3 a) Fyzikální principy. 5 Chemický potenciál (µ s ) (volná energie na jeden mol: J/mol) * = chemický potenciál roztoku s za standartních podmínek

Transkript

1 MBRO ) Membránový transport Prokaryotická buňka Eukaryotická buňka a) Fyzikální principy b) Regulace pohybu roztoků membránami a jejich transportéry c) Pumpy Pohyb vody první reakce klidných či dormantních semen 3 a) Fyzikální principy 4 Hnací silou pohybu molekul v roztoku nebo plynné fázi je gradient a jeho potenciální energie. Hydratace buněk a pletiv je jednou z prvních reakcí, které se odehrávají při imbibici semen. Rozvoj oboru membránového transportu klonování, techniky patch-clamp Molekuly jsou v neustálém pohybu - difúze Difúze je spontánní proces a splňuje Fickův zákon. 5 Chemický potenciál (µ s ) (volná energie na jeden mol: J/mol) (energetické změny spojené se změnou počtu částic jednotlivých složek) 6 Probíhá buď z jednoho místa na druhé, nebo přes membránu. Rychlost, kterou se molekuly pohybují, závisí na jejich velikosti, na velikosti koncentračního gradientu, viskozitě média a teplotě. µ s = µ s* + RTlnC s + z s FE + V s P µ s * = chemický potenciál roztoku s za standartních podmínek Tento vztah je vyjádřen rovnicí: J s rychlost difúze molekuly roztoku s D s difúzní koeficient ΔC s /Δx koncentrační gradient = rozdíl v koncentracích ΔC s mezi dvěma body Δx. Gradient je směr růstu! J s = D s (ΔC s /Δx) Molekuly se pohybují ve směru koncentračního gradientu (z místa o vyšší koncentraci těchto molekul do míst o nižší koncentraci = ve směru růstu). D s pro ionty: 10-9 m 2 s -1 D s pro větší molekuly: m 2 s -1 RTlnC s = koncentrační složka, zahrnující koncentraci C roztoku s v molech na litr při standartním tlaku R, T = absolutní teplota z s FE = elektrická složka, z = náboj roztoku s (0 pro nenabitý roztok, +1, +2 nebo -1, -2 v závislosti na valenci kationtů či aniontů), F = Faradayova konstanta = množství náboje v jednom molu elektronů, E = elektrický potenciál roztoku vztažený k uzemnění V s P = složka hydrostatického tlaku, zahrnuje parciální molární objem V a tlak P. 1

2 Biologické molekuly: příspěvky V a P jsou malé µ s = µ s* + RTlnC s + z s FE Ionty, nabité molekuly Elektrochemický potenciál 7 8 Hnací silou difúze roztoku do a ven z buňky je rozdíl mezi chemickým potenciálem uvnitř buňky a chemickým potenciálem externího roztoku (Δµ s ). Pasivní pohyb se děje ve směru gradientu chemického potenciálu = ve směru růstu. Pro nenabitý roztok je elektrická složka z s FE = 0 Stabilní stav µ s = µ s* + RTlnC s Aktivní pohyb proti směru gradientu chemického potenciálu = proti směru růstu. Pro nenabité roztoky: Rovnice gradientu chemického potenciálu: 9 Pro nabitý roztok je chemický potenciál: 10 Δµ s = (µ s* + RTlnC si ) - (µ s* + RTlnC so ) Δµ s = RTln(C si /C so ) i = vnitřek buňky o = externí roztok µ s = µ s* + RTlnC s + z s FE + V s P Rovnice gradientu elektrochemického potenciálu pro nabitý roztok: Δµ s = (µ s* + RTlnC si + z s FE i ) - (µ s* + RTlnC so + z s FE o ) Hnací síla difúze nenabitého roztoku s je velikost rozdílu jeho koncentrace přes membránu. Δµ s = RTln(C si /C so ) + zf(e i - E o ) Znaménko produktu rovnice označuje směr pohybu roztoku s: záporné znaménko ukazuje, že roztok má tendenci difundovat do buňky ve směru (down) chemického gradientu. V m - membránový potenciál (membránové elektrické napětí) Pohyb nabitého roztoku reaguje na dvě nezávislé síly: rozdíl v koncentraci přes membránu a membránový potenciál. Vývoj membránového potenciálu 11 Rovnice gradientu elektrochemického potenciálu pro nabitý roztok: 12 Membrána více permeabilní pro K + než Cl - Δµ s = RTln(C si /C so ) + zf(e i - E o ) Rovnováha mezi vnitřkem a vnějškem buňky: gradient elektrochem. potenciálu Δµ s = 0. K + i Cl- difundují ve směru koncentračního gradientu (tedy z vyšší koncentrace do nižší) z části A do části B, ale K + difunduje přes membránu rychleji než Cl -. Rozdíl v náboji přes membránu RTln(C si /C so ) = - zf(e i - E o ) Rozdíl v elektrickém potenciálu: ΔE ΔE = (RTln(C o s /C i s )/z s F Pro monovalentní kationty a 25 o C : z = +1 Rozdíl v elektrickém napětí ΔE = 59 mv log (C so /C si ) Nernstova rovnice 2

3 b) Regulace pohybu roztoků membránami a jejich transportéry 13 Transportní proteiny - střídavé bloky hydrofobních a hydrofilních aminokyselin. 14 Lipofilní (hydrofobní) molekuly ATPáza H + -ATPáza Pohybují se do té doby, dokud existuje gradient chemického potenciálu. Molekuly neprocházející membránou Nutnost transportních proteinů Hydrofobní aminokyseliny dovolují překlenout fosfolipidovou dvojvrstvu membrány Hydrofilní domény ponořené do cytozolu, lumenu organel nebo vnějšku buňky Prostá difúze roztoky se pohybuji volně přes PM ve směru gradientu elektrochemického potenciálu (ve směru koncentračním spádu) 15 Pohyb roztoků proti gradientu jejich elektrochemického potenciálu = aktivní transport vyžadující buněčnou energii 16 Usnadněná difúze roztoky pohybují se ve směru gradientu elektrochemického potenciálu, ale vyžadují pro svůj transport přítomnost membránových transportérů: kanály a přenašeče Primární aktivní transport hydrolyzován ATP nebo pyrofosfát k uvolnění energie požadované pro vytvoření gradientu pumpy Sekundární aktivní transport umožněn iontovým gradientem založeným primárním aktivním transportem co-transportéry: symportéry, antiportéry c) Pumpy Transportují roztoky proti elektrochemickému gradientu. Vážou se k roztokům, které mají transportovat a hydrolyzují ATP nebo pyrofosfát jako zdroj energie. ATP-syntáza (F-typ ATPázy) 17 Pumpy hydrolyzující ATP P-typ ATPázy V-typ ATPázy ABC transportéry Inhibovány vanadatem Necitlivé k vanadatu Inhibovány vanadatem 18 Pumpa hydrolyzující pyrofosfát Pumpa hydrolyzující ATP Transportují roztoky rychlostí 10 nebo 100 molekul nebo iontů/sek. 3

4 P-typ ATPázy 19 Plazmamembránová (PM) H + -ATPáza - na Mg závislá P-typ ATPáza 20 Cytozolické domény váží a hydrolyzují ATP a uvolněná energie řídí pohyb roztoků přes membránu. Po hydrolýze ATP vznikají fosforylované meziprodukty. Gradient náboje Změna Vm Jeden proton H + je pumpován ven z cytozolu za jednu molekulu ATP Hyperpolarizace Depolarizace Funkcí PM H + pumpy je udržování cytozolického ph na 7,3 7,5. Fosforylace ATPázy ve stavu E1 vede k vazbě H + na jedné straně membrány a vede ke vzniku stavu E2. E2 má nižší afinitu k H + => uvolnění H + i anorganického P na druhé straně membrány. Hydrolýza P z E2 => vznik E1 stavu. Optimum pro fungování PM H + pumpy je 6,6 Elektrochemický gradient protonů se nazývá protonová hnací síla (proton motive force - pmf) Akumulace H + v cytozolu vede k aktivaci pumpy PM H + -ATPáza je regulována prostřednictvím enzymové aktivity spíše než genovou expresí 21 Ca 2+ -ATPáza reguluje hladinu cytozolického vápníku ( nm) 22 Pumpuje Ca 2+ z cytozolu do vakuoly nebo dalších organel Arabidopsis PM H + -ATPáza: 11 genů P-ATPáza; vyskytuje se ve všech membránách, včetně chloroplastů a mitochondrií. C-terminální regulační autoinhibiční doména (Thr; fosforylační místo) 2 geny jsou exprimovány ve všech buňkách. ATP-binding doména Individuální buňky exprimují mnohonásobné izoformy těchto genů. Aktivita H + pumpy je regulována prostřednictvím aktivity proteinu Aktivitu H + pumpy stimuluje houbový toxin fusicoccin. Hydrolýza ATP Ca 2+ -ATPázou je doprovázena transportem dvou iontů Ca 2+ přes membránu. N-terminální doména váže calmodulin (Ca 2+ senzor) => inhibice pumpování Ca 2+ V-typ ATPázy Příbuzné ATPázám typu F složitá multisubjednotková struktura Arabidopsis V-ATPázy: 13 subjednotek kódovaných 27 geny; tonoplast a endomembrány Velké množství kombinací 23 H + pumpující pyrofosfatázy (H + -PP) Funkční H + -PP - homodimer, 80 kda; vakuola, Golgiho aparát, multivezikulární tělíska, plazmatická membrána Rostliny 2 typy H + -PPázy Typ I aktivovány cytozolickým K +, inhibovány Ca 2+ Typ II silně aktivovány Ca 2+, necitlivé k K + 24 Pumpují 3 H + / 1 hydrolyzovaný ATP Chybí v chloroplastech a mitochondriích. V-ATPázy okyselují vakuolu => + náboj balancován akumulací organických aniontů (malát, oxalát) a anorganických aniontů (Cl - ). Proč existují dva typy H + pump na tonoplastu rostlinných buněk: V-ATPázy + H + -PP? Využítí velkého množství pyrofosfátu v rostlinných buňkách (mm) produkován během syntézy ADP-glukózy a uridin-difosfátu (UDP)-glukózy V-ATPázy a H + -PPázy - okyselování vakuoly => udržování tonoplastového V m okolo mv 4

5 ABC transportéry 25 ATP-Binding Casette transportéty - ATPázy P-typu: hydrolyzují ATP a transportují různé organické molekuly; vakuola, plazmatická membrána 2 základní strukturní elementy: Integrální domény Nukleotid-binding smyčky (zapojeny v hydrolýze ATP) Transport antokyanů, katabolitů chlorofylu, protihoubových látek, auxinů, vosků Akumulace metabolitů a xenobiotických molekul ve vakuole (syntetické herbicidy) (glutation; GST glutation transferáza) 5