k aktivaci některých genů a ke vzniku kompetence. Různé bakteriální druhy produkují a reagují na různé quorum sensing signální molekuly. Mechanismy působení quorum sensing signálních molekul jsou současná cílová exprese genu a koordinace celulární aktivity. Difuzní signální molekuly N-acetyl laktony homoserinu (AHL), které jsou přítomny v quorum sensing systémech, jsou typické pro mnoho G- bakterií. AHL řídí různorodé mikrobiální biologické funkce, včetně produkce antibiotik, exprese virulentních faktorů a tvorby biofilmu. Bacillus thuringiensis potlačuje virulenci závislou na quorum sensing u rostlinného patogenu Erwinia carotovora. E. carotovora produkuje a reaguje na signální acylované laktony homoserinu (AHL). Kmeny B. thuringiensis mají AHL laktonázu, která je silný AHL degradující enzym a tím potlačuje tento rostlinný patogen (Dong a kol. 2004). Vědci se domnívají, že patogenní toxiny patogenů vykazují širokospektrální aktivitu a mohou potlačovat růst mikrobiálních konkurentů nebo detoxifikovat antibiotika. Příkladem je Fusarium oxysporum, které degraduje 2,4-diacetylfluoroglucinol produkovaný Pseudomonas fluorescens, vzniká monoacetylfluoroglucinol a fluoroglucin (Schouten a kol. 2004). 2.3.3. Indukovaná systematická rezistence a systematická získaná rezistence Některé biologické kontrolní PGPB mohou vyvolat u hostitelské rostliny systematickou rezistenci proti širokému spektru patogenů (Compant a kol. 2005, Haas a Défago 2005). Indukovaná systematická rezistence (ISR = induced systematic resistance) umožňuje rostlinám odolávat útoku patogenů do listů a kořenů. Mnoho PGPB vyvolává ISR bez ohledu na produkci antibiotik (Haas a Défago 2005). ISR je fenotypicky podobná systematické získané rezistenci (SAR = systematic acquired resistence). SAR vznikne po úspěšné aktivaci obranných mechanismů rostliny jako odpověď na primární infekci způsobenou patogenem. Později dochází k hypersenzitivní 15

reakci a vzniku místních hnědých nekrotických lézí a k vysušení pletiv. Stejně jako SAR je ISR účinná proti různým typům patogenů. Rozdíl je v tom, že při ISR prospěšné bakterie nezpůsobují na rostlinách viditelné změny. Další rozdíl mezi ISR a SAR je závislost na pozdější akumulaci kyseliny salicylové (Compant a kol. 2005). SAR se vyznačuje hromaděním kyseliny salicylové (SA) a proteinů příbuzným patogenním proteinům (PR). Některé PR proteiny, například chitinázy a glukanázy, působí přímo na houbách, kde degradují buněčné stěny. ISR vyvolaná některými PGPR není spojena s hromaděním SA nebo PR proteinů, ale zahrnuje jinou signální transdukční dráhu tvořenou kyselinou jasmonovou a etylenem. Jakmile je ISR aktivována PGPB, udržuje se po dlouhé časové období, i když se sníží počet patogenních bakterií (Zehnder a kol. 1999). Studie s mutanty Arabidopsis thaliana prokázala, že obrana pomocí jasmonátu a etylenu je důležitá pro ISR, zatímco dráha závislá na kyselině salicylové u SAR je méně důležitá (Haas a Défago 2005). ISR je více závislá na zvýšení citlivosti k těmto složkám, než na zvýšení jejich produkce. Zvýšená produkce totiž může vést k aktivaci částečně odlišných obranných genů (Compant a kol. 2005). Odezva ISR je závislá na kmenech PGPB, rostlinném druhu a kultivarech (Haas a Défago 2005). ISR vyvolaná PGPB byla poprvé pozorována na karafiátu (Dianthus caryophillus) s redukcí citlivosti na vadnutí způsobené Fusarium sp. a na okurce (Cucumis sativus) s redukcí vnímavosti k listovým nemocem způsobeným Colletotrichum orbiculare. Při navození ISR dochází v rostlině k zesílení buněčných stěn, ke změně fyziologie rostliny a metabolickým odezvám, vedoucím ke zvýšení syntézy rostlinných obranných látek jako rekce na patogeny a/nebo na biotické stresové faktory (Compant a kol. 2005). Zesílení buněčných stěn je způsobeno tvorbou, uvolňováním a hromaděním fenolických látek v místě útoku patogenů. Biochemické nebo fyziologické změny v rostlině jsou způsobeny hromaděním PR proteinů, jako jsou PR-1, PR-2, chitináza a některé peroxidázy (M'Piga a kol. 1997). Ne všechny PGPB využívají PR proteiny, některé zvýší ukládání peroxidázy, fenylalanin amoniové lyázy, fytoalexinů, polyfenolové oxidázy a/nebo chalkonové syntázy. Některé geny u PGPB zapojené v syntéze antibiotik jsou vysoce homologické s některými rostlinnými geny, které jsou zapojeny v obranných reakcích (Compant a kol. 2005). 16

3. Nejdůležitější rody bakterií podporujících rostlinný růst Růst rostlin je v přírodních půdách ovlivňován biotickými i abiotickými stresovými faktory. K potlačení těchto faktorů se používají chemické látky nebo bakterie podporující rostlinný růst. Tyto bakterie mají prospěšné účinky na růst a vývoj rostliny. Aby byly účinné, musí být v půdě v dostatečném množství (Nelson 2004) a musí mít schopnost přežívat a usadit se v rhizosféře (Kurze a kol. 2001). Níže jsou popsány nejvýznamnější rody a druhy bakterií podporujících rostlinný růst a mechanizmy jejich vlivu na rostlinu a jiné, například patogenní, mikroorganizmy. 3.1 Pseudomonas Členové rodu Pseudomonas jsou G- bakterie tyčkovitého tvaru, které jsou charakteristické metabolickou všestranností, aerobní respirací, pohyblivostí pomocí jednoho nebo několika polárních bičíků a vysokým obsahem guaninu a cytozinu (59 68 %). Do této široké a heterogenní skupiny patří například Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens a Pseudomonas syringae (Haas a Défago 2005). Některé kmeny fluorescenčních pseudomonád kolonizují kořeny u různých plodin a chrání je před nemocemi způsobenými půdními houbovými patogeny. Potlačení nemocí těmito bakteriemi zahrnuje směs mechanismů, včetně účinné konkurence o živiny a kolonizační místa, potlačení produkcí antimikrobiálních složek, a navození rezistence rostliny. Účinnost kmenů rodu Pseudomonas závisí velkou měrou na jejich schopnosti udržovat stabilní populaci a na metabolické aktivitě, projevující se minimálně po dobu potřebnou k projevení prospěšných účinků bakterií. Stejně jako ostatní PGPB v půdě, jsou i druhy rodu Pseudomonas vystaveny řadě proměnlivých biotických a abiotických stresových faktorů, jako je konkurence, predace, změny v teplotě a osmolaritě, dostupnost vody a živin. Tyto faktory ovlivňují biologickou kontrolní aktivitu PGPB i velikost populace. Při přežívání v měnících se vnějších podmínkách jsou bakterie závislé na regulačních mechanismech, které jim dovolí rychle reagovat na stresové situace. Mezi regulační prvky, které přispívají k přežití bakterií ve stresových podmínkách, patří alternativní sigma faktory RpoS (σ s ) a RpoE (σ 22 ), u fluorescenčních pseudomonád označovaný jako AlgU nebo AlgT. RpoS se u pseudomonád uplatňuje při toleranci k hyperosmolaritě, vysoké teplotě a k agens tvořícím reaktivní kyslík. AlgU přispívá k toleranci proti osmotickému, oxidačnímu a 17

tepelnému stresu u P. aeruginosa a P. syringae (Schneider-Keel a kol. 2001). Obr. 4 Pseudomonas fluorescens kolonizující kořeny pšenice (www.tau.ac.il/~ecology/virtau/5-evgeniy_a/evgeniy.htm). Fluorescentní Pseudomonas produkují během kořenové kolonizace antifungální antibiotika, která navozují systematickou rezistenci v hostitelské rostlině nebo specificky ovlivňují schopnost patogena vyvolat onemocnění. Fluorescence u Pseudomonas je způsobena extracelulárním difúzním pigmentem, který se nazývá pyoverdin (Pvd) nebo pseudobaktin. Tento pigment má vysokou afinitu k Fe 3+ iontům, slouží jako siderofor. Ferripyoverdin je pyoverdin v komplexu s Fe 3+ a reaguje s vnějším specifickým membránovým receptorem, který je přítomen u pyoverdinprodukujících kmenů, ale může se vyskytovat i u některých neprodukujících kmenů. Následně je Fe 3+ transportován do cytoplazmy a redukován na Fe 2+. V určitých podmínkách funguje pyoverdin jako difúzní bakteriostatické nebo fungicidní antibiotikum, zatímco ferripyoverdin tuto funkci nemá. Pseudomonas produkující účinný siderofor jako je pyoverdin, mohou konkurovat dalším mikroorganizmům, které mají méně účinné systémy pro příjem iontů (Haas a Défago 2005). Nedostatek železa způsobený pyoverdinem je biologický kontrolní mechanismus, který se lépe uplatňuje v ph 6 než v ph 8. Bylo dokázáno, že ph je hlavní faktor ovlivňující dostupnost železa. Další siderofor produkovaný Pseudomonas, pyochelin, je antifungální antibiotikum. Pyochelin je relativně slabý Fe 3+ chelát, ale dobrý Cu 2+ a Zn 2+ chelát, proto může zbavit některé houby mědi a/nebo zinku. Rozdíl mezi siderofory a antibiotiky je nejasný. Siderofory jsou součástí primárního metabolismu, protože železo je esenciální prvek, ale příležitostně se chovají jako antibiotika, která jsou obvykle považována za sekundární metabolity. 18

Většina biologických kontrolních kmenů Pseudomonas spp. produkuje jednu nebo více antibiotických složek, které nejsou příbuzné s typickými siderofory. In vitro tato antibiotika potlačují houbové patogeny, ale mohou být také účinné proti některým bakteriím a v některých případech i proti vyšším organizmům. Mezi nejvýznamnější antibiotika produkovaná Pseudomonas patří fenaziny, fluoroglucinoly, pyoluteorin, pyrrolnitrin, cyklické lipopeptidy a kyanovodík, který je nestálý (Haas a Défago 2005). Obr. 5 Antibiotika produkovaná fluorescentními druhy rodu Pseudomonas, důležitá pro biologickou kontrolu (Haas a Défago 2005). Fenaziny jsou analogy flavinových koenzymů a potlačují transport elektronů. V přítomnosti ferripyochelinu fenaziny katalyzují tvorbu hydroxylových radikálů, které poškozují lipidy a další makromolekuly. 2,4-diacetylfluoroglucinol ničí membrány u Pythium spp. a ničí zoospory těchto oomycet. Ve vysoké koncentraci je však fytotoxický. Pyrrolnitrin je inhibitor houbových respiračních řetězců (Haas a Défago 2005) a jeho syntetická analoga se používají jako fungicidy (Ligon a kol. 2000). Cyklické lipopeptidy mají vlastnosti tenzidů 19

a jsou schopny se vkládat do membrán a rušit jejich funkce, mají široké antibakteriální a antifungicidní účinky (Haas a Défago 2005). Kyanidové ionty odvozené od kyanidu (HCN) jsou účinné inhibitory metalloenzymů, hlavně cytochromoxidázy c obsahující měď (Blumer a Haas 2000). Některé kmeny Pseudomonas corrugata, P. fluorescens, P. marginalis a P. putida jsou účinné proti houbě Verticillium dahliae Kleb., která způsobuje vadnutí plodin, hlavně u jahod (Fragaria x ananassa), řepky olejky (Brassica napus) a brambor (Solanum tuberosum). Mikrosklerocia V. dahlie se vyvíjí v pletivech mrtvé rostliny, mohou proniknout do půdy a zůstávat v ní i několik let bez přítomnosti hostitele (Berg a kol. 2002). Fluorescentí Pseudomonas spp. potlačují i patogenní houby Pythium ultimum a Rhizoctonia solani v rhizosféře cukrové řepy (Beta vulgaris altissima) pomocí produkce antibiotik viskosinamidu a 2,4-diacetylfluoroglucinolu, železitých chelátových sideroforů, kyanidu a enzymu endochitinázy (Nielsen a kol. 1998). 3.2 Serratia Serratia jsou G- nesporulující, fakultativně anaerobní, pohyblivé tyčinky. Biochemicky jsou značně aktivní, převažuje fermentativní nebo respirační typ metabolismu. Často tvoří pigmenty, například prodigiosin, které je chrání před slunečním zářením (Votava a kol. 2003). Obr. 6 Biosyntéza prodigiosinu u Serratia marcescens. MAP a MBC jsou prekurzory identifikované na mutantech (Williams 1973). Také rody Serratia jsou často asociovány s rostlinnými kořeny a mají antifungální vlastnosti, proto se používají pro biologickou kontrolu rostlinných patogenů. Například 20

Serratia liquefaciens, vyskytující se v rhizosféře karafiátů, se užívá pro ochranu kořenových řízků a S. marcescens B2 potlačuje půdní nemoci u bramboříků. S. plymuthica má antifungální účinky proti Fusarium culmorum, Pythium spp. a dalším houbovým patogenům (Kurze a kol. 2001). Některé chitinolytické bakterie a houby, například Serratia marcescens, jsou biologické kontrolní agens (BCA) chránící rostliny proti patogenním houbám. Chitin, nerozpustný lineární 1,4-β-glykosidicky pospojovaný polymer N-acetylglukosaminu (GlcNac), je významná stavební složka většiny buněčných stěn u hub (Berg a kol. 1999). S. plymuthica kmen HRO-C48 se nachází v rhizosféře řepky olejky (Brassica napus) a jako biologické kontrolní agens splňuje následující kritéria: vysoká chitinolytická aktivita působící proti houbovým patogenům, produkce rostlinného růstového hormonu indol-3- octové kyseliny, relativní neškodnost k lidskému zdraví a životnímu prostředí a nízká rezistence k antibiotikům. S. plymuthica kmen HRO C48 je účinný proti vadnutí a kořenové hnilobě u jahod (Fragaria x ananassa) způsobených Verticillium dahlie a Phytophthora cactorum (Kurze a kol. 2001). Kmen HRO-C48 produkuje siderofory a antibiotikům podobné látky. Přímé antifungální účinky mohou být založeny na antibióze a produkci lytických enzymů. S. plymuthica kmen HRO-C48 produkuje různé chitinázy. Chitinolytický systém je tvořen ze dvou endochitináz, chitobiosidázy a dvou N-acetyl-β-1,4-D-hexosaminidáz, včetně chitobiázy. N-terminální aminokyselinová sekvence endochitinázy je podobná chitináze u Serratia marcescens (Berg a kol. 1999). 3.3 Streptomyces Členové rodu Streptomyces jsou G+ bakterie patřící mezi aktinomycety. Většinou tvoří rozsáhlé vzdušné mycelium s dlouhými řetízky spor. Jsou významnými producenty antibiotik (Rosypal a kol. 2003). Tyto bakterie jsou velmi citlivé vůči kyselým podmínkám. Vyplývá to z jejich rozšíření v kyselých půdách. Ve vysoce kyselých půdách je jejich množství často menší než 1% celkového množství bakterií, růst je prakticky potlačen v minerálních půdách s ph 5.0 nebo méně. Některé kmeny streptomycet vyskytující se v kyselých půdách jsou více tolerantní ke kyselým podmínkám než kmeny z neutrálních nebo alkalických půd. Tato tolerance je ovlivněna i dalšími faktory, jako je konkurence, vlhkost a dostupnost dusíku. 21

Mohou být právě tak důležité jako půdní ph v ovlivnění vývoje těchto bakterií (Hagedorn 1976). Streptomyces spp. jsou schopny produkovat široké spektrum antibiotik jako sekundárních metabolitů, stejně jako rozmanité množství enzymů degradujících buněčnou stěnu hub, jako jsou celulázy, hemicelulázy, chitinázy, amylázy, glukanázy a jiné. Streptomyces spp. mohou vystupovat jako mykoparazité houbových spor a hyf, které ničí pomocí výše uvedených extracelulárních enzymů. Sacharidy ovlivňují u streptomycet produkci antibiotik a vzájemné vztahy mezi bakteriální buňkou a buněčným povrchem houbové hyfy. Streptomyces ambofaciens potlačuje Pythium, které způsobuje opadávání semenáčků u rajčat (Solanum lycopersicon), a Fusarium, které způsobuje vadnutí bavlníku (Gossypium herbaceum). Většina poškození Pythium nastane v počátečním stádiu klíčení semen, kdy sazenice uvolní velké množství výměšků a zralé buněčné stěny nejsou ještě plně vytvořeny. Podobné potlačení kořenových chorob způsobují některé druhy streptomycet ve formě spor, mycelia, nebo kombinace spor a mycelia. Rhizoctonia, způsobující kořenovou hnilobu hrachu (Pisum sativum), je potlačována S. hygroscopicus var. geldanus pomocí produkce geldanamycinu, antibiotika produkovaného tímto kmenem v půdě. Mnoho studií naznačuje, že kmeny rodu Streptomyces jsou kvantitativně i kvalitativně důležité v rhizosféře, mohou zde působit jako rostlinné růstové stimulátory, stejně jako kořenoví kolonizátoři (Yuan a Crawford 1995). Obr. 7 Chemická struktura geldanamycinu (http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/g3381dat.pdf). Streptomyces kmen WYEC108 (později se ukázalo, že jde o druh Streptomyces lydicus) je antagonista Pythium ultimum a Rhizoctonia solani. Druhy rodu Pythium jsou významné půdní patogeny, které způsobují hnilobu semen a před- a poemergenční 22

opadávání semenáčků u široké škály hostitelských rostlin. Kmen Streptomyces lydicus WYEC108 je silný antagonista různých houbových patogenů. Mechanismus spočívá v produkci extracelulárních antifungálních metabolitů. Když byly spory nebo vlákna S. lydicus WYEC108 použity pro obalení hrachových semen, semena byla chráněná před invazí P. ultimum. Kolonizace kořenových špiček kmenem WYEC108 může dlouhodobě tlumit kořenové nemoci. Mladé buňky v kořenových špičkách jsou více náchylné k útokům půdních houbových patogenů (Yuan a Crawford 1995). Obr. 8 Kmen S. lydicus WYEC108 ničící buněčnou stěnu hyfy P. ultimum P8 (Yuan a Crawford 1995). Kmeny streptomycet kolonizující kořeny se využívají k nahrazení nebo k doplnění chemických fungicidů v zemědělství (Yuan a Crawford 1995). 3.4 Burkholderia Členové tohoto rodu jsou G- nefermenutjcí štíhlé tyčinky, rovné nebo mírně zahnuté, neschopné fermentovat glukózu, ovšem štěpící ji aerobně respiračním mechanismem (Votava a kol. 2003). Burkholderia sp. kmen PsJN, který byl původně určen jako Pseudomonas sp. kmen PsJN, je bakterie stimulující rostlinný růst. Byla izolována jako kontaminanta symbionta cibulových kořenů Glomus vesiculiferum. Tato bakterie slouží jako PGPB, snižuje hladinu zpomalujícího hormonu etylenu pomocí produkce deaminázy 1-aminocyklopropan-1-23

karboxylové kyseliny (ACC). Kmen PsJN také vykazuje biologickou kontrolní aktivitu proti plísni šedé a může efektivně chránit před Botrytis cinerea. Tato bakterie byla objevena v kořenech a stoncích brambor (Solanum tuberosum) a rajčat (Solanum lycopersicon), v listech, stoncích a kořenech révy vinné (Vitis vinifera) (Reiter a kol. 2005). Obr. 9 Kořenový povrch a kořenové vnitřní pletivo Vitis vinifera kolonizované Burkholderia sp. kmenem PsJN (Reiter a kol. 2005). Burkholderia, stejně jako ostatní PGPB kolonizuje nejprve kořenové povrchy. Po tomto počátečním kolonizačním kroku mohou tyto bakterie vstupovat do kořenů skrz trhliny a/nebo procházejí kořenovými špičkami nebo přes střední lamelu epidermální vrstvy. Buňky PsJN také kolonizují rhizodermální buňky, mezibuněčné a vnitrobuněčné prostory kortikálních buněk, endodermis a xylemové cévy. Burkholderie mohou narušit kořenová vnitřní pletiva - procházejí mezi epidermálními a kortikálními buňkami a mohou proniknout centrálním válcem porušením endodermis. Buňky PsJN také produkují endoglukanázu a endopolygalakturonázu, enzymy degradující buněčnou stěnu. Byla pozorována hostitelská obranná reakce, hromadění fenolických látek v některých kortikálních buňkách, jako následek kolonizace kmenem PsJN. Tento kmen se šíří ke vzdušným částem rostliny pomocí transpiračního proudu z kořenových xylémových cév (Reiter a kol. 2005). 3.5 Bacillus Rod Bacillus, v přírodě velmi rozšířený, zahrnuje G+, aerobní, případně fakultativně anaerobní tyčinky. Většinou jsou pohyblivé díky peritrichálně umístěným bičíkům. Důležitým znakem tohoto rodu je schopnost tvořit endospóry, sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku (Votava a kol. 2003). 24

Bacillus thuringiensis potlačuje virulenci regulovanou quorum sensing (QS) u rostlinného patogenu Erwinia carotovora díky mikrobiálnímu antagonismu. E. carotovora produkuje a reaguje na signálové acyl laktony homoserinu (AHL) při regulaci produkce antibiotik a expresi virulence. Kmeny B. thuringiensis mají AHL laktonázu, která je účinným AHL degradujícím enzymem. B. thuringiensis nezasahuje do růstu E. carotovora, ale ruší hromadění AHL signálních molekul. B. thuringiensis významně snižuje dopad tohoto patogenu, který způsobuje měkkou hnilobu brambor (Solanum tuberosum). Virulence E. carotovora je závislá na schopnosti produkovat a vylučovat enzymy degradující buněčnou stěnu rostlin, včetně pektátové lyázy, pektinové lyázy a polygalakturonázy. Kmeny B. thuringiensis neprodukují antibiotikům podobné látky, které by mohly zasahovat do šíření E. carotovora. Bacillus cereus a Bacillus mycoides, druhy blízce příbuzné B. thuringiensis, také produkují AHL laktonázy. Tyto enzymy bacilů jsou vysoce konzervované, sdílejí více než 90% homologii na peptidové úrovni. B. fusiformis, který neprodukuje AHL degradující enzymy, má mnohem nižší účinky na hromadění AHL než kmeny B. thuringiensis, které produkují AHL laktonázy. Bacillus sp. kmen A24 má AHL laktonázovou aktivitu a působí jako biologické kontrolní agens proti E. carotovora. Také působí proti Agrobacterium tumefaciens, které způsobuje crown gall nemoc u rajčete (Solanum lycopersicon) (Dong a kol. 2004). Některé druhy Bacillus produkují in vitro antibiotika, jako například oligomycin A, kanosamin, zwittermicin A a xantobacin (Compant a kol. 2005). Mohou také spustit ISR pomocí 2,3-butandiolu (Haas a Défago 2005). Často se používají jako bakteriální hnojiva (Maier a kol. 2000). Obr. 10 Chemická struktura zwittermicinu A (Broderick a kol. 2000). 25

3.6 Paenibacillus Paenibacillus jsou G+ tyčinky tvořící oválné endospóry zduřující buňku a jsou pohyblivé pomocí bičíků. Jsou fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní a některé druhy produkují sliz (www.en.wikipedia.org/wiki/paenibacillus). Paenibacillus polymyxa, dříve nazývaný Bacillus polymyxa, je běžná půdní bakterie patřící do skupiny PGPB. Nepřímé mechanismy podpory růstu rostlin u Paenibacillus polymyxa zahrnují sekundární bakteriální metabolity jako kyanovodík, siderofory a antibiotika. Jeho naočkováním dochází k potlačení některých rostlinných patogenů. Do přímých mechanismů patří konkurence o živiny. Tato bakterie má relativně široký hostitelský okruh. Nachází se na obilninách a některých dvouděložných rostlinách, včetně Arabidopsis thaliana. U Arabidopsis thaliana dochází po naočkování Paenibacillus polymyxa ke změnám v expresi genů a k vytvoření částečné rezistence k biotickým i abiotickým stresovým faktorům. P. polymyxa je antagonista Erwinia carotovora (Timmusk a Wagner 1999). Obr. 11 Vlevo rostlina pěstovaná v přítomnosti P. polymyxa. Došlo k potlačení vadnutí rostliny. Vpravo kontrolní rostlina (Timmusk a Wagner 1999). Paenibacillus polymyxa syntetizuje indol-3-etanol (TOL). TOL se snadno dostává do rostlin, kde slouží jako zásobní prekurzor indoloctové kyseliny (IAA). Může být převedený na aktivní fytohormony IAA pomocí rostlinné TOL-oxidázy a O 2. Navíc převedení TOL na IAA uvnitř kořenů může snížit pravděpodobnost nadbytku IAA v rhizosféře a následný škodlivý 26

účinek na kořenový vývoj. Paenibacillus polymyxa také navozuje ISR v rostlinách (Persello- Cartieaux a kol. 2003). Paenibacillus sp. kmen 300 a Streptomyces sp. kmen 385 produkují extracelulární chitinázy k potlačení Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, které napadá okurky (Cucumis sativus). Syntetizují také β-1,3-glukanázu a tak lyzují buněčnou stěnu tohoto houbového patogenu (Compant a kol. 2005). 3.7 Delftia Delftia jsou G- rovné nebo mírně zakřivené tyčinky, vyskytující se samostatně nebo v párech. Pohybují se pomocí peritrichálních bičíků a v buňkách se jim hromadí poly-βhydroxybutyrát (PHB). Kolonie jsou mírně vypouklé, hladké, s nepravidelnými difůzními okraji. Téměř všechny kmeny Delftia se vyskytují v půdě, v prostředí silně kontaminovaném organickými škodlivinami nebo v kalech biologických čistíren odpadních vod. Mohou degradovat škodlivé organické i anorganické látky. D. acidovorans P4a mineralizuje 2,4- dichlorofenoxyoctovou kyselinu (2,4-D) a 2-metyl-4-chlorofenoxyoctovou kyselinu v alkalických podmínkách. D. acidovorans kmen WDL34 degraduje 3,4 DCA (3,4- dichloroanilin). Tereftalát 1,2-dioxygenázový systém (TERDOS) byl objeven v buněčných extraktech z D. tsuruhatensis T7. Další enzymy izolované z D. acidovorans, která byla dříve označována jako Pseudomonas acidovorans, jsou součástí xenobiotických degradujících drah pro látky jako jsou organofosfáty, haloacetáty, nitrobenzen, anilin nebo 3-chloroanilin a další. Delftia tsuruhatensis kmen HR4 byl izolovaný z rhizosféry rýže (Oryza sativa). Tento kmen potlačuje růst různých rostlinných patogenů, zvláště třech hlavních rýžových patogenů, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Rhizoctonia solani a Pyricularia oryzae Cavara, má vysokou biologickou kontrolní aktivitu a schopnost fixovat atmosférický dusík. HR4 působí proti rýžové bakterióze a ničení rýžových pouzder. Navržené mechanismy, kterými Delftia působí jako PGPB jsou produkce antibiotik, sideroforů, lytických enzymů nebo navození systematické rezistence. Kmen HR4 může také pronikat dovnitř rýžových kořenů. Jeden gram čerstvého rýžového kořenu může vyměšovat 2,25 mg organických kyselin do rhizosféry. Všechny tyto organické kyseliny mohou být zdrojem uhlíku pro acidofilní kmeny bakterií Delftia. Pokles ph v půdě z 6 na 4 vlivem biochemických procesů, jako jsou nitrifikace a oxidace železa je výhodné pro osídlování a růst kmenů Delftia (Han a kol. 2004). 27

3.8 Stenotrophomonas Stenotrophomonas jsou G- tyčinky, štíhlé, mírně zahnuté, pohyblivé a nefermentující (Votava a kol. 2003). Tyto bakterie mohou degradovat xenobiotické látky a tím dekontaminovat půdu. Produkují fytohormon indol-3-octovou kyselinu (IAA), který je odpovědný za podporu rostlinného růstu. Stenotrophomonas také produkují antifungální antibiotika jako maltofilin, alteramid a xantobacin A spolu s širokým spektrem extracelulárních enzymů jako chitinázy, proteázy a glukanázy. Mnohé z těchto metabolitů jsou odpovědné za biotechnologické aplikace při dekontaminaci půdy a v biologické kontrole nad rostlinnými patogeny (Suckstorff a Berg 2003). Obr. 12 Dvě tautomerické struktury sodíkových solí xantobacinu A a jejich metanolytický produkt (Hashidoko a kol. 1999). Stenotrophomonas dříve patřily do rodu Pseudomonas a později do rodu Xanthomonas. Na rozdíl od Xanthomonas, u Stenotrophomonas nebyla zjištěna žádná fytopatogenní aktivita, ale za určitých podmínek mohou poškodit rostliny nebo jejich části. Stenotrophomonas mají pozitivní účinky na kořenovou délku a vývoj kořenových vlásků, zatímco negativně působí na délku stonků a na vývoj listů. Účinky jednotlivých druhů Stenotrophomonas jako biologických kontrolních agens jsou závislé na množství produkované indol-3-octové kyseliny a hlavně na koncentraci jednotlivých bakterií. Optimální koncentrace pro stimulaci růstu rostlin je 10 5 CFU, při vyšší nebo nižší koncentraci se růst zpomaluje. Například S. rhizophila DSM 14405 při koncentraci 10 5 CFU může zvýšit vyvíjení kořenových vlásků až o 71%. Koncentrace také ovlivňuje počet listů na rostlině. Vysvětlení závislosti účinků Stenotrophomonas na koncentraci je pravděpodobně v regulaci sekundárních metabolitů. Tento jev je závislý na komplexní regulaci a dovoluje bakteriím detekovat jejich vlastní hustotu pomocí produkce AHL a tím reagovat na různé faktory 28

vnějšího prostředí. Avšak žádné quorum sensing mechanismy nebyly objeveny u S. maltophilia a S. rhizophila (Suckstorff a Berg 2003). Největší účinky jako PGPB má S. nitritireducens (Suckstorff a Berg 2003). Kombinací bakterií Pseudomonas fluorescens a Stenotrophomonas maltophila dochází ke zlepšení ochrany řepy cukrovky (Beta vulgaris) proti Pythium, které způsobuje opadávání semenáčků (Whipps 2001). 3.9 Azospirillum Azospirillum jsou bakterie žijící samostatně v půdě, nebo v těsných asociacích s rostlinami v rhizosféře. Nachází se v rhizosféře tropických a subtropických travin Jsou to G- tyčinky, pohyblivé pomocí jednoho bičíku a jsou schopny vázat atmosférický dusík (www.en.wikipedia.org/wiki/rhodospirillaceae). Mechanismus, kterým Azospirillum spp. může chránit rostliny, je složen z více vlivů, zahrnující syntézu fytohormonů, N 2 fixaci, aktivitu nitrát reduktázy a zvýšenou absorpci minerálů. Nevýhodou je, že Azospirillum spp. nerozpouští fosforečnany. Proto ke zvýšení dostupnosti dusíku a fosforu jako živin u rostlin se používá kombinace bakterií rodu Azospirillum a bakterií rozpouštějících fosfor. Mikrobiální fixace prodlužuje metabolickou aktivitu při opětovném použití buněk. Alternativní přístup pro používání bakterií rozpouštějících fosfor jako mikrobiálních očkovacích látek je používání smíšených kultur nebo jejich společné naočkování s ostatními mikroorganizmy. Například společné naočkování kmenů Pseudomonas striata a Bacillus polymyxa vykazuje schopnost rozpouštět fosforečnany s kmenem Azospirillum brasilense. To má za následek významné zlepšení stavu obilnin a výnosu sušiny, s průvodním zvýšením N a P absorpce. Společné naočkování pšenice Azospirillum lipoferum kmenem 137 a Bacillus megaterium poskytuje více vyvážené výživy pro rostliny a zlepšení v absorpci N a P. Kombinované očkování bakterií rozpouštějících fosforečnany a Azospirillum nebo Azotobacter má prospěšný vliv na výnos, stejně jako na N a P hromadění v různých plodinách (Hesham a El-Komy 2005). 3.10 Rhizobium Rhizobium jsou G- aerobní tyčky, heterotrofní. Některé druhy jsou schopny vázat atmosférický dusík. Rhizobium leguminosarum žije v symbióze s bobovitými rostlinami. Tyto 29