5) Fyziologie rostlinných hormonů auxinů: receptory a signální dráhy

Transkript

1 SFZR ) Fyziologie rostlinných hormonů auxinů: receptory a signální dráhy a) Auxinový receptor TIR1 b) Auxinový receptor ABP1 c) Kooperace receptorů TIR1 a ABP1 Estelle M et al. (2011) Auxin Signaling: From Synthesis to Systems Biology; Cold Spring Harbor Laboratory

2 SFZR 2 b) Auxinový receptor ABP1 Hertel R et al. (1972) 1972 identifikace ABP1 (Auxin-Binding Protein 1) v izolovaných membránách z buněk kukuřičné koleoptile; vazba radioaktivního auxinu v membráně 1985 izolace proteinu ABP1 z kukuřice; velikost 22 kd Lobler M an Klämbt DA (1985) Konec 80. let klonování ABP1 a struktura ABP1 Auxin-binding doména Pravděpodobná auxin-binding doména N Box a Box b Box c KDEL C Auxin se váže k plazmamembránové frakci? ALE Protein ABP1 nemá transmembránovou doménu Navržen model Docking proteinu

3 SFZR 3 Transport ABP1 z endoplazmatického retikula do apoplastu Tromas A et al. (2010) Většina ABP1 je lokalizována v endoplazmatickém retikuku (ER). Malá část ABP1 je pomocí vezikul sekretovába zatím neznámým mechanizmem do apoplastu a přichycena na plazmatickou membránu (Plm). Sekrece ABP1 byla dokázána v různých typech buněčných kultur. ABP1 se pravidelně nalézá i v kultivačním médiu. Brefeldin - inhibitor vesikulárního transportu - inhibuje sekreci ABP1 do kultivačního media.

4 SFZR 4 Jaké jsou důkazy pro to, že ABP1 je extracelularní auxinový receptor? Elektrofyziologické experimenty na protoplastech IAA ABP1 Anti-ABP1 antibody ABP1 Control Docking protein Docking protein +NAA +NAA +anti-abp Hyperpolarizace membrány Hyperpolarizace membrány je blokována Barbier-Brygoo H et al. (1989) Technika patch-clamp: Auxinem-indukované zvýšení ATP-závislého proudu může být blokována protilátkami proti ABP1

5 SFZR 5 Elektrofyziologické reakce velmi rychlé (minuty) ALE Růstové reakce jsou pomalejší Potřeba citlivého experimentálního systému k odhalení funkce ABP1 v kontrole růstu Auxinem-indukované zvětšování protoplastů 12 min 6 h Keller C and Van Volkenburgh E (1996) IAA

6 SFZR 6 Časový průběh zvětšování protoplastů a auxinem-indukovaný růst kukuřičné koleoptile Zapojení ABP1 ve zvětšování protoplastů Steffens B and Lüthen H (2000) Auxinový signál pro zvětšování protoplastů je přijímán ABP1 Steffens B et al. (2001)

7 SFZR 7 Teorie kyselého růstu, protonová pumpa a draslíkové kanály Hager A et al. (1971) Rayle D and Cleland R (1970) Auxin Exkrece H + do apoplastu Snížení ph v apoplastu Aktivace enzymů rozvolňujících buněčnou stěnu apoplast cytozol H H + + H + H + H + IAA ATP H + -ATPáza ADP? ABP1 Docking protein Plazmatická membrána Christian M et al. 2006, upraveno Vazba auxinu k ABP1 Stimulace aktivity H + -ATPázy Hyperpolarizace membrány Acidifikace apoplastu

8 SFZR 8 Podmínky platnosti teorie kyselého růstu 1. Kyselé pufry by měly indukovat růst. Kyselé pufry stimulují růst. 2. Auxin by měl zvyšovat rychlost exkrece H + a kinetika exkrece H + by měla korelovat s rychlostí růstu. Auxin stimuluje exkreci H + po min lag fáze = kinetika růstu. 3. Neutrální pufry by měly inhibovat růst indukovaný auxinem. Neutrální pufry inhibují auxinem-indukovaný růst. Fusicoccin stimuluje rychlou exkreci H + a přechodný růst. 4. Látky stimulující exkreci H + by měly stimulovat růst. 5. Buněčná stěna by měla obsahovat faktory, které rozvolňují buněčnou stěnu při nízkém ph. V buněčné stěně se vyskytují expansiny aktivované nízkým ph, které rozvolňují buněčnou stěnu.

9 SFZR 9 Podmínkou růstu buňky je turgor. Auxin sám nezvyšuje turgorový tlak. Akumulace H + v apoplastu Kompenzace náboje v cytosolu K + kanály transportující K + dovnitř buňky apoplast cytosol ATP H + K+ K + H + -ATPáza ADP H + H + IAA ABP1 Docking protein? H + H + Plazmatická membrána Christian M et al. 2006, upraveno K + kanál K + kanál K + K + K + Akvaporin H 2 O H 2 O Akumulace K + v cytosolu Transport H 2 0 do buňky Turgor RŮST Přítomnost K + : podmínka udržení trvalé acidifikace a trvalého růstu

10 SFZR 10 Důkazy zapojení K + kanálů v auxinem-indukovaném růstu - auxinem-indukované prodlužování kukuřičné koleoptile je závislé na koncentraci K + - auxinem-indukované zvětšování protoplastů je závislé na koncentraci K + - TEA (inhibitor K + kanálů) inhibuje auxinem-indukované prodlužování Christian M et al. (2006) - ZMK1 (Zea mays K + channel 1) je exprimován v závislosti na koncentraci auxinu - auxinem-indukovaná exprese ZMK1 koreluje s auxinem-indukovaným růstem - rostliny s knokautovaným ZMK1 jsou embryo letální - rostliny s overexprimovaným ZMK1 jsou supersensitivní k auxinu

11 SFZR 11 Tromas A et al. (2010) Sauer M and Kleine-Vehn J (2011)

12 SFZR 12 UPDATE 2014 Spartz AK et al. (2014) Plant Cell 26: Aktivita H + -ATPázy (protonové pumpy) je stimulována proteiny SAUR19. Mechanizmus: H + -ATPáza je aktivní pouze, když její C-terminální doména je fosforylovaná a navázaná na protein Tím je odblokováno katalyzační místo pumpy pumpa je aktivní. Pokud je protonová pumpa defosforylovaná, tak není aktivní. K této defosforylaci dochází vlivem protein fosfatázy PP2c-D). Pokud je SAUR19 exprimován, tak interaguje s PP2c-D a tím ho inaktivuje. Tím není protonová pumpa defosforylovaná a je aktivní.

13 SFZR 13 Přehled reakcí zprostředkovaných ABP1 - velmi rychlé auxinové reakce proud iontů přes plazma membránu Barbier-Brygoo H et al. (1989) - zvětšování buněk Im KH et al. (2000); Chen JG et al. (2006) - dělení buněk Fellner M et al. (1996) - overexprese ABP1 zvětšená velikost listů tabáku Jones AM et al. (1998)

14 SFZR 14 - knockout ABP1 zastavení vývoje embrya Arabidopsis embryo v globulárním stádiu wt abp1 - kontrola buněčného cyklu fáze G1/S David KM et al. (2007) Chen JG et al. (2001) - inaktivace ABP1 - snížení exprese cyklinů CYCD3 a CYCD6 David KM et al. (2007) - řízená inaktivace ABP1 redukce růstu listů Arabidopsis Braun N et al. (2008)

15 SFZR 15 Rychlá auxinem-indukovaná inhibice endocytózy proteinů PIN1. Plazma membrána Endozom PIN1 Auxin PIN1 Paciorek T et al. (2005)

16 SFZR 16 Robert S et al. (2010) Cell 143: Endocytóza PIN1 je nezávislá na TIR1, ale vyžaduje ABP1. ABP1 stimuluje endocytózu PIN1 proteinů závislou na proteinu clathrinu. Negativní účinek auxinu na internalizaci PIN1 proteinů může být zprostředkován ABP1. Sauer M, Kleine-Vehn J (2011)

17 SFZR Lokalizace a uspořádání kortikálních mikrotubulů (MT) je důležité 17 pro utváření tvaru buňky. Kortikální mikrotubuly, které jsou připojeny k vnitřní straně plazmatické membrány, řídí syntézu celulózy. Epidermální zpevňující buňky listů Epidermální zpevňující buňky listů: Lalokovitá část tvorba F-aktinu ROP2/RIC4 systémem. Prohlubňovitá část tvorba mikrotubulů ROP6/RIC1 systémem. F-actin Lalokovitá část (výběžek; lobeforming region) ROP (Rho Of Plants) = = Rho-related GTPáza (hydroláza) Mikrotubuly Prohlubňovitá část (indenting region ) GTP GDP + Pi Energie Např. translace

18 SFZR 18 Xu T et al. (2010) Cell 143: Auxin zvyšuje tvorbu laloků epidermálních zpevňovacích epidermálních buněk listů. Mutant Arabidopsis abp1-5 má odlišné epidermální zpevňovací buňky a auxin nezvyšuje tvorbu laloků. Polarizace PIN1 je pravděpodobně nutná pro vytváření laloků. Sauer M, Kleine-Vehn J (2011)

19 SFZR 19 Mechanizmus auxinem regulované tvorby tvaru buňky vlivem re-organizace cytoskeletu prostřednictvím Rho-GTPase-závislé dráhy. Nagawa S et al. (2012) PlosONE10: e ) Bylo potvrzeno, že auxin prostřednitvím ABP1 aktivuje ROP2 a ROP6 signalizaci. Yang Z, Lavagi I (2012) (Review)

20 SFZR 20 Update 2014 Xu T et al. (2014) Science 343: Ruan Y and Wasteneys GO (2014) (Review) Objeven další element signální dráhy ABP1 zapojený v regulaci tvaru zpevňovacích epidermálních buněk listů. TMK kináza transmembránová kináza. Auxin indukuje tvorbu komplexu ABP1 a TMK na vnějším povrchu buňky (v apoplastu). Tento komplex aktivuje signální kaskádu ROP2 a ROP6.

21 SFZR 21 c) Kooperace receptorů TIR1 a ABP1 1) TIR1 kontroluje syntézu H + -ATPázy a K + kanálů Christian M et al. (2006) outside H + K+ K + IAA ABP1 inside H + -ATPase Docking protein Plasma membrane ZKM1 ZKM1 ATP ADP Translation IAA TIR1 Transcription IAA TIR1 Translation ARF AuxRE H + -ATPase gene ARF AuxRE K + -channel gene Transcription

22 SFZR 22 2) TIR1 kontroluje syntézu proteinu PIN1, ABP1 kontroluje jeho polární lokalizaci H + IAA IAA IAA outside ABP1 inside H + -ATPase Docking protein Plasma membrane PIN1 PIN1 ATP ADP IAA TIR1 ARF Transcription Translation PIN1 AuxRE PIN1 gene Endozom

23 SFZR 23 3) Rychlá aktivace fosfolipázy A Auxin velice rychle (do 2 min) aktivuje fosfolipázu A (ppla) prostřednictvím ROP signalizace. Mastné kyseliny a lizolipidy (LPX) aktivují transkripci. Mastné kyseliny aktivují pomocí calciumdependent kinázy protein PINOID hlavní regulátor PIN proteinů. Scherer GFE et al. (2012)

24 SFZR 24 4) Duální úloha receptorů ABP1 a TIR1 v kontrole buněčného cyklu David KM et al. (2007)

25 SFZR 25 5) ABP1 kontroluje expresi primárních genů AUX/IAA Braun N et al. (2008) Inaktivace ABP1 vede k významným změnám v expresi auxinem regulovaných primárních genů AUX/IAA. ABP1 reguluje expresi těchto genů nepřímo. UPDATE 2013 Tromas A et al. (2014) Nature Communications 4: 2496 ABP1 je negativní regulátor TIR1 signální dráhy. Absence auxinu: Vysoká stabilita Aux/IAA blokáda exprese genů Přítomnost auxinu: Vazba auxinu k ABP1 snížení stability AuX/IAA uvolnění exprese genů UPDATE 2014 Paque S et al. (2014) Plant Cell 26: ABP1, prostřednictvím TIR1 signalizace, ovlivňuje expresi genů kódujících proteiny buněčné stěny.

26 SFZR 26 Symbolický model potencionální interakce ABP1 a TIR1 Scherer GFE (2011)

27