a) Brasinosteroidy Arabidopsis

1 Přenos signálu brassinosteroidů vrostlinách a steroidů u živočichů a) Brasinosteroidy Arabidopsis b) Podobné účinky brasinosteroidů a steroidů c) Ecdysteroidy - Drosophila M ti F ll Martin Fellner 2010

2 Vývoj organismu regulují signály (faktory) Receptor R Vnitřní genetická info metabolismus hormony Vnější světlo teplota vlhkost plyny gravitace Signál Receptor Zesilovač Reakce (např. exprese genů)

3 Obecné schéma přenosu ř signálu Signál Receptor Zesilovač (secondary messenger) Vnější (světlo, teplota, gravitace, vlhkost) Vnitřní (hormony, metabolity, genetická informace) Intracelulární (pro lipofilní hormony => snadno difundující membránou) Membránové (povrchové) (pro hormony rozpustné ve vodě => neschopné procházet membránou) Cyklický AMP a GMP, diaglycerol, gy inositol-trifosfát, Ca 2+ ionty Reakce Exprese genů, ů indukce aktivity it kanálů a pump, atd.

4 Genetické studie - snaha definovat molekulární mechanizmy účinků steroidních hormonů Brasinosteroidy - Arabidopsis thaliana (26 tisíc genů) Detailní popis biosyntézy brasinosteroidů Znalost signálních drah Steroidy savci, hmyz - Drosophila melanogaster (12 tisíc genů) Detailní popis transkripce genů aktivované 20E hydroxyecdysone Znalost biosyntézy ecdysteroidu Studium signálních drah => společné a rozdílné prvky

5 a) Brasinosteroidy Arabidopsis Biosyntéza brasinosteroidů (BR) a homeostáza Rostliny 1 miliarda let Živočichové Hormony - polyhydroxylované y y steroidní molekuly BR a steroidy kontrolují: - regulaci genové exprese - buněčné dělení - expanzi buněk - diferenciaci buněk PCD - PCD - homeostázu

6 1979 brasinolid (BL) koncový produkt biosyntetické dráhy - stimuluje prodlužování stonku - stimuluje prodlužování kořene (nízké koncentrace) Brasinolid - inhibuje prodlužování kořene (vysoké koncentrace) - stimuluje klíčení semen a růst listů HO OH HO Prodlužování 2. internodu stonku fazole HO H O O Brasinosteroidy a auxiny mají synergické účinky. Stimulace: - tvorby laterálních kořenů - prodlužování stonku -růstu pylové láčky - ohýbaní listů a epinastie - aktivity protonové pumpy - diferenciace xylému Ohýbání listů Auxin rychlý účinek Brasinolid pomalý účinek Update 2010 Kang B et al. (2010) Molecular Plant 3: 260-268 Interakce signálních drah auxinů a brassinosteroidů

7 Použití brasinosteroidů v zemědělství: - zvyšování výnosů - stimulace rezistence ke stresům Výskyt: - ve všech testovaných pletivech -nejvíce v apikálních částech stonků Brasinosteroidy nejsou pravděpodobně transportovány t na dlouhé vzdálenosti Symons GM et al (2008) J Exp Botany 59: 17 24 Symons GM et al. (2008) J Exp Botany 59: 17-24 Review o transportu brassinosteroidů

8 Existence BR a biologická i aktivita it velké množství literatury t Fungování a signální dráhy objeveny nedávno Genetický přístup fyziologická, biochemická a molekulární charakterizace mutantů Selekce mutantů s redukovanou biosyntézou BR (rajče, hrách, rýže, Arabidopsis) Výrazný fenotyp mutantů; Arabidopsis pleiotropický efekt mutací Tma: krátký vzrůst, tlustý hypokotyl, otevřené zvětšené dělohy, přítomnost primárních listových pupenů Světlo: trpasličí vzrůst, tmavozelená barva, Redukovaná apikální dominance, pylová sterilita, narušené fotoperiodické reakce, zpožděná senescence chloroplastů a listů, redukované množství xylému, změny v reakci ke světlu. bri1 WT cpd det2 WT det2 WT WT

9 Aplikace exogenních BR vede k normalizaci mutantních fenotypů CL - campesterol CT - cathasterone TE - teasterone DT - dehydroteasterone TY - typhasterol CS - castasterone BL - brassinolide

10 Výrazný fenotyp mutanta Identifikace genů zapojených v syntéze BR Porozumění mechanizmu homeostáze Porozumění mechanizmu signalizace Signalizace Biosyntéza Mutanti v signálních drahách mají vyšší hladinu endogenních hormonů Homeostáza BR-mutanti Cytokinin-mutanti Auxin-mutanti

11 Kontrolní mechanizmy regulující hladinu BR: - regulace biosyntézy - inaktivace BR -zpětná vazba od signální dráhy Dvě biosyntetické dráhy BR ranná C-6 oxidace pozdní C-6 oxidace Rostliny Campesterol BR Živočichové Cholesterol Steroidy Klíčové kroky syntézy BR a steroidů jsou vysoce konzervované přítomnost 5 -reduktázy Hmyz přítomnost 5 -reduktázy nebyla zatím prokázána

12 Biosyntetické dráhy BR Taiz L, Zeiger E (2006) Plant Physiology, 4th. ed., str. 617-634

13 Přenos signálu brasinosteroidů Fyziologické studie Identifikace BR jako růstových regulátorů Genetické studie Identifikace BR jako růstových ů hormonůů Identifikace BR receptoru na plazmatické membráně + dalších elementů dráhy Obrovský nárůst znalostí mol. základů účinků BR Enormní nárůst publikací o BR

14 Identifikace BR-insensitivních mutantů Mutovaná populace rostlin 0 BL Vysoká konc. BR BR-insensitivní mutanti Mutant bri1 (brassinosteroid-insensitive1) Wild type a brd2 mutant rýže BR-insensitivní mutanti jsou podobní mutantům s defektem v syntéze BR. Jejich fenotyp však nelze změnit exogenními BR.

15 Laboratoř J. Chory identifikace dalších trpasličích alel bri1 Plně funkční BRI1 je pozitivním regulátorem signálních drah BR Další geny této skupiny: BRL1, BRL2 a BRL3 BRL1 a BRL3 váží BR. Ektopická exprese těchto genů řízená promotorem BRI1 je schopna zrušit účinek mutace bri1. BRL1 a BRL3 se specificky exprimují ve vaskulárním systému => mutace brl1 a brl3 vedou k abnormálnímu poměru v diferenciaci floému a xylému. Trojitý mutant bri1brl1brl3 - zesílený trpasličí vzrůst a vaskulární fenotyp bri1 bri1brl1brl3 Vazebné studie: vysoká specificita vazby BL k BRI1 proteinu WT brl1 brl3 BRI1 je receptorem brasinosteroidů

16 Struktura receptoru BRI1 N-terminal signal peptide Cysteine pair Putative leucine zipper Leucine-rich repeats (LRR) 70-amino acid island BL-binding site BRI1 kóduje leucin-rich repeat (LRR) transmembránovou receptor-like kinázu (RLK) (LRR-RLK) (poziční klonování) LRR22 Transmembrane region PM Lokalizace: plazma membrána (exprese BRI1-GFP) Ser/Thr kinase domain (KD) C-terminal tail Juxtamembrane domain Cytoplazma

17 LRR-LRK LRK největší skupina receptorů v Arabidopsis genomu: ~230 členů 70 amino+lrr obecný proteinový motiv, který se vyskytuje u rodiny proteinů zvaných LRR-R (LRR-Receptor-like) s velmi odlišnými funkcemi u všech druhů organizmů. BRI1 CLV1 Cf-9 Toll Unikátní znak BRI1: obsahuje 70 amino acid island a zároveň KD Jiné LRR-R neobsahují KD a přenáší signál prostřednictvím intracelulární protein-protein interakce (CLV1, Cf-9). Receptor Xa21 je zapojen v rezistenci k patogenům, má KD, ale neobsahuje 70 amino acid island. Toll receptor u Drosophily obsahuje intracelulární protein (interleucin doménu), který po aktivaci receptoru váže protein podobný KD.

18 Fosforylace receptoru BRI1 Analýza mutantů s defekty v BRI1 Identifikace domén nutných pro přenos signálu BL-binding site 70-amino acid island LRR22 Juxtamembrane domain P P Ser/Thr kinase domain (KD) P P Update 2009 Wang et al. (2008) Developmental Cell 15: 220-235 235 C-terminal tail P P Tyr-831 a Tyr-956 specifická místa pro autofosforylaci; Tyr-831 leží v juxtamembránové doméně, Tyr-956 leží v Ser/Thr doméně

19 Vazba receptoru BRI1 s BAK1 (BRI1-associated receptor kináza 1) Dva modely interakce BRI1/BAK1 1. Vazba BL dovoluje fosforylaci BRI1 a tím jeho interakci s BAK1. To vede k transfosforylaci BAK1. BIM1 E-box (CANNTG) Update 2010 Chinchilla D et al. (2009) TIPS 14: 535-541 Review o funkcích BAK1 proteinu. 2. BRI1 po vytvoření homodimeru váže BL, což vede ke konform. změnám homodimeru. Tyto změny aktivují katalytickou aktivitu, která vede k fosforylaci BAK1.

20 Update 2008 Duální fyziologická role BAK1 a BKK1 Double mutant bak1bkk1 letální: - konstitutivní exprese obr. genů -ukládání kalózy BRI1 BAK1/BKK1? BAK1 FLS2 - akumulace ROS - spontánní CD ve sterilních podmínkách BR flg22 PM BKK1 = BAK1- like1 P P P P P P FLS2 = flagelin-sensitive LRR receptor kináza 2 BR-závislá BR-nezávislá signální dráha BR-nezávislá signální dráha buněčné smrti signální dráha Jádro PAMP = pathogen-associated molecular pattern Brasinosteroidy zprostředkované buněčné prodlužování a proliferace Konstitutivní obranná reakce a spontánní buněčná smrt PAMP - imunitní reakce He et al. (2007) Current Biology 17: 1109-1115 Kemmerling et al. (2007) Current Biology 17: 1116-1122 Chinchilla et al. (2007) Nature 448: 497-501 Podle He et al. (2007) Current Biology 17: 1109-1115

21 Přenos signálu BR od receptoru (Podobný přenosu signálu v signální dráze Wnt u živočichů) Tvorba heterodimeru BRI1/BAK1 Iniciace signální kaskády 4 modely regulace BIM1 E-box (CANNTG)

22 4 modely regulace signální kaskády 1) BAK1 funguje jako signální rameno komplexu BRI1/BAK1 BAK1 interaguje přímo s cytolazmatickými proteiny Overexprese BAK1 stimuluje endocytózu BRI1 do protoplastu => BRI1 v cytoplazmě může interagovat s cytoplazmatickými cíli. 2) Existuje protein BKI1 (BRI1 kinase inhibitor 1) - negativní regulátor Overexprese BKI1 vede k trpasličímu fenotypu s redukovanou citlivostí k BR => BKI1 funguje jako negativní regulátor signální dráhy BR. BKI1 interaguje s BRI1 => znemožnění vazby BRI1 s BAK1 => => blokáda signální dráhy.

23 Update 2009 Wang et al. (2008) Developmental Cell 15: 220-235 Vazba BL k homodimeru BRI1 Uvolnění BKI1 od BRI1 Základní fosforylace o substrátů Oligodimerizace s BAK1 Základní přenos signálu Transfosforylace BRI1/BAK1 Zesílený přenos signálu 3) Existují proteiny TTL (Trans thyretin-like) a homolog TRIP1 (TGF β -Receptorinteracting protein 1) TTL a TRIP1 jsou fosforylovány proteinem BRI1 => přenos signálu.

24 Update 2009 Identifikace BSK - substrát BRI1 (BSK = cytosolická receptor-like kináza) Tang et al. (2008) Science 231: 557-560 - BR + BR Vazba BKI1 a BSK k BRI1 Autofosforylace BRI1 Vert (2008) Current Biology 18: R963-R965 Žádný přenos signálu Základní fosforylace BSK Transfosforylace BRI1/BAK1 Základní přenos signálu Zesílená fosforylace BSK BIN2? Zesílený přenos signálu

25 4) Regulace proteinu BIN2 (brassinosteroid insensitive 2) proteinem BRI1 BIN2 identifikován pomocí mutanta bin2 semidominantní mutant s fenotypem podobným bri1. BIN2 protein kináza podobných živočišné GSK3 (glykogen synthese kinase 3), která fosforyluje glygogen syntázu zapojena v mnoha živočišných vývojových procesech; 10 kináz u Arabidopsis. bin2 gain-of-function mutant nebo overexprese genu BIN2 inhibuje BR signaling => trpasličí fenotyp ASK22, ASK23 další GSK3 kinázy fungují redundantně s BIN2 Loss-of-function mutace v BIN2 nebo ASK22, 23 => žádný fenotyp Loss-of-function mutace v BIN2 a zároveň v ASK22, 23 => konstitutivní BR fenotyp WT WT BIN2 aktivní kináza inhibující další signální proteiny = negativní regulátor bin2/+ bin2 bin2/+ BIN2 je inaktivována příjmem brasinosteroidů bin2

Přenos signálu úloha proteinu BIN2 (brassinosteroid- insensitive 2) 26 Lokalizace BIN2: Plazma membrána Cytoplazma Jádro Absence BR: Fosforylace proteinů BES1 a BZR1 konstitutivně lokalizovaných v jádře. BES1 (bri1-ems-suppressor 1) BZR1 (brassinazole-resistant resistant 1) Update 2008 Degradace BIM1 E-box (CANNTG) E3? P P 14-3-3 Lokalizace v cytoplazmě P BZR1 vazba k DNA BR?? BSU1? BIN2 BR P BES1 a BZR1 transkripční faktory BR-indukovaných genů; krátká životnost; degradace 26S proteasome Fosforylované BES1 a BZR1 se nemohou vázat k DNA a jsou degradovány Ryu et al. (2007) Plant Cell 19: 2749-2762 Gendron and Wang (2007) Current Opinion in Plant Biology 10: 436-441 P BZR1 P BR-indukované geny nejsou exprimovány

27 Přítomnost BR = vazba BR k receptoru BIM1 E-box (CANNTG) Aktivovaný BRI1/BAK1 heterodimer inhibuje aktivitu BIN2 kinázy (ne)známým mechanismem + Aktivita serin/threonin fosfatázy BSU1 (bri1 supressor 1) Update 2008 Degradace E3? P P 14-3-3 Lokalizace v cytoplazmě Akumulace defosforylované formy BES1 a BZR1 v jádře Ryu et al. (2007) Plant Cell 19: 2749-2762 P P BZR1 P P vazba k DNA BR?? BSU1? BIN2 BR Gendron and Wang (2007) Current Opinion in Plant Biology 10: 436-441 BZR1 Aktivace či potlačení genové exprese Update 2008 Peng et al. (2008) Molecular Plant: 338-346 BIN2 degradace ubiquitinací

28 Regulace genové exprese transkripčními faktory BES1 a BZR1 Sekvenování Arabidopsis genomu Nové metody exprese genů - mikroaray Identifikace stovek BR-indukovaných genů Up-regulované a down-regulované geny zapojené pravděpodobně v: - syntéze a modifikaci buněčné stěny - formaci cytoskeletu - biosyntéze BR - signálních dráhách - transportu BR Tma: semidominantní mutanti bes1 a bzr1 potlačují trpasličí růst bri1, protože mutace vedou k syntéze proteinů méně citlivých k proteolýze Světlo: bes1 > WT (podobné rostlinám overexprimujícím DWF4 a BRI1) bzr1 < WT (semitrpasličí) BES1 a BZR1 jsou z 90% identické, ale regulují odlišné skupiny genů

29 Identifikace nových transkripčních faktorů interagujících s BES1 BES1 + BIM1 (BES1-interacting Myc- like 1) BES1/BIM1 heterodimer Aktivace genové exprese vazbou k E-boxu BIM1 E-box (CANNTG)

30 Update 2009 Yu et al. (2008) PNAS 105: 7618-7623 BES1 reguluje transkripční faktory ELF6 a REF6, které regulují expresi terčových genů a koordinují BR reakce s dalšími vývojovými procesy. Li et al. (2009) Plant J 58: 275-286 Identifikace TF AtMYB30. Pomáhá zesilovat expresi BR-indukovaných genů. BES1 jednak přímo ovlivňuje AtMYB30, jednak se AtMYB30 přímo váže na E-box promotoru regulovaných genů. Update 2010 Li et al. (2010) PNAS 107: 3918-3923 Identifikace proteinu ISW1 (Interact With Spt6), který je zapojen v procesech aktivace RNA polymerázy II. Spt6 transkripční elongační faktor Model fungování AtISW1 v regulaci genové exprese zprostředkované BES1 Za přítomnosti BR se BES1 váže k ISW1, kterého směřuje k promotoru BR-responsivního genu. Zde se ISW1 váže k elongačnímu faktoru Spt6. Spt6 interaguje přímo s RNA polymerázou II.

31 BZR1 vazba k BRRE (BRresponsive element) Inhibice exprese BR-biosyntetických genů Zpětnovazebná regulace biosyntetické dráhy BR BIM1 E-box (CANNTG)

32 Update 2008 Geldner et al. (2007) Genes and Development 21: 1598-1602 Gendron and Wang (2007) Current Opinion in Plant Biology 10: 436-441 Endozomální lokalizace BRI1 Endocytóza běžná u živočichů a kvasinek Plazma membrána Endozom - inaktivace receptoru (např. BOR1) - aktivace signálu BRI1 BRI1 Transport k cíli nebo transport do lysozomu a degradace - distribuce BRI1 v PM či endozomech není změněna v BR-deficientních mutantech či po ovlivnění BR => endocytóza není závislá na aktivačním stavu BRI1 - endozomální BRI1 je konstitutivně aktivní Důvody existence signální dráhy BRI1 prostřednictvím endozomů: - doplňkový k PM BRI1 (nedostatek místa na PM) - degradace BRI1 utlumení signální dráhy Update 2010 Tang W et al. (2010) Current Opinion in Plant Biol 13: 27-33 Review o signálních drahách brassinosteroidů

33 Klíčová slova pro příští přednášku Drosophila Ecdysone Ecdysteroid Ecdysteroid signaling EcR/USP Insect hormone receptor Nuclear receptor Polytene chromosome 20E 20-hydroxyecdysone g http://www.google.cz/ / Google: NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

34 b) Podobné účinky brasinosteroidů a steroidů Účinky ecdysteroidu na růst a vývoj hmyzu: - morfogeneze - proliferace - syntéza kutikuly - vývoj vajíčka - časování vývoje -PCD Společné prvky s vývojovými ý a fyziologickými reakcemi rostlin k BR, které zahrnují: - regulaci genové exprese - diferenciaci buněk - expanzi buněk - buněčné dělení - homeostázu -PCD

35 1) BR a ecdysteroid regulují změny tvaru buněk spojené s dozráváním BR: regulace exprese genů kódujících proteiny spojené s buněčnou stěnou a zapojené v expanzi buněk Ecdysteroid: spouštění morfogeneze struktur dospělců během metamorfózy - -změna tvaru buněk na úrovni cytoskeletálního aktinu Rostliny Hmyz Přítomnost rigidní buněčné stěny Integrita buňky interní cytoskelet Regulace tvaru buňky změnami v hladině proteinů spojených s buněčnou stěnou Regulace tvaru buňky změnami cytoskeletu

36 2) BR a ecdysteroid regulují programovou smrt buňky Ecdysteroid: spouští masivní smrt tkání larev během ranných fází metamorfózy Drosophila přítomnost autofagie s charakteristickými rysy apoptózy (fragmentace DNA a aktivace kaspázy) (viz přednášky MBR 3a-f) Ecdysteroid 20E (slinné žlázy larev během regulace) Indukce tkáňově specifických genů klíčových pro PCD Např. geny: E93 reaper hid Ecdysone = prekurzor 20E (periferní tkáně) ark dronc croquemort

37 BR: indukují PCD vznik tracheálních elementů (xylém transport vody rostlinami) BR-deficientní mutant det2 P X Abnormální xylém BR jsou zapojeny v tvorbě xylému X P Xylém je tvořen tracheidy

38 BR stimulují diferenciaci tracheid - modelový systém zinia (Zinnia elegans) Mezofylové buňky diferencují v tracheální elementy vlivem auxinů (viz přednášky MBR 3a-f), GA a BR. Unikonazol (inhibitor GA a BR) Chrání buňky před diferenciací BR překonává ochranu GA nepřekonává ochranu BR iniciuje poslední krok cytodifereneciace = PCD Mezofylové buňky inkubované 2-3 dny v médiu s BR Molekulární mechanizmus není znám

39 c) Ecdysteroidy - Drosophila Receptor R Klasická signální dráha Signální dráha s receptorem uvnitř buňky (jaderný receptor) V jednom kroku: -příjem signálu - reakce k signálu Unikátní struktura Unikátní struktura jaderného receptoru

40 Unikátní struktura jaderného receptoru Ligand-binding doména (LBD) méně konzervovaná C-terminální DNA-binding doména (DBD) vysoce konzervovaná Nukleární receptory vývojově velice staré Drosophila 2 fyziologicky aktivní lipofilní hormony (20E, JH); genom obsahuje pouze 18 genů pro jaderné receptory (člověk 48 genů) Update 2009 Drosophila jednoduché signální dráhy modelový systém Maar and Thakur (2009) Genes and Development 23: 419-432 Identifikace transkripčních regulátorů (zinc cluster family) u hub reprezentují funkční homology jaderných receptorů multibuněčných organizmů (metazoan).

41 6 odlišných podskupin jaderných receptorů se společnou konzervovanou doménou mezi DBD a LBD. 18 jaderných receptorů u Drosophily Známé jaderné receptory obratlovců pro: - estrogen (ER) - glukokortikoid (GR) - thyrodní hormon (TR) - retionovou kyselinu (RAR) - retinoid X (RXR) Ligandy jaderných receptorů = lipofilní molekuly Orfan receptor jaderný receptor bez známého přirozeného ligandu; mohou fungovat nezávisle na ligandu

42 Princip fungování jaderného receptoru DBD 2 zinc fingers: 1. Poskytuje DNA-binding specificitu prostřednictvím P-boxu (5 aminokyselin) 2. Dovoluje dimerizaci DBD oblastí LBD tvořena 11-13 -helixy, které formují vazebné místo pro ligand TC Transkripční koaktivátor Hormon 20E DBD LBD 1 2 Vazba 20E k LBD AF2 Aktivace LBD (rotace helixu 12) AGGTCA Vazba ke genu pro jiný receptor Exprese Při aktivaci genů prostřednictvím jaderných receptorů dochází ke změnám v organizaci chromatinu. TC NURF - NUcleosome Remodeling Factor transkripční koaktivátor; ATP-dependent chromatin remodeling enzym; váže se na LBD v závislosti na koncentraci 20E.

43 Regulační kaskády 20-hydroxyecdysonu OH Protorakální žláza Ecdysteroid -ecdyson Hemolymfa 20E HO HO H 3 C H 3 C H 3 C OH H CH 3 CH 3 OH H O Nukleární receptor hormonu 20E: 20E Heterodimer EU EcR receptor pro ecdysone USP ultraspiracle Update 2008 Vliv ligandu na jadernou lokalizaci EcR? Absence ecdysteroidu Nerovnoměrná distribuce EcR mezi cytoplazmu a jádro E-doména EcR (stejně jako E-doména USP) zvyšuje jadernou lokalizaci EcR i při absenci hormonu EU nezávislá signální dráha ecdysteroidu: DHR38 heterodimerizuje s USP; DHR38 neobsahuje ligand binding pocket ani coaktivator binding site (DHR38 - ortholog savčího NGFI-B orfan receptoru)

44 Konec embryogeneze Pulzy yprodukce 20E 3 larvální stádia Molekulární a genetické studie Drosophily Metamorfogeneze E U Proces dospívání 20E je klíčový hormon v determinaci časování vývoje hmyzu Reakce: morfogenetické fyziologické chování apoptické reproduktivní Absence 20E: EcR působí jako represor diferenciace sensorických neuronů v křídlech Drosophily Přítomnost 20E: Vazba 20E k EcR - uvolnění represe Obratlovci: dospívání je regulováno tyrodním hormonem mechanismus signalizace není dostatečně znám Update 2009 Ishimoto o H et al. (2009) PNAS 106: 6376-63816 638 20E - nezbytný regulátor dlouhodobé paměti; konsoliduje paměť tím, že reguluje molekulární a buněčné procesy důležité ve formování neuronů.

45 20E reguluje transkripčně EcR + 6 dalších genů pro jaderné receptory Množství mrna těchto genů se mění synchronně s pulzy ecdysteroidů 1 2 3 4 5 6

46 20E reguluje signální dráhy expresí genů pro jaderné receptory, a to prostřednictvím vazby na receptorový komplex heterodimeru EcR/USP. Geny pro jaderné receptory: DHR3 DHR4 E75 E78 DHR39 ftz-f1 etc. Receptor EcR/USP TC Transkripční koaktivátor Exprese AGGTCA

47 Geny E75 a E78 jako cíle komplexu 20E-EcR/USPEcR/USP E75 a E78 jsou orfan receptory nemají známé ligandy Podobné lidskému receptoru REV-ERBA Mutace v genu E78 nemá vliv na životnost a fertilitu E75 - složitý genetický lokus kóduje nejméně 3 izoformy proteinů, které se liší N-terminálními sekvencemi Nulová mutace v genu E75 postrádá všechny izoformy zastavení oogeneze => role v samičí fertilitě Receptor E75 má hemovou skupinu na LBD => možnost vazby NO (oxid dusnatý) a CO (oxid uhelnatý) => NO a CO modulují aktivitu E75 Update 2009 Bernardo TJ et al. (2009) J Mol Biol 387: 794-808 Existence 4 alternativních promotorů => produkce izoforem E75A, E75B, E75C a E75D. Tyto promotory obsahují nejméně desítku responsivních elementů pro 20E (EcRES) => vysoká flexibilita reakcí k ecdysonu.

48 Geny DHR3 a DHR4 jako cíle komplexu 20E-EcR/USP DHR3 orfan receptor; nezbytná funkce během embryogeneze, před tvorbou zámotku a před startem metamorfózy DHR3 downreguluje rané geny indukované 20E, ale není nutný => redundance = existence dalších negativních regulátorů na počátku metamorfózy DHR3 mutant - redukce exprese orfan receptoru FTZ-F1 => DHR3 aktivuje gen ftz-f1; DHR3 se váže k promotoru genu ftz-f1 Aktivace transkripce ftz-f1 receptorem DHR3 je potlačována vazbou DHR3 k E75B => přesné časování exprese FTZ-F1 je určeno akumulací DHR3 a rozpadem E75B

49 DHR4 orfan receptor; exprese probíhá paralelně s DHR3 => DHR3 a DHR4 mohou mít společné regulační funkce Vypnutí DHR4 způsobuje: 1) Předčasné zakuklování vznik malých jedinců 2) Ztrátu funkcí během rané metamorfozy DHR4 downreguluje geny na počátku metamorfózi; paralelní funkce s DHR3 naznačuje, že funguje redundantně v řízení přepnutí genetického programu z fáze pozdní larvy do fáze kukly

50 Geny ftz-f1 a DHR39 jako cíle komplexu 20E-EcR/USP ftz-f1 - dva promotory generují 2 odlišné izoformy proteinu s unikátními N- terminálními sekvencemi; LBD je společná ftz-f1 raná fáze embryogeneze; βftz-f1 pozdní stádia vývoje DHR39 sekvenčně podobný s ftz-f1; předchází expresi βftz-f1; DHR39 je downregulován, když hladina βftz-f1 je maximální DHR39 a ftz-f1 se váží k identickým DNA sekvencím => funkčně se překrývají na úrovni regulace genů ftz-f1 je nutný pro životaschonost; nuloví mutanti DHR39 jsou životní a fertilní Update 2008 βftz-f1 zapojen v biosyntéze ecdysteroidu; iniciace koordinace PCD slinných žláz

51 bftz-f1 hraje nezbytnou roli v pozdní fázi vývoje larvy a kukly Exprese bftz-f1 Puls vysoké koncentrace 20E na konci 3. larválního stádia Iniciace metamorfózy + 2. puls 20E Vývoj hlavy dospělce Založení celého těla dospělce PCD v larválních tkáních

52 Přehled všech 18 jaderných receptorů u Drozofily Update 2009 Bernardo TJ et al. (2009) J Mol Biol 387: 794-808 Jaderrný receptor DHR96 váže cholesterol a je nezbytný pro koordinaci transkripce genů, které jsou regulovány cholesterolem a jsou zapojeny v příjmu cholesterolu, jeho transportu a ukládání => DHR96 je důležitý pro homeostázu. To podporuje fakt, že mutanti Drosophila s nízkou hladinou cholesterolu jsou letální.

53 Schéma regulace genů pro jaderné receptory komplexem 20E-EcR/USP EcR/USP během metamorfózy

54 Studie zvětšování polytenních chromozomů ve slinných žlázách larev Znalost molekulárních mechanizmů účinků ecdysteroidů http://en.wikipedia.org/wiki/drosophila Becker (1959) Clever a Karlson (1960) Ashburner (1974) kultivace slinných žláz v přítomnosti 20E Charakterizace nafukovacích reakcí chromozomů (puffing) Důkazy: genetická reakce k ecdysteroidu zahrnuje > 100 puffů Postulace steroidy-indukované regulační kaskády: 20E přímo indukuje malé skupiny ranných regulačních genů reprezentujících asi 6 puffů na polytenních chromozomech. http://www.ucsf.edu/sedat/polytene_chrom.html Proteiny ranných genů jsou lokalizovány v místech puffů a mají pravděpodobně 2 opačné funkce:

55 1) Potlačují svoji vlastní expresi samo-zeslabující funkce 2) Indukují velké řady genů zapojených v sekundárních reakcích; pozdější geny kontrolují biologické reakce k ecdysteroidům Molekulární studie v posledních letech => potvrzení Ashburnerova modelu fungování ecdysteroidu Genetické reakce k brasinosteroidům a steroidům - podobnosti a rozdíly Microaray results: Arabidopsis: 8000 testovaných genů => 50 regulovaných BL Drosophila: 31% ze 465 testovaných EST ukazuje silnou indukci ecdysteroidy (až 3x silnější) Arabidopsis: 27 tisíc genů Drosophila: 14 tisíc genů 1) Genetické reakce u Drosophily jsou složitější než u Arabidopsis

56 Počet steroidy indukovaných genů kódujících transkripční faktory: Drosophila > Arabidopsis ~ 12 genů kódujících transkripční faktory indukovaných 20E Ranné puffy: BR-C, E74, E75 Elementy signálních drah (forhead, cryptocephal) Zvýšená exprese koreluje s pulzy 20E: DMef2, bagpipe, tinman Arabidopsis: BR indukují relativně malé změny v genové aktivitě ( 2-4x); silněji indukované geny nebyly identifikovány Drosophila: 20E indukuje velmi silné změny v aktivitě ranných genů ( >>4x) 2) Genetické reakce k ecdysteroidům u Drosophily jsou řádově vyšší než reakce genů u Arabidopsis indukovaných BR Hmyzí metamorfóza rychlá a masivní změna ě plánu Složitější indukce genové aktivity it

57 Redundance genetických drah v přenosu signálu ecdysteroidů Vysoký stupeň nadbytečnosti signálních drah BR Genetické studie jsou komplikované Drosophila - genetické skríningy pro nalezení ecdysteroidních byly realizovány nedávno Málo informací o nadbytečnosti ecdysteroidních signálních drah Genetická charakterizace jaderných receptorů u Drosophily - vysoká pravděpodobnost redundance Polovina genů: regulace steroidem 20E počátek metamorfózy Podpora modelu: nulové mutace nemají vliv na životnost a fertilitu (DHR39, E78, E75B) DHR3 indukovaný 20E je nezbytný pro represi ranných genů; mutanti nemají defekt v represi ranných genů funkční nadbytečnost odlišných izoforem kodovaných stejným genem (EcR, BR-C, E75) Nižší stupeň ň redundance d u Drosophily než u Arabidopsis i - Drosophila menší genom

58 Mimojaderná regulace ecdysteroidních signálních drah Objev EcR/USP heterodimeru na chromozomu => změna aktivity genů Důkazy pro regulaci signální dráhy v cytoplazmě = Fosforylační kaskáda spouštěná BR Úrovně mimojaderné regulace signálních drah: 1) EcR/USP vyžaduje interakci s chaperony; chaperony se však vyskytují v cytoplazmě 2) Metabolická inaktivace hormonu; (existuje i u brasinosteroidů); enzymy P450 inaktivují 20E 3) Modulace hladiny ecdysteroidů gen E23 indukovaný hormonem 20E moduluje hladinu hormonu 20E (tj. sám sebe) v buňce

59 20E? Indukce exprese genu E23 E23 Exprese Gen E23 kóduje transportér typu ABC aktivní transport malých sloučenin. E23 transportuje 20E z buňky redukce koncentrace hormonu 20E. 20E ABC transportér Studie gain-of-function: function: E23 funguje jako obecný negativní regulátor signální dráhy tlumí expresi genů indukovaných 20E.

60 4) Hormon 20E má přímé a rychlé účinky Chamlin a Truman (2000) nezávisle na expresi jaderných genů Development 127: 3543-3551 20E!! Oxid? [ NO ] dusnatý < 15 minut => bez transkripce a syntézy proteinů Proliferace neuroblastů během metamorfózy Existuje receptor pro hormon 20E na plazmatické membráně či v cytoplazmě? Mohl by být receptor typu LRR, podobně jako u Arabidopsis receptor pro brasinosteroidy

61 Neznámé hmyzí hormonální receptory souvislost s rostlinami ABA cytokininy etylén BR auxin BEE1 BEE2 BEE3 antagonisticky, synergisticky Diptera není pozorována modifikace účinků ů ectysteroidů juvelním hormonem o JH při procesu svlékání Málo známo o molekulárních mechanizmech účinků JH v interakci s ecdysteroidy

20E 62 Kukla Drosophily: interakce 20E s JH JH USP? Exprese Struktura LBD receptoru USP není konzistentní se strukturou JH Ranný gen BR-C Existují hormonální signální dráhy paralelně s 20E nebo ve spojení s 20E Manduca sexta Ecdysone (inaktivní prekurzor 20E)? Receptor = EcR/USB (nízká transkripční aktivita k ecdysonu) Chamlin a Truman (1998) Development 125: 269-277 Proliferace neuroblastů během ranného vývoje kukly Ecdysone funguje jako hormon

63 Koevoluce rostlin a hmyzu: fytosteroidy Rostliny yprodukují ecdysteroidy ys aktivitou u hmyzu = fytoecdysteroidy y y 5 6% testovaných druhů rostlin Hladina fytoecdysteroidů je závislá na: - druhu rostliny Fytoecdysteroidy: 20E ponasteron makisteron A cyasteron ecdyson Účinné u hmyzu - části rostliny - ročním období -habitu - vývojovém stádiu Syntetická dráha fytoecdysteroidů není objasněna

64 Fytoecdysteroidy mohou způsobovat nechutenství u některých hmyzích druhů (prostřednictvím chuťových receptorů) Obrana rostlin proti hmyzu ecdyson 20E ponasteron Způsobují vývojové změny: - Inhibice růstu - Zvýšení larválních stádií -Předčasné kuklení Hmyz si vytváří rezistenci k fytoecdysteroidům, které konzumuje. Důkaz existence metabolických drah, které detoxifikují fytoecdysteroidy Ecdysteroidy nemají škodlivé účinky na savce Možnost využití ecdysteroidů v zemědělství jako insekticidů

65 Steroidní hormony syntetizovány pomocí enzymů skupiny cytochromů P450 Jednobuněčný předek Divergence syntetických drah syntézy steroidů!! Společná potřeba polyhydroxylovaných steroidních ke koordinaci celkového vývoje

66 Interakce signální dráhy 20E a inzulinu regulace finální velikosti těla hmyzu X neznámý faktor X Y neznámý faktor Y dfoxo transkripční faktor PI3K fosfatidyl inositol 3-kináza Insulin receptor - citlivý k teplotě Colombani J et al. (2005) Science 310: 667-670 King-Jones, Thummel (2005) Science 310: 630-631

MF 67 Použitá literatura Brasinosteroidy Thummel CS, Chory J (2002) Genes and Development 16: 3113-3129 Fellner M (2003) In: S.Hayat, A. Ahmad (eds) Brassinosteroids, Kluwer, 69-86 Chow B, McCourt P (2006) Genes and Development 20: 1998-2008 Müssig C et al. (2006) Plant Biology 8: 291-296 Haubrick LL, Assmann SM (2006) Plant, Cell and Environment 29: 446-457 Wang Z-Y et al. (2006) Cell Research 16: 427-434 Wang X, Chory J (2006) Science 313: 1118-1122 Li J, Jin H (2006) Trends in Plant Science 12: 37-41 Vert G, Chory J (2006) Nature 441: 96-100 Bishopp A et al. (2006) Development 133: 1857-1869 Haubrick LL, Assmann SM (2006) Plant, Cell and Environment 29: 446-457 Taiz L, Zeiger E (2006) Plant Physiology. 4th Edition, Sinauer Asociates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts He et al. (2007) Current Biology 17: 1109-1115 Kemmerling et al. (2007) Current Biology 17: 1116-1122 Chinchilla et al. (2007) Nature 448: 497-501 Ryu et al. (2007) Plant Cell 19: 2749-2762 Gendron and Wang (2007) Current Opinion in Plant Biology 10: 436-441 Geldner et al. (2007) Genes and Development 21: 1598-1602 Peng P et al. (2008) Molecular Plant 1: 338-346

MF 68 Steroidy (ecdysteroidy) Thummel CS, Chory J (2002) Genes and Development 16: 3113-3129 Baker KD et al. (2003) Cell 113: 731-742 King-Jones K, Thummel CS (2005) Nature Reviews Genetics 6: 311-323 Orme MH, Leevers SJ (2005) Cell Metabolism, Nov.: 277-278 King-Jones K, Thummel CS (2005) Science 310: 630-631 Colombani J (2005) Science 310: 667-670 Schubiger M et al. (2005) Development 132: 5239-5248 Shingleton AW (2005) Current Biology 15: R825-R827 King-Jones K et al. (2005) Cell 121: 773-784 Badenhorst P et al. (2005) Genes and Development 19: 2540-2545 Thummel CS (2005) Cell: 151-153 Palanker L et al. (2006) Development 133: 3549-3562 Takemoto K et al. (2007) PNAS 104: 13367-13372 Nieva C et al. (2007) Cellular Signaling 19: 2582-2587

69 Kdo jsou? Thomas Altmann University of Potsdam, Golm Steven D Clouse North Carolina State University, Raleigh Joanne Chory The Salk Institute, La Jolla Bishop Gerard J University of Wales Aberystwyth, Aberystwyth Müssig C University of Potsdam, Golm Sally M Assmann Pennsylvania State University, Peter McCourt University of Toronto, Toronto

70 Kirst King-Jones Carl S Thummel Anthony Bishopp University of Utah, Salt Lake City University of Utah, Salt Lake City University of Helsinki, Helsinki

71 Klíčová slova pro příští přednášku Ubiquitination E3 ubiquitin ligase Constitutive photomorphogenic 1 Mammalian COP1 Photomorphogenesis Tumorigenesis g http://www.google.cz/ / Google: NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/