SPORULACE BACILLUS SUBTILIS

SPORULACE BACILLUS SUBTILIS 1.Buňka 1 nebo více buněk odlišných DĚLENÍ EXTERNÍ SIGNÁLY (pokles zdrojů výživy, hustota populace) INTERNÍ SIGNÁLY (stádium buněčného cyklu) Signální transdukce SPORULACE HLADOVĚNÍ - pokles intracelulární hladiny GTP (inhibice GTP biosynthesy = sporulace i v prostředí bohatém živinami HUSTOTA - sporulace pouze při vysoké hustotě buněk feromon-like faktor (peptidy) - akumulace v husté kultuře B.CYKLUS -? NESPORULUJÍCÍ MUTANTY geny Spo0 (A,B,E,F,H,J,K ) - Exprimují se při normálním růstu buněk role v detekci signálů a regulaci přechodu vegetativní růst sporulace - Spo0A = transkripční faktor

Terminální buňka LYSE Mateřská buňka (MB) Forespore (FS, pre-spora ) Zárodečná buňka DALŠÍ VÝVOJ Tvorba septa σ F II σ E Tvorba axiálního filamenta 0 - I SPORULACE BACILLUS SUBTILIS 6-8 hod VII V - VI III. IV σ G -Oddělené kompartmenty - Kompletní genomy - Rozdílná exprese (koordinace) - >500 genů (1/10 genů) = časová a místní regulace genové exprese - 5 sigma (σ) faktorů RNA polymeras + 4 DNA vazebné proteiny - cot geny = kódují polypeptidy komponent obalu spory - synt MB - ssp geny = malé proteiny uvnitř spóry (SASP) - synt PRE-SPORA některé vazba na genom = resistence k UV σ k

???? ROZHODOVÁNÍ B.CYKLUS SPORULACE ASYMETRICKÉ BUNĚČNÉ DĚLENÍ JAK ASYMETRICKÉ DĚLENÍ OVLIVNÍ OSUD OBOU KOMPARTMENTU = MB x FS KOMUNIKACE OBOU KOMPARTMENTU BĚHEM VÝVOJE ŘÍZENÍ GENOVÉ EXPRESE V ZÁVISLOSTI NA MORFOGENESI = TIMING Richard Losick (Harvard University) REGULACE úroveň transkripce úroveň post-translační

2 KOMPONENTOVÝ REGULAČNÍ SYSTÉM signální transdukce regulace genové exprese a chování buněk jako odpověď na změny externích podmínek A) SENSOR membránový B) REGULÁTOR N Registrace signálu vnitrobuněčný N C Přenos signálu C Přenos fosfátu N Detekce signálu C Funkce Konservativní doména na N-konci 120 AK Konservativní doména na C-konci 200-250 AK Často histidine protein kinasa - autofosforylace na His Často transkripční faktor PŔÍKLADY: - Sporulace - Chemotaxe - Exprese porinů etc. SPORULACE X DALŚÍ SYSTÉMY Kaskáda fosforylací mezi PK a transkripčním faktorem Regulátor - přímá fosforylace protein kinasou

SPORULACE BACILLUS SUBTILIS A) SENSOR = KinA B) REGULATOR = Spo0A kina mutanta - redukce sporulace na 10 % další protein kinasa - KinB kina,kinb mutanta - nesporuluje možná substituce protein kinas KinA =? Integrace signálu množství živin a signálu buněčného cyklu = 3 PAS domény -? Sensing energie buňky a redox stavu - inhibice jako odpověď na DNA poškození nebo blok DNA replikace SIGNÁL KinA + ATP KinA~ P + ADP KinA~ P + Spo0F KinA + Spo0F~ P Spo0F~ P + Spo0B Spo0F + Spo0B~ P Spo0B~ P + Spo0A Spo0B + Spo0A~ P TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Geny Spo0F, Spo0B, Spo0A - Není amplifikace signálu - V každém kroku lze ovlivnit - Exprimují se při normálním růstu buněk V nesporulujících buňkách, basální hladina exprese Fosforylace transkripce > 500 genů

KinA Cell density signály (sekretované peptidy processing import jako pentapeptidy zpět do buněk inhibice fosfatas) Rap1 Signály Spo0E KinA~ P Spo0F Spo0B Spo0A KinB~ P Spo0F~ P Spo0B~ P Spo0A~ P KinB + další kinásy KinC,D,E Spo0E = Inhibitor iniciace sporulace (specifická fosfatasa, defosforylace Spo0A~ P) -mutace zvýšená sporulace - overexprese inhibice sporulace -některé nonsense mutace inhibice sporulace C-konec - detekce signálu N-konec - inhibice krátké fragmenty mohou inhibovat Rap1 = fosfatasa defosforylace Spo0F~ P Obg gen = GTP-binding protein (esenciální, GTP vazebná doména homologní s RAS)? Detekce hladiny GTP nebo signálů buněčného cyklu regulace aktivity Spo0B HLADOVĚNÍ? Pokles GTP? Aktivace protein kinasy nebo vliv na Obg GTP váže CodY protein (represor sporulace), snížení GTP vede k ztrátě represorové aktivity Obg Signály -? GTP

Represor CodY = má 2 ko-represory (GTP, Ile), = snížení každého z nich částečná dereprese Limitace aminokyselin Vazba nenabitých trna na ribosom aktivace inosine monophosphate xanthosine monophosphate ribosome-bound enzyme IMP dehydrogenase Snížení množství GTP branched chain fatty acid -Tvoří 90 % membránových mastných kyselin branched chain keto acid stimulace CodY vazby na DNA Sporulace GTP-binding protein, represor Bacillus subtilis dipeptide (dppabcde) operonu

Signály KinA Cell density signály (sekretované peptidy processing import jako pentapeptidy zpět do buněk inhibice fosfatas) Rap1 Signály Spo0E Oligopeptid signál Spo0K KinA~ P Spo0F Spo0B Spo0A KinB~ P Spo0F~ P Spo0B~ P Spo0A~ P Signály KinB + další kinásy KinC,D,E Obg Signály -? GTP AKTIVACE/REPRESE TRANSKRIPCE Spo0K operon = transportní systém = receptor CSF signálního polypeptidu - podobný permease polypeptidů u Salmonella), - substrate binding protein (povrch buňky) - 2 membránové proteiny (přenos substrátu) - 2 ATPasy (ATP hydrolysa, energie) - nadprodukce KinA částečná substituce Spo0K systému? Aktivace protein kinasy po detekci nebo transportu oligopeptidu Spo0A transkripční faktor - Spo0A~ P akumulace aktivace alespoň 500 genů přepnutí ze symetrického na polární dělení (SpoIIE, SpoIIA, SpoIIG) - nutné udržení určité hladiny i po iniciaci sporulace - autoaktivace exprese

sigh σ H faktor Spo0A~ P nepřímý regulátor sigh (represe represoru AbrB) - Řídí transkripci spoiiaa-spoiiab-sigf operonu kóduje σ F (časný faktor pre-spóry) Funguje ve vegetativních buňkách

SYMETRICKÉ DĚLENÍ POLÁRNÍ DĚLENÍ 0 - I - vegetativní buňky - FtsZ (tvorba septa v místě FtsZ assembly) - Min systém DivIVA PLR Spo0J oric SpoIIIE Chromosome - sporulace nukleoidy spojené axiálním filamentem (stadium I) FtsZ ring - změna posice z centra do oblasti obou pólů - pod kontrolou Spo0A~P (? jaké geny) septum v jednom z polárních rings FtsZ - kontrola sporulačním σ H faktorem (mutanty mají asymetrický FtsZ ring, ale netvoří septum) oba póly jsou místem, kde může septum vzniknout - mutanty v σ E faktoru pre-sporové kompartmenty na obou pólech nukleoid - translokace do pre-spory (přes septum) SpoIIIE = podobný proteinu pro přenos konjugativních plasmidů Streptomycet spoiiie mutanty - 30 % nukleoidu z oblasti ori - chyceno v prespoře (? CEN-like oblast) Spo0J =? Vazba ori k pólu (spo0j / spoiiie mutanta není chycena

Vegetativní buňky - FtsZ v centru Iniciace sporulace FtsZ zmizí z centra a objeví se v krajových posicích vyžaduje Spo0A~P FtsZ tvoří spiralovitou strukturu - posun k pólum, stejná struktura FtsA-GFP a EzrA- GFP (proteiny vážící FtsZ) FtsZ -GFP SpoIIIE chromatin centrální ring polární ring Reverse sporulace přidáním živin opět spirály - posun směrem k centru Tvorba spirály závislá na FtsA a na σ H FtsZ - degradace FtsZ Soj Relokalizace z pólu na pól DivIVA RacA exprese SpoIIIE

Stádium II asymetrické kompartmenty TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ F PRE-SPORA Mateřská buňka (MB) σ F Forespore (FS, pre-spora ) σ F - kontrolované geny se začnou exprimovat hned jak se vytvoří polární septum σ F : -přítomen před sporulací (imunofluorescence) - po septaci v obou kompartmentech (i v mateřské buňce - imunofluorescence) jeho produkce začíná PŘED septací -v některých mutantách je aktivní před septací a v mutantě s 2 pólovými kompartmenty je aktivní v obou Regulace AKTIVITY σ F Proteiny: SpoIIE SpoIIAB SpoIIAA Syntetisovány před septací SpoIIAB: anti- σ - faktor - vazba σ F inhibice transkripce řízené σ F PK - fosforylace Ser SpoIIAA: anti- anti- σ - faktor - fosforylace prostřednictvím SpoIIAB ruší schopnost SpoIIAA vázat SpoIIAB SpoIIAB: vazebné místo pro adenosinové nukleotidy ovlivnění relativní afinity SpoIIAB pro alternativní vazebné partnery (σ F, SpoIIAA) ATP stimulace tvorby komplexu SpoIIAB - σ F ADP stimulace tvorby komplexu SpoIIAB - SpoIIAA SpoIIE: specifická Ser fosfatasa, defosforyluje (aktivuje) SpoIIAA vazba na σ F - SpoIIAB komplex uvolnění σ F

σ F SpoIIAB - σ F (ADP) inaktivní (ATP) SpoIIAB aktivní fosforylace SpoIIAA aktivní σ F SpoIIAA ~ P inaktivní aktivní SpoIIAB - SpoIIAA inaktivní SpoIIE defosforylace? Důležitým regulačním faktorem je pokles hladiny ATP : ADP v malém kompartmentu prespory Preferenční vazba SpoIIAB - SpoIIAA (ADP) SpoIIE: integrální membránový protein, C-doména má fosfatasovou aktivitu Lokalisace: před septací - v obou místech potenciálního polárního dělení (závislá na FtsZ) po tvorbě polárního septa - zmizí z druhého pólu, zůstává v septu aktivace σ F - zmizí i ze septa v době septace - v místě mezi oběma kompartmenty Prespóra = 5-7 x menší než mateřská buňka koncentrace nefosforylovaného SpoIIAA vyšší v PRESPOŘE SpoIIAA -uvolníσ F z komplexu SpoIIAB - σ F Nadprodukce SpoIIE zvýšená defosforylace SpoIIAA ~ P předčasná aktivace σ F + Další role SpoIIE - mutanty - aberantní septum, tenčí vrstva peptidoglykanu -zpoždění septace

? ATP : ADP ATP : ADP IIAB - σ F IIE σ F IIAA ~ P IIAB-IIAA?? -Jak je určena subcelulární lokalisace SpoIIE - Role ADP:ATP etc... MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ E MATEŘSKÁ BUŇKA aktivace genů kontrolovaných σ E - krátce po aktivaci σ F v prespoře syntetisován jako prekursor pro- σ E (SpoIIGB) - aktivován proteolytickým štěpením N-koncových 27 AK synthesa pro- σ E -před asymetrickým dělením, Operon SpoIIG - indukován Spo0A~ P SpoIIGA protein - membránově vázaný - processing pro- σ E, je přítomen před septací Regulace processingu časová (po septaci) i místní (mateřská buňka) Úprava pro- σ E σ E vyžaduje ještě další gen(y) pod kontrolou σ F SpoIIR identifikován časováregulacezávislánaσ F (na prespóře) a na RsfA aktivatoru (pod kontrolou σ F )

SpoIIR nese potenciální signální sekvenci - při expresi ve vegetativních exponenciálně rostoucích buňkách - produkce do média SpoIIR sekrece z prespory? kontakt s extra - cytoplasmatickou doménou SpoIIGA (nebo jiného proteinu) SpoIIGA = receptor / proteasa (aspartátová) SpoIIR = sekretovaný signální protein interagující s receptorovou doménou SpoIIGA - aktivace proteasové domény pro- σ E σ E SpoIIGA spoiir spoiir Hlavní funkce SpoIIR: koordinace vývoje mateřské buňky a prespory?? Jak se zabrání, aby SpoIIR neaktivoval SpoIIGA molekuly v membráně prespory? další mechanismy (? Blok aktivity σ E v prespoře) -zjištění, že σ E zmizí z prespory -? fce SpoIIIE

ENGULFMENT (POHLCENÍ) = Fagocytosa-like proces σ E σ F III. σ G Kooperace mateřské buňky a prespory MORFOLOGICKÉ ZMĚNY: Konverse post-septačního sporangia Vznik struktury buňka v buňce = STÁDIUM III Degradace peptidoglykanu septa (od centra) vychlípení kompartmentu přespory do mateřské buňky (vyšší osmolarita prespory) migrace cytoplasmatické membrány mateřské buňky fuse uzavření PRESPORY - dvojitá membrána kontrola σ F (prespora) a σ E (mateřská buňka) aktivace řady genů

GENOVÉ EXPRESE V PRESPOŘE + KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU - Po ukončení engulfment stádium III - σ F (prespora) aktivace transkripce SpoIIIG (sigg) v prespoře σ G závislá na přítomnosti σ E v mateřské buňce mateřská buňka generuje signál nutný pro expresi SpoIIIG σ G aktivuje řadu genů pre-spory (včetne ssp) autoaktivace vlastní exprese zvýšení hladiny KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU na úrovni transkripce na úrovni aktivace (i když je SpoIIIG pod kontrolou jiného promotoru, není σ G dostatečně aktivní bez σ E aktivity ) závisí na 8 proteinech produkovaných ze SpoIIIA operonu pod kontrolou σ E v mateřské buňce, spoiiiah kóduje protein podobný komponentám sekrečního systému. SpoIIIAH interaguje s SpoIIQ prespory pravděpodobně tvoří kanál mezi prespórou a mateřskou buňkou? Co transportuje (?regulační protein/y, malé metabolity, živiny, důležitý i v pozdějších stádiích) KOORDINACE ČASOVÉHO VÝVOJE

MATEŘSKÁ BUŇKA REGULACE GENOVÉ EXPRESE V MATEŘSKÉ BUŇCE - KASKÁDA σ E (mateřská buňka) 1. set genů regulační gen SpoIIID (DNA-vazebný protein) SpoIIID spolu se σ E -polymerasou zapnutí 2. setu genů = geny nutné pro σ K (mateřská buňka) σ K -polymerasa σ K -polymerasa zapnutí 3. setu genů - GerE (DNA-vazebný protein) GerE = represor časněji zapnutých genů (včetně σ K ) GerE spolu se σ K -polymerasou zapnutí 4. (posledního) setu genů MATEŘSKÁ BUŇKA: 2 sigma faktory (σ E, σ K ) + 2 DNA-vazebné proteiny (SpoIIID, GerE)

ZPĚTNÁ SIGNALISACE Z PRESPORY DO MATEŘSKÉ BUŇKY III. σ G IV σ K σ K Kontrola pozdní genové exprese v mateřské buňce Syntetisován jako pro- σ K (aktivace odstraněním N-koncových 20ti AK) Aktivace (processing) blokován mutací v SpoIIIG (σ G ) Aktivace vyžaduje účinek produktu(ů) genu(ů) aktivovaných σ G v prespoře Role produktu genu SpoIVB lokalisace na membráně prespory SpoIVFB pro- σ K σ K SpoIVB SpoIVB SpoIVB aktivace membránově vázané metaloproteasy SpoIVFB, aktivita modulovaná dvěma membránovými proteiny mateřské buňky SpoIVFA a BofA SYNCHRONISACE VÝVOJE OBOU KOMPARTMENTU exprese σ K bez pro-sekvence předčasná aktivace σ K defekty ve sporulaci, aberantní spory

σ K Několik hladin regulace VEGETATIVNÍ BUŇKA SpoIVCA 48kbp MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA SigK SpoIVCA Skin element (48 kbp) obsahuje gen SpoIVCA je aktivován SpoIIID - σ E kóduje místně specifickou rekombinasu - vyštěpí skin element (specifická sekvence 5 bp) spojení SigK genu (pro- σ K ) POUZE V MATEŘSKÉ BUŇCE Skin element homologie s genomem bakteriofága PBSX asi kryptický profág využit buňkou pro- σ K SpoIVCA X Umělé odstranění skin elementu nepoškozuje sporulaci další hladiny regulace Další hladiny regulace σ K : regulace exprese SigK = kombinovaná akce SpoIIID - σ E aktivace odštěpením pro-sekvence positivní feedback = autoaktivace exprese Exprese cot genů (obaly spóry)

MATEŘSKÁ BUŇKA σ A σ H Spo0A~ P POLÁRNÍ DĚLENÍ PRESPORA FM4-64 - membrána SpoIIE σ F FM4-64 - membrána spoiid-gfp (σ E ) pro- σ E σ E SpoIIGA-SpoIIR proteolýza? SpoIIIA kanál σ G spoiiq-gfp (σ F ) FM4-64 - membrána FM4-64 - membrána sspa-gfp (σ K ) pro- σ K σ K cot SpoIVFB-SpoIVB proteolýza Septum/ obal prespory ssp gere-gfp (σ G ) Membrána prespóry není dostupná pro lipofilní FM4-64 (engulfment)

LABORATORNÍ KMENY, INDIVIDUÁLNÍ BUŇKY X DIVOKÉ KMENY ISOLOVANÉ Z PŘÍRODY Branda et al., (2001), Fruiting body formation by Bacillus subtilis, PNAS 98: 11621 11626 Laboratorní kmen Divoký kmen Divoký kmen = u okraje kolonie 100 μm Divoký kmen = SEM 10 μm 10 μm

Fuse: - lacz genu + sspe (exprese v pozdějších fázích sporulace, prespora) - lacz genu + spoiid 50 μm Vzdušné (aerial) struktury na koloniích lokalisace exprese lokalisace sporulace MÍSTNÍ LOKALISACE DIFERENCIACE UVNITŔ MNOHOBUNĚČNÉ STRUKTURY Podobně u dalších mikroorganismů - Streptomyces, Myxobacteria etc...

REGULACE LOKALISACE SPORULACE? Analysa mutant - v genech Spo0A, Spo0H (σ H ) = regulátory iniciace sporulace - v genu SigF (σ F )= časný regulátor vývoje prespory - v genech YveQ and YveR = transkripce pod kontrolou Spo0A a σ H, pravděpodobně kódují enzymy syntetisující EPS (exopolysacharide, často součástí mnohobuněčných agregátů, biofilmů) - mutanta sfp = nemá phosphopantetheinyltransferasu, která je důležitá pro produkci surfactinu (surfactants důležité pro tvorbu vzdušných struktur - snížení povrchové smáčivosti ) 0.5 μm Spo0A, Spo0H (σ H ) ROLE PŘI TVORBĚ VZDUŠNÝCH STRUKTUR, KTERÉ SE STANOU MÍSTEM SPORULACE MNOHOBUNĚČNÝCH POPULACÍ B.SUBTILIS, ASOCIOVANÝCH S PEVNÝM POVRCHEM

Změny ve vnitrobuněčné koncentraci Spo0A-P regulují odlišnou genovou expresi v různých buňkách Nižší hladina Spo0A-P Vysoká hladina Spo0A-P Transkripční represor, konstitutivní Studium diferenciace

Okraj kolonie Diferenciace v kolonii/biofilmu

B. subtilis E.coli P. aeruginosa B. subtilis Aguilar et al., Curr Opin Microbiol. 10: 638 643, 2007 Veening et. al,.j Bacteriol. 188, 3099 3109, 2006? DOMESTIKACE = Obecná vlastnost mikroorganismů

Kanibalismus Bacillus subtilis Stress indukce záchranného programu, např. sporulace - spóry přežijí Spo0A aktivován pouze v cca ½ buněk populace při hladovění (závisí na podmínkách) směsná populace buněk (Spo0A-ON) a buněk (Spo0A-OFF) základem pro kanibalismus Spo0A-ON buňky: zapnutí transkripce operonů skfa-h a sdpabc produkce a export peptidového faktoru Skf podobného antibiotiku (cyklický 26 AK peptid) + proteinového toxinu SdpC zabijí Spo0A-OFF buňky Spo0A-ON Skf Sporulation killing factor Spo0A-OFF Sdp Sporulation delay protein 42 AA peptid Živiny ze zabitých buněk zpomalí sporulaci, resp. průchod Spo0-ON buněk stádiem, kdy je nastartován irreversibilní program - Oddálí se rozhodnutí Ochrana Spo0A-ON buněk před zabitím skfa-h nese geny pro proteiny exportující peptidový killing faktor. SdpC proteinový toxin stimuluje sousední operon SdpRI SdpI imunitní protein pouze v Spo0A-ON buňkách

Kanibalismus Bacillus subtilis v kolonii/biofilmu - Spo0A-ON buňky, které kanibalizují (produkuji toxiny a jsou resistentní), zároveň produkují ECM - Živiny z lysovaných buněk podporují tvorbu ECM, zároveň oddalují sporulaci dokud se nevytvoří struktura ve které spóry vznikají, spóry jsou pak lépe chráněny - Analogie programované buněčné smrti - Koordinace kanibalismu a produkce ECM specifickou buněčnou subpopulací je zprostředkovaná surfactinem který funguje jako quorum sensing molekula.