Univerzita Karlova v Praze 3. lékařská fakulta

Univerzita Karlova v Praze 3. lékařská fakulta Ústav normální, patologické a klinické fyziologie VLIV PRENATÁLNÍ EXPOZICE METAMFETAMINU A CROSS FOSTERINGU NA FUNKČNÍ ZMĚNY U LABORATORNÍHO POTKANA Mgr. Lenka Hrubá Disertační práce Školitel: doc. MUDr. Romana Šlamberová, Ph.D. Praha 2010

Bibliografická identifikace Jméno a přijmení autora: Mgr. Lenka Hrubá Název disertační práce: Vliv prenatální expozice metamfetaminu a crossfosteringu na funkční změny u laboratorního potkana. Název disertační práce anglicky: The effect of prenatal MA exposure and crossfostering on functional changes in laboratory rat. Školící pracoviště: Ústav normální, patologické a klinické fyziologie 3. LF UK Školitel: doc. MUDr. Romana Šlamberová, Ph.D. Obor postgraduálního doktorského studia biomedicíny: Fyziologie a patofyziologie člověka Předseda oborové rady: Prof. MUDr. Jaroslav Pokorný, DrSc. _ Práce vznikla v letech 2006 2010 v rámci prezenčního postgraduálního doktorského studia biomedicíny na 3. lékařské fakultě Univerzity Karlovy v Praze a byla odevzdána dne 28.5. 2010. ii

Prohlášení Prohlašuji, že v disertační práci jsou použita originální data ze studie provedené v rámci mého prezenčního postgraduálního studia na Ústavu normální, patologické a klinické fyziologie 3. LF UK. Disertační práce byla podpořena z finančních zdrojů Výzkumného záměru Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (MSM 0021620816), Centra neurověd Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (LC554) a z prostředků Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví České republiky (1A8610-5/2005). Prohlašuji, že jsem na této disertační práci pracovala samostatně a že jsem nepoužila jiné zdroje a literaturu než ty, které jsou uvedeny v seznamu použité literatury. V Praze dne 28.5. 2010 Mgr. Lenka Hrubá A iii

Poděkování Velmi ráda bych poděkovala všem, kteří mi pomáhali při vzniku této práce. Především své školitelce doc. MUDr. Romaně Šlamberové, Ph.D., za její odborné vedení, všestrannou pomoc a podporu, kterých se mi dostalo během celého postgraduálního studia. Dále děkuji MUDr. Barboře Schutové za pomoc při experimentech a doc. MVDr. Šimonu Vaculínovi, Ph.D. za cenné připomínky v oblasti výzkumu bolesti. Nakonec bych chtěla poděkovat své rodině za podporu a poskytnuté zázemí. iv

Seznam zkratek 2. LF UK 2. lékařská fakulta Univerzity Karlovy 5-HT serotonin ABN arched back nursing, kojení v aktivní pozici s nahrbeným hřbetem ACTH adrenokortikotropní hormon ADHD attention deficit-hyperactivity disorder, syndrom deficitu pozornosti s hyperaktivitou ANOVA ANalysis Of VAriance, analýza rozptylu BNST bed nucleus of stria terminalis CART cocaine-and-amphetamine-regulated-transcript CNS centrální nervový systém D diestrus DA dopamin DAT dopaminový přenašeč ED embryonální den EMCDDA Evropské monitorovací centrum pro drogy a drogovou závislost EPM elevated plus maze, vyvýšené křížové bludiště FN fakultní nemocnice FR fyziologický roztok FR matka matka, které byl aplikován fyziologický roztok HCl kyselina chlorovodíková HPA hypotalamo-hypofyzární nadledvinová osa IQ inteligenční kvocient LG licking/grooming, olizování/pečování LS laterální septum MA metamfetamin MA matka matka, které byl aplikován metamfetamin MAO monoaminooxidáza MPOA mediální preoptická oblast mrna mediátorová ribonukleová kyselina v

MWM Morris water maze, Morrisovo vodní bludiště NA noradrenalin NaCl chlorid sodný OF open field, otevřená aréna OSN Organizace spojených národů P proestrus PD postnatální den PVN paraventrikulární jádro SAP stretched attened posture s.c. subkutánně VMH ventro-mediální jádro hypotalamu vi

Abstrakt Cíl: Cílem disertační práce bylo zjistit, do jaké míry pozmění cross-fostering funkční změny zvířat, prenatálně vystavených účinkům metamfetaminu (MA). V experimentální části studie byl u laboratorních potkanů testován vliv prenatální, resp. postnatální expozice MA, aplikovaného prostřednictvím mateřského mléka, a vliv rozdílné mateřské péče na postnatální vývoj, kognitivní funkce, chování, anxietu a nocicepci. Metodika: Dospělé samice laboratorního potkana byly vystaveny chronickému působení MA (5mg/kg) nebo fyziologickému roztoku (FR). Tyto látky byly aplikovány subkutánně po dobu 9 týdnů: 3 týdny před zabřeznutím, 3 týdny po dobu březosti a 3 týdny po dobu laktace (PD1-PD23). Kontrolním samicím (K) nebyla podávána žádná látka. V postnatální den (PD) 1 byl proveden cross-fostering tak, že u matky zůstala vždy její 4 biologická mláďata a 8 dalších mláďat pocházejících od matek s odlišnou premedikací než měla ona sama, k ní bylo přidáno. Tímto způsobem bylo získáno 9 experimentálních skupin (K/K, K/FR, K/MA, FR/K, FR/FR, FR /MA, MA/K, MA/FR, MA/MA). Mláďata byla testována během postnatálního vývoje (PD 1 PD 23) podle ukazatelů zralosti (váhový přírůstek, prořezání zubů, otevření uší a očí, test úlekové reakce). Jejich vývoj byl dále hodnocen s využitím testů negativní geotaxe, tail pull testu na buničité vatě a na mřížce, vzpřimovacího reflexu z podložky a ze vzduchu, senzorimotorické koordinace pohybů na rotujícím válci a na hrazdě. Dospělí potomci (samci a samice) byli testováni v otevřené aréně (OF) a na vyvýšeném křížovém bludišti (EPM) pro vyhodnocování lokomoce a anxiety. Plantar test byl užit ke studiu nocicepce. V případě dospělých samců byla navíc testována schopnost učení a paměť v Morrisově vodním bludišti (MWM). U dospělých samic bylo u každého testu sledováno, ve které fázi estrálního cyklu se nachází. Výsledky: Výsledky studie prokázaly, že jak prenatální, tak postnatální expozice MA, postihuje postnatální vývoj mláďat, a to především při zjišťování jejich váhového přírůstku a zralosti, senzorimotorických funkcí a posturálních reflexů. Postnatální expozice MA, aplikovaného prostřednictvím mateřského mléka, snížila čas strávený vztyčováním v OF, zvýšila anxietu a snížila prahy nocicepce u dospělých samic v porovnání se samicemi, které vychovávaly kontrolní matky nebo matky s expozicí FR. vii

Postnatální expozice MA a FR snížila lokomoci v OF a zvýšila anxietu v OF a EPM ve srovnání se samci, vychovávanými kontrolními matkami. Samci, kteří byli vystaveni prenatální expozici MA a FR, měli v porovnání s kontrolními samci zvýšené prahy bolesti. Závěr: Výzkum, prováděný v rámci předložené disertační práce ukázal, že crossfostering může zásadně ovlivnit vývoj mláďat během laktace. Postnatální expozice MA či výchova matkou s expozicí MA naopak způsobuje negativní změny, které přetrvávají až do dospělosti. Bylo rovněž zjištěno, že postnatální péče, zajišťovaná kontrolními matkami, potlačila v některých případech negativní vliv prenatální expozice MA. viii

Abstract Aim: The aim of our study was to investigate the impact of prenatal methamphetamine (MA) exposure and cross-fostering on development of rat pups during preweaning period and on behavior, anxiety, cognitive function and nociception in adulthood. Methods: Mothers were daily exposed to injection of MA (5 mg/kg) or saline (S) approximately for 9 weeks: three weeks prior to impregnation, throughout the entire gestation period and for 23 days of lactation (until weaning). Control females (C) did not receive any injection. On postnatal day (PD) 1, pups were cross-fostered so that each mother received some of her own and some of the pups of mother with the other two treatments. We obtained 9 experimental groups (C/C, C/S, C/MA, S/C, S/S, S/MA, MA/C, MA/S, MA/MA). Pups were tested during postnatal development (PD 1 to PD 23) by means of following behavioral tests: negative geotaxis, tail pull on cellulose cotton wool and on grid, righting reflex on surface, righting reflex in mid-air, rotarod and bar-holding and were examined for physiological maturation (weight gain during lactation, ear opening, startle response, tooth eruption and eye opening). In adulthood, males and females rats were tested in the Open field (OF) and in the Elevated plus maze (EPM) for behavior and anxiety and in the Plantar test for thermal nociception. Adult male rats were tested on cognitive function in the Morris water maze (MWM). In adult female rats, phases of the estrous cycle were recognized and compared. Results: Our results showed that both prenatal and postnatal MA exposure via breast milk impair development of rat pups during preweaning period. In adulthood, female rats postnatally exposed to MA via breast milk had decreased exploratory behavior in the OF, increase anxiety in the OF and decreased nociception in the plantar test relative to rats fostered by control or saline-treated dams. Adult male rats postnatally exposed to MA or saline had decreased locomotion in the OF and increased anxiety in the OF as well as in the EPM compared to male rats fostered by control dams. Nociception was incresed in male rats prenatally exposed to saline or MA relative to prenatally control rats. Conclusion: The present study demonstrates that cross-fostering may affect development of rat pup in preweaning period and functional changes in adulthood. ix

Postnatal care of mother exposed to MA causes negative changes which persist until adulthood. In some cases postnatal care of control mothers at least partially suppressed the negative effect of prenatal MA exposure. x

OBSAH Bibliografická identifikace...ii Prohlášení...iii Poděkování...iv Seznam zkratek...v Abstrakt...vii Abstract...ix ÚVOD...1 1 METAMFETAMIN...4 1.1 FARMAKOKINETIKA... 4 1.2 FARMAKODYNAMIKA... 4 1.3 METAMFETAMIN A NEUROTOXICITA... 5 1.4 ÚČINKY METAMFETAMINU OBECNĚ... 6 1.5 PRENATÁLNÍ EXPOZICE METAMFETAMINU... 8 1.5.1 Klinické studie... 8 1.5.2 Experimentální studie... 9 1.6 VLIV METAMFETAMINU NA KOGNITIVNÍ FUNKCE... 10 1.7 VLIV METAMFETAMINU NA CHOVÁNÍ... 12 1.8 VLIV METAMFETAMINU NA BOLEST... 13 1.9 VLIV METAMFETAMINU NA MATEŘSKÉ CHOVÁNÍ... 14 1.10 METAMFETAMIN V MATEŘSKÉM MLÉCE... 15 2 FAKTORY, KTERÉ OVLIVŇUJÍ VÝVOJ A CHOVÁNÍ POTOMKŮ...17 2.1 VLIV ROZDÍLNÉ MATEŘSKÉ PÉČE NA VÝVOJ POTOMKŮ... 17 2.2 PŘENOS MATEŘSKÉHO CHOVÁNÍ NA DALŠÍ GENERACI... 18 2.3 VLIV CROSS FOSTERINGU NA VÝVOJ MLÁĎAT... 19 2.4 POSTNATÁLNÍ HANDLING... 21 2.5 VLIV PROSTŘEDÍ NA VÝVOJ MLÁĎAT... 21 3 CÍLE PRÁCE...25 4 MATERIÁL A METODIKA...26 4.1 CHEMIKÁLIE... 26 4.2 ZPŮSOB CHOVU POKUSNÝCH ZVÍŘAT... 26 4.3 APLIKACE LÁTEK... 26 4.4 FERTILIZACE... 27 4.5 CROSS-FOSTERING... 27 4.6 ZNAČENÍ MLÁĎAT... 29 xi

4.7 TESTOVÁNÍ MLÁĎAT PŘED ODSTAVEM... 29 4.7.1 Charakteristika vrhu a zralosti mláďat... 29 4.7.2 Negativní geotaxe... 30 4.7.3 Tail pull test... 31 4.7.4 Vzpřimovací reflex z podložky... 32 4.7.5 Vzpřimovací reflex ze vzduchu... 33 4.7.6 Rotující válec... 33 4.7.7 Hrazda... 36 4.8 TESTOVÁNÍ V DOSPĚLOSTI... 36 4.8.1 Behaviorální testy... 37 4.8.1.1 Otevřená aréna... 38 4.8.1.2 Vyvýšené křížové bludiště... 38 4.8.2 Kognitivní testy... 40 4.8.2.1 Test učení... 43 4.8.2.2 Test probe... 43 4.8.2.3 Test paměti... 43 4.8.2.4 Test motoriky... 43 4.8.3 Testování nocicepce... 44 4.8.3.1 Plantar test... 44 4.9 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ... 45 4.9.1 Testování mláďat před odstavem... 46 4.9.2 Behaviorální testy... 46 4.9.3 Kognitivní testy... 46 4.9.4 Testování nocicepce... 47 5 VÝSLEDKY...48 5.1 BŘEZOST A POROD... 48 5.2 TESTOVÁNÍ MLÁĎAT PŘED ODSTAVEM... 48 5.2.1 Počet narozených mláďat... 48 5.2.2 Porodní hmotnost... 49 5.2.3 Hmotnostní přírůstek mláďat během laktace... 49 5.2.4 Ukazatele zralosti mláďat... 50 5.2.5 Negativní geotaxe... 51 5.2.6 Tail pull test... 52 5.2.7 Vzpřimovací reflex z podložky... 53 5.2.8 Vzpřimovací reflex ze vzduchu... 54 5.2.9 Rotující válec... 54 5.2.10 Hrazda... 55 5.3 BEHAVIORÁLNÍ TESTY... 60 xii

5.3.1 Otevřená aréna... 60 5.3.1.1 Samice... 60 5.3.1.2 Samci... 60 5.3.2 Vyvýšené křížové bludiště... 66 5.3.2.1 Samice... 66 5.3.2.2 Samci... 66 5.4 KOGNITIVNÍ TESTY... 70 5.4.1 Test učení... 70 5.4.2 Probe test... 71 5.4.3 Test paměti... 72 5.4.4 Test motoriky... 72 5.5 TESTOVÁNÍ NOCICEPCE... 77 5.5.1 Samice... 77 5.5.2 Samci... 77 6 DISKUZE...81 6.1 CHARAKTERISTIKA VRHU, ZRALOSTI A VÝVOJE MLÁĎAT... 81 6.2 BEHAVIORÁLNÍ TESTY... 86 6.3 KOGNITIVNÍ TESTY... 91 6.4 TESTOVÁNÍ NOCICEPCE... 95 7 ZÁVĚR...99 7.1 VLIV METAMFETAMINU NA VÝVOJ A UKAZATELE ZRALOSTI... 99 7.2 VLIV METAMFETAMINU NA CHOVÁNÍ... 99 7.3 VLIV METAMFETAMINU NA KOGNITIVNÍ FUNKCE...100 7.4 VLIV METAMFETAMINU NA NOCICEPCI...100 7.5 VLIV EXPOZICE STRESU Z INJEKČNÍ APLIKACE... 100 7.6 VLIV ESTRÁLNÍHO CYKLU... 100 8 LITERATURA...102 9 PUBLIKACE A PREZENTACE AUTORA...121 9.1 PUBLIKACE IN EXTENSO S IMPAKT FAKTOREM... 121 9.2 PUBLIKACE IN EXTENSO BEZ IMPAKT FAKTORU... 122 9.3 PREZENTACE NA KONGRESECH A SYMPOZIÍCH... 123 xiii

ÚVOD Problémové užívání drog je podle EMCDDA (Evropské monitorovací centrum pro drogy a drogovou závislost) definováno jako injekční užívání drog a/nebo dlouhodobé či pravidelné užívání drog opioidního a amfetaminového typu (vyjímaje extázi) a také kokainu. V ČR jsou do odhadů počtu problémových uživatelů drog zahrnuti pouze uživatelé metamfetaminu (MA) a opioidů, jako je heroin a buprenorfin, neboť užívání kokainu je v ČR stále na relativně nízké úrovni a prevalenci jeho problémového užívání prakticky nelze odhadnout (Mravčík et al. 2009). MA (pervitin) představuje v ČR nejrozšířenější problémově zneužívanou tzv. tvrdou drogu (Zábranský 2003). Nejnovější epidemiologická data z Národního monitorovacího střediska pro drogy a drogové závislosti vypovídají, že počet problémových uživatelů drog se v roce 2008 zvýšil na cca 32,5 tisíce (v roce 2006 30,2 tisíce). Na tomto počtu se podílí téměř 21,2 tisíce uživatelů MA a asi 11,3 tisíc uživatelů opioidů. Odhadované počty problémových uživatelů drog jsou nejvyšší v Praze (10 tis.) a Ústeckém kraji (4,1 tis.). V ČR je, ve srovnání s ostatními evropskými státy, nejvyšší počet lidí závislých na MA v poměru k počtu obyvatel, tj. asi 0,7 procenta populace mezi 15. a 64. rokem, zatímco průměr v Evropě činí asi 0,5 %. V ČR uvádí MA jako primární drogu 59 % všech klientů, léčených z drogové závislosti (Studničková a Petrášová 2009). Klienti léčení v souvislosti s MA uvádí vysokou míru injekčního užívání této drogy, tj. asi 80 % (Mravčík et al. 2009). Podíl injekčních uživatelů je dlouhodobě velmi vysoký a představuje riziko zejména pro přenos infekcí a předávkování. Podle zprávy OSN z roku 2008, užívá MA asi 25 milionů lidí na celém světě a obliba této stimulační drogy stále roste (http://www.unodc.org/documents/aboutunodc/ar08_web.pdf), přičemž za vzestupem její obliby stojí její snadná výroba a také to, že je velmi levná; například v porovnání s kokainem (Rawson et al. 2002). V roce 2006 se celosvětová výroba MA odhadovala na 266 tun, a překročila tak výrobu jakékoliv jiné nezákonné syntetické drogy. Výroba MA ve světě je koncentrována převážně v Severní Americe a jihovýchodní Asii. K nezákonné výrobě MA dochází i v Evropě, i když ta je většinou omezena právě na ČR, kde bylo v roce 2008 odhaleno 1

více než 434 malých kuchyňských laboratoří (v roce 2000 to bylo 188 laboratoří) (Mravčík et al. 2009). Na rozdíl od ostatních částí světa, kde užívání MA v posledních letech vzrostlo, se úroveň jeho užívání v Evropě jeví jako stagnující, či mírně omezená (Griffiths et al. 2008). Užívání této drogy se koncentruje právě v ČR a do určité míry na Slovensku. Právě tyto dvě země uvádí nejnovější odhady problémového užívání MA. Zpráva Výboru pro mezinárodní kontrolu drog OSN odhaluje narůstající výrobu a konzumaci nelegálních drog, zejména MA a extáze právě v ČR. Český statistický úřad odhaduje, že se v ČR ročně zkonzumuje cca 4,5 tuny MA. Jen pro zajímavost, v roce 2002 zabavily represivní orgány v ČR celkem 4,3 kg MA a 0,41 kg jiných amfetaminů. Toto množství činí pouhé 0,1% veškeré předpokládané produkce. Podle všech dostupných informací je kompletní konzumace MA zajišťována tuzemskou výrobou. 88 % MA vyrobeného v ČR je určeno pro domácí potřebu, zbytek se vyváží do Velké Británie, Německa a na Slovensko (Mravčík et al. 2009). Jedním z problémů dnešní doby je nejen samotná drogová závislost, ale především snižování věkové hranice prvého setkání s drogou. Uživatelé MA jsou v průměru výrazně (o více než 3 roky) mladší než uživatelé heroinu a jsou také pod celkovým věkovým průměrem žadatelů o léčbu. Podle Celopopulační studie užívání psychotropních látek v ČR v roce 2008, vycházející z representativního vzorku 4500 respondentů ve věku 15-64 let, mělo celoživotní zkušenosti s užitím amfetaminů, resp. MA 4,3 % populace (5,7 % mužů, 3,0 % žen). Nejvyšší, tj. 8,5 %, byla celoživotní prevalence ve věkové skupině 25-34 let (Mravčík et al. 2009). Narůstá také tzv. rekreační užívání drog a dalším, velice závažným problém, je zneužívání omamných látek ženami v průběhu těhotenství. Průměrná délka abúzu drog, podle zkušeností z Gynekologicko-porodnické kliniky 2. LF UK a FN v Motole v době otěhotnění, je u uživatelek MA 3,3 roky. Se ženami, závislými na drogách, je velmi těžká spolupráce, neboť těhotenství není u většiny z nich dostatečným podnětem ke změně jejich návyků (Vavřínková a Binder 2006). Velmi obtížné je rovněž oddělit přímé účinky MA při polydrogové závislosti. Ženy užívající MA velmi často kouří cigarety, pijí alkohol, nebo berou další drogy (Hans 1999). Navíc je způsob života drogově závislých žen ovlivněn takovými stresovými faktory, jako je nezaměstnanost, prostituce a kriminalita. Těhotné ženy užívající drogy proto nevystavují rizikům pouze sebe, ale také své potomky. 2

Z těchto zjištění jasně vyplývá, že MA je nejvíce problémově zneužívanou tvrdou drogou v ČR. Výzkumy v oblasti závislosti MA jsou proto velice důležité a přispějí svými výsledky ke zjištění mechanismů účinků MA v prenatálním a také v postnatálním období. 3

1 METAMFETAMIN MA je syntetická droga, která náleží do skupiny amfetaminů, které se vedle kokainu a kofeinu řadí mezi psychomotorická stimulancia. Díky svému vysokému potenciálu pro vyvolání závislosti a snadné výrobě patří v současné době k nejvíce zneužívaným návykovým látkám nejen v ČR, ale i v dalších zemích Evropy a světa. V České republice jeho historie sahá až do období druhé světové války, kde se legálně vyráběl pro vojáky Wehrmachtu a jednotky SS. Nelegálně se začal "vařit" na přelomu 70. a 80. let minulého století, kdy se nejprve užíval v malých uzavřených komunitách a v 90. letech se začal z ČR šířit do zahraničí. 1.1 FARMAKOKINETIKA MA je lipofilní látka, která dobře prostupuje buněčnými membránami, hematoencefalickou a placentární bariérou (Dattel 1990, Nordahl et al. 2003). Do organismu se snadno dostává přímým vpravením do žíly, vstřebáváním do krve z gastrointestinálního traktu a rovněž nosní sliznicí. Po podání se dobře distribuuje v centrálním nervovém systému (CNS) a při zneužívání MA ženami v těhotenství tak může ovlivňovat prenatální vývoj CNS plodu. Díky methylové skupině, která ho chrání před degradací monoaminooxidázou (MAO) v játrech, může trvat poločas eliminace MA 12 až 34 hodin. Asi 45 % dávky MA se metabolizuje na amfetamin a obě látky se vylučují renální exkrecí. MA je nejčastěji užíván perorálně, intravenózně, nazálně nebo inhalačně a způsob podání ovlivňuje jeho účinek. Po perorálním podání je MA postupně absorbován ze střeva a jeho koncentrace v krvi stoupá pomalu. Při intravenózním podání, nebo šňupání nastupuje účinek ihned a dochází k náhlému zvýšení jeho koncentrace v krvi a v mozku. 1.2 FARMAKODYNAMIKA Amfetaminy se svojí strukturou podobají katecholaminům, které se přirozeně vyskytují v organismu a mají funkci neurotransmiterů dopamin (DA) a noradrenalin (NA). Avšak nejsou schopny aktivovat cílové receptory těchto transmiterů. Aktivují receptory pro DA a NA nepřímo tím, že stimulují jejich uvolňování. Všechny 4

amfetaminy zvyšují koncentraci katecholaminů DA, NA a neurotransmiteru serotoninu (5-HT) na nervových zakončeních v CNS a v periferii. Mnohem důležitější ale je, že amfetaminy jsou selektivně koncentrovány v noradrenergních a dopaminergních zakončeních, protože jsou vychytávány membránovými transportéry, které za normálních okolností pomáhají odstranění a zpětnému vychytávání NA a DA. MA je těmito transportéry pumpován do presynaptického zakončení a blokuje zpětné vychytávání NA a DA (Iversen 2008). Experimenty na plazmatických membránách bylo prokázáno, že MA má nejvyšší účinek na noradrenergní transportér, 5-9krát nižší na dopaminergní a 200-500krát nižší na serotoninergní transportér (Han a Gu 2006). Jakmile se MA dostane do nervového zakončení, je rozpoznán vezikulárním transportérem, který shromažďuje neurotransmitery uvnitř synaptických váčků. Dochází k mobilizaci synaptických váčků a k uvolnění NA a DA do cytoplasmy presynaptického zakončení. V presynaptickém zakončení se tak hromadí obrovské množství NA a DA. Toto nahromadění je zesíleno také tím, že MA je schopen blokovat MAO, která odbourává monoaminy v presynaptickém zakončení. Výsledkem je tedy nahromadění NA a DA v synaptické štěrbině a zvýšené působení na postsynaptické membráně. 1.3 METAMFETAMIN A NEUROTOXICITA Ukázalo se, že MA je neurotoxický pro dopaminergní a serotonergní systém, avšak mechanismy jejich neurotoxického účinku nejsou zcela známy. Většina studií testovala neurotoxicitu u zvířat po podání vysoké dávky po dobu jednoho či více dní. Takovéto dávky vyvolávají snížené hladiny DA a dopaminového přenašeče (DAT) ve striatu až o 50%, a také ztrátu vezikulárního monoaminového transportéru a degeneraci dopaminových nervových zakončení (Seiden et al. 1988, Vorhees a Pu 1995). Změny byly pozorovány také v serotonergním systému. Byly nalezeny snížené hladiny 5-HT a tryptofan hydroxylázové aktivity ve frontálním kortexu a hipokampu po nižších dávkách MA a ve striatu a parietálním kortexu po dávkách vyšších (Buening a Gibb 1974, Hotchkiss a Gibb 1980, Seiden et al. 1988). Experimentální studie ukázaly, že užívání MA nemusí u potkanů nutně způsobit trvalé poškození dopaminergního systému. Cass a Manning (1999) zjistili, že snížená hladina DA a DAT přetrvávala 1 5

týden až 1 měsíc po ukončení užívání MA, ale už 1 rok po abstinenci nebyly pozorovány žádné změny v koncentracích DA a DAT oproti kontrolní skupině. Klinické studie ukázaly, že u chronických uživatelů amfetaminu i MA byla snížená hladina DAT v bazálních gangliích (McCann et al. 1998, Volkow et al. 2001a) a v prefronálním kortexu (Sekine et al. 2003). Wilson et al. (1996) sledovali změny dopaminergního a serotonergního systému u 12 lidí, kteří dlouhodobě užívali MA. U těchto lidí byla nalezena snížená koncentrace DA a DAT v bazálních gangliích a nucleus accumbens a snížená aktivita tyrozin hydroxylázy v nucleus accumbens. Žádné změny nebyly pozorovány v hladinách NA a 5-HT. Podobně, jako experimentální, tak i klinické studie ukázaly, že poškození dopaminergního systému nemusí být trvalé (Wilson et al. 1996). McCann et al. (1998) však zjistili, že úbytek DAT přetrvával i 3 roky po abstinenci. U lidí, závislých na MA, byly po 2 letech abstinence zjištěny přetrvávající kognitivní deficity, přestože došlo k normalizaci hladin DAT (Volkow et al. 2001b). 1.4 ÚČINKY METAMFETAMINU OBECNĚ Účinky MA závisí na způsobu podání a na dávce. Bylo zjištěno (Grace 2000), že perorálně podaný MA napodobuje tonickou aktivitu dopaminergních neuronů, kdy dochází k pomalému uvolnění nízkých hladin DA na synapsích, aniž by došlo k vyvolání závislosti. Při aplikaci MA do žíly nebo kouřením se DA uvolňuje ve velkém množství, což napodobuje fázickou aktivitu dopaminergních neuronů a aktivuje postsynaptické receptory. Postupně tak vzniká závislost. Zneužívání MA se považuje za závislost, když jedinec pociťuje neustálou touhu drogu brát a dochází k pravidelnému užívání MA, (téměř každé dvě hodiny). Dochází přitom ke zvyšování dávky z důvodu tolerance a celková denní dávka se posléze může pohybovat od 0,2 do 1 g (Davidson et al. 2001, Kramer et al. 1967). Nathanson (1937) sledoval subjektivní pocity u 55 mladých lidí pracujících v nemocnici, jimž bylo podáno 20 mg Benzedrinu (směs D- a L-amfetaminu). Zjistil, že nejčastějšími pocity, které u těchto lidí převládaly, byla radost, pohoda a také menší pracovní vyčerpání. Podobné účinky byly zaznamenány v další studii, zkoumající 100 dánských dobrovolníků, kteří vykazovali zvýšené pracovní nasazení, projevovali dobrou náladu a upovídanost (Bahnsen et al. 1938). Po vyšších dávkách (20-50 mg) 6

jsou tyto účinky intensivnější. Objevují se projevy většího pracovního nasazení a nadšení - myšlenky proudí rychle a schopnost koncentrace je snížená, často se vyskytuje zvýšené sebevědomí (Iversen 2008, Nordahl et al. 2003). Vysoké dávky pak vyvolávají pocity euforie, jejíž intenzita závisí na dávce. Jedinec proto dávku neustále zvyšuje a opakuje užívání v krátkých intervalech (Iversen 2008). U těchto lidí jsou potlačeny jakékoliv nepříjemné pocity, mizí pocit únavy, fyzická i psychická výkonnost organismu je značně zvýšena. Člověk je neklidný a objevuje se u něj stereotypní chování (Ellinwood 1969, Rylander 1971). Po odeznění působení drogy je pak člověk zcela fyzicky vyčerpaný, většinou usne a spí až 18 hodin. Po probuzení se objevují pocity strachu, úzkosti a depresí (Grinspoon a Hedblom 1975, Morgan a Beck 1997). Častým následkem intoxikace vysokými dávkami MA je rozvoj akutní psychózy (Bell 1973). Objevuje se podezíravost až paranoidní myšlení, sluchové, zrakové a taktilní halucinace pocity parazitózy a svědění kůže. Dalším faktorem, který má vliv na účinky amfetaminů, jsou pohlavní hormony. White et al. (2002) sledovali 13 zdravých žen v různých fázích menstruačního cyklu. Zjistili, že euforické účinky po perorálním podání 15 mg amfetaminu, byly silnější v průběhu folikulární fáze v porovnání s fází luteální. Citlivost na amfetamin ve folikulární fázi pozitivně korelovala s hladinami estradiolu. MA má také periferní sympatomimetické účinky, neboť nepřímo zvyšuje uvolňování NA na sympatických nervových zakončeních. Působení NA na α1- adrenoreceptory zvyšuje krevní tlak, zatímco působení NA na β1-adrenoreceptory zrychluje tepovou frekvenci. V plicích uvolněný NA působí na β2-adrenoreceptory, kde dilatuje bronchy. Dalšími účinky jsou suchost v ústech, retence moči, mydriáza a tachypnoe (Iversen 2008). U lidí závislých na MA bylo také pozorováno poškození myokardu (Yu et al. 2003). Zejména účinky na kardiovaskulární systém mohou být život ohrožující. Při předávkování jsou nejčastějšími příčinami smrti kardiovaskulární selhání, nebo cévní mozková příhoda. Abstinenční syndrom se pak projevuje spíše psychickými potížemi, jako je dysforická letargie, deprese, agresivita, iritabilita a bažení. Z fyzických příznaků byla zaznamenána zvýšená potřeba spánku a přijmu potravy (Iversen 2008). 7

1.5 PRENATÁLNÍ EXPOZICE METAMFETAMINU MA je díky svým anorektickým účinkům oblíbenou drogou u těhotných, drogově závislých žen, neboť zabraňuje přibírání na váze a dodává pocit energie. Statistické studie zjistily, že pouze 17 % žen závislých v USA na drogách, užívalo primárně MA, avšak v průběhu těhotenství jejich počet vzrostl na 38 % (Marwick 2000). MA prochází placentární bariérou a dostává se tak do organismu plodu. Koncentrace drogy dosahuje u dítěte většinou 50 % koncentrace drogy, cirkulující v organismu matky. Koncentrace v organismu plodu se může zvyšovat z důvodu pomalejšího odbourávání MA v játrech a dokonce přesáhnout koncentraci v organismu matky (Dattel 1990). Bylo prokázáno, že stimulancia způsobují periferní vazokonstrikci, tachykardii matek a zvýšenou iritabilitu dělohy. Výrazná vazokonstrikce způsobuje snížení průtoku v arteria uterinae, zvýšení vaskulární rezistence, což se projeví jako hypoxémie, hypertenze a tachykardie plodu (Behnke et al. 1998). Vlivem chronické hypoxie se rodí plod s nízkou porodní hmotností a se známkami intrauterinní růstové retardace (Singer et al. 1994, Tronick a Beeghly 1999). Je prokázáno rovněž vyšší procento předčasných porodů. Při abúzu MA je také prokázán vyšší výskyt placentárních změn, které vedou k abrupci placenty a syndromu náhlého úmrtí novorozence (Burkett et al. 1990, Konkol 1994). 1.5.1 Klinické studie U dětí, jejichž matky užívaly MA během těhotenství, byly pozorovány změněné vzorce chování charakterizované abnormálním spaním, odmítáním mléka, třesem a hypertonií (Oro a Dixon 1987). U těchto dětí bylo také zjištěno, že byly menšího vzrůstu, měly menší obvod hlavy a nižší porodní hmotnost (Eriksson et al. 1978, Little et al. 1988). Zjištěny u nich byly také srdeční vady a rozštěpy rtů (Plessinger 1998). Pomocí ultrasonografie bylo prokázáno, že expozice MA během těhotenství má negativní vliv na vyvíjející se CNS plodu (Dixon 1989). Byly zjištěny kraniální abnormality (u 35 % případů), přičemž u zdravých jedinců to bylo pouze 5 %. Pozorovány byly rovněž intraventrikulární hemoragie a echodensity v bazálních gangliích a frontálním laloku. V další studii (Chang et al. 2004) byly pomocí magnetické rezonance zjišťovány u 13 dětí, které byly vystaveny intrauterinnímu vlivu MA, objemy subkortikálních struktur mozku. U těchto dětí bylo pozorováno zmenšení 8

putamen, globus pallidus, hipokampu a nucleus caudatus. Redukce v těchto strukturách mozku korelovala s horšími výkony v udržování pozornosti a zpožděné verbální paměti. Žádné rozdíly, oproti kontrolním jedincům, nebyly pozorovány v talamu, středním mozku a mozečku. Errikson et al. (1994) sledovali skupinu 64 dětí prenatálně vystavených MA od narození až do jejich 10 let věku. U těchto dětí bylo zjištěno, že zaostávaly ve škole a měly sklony k agresivnímu chování. Další studií, která sledovala vliv prenatální expozice MA na chování potomků, bylo prokázáno, že tito potomci měli zhoršenou lokomoci a zvýšený stres (Smith et al. 2008). 1.5.2 Experimentální studie Podávání MA březím samicím laboratorního potkana v dávkách 5, 10, 15 a 20 mg/kg, slouží jako experimentální model pro stanovení potenciálních rizik expozice MA. Tyto dávky vedou k takovým koncentracím drogy v mozku, které odpovídají hodnotám zjištěným u plodů na droze závislých matek (Acuff-Smith et al. 1996, Cho et al. 1991). Potkaní matky, kterým byl aplikován MA, měly kratší dobu březosti, snížený přírůstek na váze a vrhy o menším počtu mláďat, než kontrolní samice (Martin et al. 1976). Cho et al. (1991) podávali březím samicím potkana MA v dávkách 1 4,5 mg/kg od 7. do 20. dne gestace. Dávky větší než 2 mg/kg snížily u samic hmotnostní přírůstek. Mláďata těchto matek měla nižší porodní váhu a jejich vývoj byl opožděný oproti kontrolám později se jim otevíraly oči, prořezávaly řezáky a sestupovala varlata. Pokud byla mláďata prenatálně vystavena expozici MA v dávce 3 nebo 4,5 mg/kg, tak v testech negativní geotaxe a vzpřimovacího reflexu ze vzduchu dosahovala horších výsledků, než kontrolní mláďata. U samců, prenatálně vystavených MA, bylo pozorováno snížení motorické spontánní aktivity v PD 21, ale zvýšení podmíněné únikové odpovědi. Weissman a Caldecott-Hazard (1993) aplikovali po celou dobu gestace MA v dávce 2 nebo 10 mg/kg. Žádné rozdíly, oproti kontrolním zvířatům, nebyly pozorovány ve vývoji (otevírání očí), v reflexech (vzpřimovací reflex) nebo prostorovém učení. Potomci vystaveni vyšší dávce MA (10 mg/kg), byli méně aktivní v motorické aktivitě a exploraci. Nízká dávka MA (2 mg/kg) způsobila snížení DA transportérů ve striatu a 9

serotoninových transportérů ve striatu, hipokampu a hypotalamu. Vyšší dávka MA (10 mg/kg) naopak koncentraci transportérů zvýšila ve středním mozku, mostu a hipokampu. Acuff-Smith et al. (1992, 1996) pozorovali deficity u mláďat prenatálně exponovaných MA dávkami 5, 10, 15 a 20 mg/kg v závislosti na době expozice. První skupině byl MA aplikován od 7. do 12. dne gestace a druhé od 13. do 18. dne gestace. Skupina mláďat exponovaných MA v časnějším stadiu, měla zpomalený vývoj časné lokomoce a v dospělosti zhoršené prostorové učení a paměť. U mláďat prenatálně vystavených MA byly také pozorovány oční poruchy, jako je anoftalmie, mikroftalmie nebo odchlípení sítnice. Anoftalmie byla přítomna u zvířat exponovaných v časnějším stadiu, zatímco odchlípení sítnice u zvířat vystavených MA v pozdějším období prenatálního vývoje. Hladina 5-HT byla snížena v oblasti nucleus accumbens po aplikaci 20 mg/kg v pozdějším stadiu březosti. Expozice v tomto období způsobila vyšší mortalitu a snížení tělesné hmotnosti. Nižší tělesná hmotnost u obou pohlaví prenatálně vystavených MA ve druhé polovině prenatálního vývoje, byla pozorována po celou dobu testování až do dospělosti. 1.6 VLIV METAMFETAMINU NA KOGNITIVNÍ FUNKCE Klinické i experimentální studie ukázaly, že psychostimulancia, která působí na monoaminergní systém, mají schopnost ovlivnit kognitivní funkce. Bylo prokázáno, že ovlivnění kognitivních funkcí závisí na dávce, na čase podání a na délce expozice. Podle Iversena (2008) se předpokládá, že vliv amfetaminů na kognitivní funkce se děje prostřednictvím uvolňování dopaminu v prefrontální kůře. Některé experimentální studie, které sledovaly vliv prenatální a postnatální expozice MA, poukázaly na zhoršené kognitivní funkce v závislosti na dávce a času podání. Acuff-Smith et al. (1992, 1996) zjistili, že pouze vysoké dávky MA (15 a 20 mg/kg) aplikované samicím potkana v časném období těhotenství (od 7. do 12. dne), zhoršily v dospělosti u jejich potomků kognitivní funkce. Pokud byly samice vystaveny nízkým dávkám MA (5 nebo 10 mg/kg) ve stejném prenatálním období, tak žádné zhoršení kognitivních funkcích u potomků pozorováno nebylo (Acuff-Smith et al. 1996). Zhoršení prostorového učení a paměti nebylo prokázáno ani u dospělých potkanů, kteří byli v pozdějším prenatálním období (od 13. do 18. dne) vystaveni 10

chronickému působení MA v dávkách 5, 10, 15 nebo 20 mg/kg. Potkani, kteří byli od postnatálního dne (PD) 11 do PD 20 vystaveni 4 x denně injekční aplikaci MA v dávce 10 mg/kg, měli v dospělosti zhoršené kognitivní funkce. Pokud byla stejná dávka aplikována potkanům od PD 1 do PD 10, pak nebyly oproti kontrolním zvířatům v kognitivních funkcích pozorovány žádné rozdíly. Různé klinické studie prokázaly u lidí, užívajících MA, zhoršení vizuální a verbální paměti. Simon et al. (2000) sledovali u 65 lidí, pravidelně užívajících MA, zhoršení výkonnosti v testech vyvolávání vzpomínek a v logickém myšlení, aniž by se IQ uživatelů MA lišilo od kontrolních jedinců. Salo et al. (2002) pozorovali zhoršení výkonnosti v testech pozornosti u chronických uživatelů MA, abstinujících 8 16 týdnů. Tito jedinci měli zhoršenou schopnost udržet pozornost a ovládat koncentraci. V další studii mělo 10 uživatelů MA, v porovnání s kontrolními jedinci, zhoršenou schopnost rozhodování, čemuž odpovídala snížená mozková aktivita v prefrontálnim kortexu (Paulus et al. 2002). Některé z těchto deficitů mohou vymizet v průběhu abstinence. Simon et al. (2000) zjistili, že se u uživatelů MA obnovila schopnost ignorovat nepodstatné informace a manipulace s informacemi po 3 měsících abstinence, ačkoliv deficity ve verbálních úkolech přetrvávaly 5 6 měsíců po abstinenci. Na rozdíl od chronického podávání MA, akutní podávání amfetaminových drog, v závislosti na dávce, může vést ke zlepšení některých aspektů kognitivních funkcí. Grilly a Loveland (2001) se zabývali vlivem akutního podávání amfetaminu na kognitivní funkce a chování v závislosti na velikosti jednotlivých dávek. Nízké dávky akutně podávaného amfetaminu (0,1 0,4 mg/kg) vyvolaly u potkanů zlepšení výkonnosti v kognitivních testech. Amfetamin zkracoval reakční dobu a snižoval latence odpovědi na jednotlivé úkoly, aniž by došlo ke ztrátě přesnosti. Zlepšení výkonnosti se týkalo hlavně úkolů, které vyžadovaly zvýšenou pozornost. U vyšších dávek (0,4 1 mg/kg) akutně podávaného amfetaminu bylo pozorováno zvyšování rychlosti odpovídání, ale také snižování přesnosti. Při dávkách vyšších než 3 mg/kg, byla výkonnost v kognitivních testech narušena výskytem stereotypního chování. Studie sledující vliv akutního amfetaminu u lidí také prokázaly zlepšení výkonnosti v kognitivních testech u nízkých dávek (Grinspoon a Hedblom 1975, Weiss a Laties 1962). Zlepšení výkonnosti se týkalo hlavně úkolů vyžadujících zvýšenou pozornost po delší dobu. Tyto úkoly byly ale jednoduché, nezábavné a opakující se. 11

V jiných testech amfetaminy kognitivní funkce neovlivnily a neměly vliv ani na hodnotu IQ. Studií, zkoumajících vliv akutního MA na kognitivní funkce, je velice málo. Johnson et al. (2000) zjistili, že MA podaný zdravým jedincům v dávce 0,21 a 0,42 mg/kg zlepšil pozornost a přesnost v různých kognitivních testech, avšak měl nepříznivý vliv na kardiovaskulární systém. 1.7 VLIV METAMFETAMINU NA CHOVÁNÍ MA, stejně jako ostatní psychostimulancia, ovlivňuje chování jedinců, a to jak u lidí, tak u laboratorních zvířat. Psychostimulancia jsou známa tím, že zvyšují agresivitu a narušují sociální, mateřské i sexuální chování. Účinek MA závisí, podobně jako u kognitivních funkcích, na dávce, na délce podávání a také na individuální reaktivitě jedince. U zvířat způsobují nízké dávky MA zvýšení lokomoce, a to v závislosti na dávce. Vyšší dávky MA (5 10 mg/kg) vyvolávají stereotypní chování, pro které jsou charakteristické stále se opakující, bezúčelné pohyby, které se liší podle druhu zvířete. U potkanů je to například kývání hlavou, ohryzávání, olizování a čištění se. Při těchto dávkách zvíře zůstává na jednom místě klece a neustále opakuje určité pohyby. Studiem lézí dopaminergních oblastí mozku bylo zjištěno, že pro vyvolání stereotypního chování u potkana je nutná dopaminergní aktivita basálních ganglií, zatímco za lokomoci je zodpovědná dopaminergní aktivita v nucleus accumbens (Kelly et al. 1975, Price a Fibiger 1974). Jestliže byly dávky dostatečně vysoké a opakovaly se, pak bylo u potkanů pozorováno sebepoškozující chování, včetně ohryzávání a okusování vlastního ocasu (Kita et al. 2003). Sebepoškozující chování bylo také pozorováno u lidí užívajících MA a zahrnovalo kousání se, bouchání hlavou, škrábání, řezání, tahání se za vlasy. Israel a Lee (2002) rovněž popsali, že lidé, kteří dlouhodobě užívali MA, si opakovaně poškozovali své genitálie. Užívání amfetaminu a MA je často spojeno s kriminalitou a charakterizováno násilnickým chováním, častými výbuchy agresivity a problémem kontrolovat vlastní chování (Boles a Miotto 2003). Lidé závislí na MA byli, oproti kontrolním jedincům, více impulsivní, nedokázali potlačit svoji agresivitu a daleko více projevovali verbální a fyzickou agresi než jedinci závislí na alkoholu (Makusa et al. 1990). Rovněž další autoři 12

ukázali (Brecht et al. 2004), že chování u 57 % lidí, užívajících MA, bylo spojeno s agresivitou a 43 % mělo problém kontrolovat svou zlost a násilnické chování. Klee a Morris (1994) sledovali kriminalitu uživatelů heroinu a MA ve Velké Británii. Prokázali, že kriminalita uživatelů heroinu byla úzce spojena s potřebou obstarat si na drogu peníze, zatímco kriminalita uživatelů MA závisela spíše na frekvenci užívání drogy. Jedna z experimentálních studií, zkoumajících chování myší ovlivněných drogami ukázala, že chronická expozice MA zvýšila agresivní chování, které nebylo závislé na aktivaci lokomoce (Sokolov et al. 2004). MA je dále spojen s takovými změnami sociálního chování, jako jsou narušená sociální interakce a hravé chování. Potkani, kterým byl aplikován MA, měli oproti kontrolním zvířatům zkrácenu dobu strávenou vzájemnými interakcemi (Pometlová et al. 2008). Podobně Schiorring (1977) ukázal, že akutně i chronicky podávaný MA vede u opic k sociální uzavřenosti. Studie, která zkoumala vliv amfetaminů na sociální chování, prokázala, že amfetaminy podávané v dávkách zvyšujících lokomoci, snižovala u potkanů hravé chování (Siviy et al. 1995). U lidí užívajících MA, jsou prokázány změny sociálního chování, které se navenek jeví jako problémy ve škole, v rodině, nebo v zaměstnání (Sommers et al. 2006). 1.8 VLIV METAMFETAMINU NA BOLEST V současné době existuje jen velmi málo prací, zabývajících se vlivem expozice amfetaminu a MA na vnímání bolesti. V několika studiích, publikovaných v minulých letech, bylo zjištěno, že psychostimulancia, jako jsou kokain a amfetaminy, zvyšují analgetický účinek opioidů (hlavně morfinu) (Dalal a Melzack 1998). Dále bylo zjištěno, že psychostimulancia mají analgetické účinky v modelech tonické bolesti (jako je např. formalínový test) (Altier a Stewart 1999, Morgan a Franklin 1990). Analgetické účinky psychostimulancií na akutní modely bolesti ( hot plate test) byly také zkoumány (Lin et al. 1989, Pertovaara et al. 1991), avšak výsledky z těchto studií jsou nedostačující. Účinek těchto drog na vnímání bolesti může být zprostředkován dopaminem, nicméně v přenosu bolesti může být zapojen rovněž serotoninergní či noradrenergní systém (Izenwasser a Kornetsky 1988) nebo mohou působit nepřímo prostřednictvím endogenních opiodů (Lin et al. 1989, Pertovaara et al. 1991). Byly 13

publikovány studie, které ukázaly, že analgetické účinky vyvolané psychostimulancii (převážně na tonickou bolest) byly potlačeny podáním antagonistů dopaminu, což svědčí o dopaminergním supraspinálním přenosu (Altier a Stewart 1998, Altier a Stewart 1999). Dalším z možných mechanismů umožňujících vyvolání analgesie psychostimulancii, může být působení CART peptidů, které zprostředkovávají systém odměny a vyvolávají anorektické účinky (Vicentic a Jones 2007). Bylo zjištěno, že CART peptidy snižují hyperalgesii/alodynii u zvířecích modelů s neuropatickou bolestí (Damaj et al. 2006). 1.9 VLIV METAMFETAMINU NA MATEŘSKÉ CHOVÁNÍ Drogová závislost během těhotenství a v období laktace, je závažným zdravotním i sociálním problémem. Drogy, užívané během těhotenství, totiž nejsou rizikové pouze pro matku, ale vyvolávají u vyvíjejícího se organismu změny, které mohou mít trvalé následky. Statistická zjištění (Vavřínková et al. 2001) ukazují, že dívky a ženy, které podlehly drogové závislosti, žijí velmi často v narušeném sociálním prostředí. Četné studie popisují drogově závislé, gravidní ženy, jako velmi mladé, bez partnera, s nižším vzděláním a bez zaměstnání. Tyto ženy pak nevěnují svému dítěti dostatečnou prenatální ani postnatální péči a o dítě se nedovedou postarat. Výsledkem je psychická deprivace a mnohdy také celoživotní zdravotní i psychické následky plynoucí z nezodpovědnosti matek. Existuje jen málo experimentálních studií, které se zabývají vlivem MA a amfetaminu na mateřské chování. Vliv MA na mateřské chování byl sledován pouze v jediné experimentální studii, kterou publikovali Šlamberová et al. (2005a, 2005b). Posledně uvedení zjistili, že aplikace MA během březosti, popř. březosti a laktace, negativně ovlivňuje mateřské chování. Dále bylo prokázáno, že matky, které dostávaly MA v dávce 5 mg/kg denně, kojily méně a méně pečovaly o svá mláďata, než kontrolní matky. Tyto matky rovněž trávily méně času v hnízdě, tj. v kontaktu se svými mláďaty. Místo toho pečovaly samice samy o sebe (jedly, pily, čistily se), nebo relaxovaly mimo hnízdo. Samice s expozicí MA rovněž trávily více času mimo hnízdo explorací a čicháním, než samice kontrolní. Opakované podávání injekcí MA během gestace a 14

laktace prodlužovalo latenční dobu v testu návratu prvního mláděte do hnízda ( retrieval test ) a vrácení všech mláďat do hnízda. Další dvě studie zkoumaly vliv amfetaminu, podávaného v období laktace, na mateřské chování. Piccirillo et al. (1980) zjistili, že opakovaným podáváním injekcí amfetaminu během laktace, se snížila doba kontaktu mezi matkou a mládětem, prodloužila se latenční doba v testu návratu mláďat do hnízda ( retrieval test ) a snížil se počet navrácených mláďat, spolu se zvětšujícím se počtem míst, kam se zvířata navracela. Tyto samice trávily také méně času vytváření hnízda a kojením ve prospěch lokomotorických aktivit matek. Všechny uvedené důsledky aplikace amfetaminu byly závislé na velikosti dávky, přičemž nejnižší podávaná dávka (0,05 kg/mg) neměla vliv na mateřské chování matek. Fraňková (1972) zjistila, že matky, kterým byl podáván amfetamin (3 mg/kg) během prvních 10 dnů laktace, měly prodloužené latenční časy prvního kontaktu matky a mláděte, přičemž byla snížena celková doba kontaktu mezi matkou a mládětem. Další mateřské aktivity, jako je stavění hnízda a shromažďování podestýlky, byly také sníženy. Ukázalo se také, že kontrolní matky trávily téměř 75 % svého času v hnízdě, kojením (aktivním či pasivním), nebo aktivním kontaktem s mláďaty (jejich olizováním a pečováním o ně). Kontrolní matky navíc dbaly na to, aby se mláďata nacházela společně v jednom hnízdě. Naopak u matek, kterým byl podáván amfetamin, byla celková doba, po kterou setrvávala v hnízdě společně s mláďaty (v porovnání s kontrolními matkami) nižší, což znamená, že se snížil jak jejich pasivní, tak aktivní kontakt s mláďaty. Tyto matky trávily více času aktivitami mimo hnízdo, vykazovaly stereotypní chování a jejich mláďata se pohybovala převážně mimo hnízdo. Všechny tyto experimentální studie ukázaly, že potkaní samice, kterým byla po dobu březosti nebo laktace podávána droga, projevovaly snížený zájem o svá mláďata, což odpovídá klinickým studiím. Snížení mateřské péče může mít následně negativní dopad na jejich vývoj. 1.10 METAMFETAMIN V MATEŘSKÉM MLÉCE Jen málo klinických studií (Bartu et al. 2009, Ilett et al. 2007, Steiner et al. 1984), se dosud zabývalo průnikem amfetaminů do mateřského mléka a možností vlivu na postnatální vývoj dětí během laktace. 15

První studií, která se věnovala pronikáním amfetaminů do mateřského mléka, byla práce, kterou publikovali Steiner et al. (1984). Ženě, která trpěla narkolepsií, byl podáván amfetamin v dávce 20 mg denně po dobu těhotenství a léčení pokračovalo i po porodu. Byla analyzována koncentrace amfetaminu v plazmě a v mateřském mléce matky a byla analyzována moč dítěte 10. a 42. den po porodu. Koncentrace amfetaminu, nalezeného v mateřském mléce, byla asi 3x až 7x větší, než koncentrace nalezená v plazmě matky 10. a 42. den po porodu. Malé množství amfetaminu bylo nalezeno také v moči dítěte. Bartu et al. (2009) se zabývali pronikáním methylamfetaminu a amfetaminu do mateřského mléka po rekreačním užití drogy. Studie se zúčastnily 2 kojící ženy, které si aplikovaly amfetaminy intravenózně a užívaly je nepravidelně ( rekreačně ). Množství a čistota dávky, kterou si ženy aplikovaly, nebyla známa. Koncentrace drogy byla analyzována ze vzorků moče a mateřského mléka. Moč byla sbírána 4 hodiny po užití dávky a mateřské mléko v intervalech 2-6 hodin po dobu 24 hodin. U žen bylo v moči nalezeno převládající množství methylamfetaminu a malé množství amfetaminu. Průměrná koncentrace drogy nalezená v mateřském mléce za 24 hodin byla 111 μg l -1 a 281 μg l -1 pro methylamfetamin a 4 μg l -1 a 15 μg l -1 pro amfetamin. Absolutní dávka drogy (= průměrná koncentrace drogy v mléce vynásobená průměrným příjmem mléka za den; μg kg -1 den -1 ) nalezená u dětí byla 17,5 μg kg -1 den -1 a 44,7 μg kg -1 den -1. Podobné, absolutní dávky drogy, byly nalezeny také u dětí, jejichž matky byly terapeuticky léčeny amfetaminy. V další práci, která se zabývala přenosem dexamfetaminu do mateřského mléka, byly studovány čtyři ženy, které trpěly ADHD ( attention deficit-hyperactivity disorder ) a které byly léčeny perorálně dexamfetaminem v dávce od 15 45 mg (Ilett et al. 2007). Průměrná koncentrace drogy v mateřském mléce se pohybovala v rozmezí od 66-313 μg l -1. Absolutní dávka dexamfetaminu u dítěte, se pohybovala v rozmezí od 10 do 47 μg kg -1 den -1. Všechny zmíněné studie ukázaly, že amfetaminy snadno přecházejí do mateřského mléka. I když u dětí nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky, tak podle Hale a Ilett (2002) je doporučeno, aby matky nekojily dříve, než 24 až 36 hodin po užití drogy. 16

2 FAKTORY, KTERÉ OVLIVŇUJÍ VÝVOJ A CHOVÁNÍ POTOMKŮ Vývoj a formování jedince nezávisí jen na genetickém materiálu, který zdědíme po rodičích, ale také na vlivu zevního prostředí, které v optimálních podmínkách napomáhá plně vyjádřit zděděný genetický potenciál, nebo naopak potlačí nevhodnou genetickou informaci. Nové výzkumy naznačují, že vývoj a chování jedince může v raném období života ovlivnit mateřský kontakt (Meaney 2001) a také prostředí, do kterého se jedinec narodí (Champagne a Meaney 2007). Pokud je toto prostředí bezpečné a inspirativní, dochází při vývoji osobnosti jedince k menšímu výskytu patologií. Klinické i experimentální studie potvrzují, že včasný kontakt mezi matkou a dítětem má nepostradatelný vliv na vývoj dítěte a následné utváření jeho fenotypu (Schanberg a Field 1987). Naopak, různé psychické deprivace a konflikty v rodině, mohou mít dlouhodobé následky na vývoj dítěte (Cogill et al. 1986, Meaney 2001). Nedostatečná mateřské péče u primátů a lidí, ať už v důsledku zanedbání péče o jedince či v důsledku mateřské deprivace, má za následek zhoršení kognitivních funkcí, snížené sociální chování a také zvýšenou citlivost na stres (Carlson a Earls 1997, Cogill et al. 1986, Trickett a McBride-Chang 1995). Tyto děti jsou pak daleko více náchylnější k různým patologiím, jako je zvýšená anxieta, různé psychózy a poruchy nálad, které mohou přetrvávat po celý život (Bebbington et al. 2004). Podobně je tomu u potkanů, kde mateřská deprivace, či dlouhodobá separace mláďat od matky negativně ovlivňuje vývoj a chování jedince, jeho reakci na stres, kognitivní funkce a sociální interakci (Kalinichev et al. 2002, Lehmann et al. 1999, Lovic et al. 2001). Naopak, postnatální krátkodobá separace mláďat od matek ( postnatal handling ), která stimuluje mateřské chování (Liu et al. 1997), snižuje reakci na stres u mláďat a zlepšuje jejich kognitivní funkce (Meaney et al. 1991, Meaney et al. 1985). 2.1 VLIV ROZDÍLNÉ MATEŘSKÉ PÉČE NA VÝVOJ POTOMKŮ U potkanů je pro vývoj mláďat nejdůležitější matka, která je shromažďuje kolem sebe, olizuje je, pečuje o ně a kojí je do doby, než opustí hnízdo (Rosenblatt 1994). Protože i laboratorní potkani se v intenzitě mateřského chování liší, je intenzita 17

mateřské péče u potkaních matek hodnocena podle frekvence olizování a pečování, podle licking/grooming (LG) a kojení v aktivní pozici s nahrbeným hřbetem, arched back nursing (ABN). Michael Meaney a jeho kolegové pozorovali u potkanů jejich péči o mláďata. Vyhodnocovali, jak intenzivně potkaní matky olizovaly, opečovávaly a kojily svá mláďata. Ze samic pak vybrali dvě extrémní skupiny jednu, velmi málo olizující a pečující (nízký LG-ABN) a druhou, kde samice mláďata naopak olizovala velmi intenzivně (vysoký LG-ABN). Následně pak u jejich potomků sledovali, jak se tato rozdílná péče projevila na jejich vlastnostech (Caldji et al. 1998, Francis et al. 1999, Liu et al. 2000, Liu et al. 1997, Meaney 2001). Citované studie ukázaly, že rozdíly v mateřském chování během prvních týdnů po porodu, se projevily změnami genové exprese, odlišným vývojem a chováním potomků, a to jak u samců, tak samic (Caldji et al. 1998, Francis et al. 1999, Liu et al. 2000, Liu et al. 1997). Bylo zjištěno, že mláďata, která byla vystavena péči matky s vysokou frekvencí LG a ABN, byla v dospělosti méně bojácná a méně citlivá na stres než jedinci, kteří během svého vývoje obdrželi málo LG a ABN. Potomci o které samice během jejich vývoje intenzivně pečovaly, ukázali nižší sekreci adrenokortikotropního hormonu (ACTH) a kortikosteronu při stresu, zvýšenou citlivost hypotalamo-hypofyzární nadledvinové (HPA) osy na inhibiční účinky glukokortikoidů. Také výkon v Morrisově vodním bludišti, kde byly testovány kognitivní funkce (učení a paměť), byl podstatně lepší u potkanů intenzivně pečujících matek. Kromě toho měla tato mláďata v dospělosti vyšší koncentraci mrna pro glukokortikoidové receptory, více centrálních benzodiazepinových receptorů v centrálním a bazolaterálním jádru amygdaly a nižší koncentraci mrna pro kortikotropní stimulující faktor v paraventrikulárním jádře (PVN) hypotalamu. 2.2 PŘENOS MATEŘSKÉHO CHOVÁNÍ NA DALŠÍ GENERACI Práce, kterou publikovali Francis et al. (1999), se zabývala přenosem mateřského chování mezi po sobě následujícími generacemi. Tato studie ukázala, že samice, které během svého vývoje obdržely vyšší frekvence LG a ABN chování, pak v dospělosti pečovaly o svá mláďata více než samice, která obdržely méně LG a ABN. To nasvědčuje, že rozdíly v mateřském chování se přenášejí také na další generace 18

podle pravidla Jaká matka - taková dcera. Přenos mateřského LG na další generaci souvisí s koncentrací neuropeptidových receptorů v mediální preoptické oblasti (MPOA) hypotalamu. Vazba na oxytocinové receptory byla u matek s vysokou frekvencí LG v porovnání s matkami s nízkým LG chování zvýšena v MPOA. Po podání antagonisty oxytocinového receptoru 3. den po porodu, došlo u matek s vysokým LG k jeho výraznému snížení až na úroveň chování matek s nízkým LG (Francis et al. 2000, Champagne et al. 2001). Potomci matek s nízkým LG, měli sníženou citlivost na estrogeny v MPOA, spojenou v této oblasti se sníženou expresí α- estrogenových receptorů, a to v porovnání s potomky matek s vysokým LG (Champagne et al. 2006, Champagne et al. 2003). Estrogeny a estrogenové receptory α regulují expresi oxytocinových receptorů a působí na genomický i negenomický mechanismus ke zvýšení koncentrace oxytocinových receptorů (Bale et al. 2001, Breton a Zingg 1997, Zingg et al. 1998). Rozdíly v intenzitě LG proto regulují koncentraci mrna estrogenových receptorů α v MPOA, které slouží jako mechanismus pro rozdílnou vazbu na oxytocinový receptor, který je pozorován u potomků samic, které obdržely během vývoje rozdílnou mateřskou péči. 2.3 VLIV CROSS FOSTERINGU NA VÝVOJ MLÁĎAT Cross-fostering je metoda, při které jsou některá mláďata odebrána jejich biologickým matkám ihned po narození a vychovávaná matkami náhradními až do odstavu. Francis et al. (1999) ve své studii použili cross-fostering k odlišení vlivu genů a prostředí na vývoj mláďat. Potomci hodně pečujících matek byli adoptováni málo pečujícím samicím a naopak. Jednotlivé skupiny zahrnovaly tato mláďata: 1) skupina mláďat málo pečujících matek a skupina mláďat hodně pečujících matek, se kterými nebylo nijak manipulováno; 2) skupina falešně adoptovaných mláďat, která byla jen na chvíli odebrána z hnízda a následně vrácena biologickým matkám; 3) skupina mláďat málo pečujících samic, adoptovaných jinými málo pečujícími samicemi a na druhou stranu skupina mláďat hodně pečujících samic adoptovaných jinými intenzivně pečujícími samicemi; 19

4) skupina mláďat málo pečujících matek, adoptovaných hodně pečujícími samicemi a naopak. Výsledkem jejich studie bylo zjištění, že v dospělosti se mláďata chovala nikoliv podle toho, ze které skupiny pocházela, ale podle toho, v jakém prostředí byla vychovávána. Potomci (samci i samice) málo pečujících matek adoptovaní hodně pečujícím matkám, byli méně bojácní než potomci hodně pečujících matek adoptovaní málo pečujícím matkám. Vliv rodiny, ze které zvířata pocházela, se následně projevil i v mateřském chování samic. Samice, které pocházely z hnízd hodně pečujících matek, následně hodně pečovaly o svá mláďata a naopak. U falešně adoptovaných mláďat nedošlo ke změnám. Pokud byla samice málo pečující matky adoptována matkou hodně pečující, pak tato samice také hodně pečovala o svá mláďata. A naopak, samice odebraná hodně pečující matce, adoptovaná málo pečující matkou, pečovala o svá mláďata méně. Změna prostředí zde vedla k výrazné změně fenotypových projevů. Jiná studie (Barbazanges et al. 1996) sledovala, zda adopce v různých kritických vývojových obdobích může mít u dospělých samců laboratorního potkana vliv na kognitivní a endokrinní funkce. Adopce byla provedena několik hodin po narození (den 1) nebo 5. a 12. den po narození. Matky byly vždy v určitý den na méně než 1 minutu odebrány z klece a všechna jejich mláďata byla přesunuta do klece adoptivní matky. Další 3 skupiny byly sledovány s ohledem na možný efekt krátkodobé separace. Biologické matky byly proto v dané dny na 1 minutu odebrány z klece a poté vráceny zpět ke svému vrhu. Tato studie ukázala, že adopce a separace měly u dospělých samců potkana odlišný vliv jak na jejich chování, tak na endokrinní funkce. Dospělí potkani, kteří byli podrobeni 1 minutu trvající separaci asi 3-6 hodin po narození, měli v novém prostředí zvýšenou lokomoci a horší kognitivní funkce. Tato časná separace prodloužila sekreci kortikosteronu, vyvolanou stresem. Adopce provedená několik hodin po narození, zabránila všem těmto negativním následkům, které byly vyvolávány časnou separací a které by přetrvaly až do dospělosti. Dospělí samci, kteří byli adoptování 5. nebo 12. den, ukázali zvýšenou lokomoci v novém prostředí a horší prostorové učení. Potkani adoptovaní 12. den měli také zhoršené kognitivní funkce. Obě skupiny ukázaly ve stresovém prostředí také zvýšenou sekreci kortikosteronu. Tato studie dospěla k závěrům, že adopce provedená 5. nebo 12. den po narození, prokázala dlouhodobě negativní účinky, podobně, jako separace mláďat několik hodin po porodu. 20

Již předchozími studiemi bylo zjištěno, že matky, které během těhotenství a kojení berou drogy, nevěnují dostatečnou péči svým mláďatům. Experimentálních studií, které by se zabývaly vlivem cross-fosteringu a prenatální expozicí psychostimulačních drog existuje velice málo a žádná z těchto studií nezkoumá vliv prenatální expozice MA a cross-fosteringu. Studie, kterou publikovali Wiggins a Ruiz (1990) se zabývala vlivem cross-fosteringu a vývojem procesu myelinizace mozku u potkanů. Tato studie ukázala, že větší riziko pro myelinizaci mozku představuje jeho vystavení účinkům kokainu v prenatálním období, než expozice kokainu během laktace. Koncentrace myelinu byla zjišťována v PD 15 a PD 20 a bylo zjištěno, že u potkanů, prenatálně exponovaných kokainu, byla koncentrace myelinu snížena o 10 % v porovnání s potkany exponovanými kokainu během laktace (koncentrace myelinu snížena o 1 2 %). 2.4 POSTNATÁLNÍ HANDLING Podobné důsledky, jako adopce, měla i uměle navozená změna mateřského chování ( handling ) samic. Řada předchozích studií ukázala, že krátkodobá denní separace mláďat od matek (15 minut) vedla u těchto samic ke zvýšení LG-ABN. Francis et al. (1999) ve své studii ukázali, že tzv. handlovaná mláďata málo pečujících matek vykazovala ke svým potomkům větší frekvenci LG-ABN než mláďata, s nimiž manipulováno nebylo. Co se týče chování, v dospělosti se handlovaná zvířata málo pečujících matek nelišila v mateřském chování od mláďat hodně pečujících matek (handlovaných i nehandlovaných). Handlovaná mláďata málo pečujících matek měla vyšší koncentraci mrna pro glukokortikoidové receptory, více centrálních benzodiazepinových receptorů v centrálním a bazolaterálním jádru amygdaly a nižší koncentraci mrna pro kortikotropní stimulující faktor v PVN hypotalamu, než nehandlovaná mláďata málo pečujících matek. Ani v koncentracích daných receptorů se handlovaná mláďata málo pečujících matek nijak nelišila od handlovaných či nehandlovaných mláďat hodně pečujících matek. 2.5 VLIV PROSTŘEDÍ NA VÝVOJ MLÁĎAT Jak prokázaly další, níže citované studie, kromě rozdílné mateřské péče, se na vývoji a chování mláďat podílí i vliv prostředí. Jedinci se stejnou genovou výbavou 21

dospívají pod vlivem různých prostředí k odlišným výsledkům. Zda sociální prostředí v interakci s rozdílnou mateřskou péčí může změnit vzorce mateřského chování a zda se tato změna může přenést také na další generaci zkoumali ve své práci Champagne a Meaney (2007). V den odstavení mláďat umístili potomky (samice) od matek jak s vysokou frekvencí LG, tak nízkou frekvencí LG do různých prostředí (Obr. 2.1). Potomci byli umístěni do 3 různých typů prostředí: 1) Ochuzené prostředí mláďata byla umístěna sama do malého boxu, kde podlaha byla z drátěného pletiva; 2) standardní prostředí mláďata byla umístěna v párech (stejné pohlaví a stejný vrh) ve větším boxu s podestýlkou; 3) Obohacené prostředí mláďata byla umístěna do několikapatrové, šestimístné ocelové klece s drátěnou podlahou, kde měla k dispozici různé hračky. Po 50 dnech strávených za těchto podmínek, byla zvířata umístěna do standardních podmínek, spářena a bylo sledováno mateřské chování samic k potomkům. Dále pak byly tyto samice, po odstavení svých mláďat, testovány v otevřené aréně ( open field ) na explorativní chování a testovány na paměť testem rozpoznávání objektů ( object recognition test ). Současně byla samicím zjišťována koncentrace oxytocinových receptorů v mozku (generace F 1 ). Samice od matek z generace F 1 pak byla umístěna do standardních podmínek a po porodu bylo pozorováno jejich mateřské chování (Generace F 2 ). Autoři dospěli k závěrům, že sociální prostředí, ve kterých samice tráví čas během vývoje, hraje významnou roli v regulaci mateřské péče, explorativního chování a kognitivních funkcí. Samice, narozené matkám s nízkým LG chováním, které byly umístěny po odstavu do obohaceného prostředí v období laktace hodně pečovaly o svá mláďata (vysoká frekvence LG). Naopak samice, pocházející od matek s vysokou frekvencí LG, které byly umístěny do ochuzeného prostředí, málo pečovaly o svá mláďata (nízká frekvence LG). Pokud byly samice umístěny do standardního prostředí, pak ty, které pocházely od matek s nízkým LG, následně málo pečovaly o svá mláďata, ve srovnání se samicemi pocházejícími od matek s vysokou frekvencí LG. Podobné výsledky byly u těchto samic pozorovány také v otevřené aréně, kde prostředí ovlivnilo jejich explorativní chování a anxietu. Samice, pocházející jak od matek s nízkým, tak vysokým LG umístěné v ochuzeném prostředí, se navzájem nelišily v explorativním chování, ale jejich explorativní chování bylo výrazně nižší v porovnání se samicemi, pocházejícími od 22

matek s vysokým LG, umístěnými do standardního prostředí. Samice pocházející od matek s nízkým LG a vysokým LG umístěnými do obohaceného prostředí ukázaly vyšší explorativní aktivitu v porovnání se samicemi od matek s nízkým LG umístěnými ve standardních podmínkách. V testu rozpoznávání objektů, pak samice, umístěné v obohacujícím prostředí, trávily více času zkoumáním nových objektů, než samice umístěné v ochuzeném prostředí. Koncentrace oxytocinových receptorů byla u samic s nízkým a vysokým LG chováním ve 3 různých prostředích měřena v 6 oblastech mozku: MPOA, PVN, bed nucleus of stria terminalis (BNST), laterální septum (LS), centrální jádro amygdaly, ventro-mediální jádro hypotalamu (VMH). Rozdíly v koncentraci oxytocinových receptorů byly nalezeny hlavně u samic, umístěných ve standardním prostředí. Samice, vychovávané matkami s vysokým LG, které byly po odstavu odstavu umístěny do standardního prostředí, měly vyšší koncentraci oxytocinových receptorů v MPOA, BSNT, LS, PVN a amygdale, v porovnání se samicemi, které pocházely od matek s nízkým LG chování, umístěnými do standardního prostředí. Rozdíly mezi samicemi umístěnými v obohacujícím, nebo ochuzeném prostředí nebyly pozorovány. Uvedené výsledky se shodují s podobně zaměřenou prací (Fulgheri et al. 1975), kde bylo zjištěno, že u samic potkana, které byly po odstavení umístěné do sociální izolace, došlo ke snížení biosyntézy estradiolu a estronu. Snížení syntézy estradiolu může snížit zvýšení vazby na oxytocinové receptory v hypotalamu, které se objevuje u samic po dosažení pohlavní zralosti (Tribollet et al. 1991, Tribollet et al. 1989) a může také zabránit up-regulaci vazby na oxytocinové receptory u samic s vysokým LG. Výsledkem je fenotyp, podobající se samicím s nízkým LG chováním. Tyto studie dokazují, že fenotyp potomka je ovlivněn jak kvalitou obdržené postnatální péče, tak prostředím, ve kterém žije. Tyto rozdíly v mateřské péči se přenášejí z generace na generaci. 23

Mateřské chování potomků generace F 1 Mateřské chování potomků generace F 2 Postnatální mateřská péče ochuzené Málo LG Málo LG standartní Málo LG Málo LG MÁLO LG HODNĚ LG standartní Málo LG Hodně LG standartní Málo LG Hodně LG obohacené Hodně LG Hodně LG standartní Hodně LG Hodně LG Prostředí po odstavení Prostředí po odstavení F 0 F 1 F 2 Obr. 2.1: Schéma a výsledky ukazující vliv rozdílného prostředí na přenos mateřského chování na další generace. Samice z generace F 0 byly umístěny do standardního prostředí. Jejich potomci, jak od samic s nízkým tak s vysokým LG chováním, byly umístěny do 3 různých prostředích. Samice z F 1 generace, které byly umístěny do ochuzeného prostředí, pečovaly o svá mláďata méně a samice z F 1 generace, které byly umístěny do obohaceného prostředí, pečovaly o svá mláďata více, aniž by záleželo na tom, z které rodiny samice pocházely. Samice umístěné do standardního prostředí měly shodný fenotyp jako generace F 0. Potomci z generace F 2 byly umístěny do standardního prostředí a jejich fenotyp byl stejný jako generace F 1. (Přezazo z Champagne a Meaney (2007)). 24

3 CÍLE PRÁCE Cílem práce bylo popsat a na základě série experimentů objasnit nejen vliv prenatální a postnatální expozice metamfetaminu (MA), aplikovaného prostřednictvím mateřského mléka, ale také vliv rozdílné mateřské péče na vývoj mláďat laboratorních potkanů během laktace. Cílem výzkumu bylo rovněž zjistit, zda následky expozice MA a rozdílné mateřské péče, přetrvají až do dospělosti. V první části výzkumu byl zjišťován vliv prenatální a postnatální expozice MA na vývoj mláďat od postnatálního dne (PD) 1 až do doby jejich odstavení od samic (PD 23). Studium bylo zaměřeno na zjišťování změn v porodní váze a ve váhovém přírůstku mláďat během laktace. Dále byl zkoumán vliv expozice MA na tzv. ukazatele zralosti mláďat (tj. otevření uší, očí, prořezání zubů, úleková reakce), posturální reflexy a senzorimotorické funkce. Kromě porovnání prenatální a postnatální aplikace MA, byla také sledována míra účinku postnatální péče během vývoje mláďat. Studován byl rovněž vliv prenatální a postnatální expozice MA a rozdílné mateřské péče na chování, anxietu a nocicepci jak u dospělých samců, tak u dospělých samic laboratorního potkana. U dospělých samic byl rovněž sledován vliv fází estrálního cyklu na jednotlivé vzorce chování, včetně ovlivnění nocicepce. Testován a vyhodnocován byl také vliv prenatální a postnatální expozice MA, aplikovaného prostřednictvím mateřského mléka a rozdílné mateřské péče, na schopnost učení i paměť dospělých samců laboratorních potkanů. 25

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 CHEMIKÁLIE D-metamfetamin HCl byl získán z Farmaceutické fakulty UK v Hradci Králové. Fyziologický roztok (0,9 % NaCl) byl dodaný firmou Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika). 4.2 ZPŮSOB CHOVU POKUSNÝCH ZVÍŘAT Samci (350 400 g) a samice (250 270 g) laboratorního potkana kmene Wistar pocházeli z Charles River Laboratories International, Inc. a byli dodáni chovnou stanicí Anlab (Praha, Česká republika). Potkani byli po 4 5 jedincích umístěni do plastových klecí o rozměrech 45 cm x 30 cm x 20 cm a ponecháni 1 týden v klidu. Chov probíhal v klimatizovaných podmínkách s kontrolovanou teplotou (22-24 C) a s volným přístupem k jídlu a pití. Světelný režim (12h světlo/12h tma) zvířat byl nastaven tak, aby světelná fáze začala v 06:00 hodin. 4.3 APLIKACE LÁTEK Dospělé samice byly rozděleny do třech skupin: (1) Skupina samic s expozicí MA. Samice této skupiny byly vystaveny chronickému působení MA, aplikovanému subkutánně (s.c.) v dávce 5 mg/kg. Metodika výzkumu, prováděného v rámci disertační práce, byla nastavena tak, aby co nejvěrohodněji simulovala účinky MA u těhotných žen závislých na drogách. MA byl proto samicím podáván po dobu přibližně 9 týdnů až do doby odstavení mláďat od matek, tj. 3 týdny před zabřeznutím (žádná žena nezačne užívat drogy až během těhotenství), po dobu březosti (většina žen nepřestane brát drogy během těhotenství) a po dobu laktace (ženy berou drogy i po porodu, takže v případě, že kojí, je jejich dítě vystaveno působením drogy také postnatálně prostřednictvím mateřského mléka (Steiner et al. 1984)). Dávkování 5 mg/kg bylo zvoleno na základě studie, kterou publikovali Acuff - Smith et al. (1996), kteří zjistili, že experimentální podávání MA březím samicím laboratorních potkanů vede k takovým koncentracím drogy v mozku, které odpovídají hodnotám zjištěným u plodů na droze závislých matek. Toto dávkování proto slouží jako experimentální model pro stanovení potenciálních 26

rizik expozice účinkům drogy in utero u lidí. (2) Skupina samic s expozicí fyziologického roztoku (FR). Těmto samicím byl ve stejnou dobu a ve stejném objemu jako v případě MA aplikován s.c. FR. (3) Kontrolní skupina samic. Samicím nebyla po celou dobu podávána žádná látka a nebyly tudíž vystaveny žádným injekčním vpichům. U všech samic byl po celou dobu experimentu sledován hmotnostní přírůstek. 4.4 FERTILIZACE Přibližně 3 týdny po podání MA byl samicím proveden vaginální výplach ke zjištění fáze estrálního cyklu. Pokud se samice nacházely ve vhodné fázi pro zabřeznutí (fáze proestrus/estrus), byly přes noc umístěny do jedné klece se sexuálně zralým samcem. Druhý den ráno byl samicím znovu proveden vaginální výplach za účelem zjištění přítomnosti spermií. Pokud se ve vzorku spermie nacházely, pak tento den byl počítán jako 1. den těhotenství. Samice byly vráceny do své domácí klece a 21. den těhotenství byly rozděleny do mateřských klecí. Den porodu byl počítán jako postnatální den (PD) 0. 4.5 CROSS-FOSTERING V předchozí studii bylo ukázáno, že podávání MA během březosti a laktace negativně ovlivňuje mateřské chování samic (Šlamberová et al. 2005a). Abychom odlišili vliv rozdílné mateřské péče a zároveň vliv postnatální expozice MA, aplikovaného prostřednictvím mateřského mléka, na funkční změny u potomků, provedli jsme v PD 1 cross-fostering. V tomto případě zůstala u matky vždy její 4 biologická mláďata (2 samci a 2 samice) a 8 dalších mláďat (4 samce a 4 samice) pocházejících od matek s odlišnou premedikací než měla ona sama, k ní bylo přidáno. Každá matka tedy vychovávala 4 kontrolní mláďata, 4 mláďata s prenatální expozicí FR a 4 mláďata s prenatální expozicí MA. V každém vrhu byl celkový počet mláďat 12, se stejným počtem samců a samic. Na základě prenatální a postnatální expozice jsme získali 9 experimentálních skupin (Tab. 4.1). V PD 23 byla mláďata od matek odstavena, rozdělena do skupin podle pohlaví a podle prenatální i postnatální expozice a ponechána ve skupinách po 4-5 jedincích až do dospělosti. 27

Tabulka 4.1: Experimentální skupiny SKUPINA PRENATÁLNÍ EXPOZICE (biologická matka) POSTNATÁLNÍ EXPOZICE (matka, kterou byla mláďata vychovávaná) PRENATÁLNÍ A POSTNATÁLNÍ FAKTORY MA/MA Metamfetamin Metamfetamin MA/FR Metamfetamin Fyziologický roztok Prenatální MA a postnatální péče matkou s expozicí MA (MA během kojení) Prenatální MA a postnatální péče matkou s expozicí FR MA/K Metamfetamin Kontrola Prenatální MA a postnatální péče kontrolní matkou FR/MA Fyziologický roztok Metamfetamin FR/FR Fyziologický roztok Fyziologický roztok FR/K Fyziologický roztok Kontrola K/MA Kontrola Metamfetamin K/FR Kontrola Fyziologický roztok K/K Kontrola Kontrola Prenatální expozice FR a postnatální péče matkou s expozicí MA (MA během kojení) Prenatální expozice FR a postnatální péče matkou s expozicí FR Prenatální expozice FR a postnatální péče kontrolní matkou Postnatální péče matkou s expozicí MA (MA během kojení) Postnatální péče matkou s expozicí FR Absolutní kontrola

4.6. ZNAČENÍ MLÁĎAT Mláďata byla značena podle prenatální expozice v PD 1. Mláďata s prenatální expozicí MA byla intradermálně značena černou tuší do levé zadní končetiny. Mláďata s prenatální expozicí FR byla značena intradermálně černou tuší do pravé zadní končetiny. Kontrolní mláďata značena nebyla. V PD 23 byla mláďata značena propíchnutím uší podle postnatální expozice, neboli podle matky, kterou byla vychovávána. Mláďatům, která byla vychovávána matkami, kterým byl aplikován MA, bylo propíchnuto levé ucho. Mláďatům, která byla vychovávána matkami, kterým byl aplikován FR, bylo propíchnuto pravé ucho. Mláďatům, která byla vychovávána kontrolními matkami, značení prováděné nebylo. 4.7 TESTOVÁNÍ MLÁĎAT PŘED ODSTAVEM Testování mláďat bylo prováděno od PD 1 do PD 23. V každé experimentální skupině bylo 8-10 samců a 8-10 samic. Testy byly vybrány na základě experimentů, které se běžně používají pro testování senzorimotorických funkcí a posturálních reflexů (Altman a Sudarshan 1975, Fox 1965, Geisler et al. 1993, Gramsbergen 1998, Meek et al. 2000, Pellis a Pellis 1994, Vorhees et al. 1979). V předchozích studiích bylo prokázáno, že jsou tyto testy citlivé na senzorické a motorické deficity vyvolané drogami (Šlamberová et al. 2006, Šlamberová et al. 2007). Mláďata byla testována vždy ve stejnou dobu, a to od 9 hodin do 12 hodin. 30 minut před začátkem experimentu byla mláďata umístěna do testovací místnosti, aby se adaptovala na nové podmínky a zabránilo se tak vlivu stresu z neznámého prostředí. Všechny plánované pokusy probíhaly v souladu se Zákonem č. 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání ve znění pozdějších předpisů (OTZ) a s Vyhláškou Ministerstva zemědělství č. 311/1997 Sb. o chovu a využití pokusných zvířat a zároveň v souladu s předpisy Výboru Rady Evropy z 24. listopadu 1986 (86/69/EEC). 4.7.1 Charakteristika vrhu a zralosti mláďat V PD 1 byl zjištěn celkový počet mláďat a počet samců a samic v každém vrhu. Dále byla hodnocena porodní váha mláďat a hmotnostní přírůstek za 23 dnů. Na základě studie autorů Meek et al. (2000) jsme sledovali dny, kdy se mláďatům prořezaly zuby, otevřely uši a oči. Dále jsme u nich testovali úlekovou reakci (Fox 1965, Meek et al. 29

2000), kdy byla mláďata vystavena vysokému tónu vyvolanému blízko ucha úderem na ladičku a poté byl sledován pohyb mláděte. Pokud se mládě leklo (cuklo sebou), bylo mu uděleno skóre 1, jestliže nebyl zaznamenán žádný pohyb, bylo mu uděleno skóre 0. Úleková reakce naznačovala, že mládě pravděpodobně slyší. 4.7.2 Negativní geotaxe (Obr. 4.1) Pomocí negativní geotaxe jsme testovali funkce vestibulárního systému (Fox 1965). Mládě bylo umístěno hlavou dolů na plošinu se sklonem 45. Poté byla měřena latence otočení mláděte o 180 (tj. hlavou nahoru). Čas byl měřen po dobu 30 sekund. Pokud se mládě během této doby neotočilo, byl mu započítán maximální čas doby měření 30 sekund. Test jsme prováděli v PD 9 a PD 11. 4.1A 4.1B 4.1C 4.1D 30

4.1E 4.1F Obr. 4.1: Negativní geotaxe. Mládě jsme umístili hlavou dolů na plošinu se sklonem 45 (A). Zvíře mělo za úkol otočit se v co nejkratším časovém limitu (B - F) hlavou nahoru (tj. o 180 ). 4.7.3 Tail pull test Tail pull testem jsme zjišťovali uchopovací reflex mláďat (Meek et al. 2000). Mláďata byla testována na dvou různých podložkách: v PD 10 na buničité vatě (Obr. 4.2A) a na mřížce v PD 12 a v PD 14 (Obr. 4.2B). Mládě bylo umístěno na podložku, drženo za ocas a za něj taženo směrem dozadu. Sledovali jsme, zda se mládě zachytí podložky předními končetinami. Pokud se zvíře zachytilo, bylo mu uděleno skóre 1, pokud zvíře test nesplnilo, tak mu bylo uděleno skóre 0. Výsledky byly hodnoceny zvlášť pro každou podložku. 4.2A 31

4.2B Obr. 4.2: Tail pull test. A) na buničité vatě; B) na mřížce. Mládě je umístěno na podložku, drženo za ocas a taženo za něj směrem dozadu. Je sledováno, zda se mládě předními končetinami zachytí podložky. 4.7.4 Vzpřimovací reflex z podložky (Obr. 4.3) Tímto posturálním reflexem jsme zjišťovali funkce labyrintu (vnitřního ucha) a mechanismu vzpřímení těla (Pellis et al. 1989, Vorhees et al. 1979). Každé mládě bylo nejprve položeno zády na podložku a poté byl měřen čas, za který se otočilo tak, že stálo na všech 4 končetinách. Čas byl měřen po dobu 10 sekund, pokud se mládě do 10 sekund nevzpřímilo, byl mu započítán maximální čas 10 sekund. Test jsme prováděli v PD 12. 4.3A 4.3B 32

4.3C 4.3D Obr. 4.3: Vzpřimovací reflex z podložky. Ukázka pohybu mláděte do polohy vstoje na všechny 4 končetiny. 4.7.5 Vzpřimovací reflex ze vzduchu (Obr. 4.4) Vzpřimovacím reflexem ze vzduchu jsme testovali posturální dynamické změny (Altman a Sudarshan 1975). Mládě bylo uchopeno oběma rukama za hlavu a konec těla tak, aby zaujalo polohu zády dolů ve výšce 40 cm nad molitanovou podložkou. Zvíře bylo poté puštěno a byl sledován jeho pád na podložku. Pokud dopadlo na všechny 4 končetiny, bylo mu uděleno skóre 1, pokud nikoliv, obdrželo skóre 0. Test jsme prováděli v PD 17. 4.7.6 Rotující válec (Obr. 4.5) Pomocí rotujícího válce byla testována senzorimotorická koordinace mláďat, která se snažila na válci udržet svým aktivním pohybem (Kábová et al. 1999). Mláďata byla po jednom umístěna na rotující se (6 otáček za minutu) válec o průměru 11,5 cm v protisměru otáčení a sledována po dobu 120 s. Byl měřen čas, po který se mládě udrželo na válci. Každé mládě bylo podrobeno šesti po sobě následujícím pokusům. Pro statistické hodnocení byla použita hodnota nejlepšího času dosaženého každým zvířetem a dále průměrný čas ze všech šesti pokusů. Navíc byl hodnocen i počet pádů. Mláďata jsme testovali v PD 23. 33

Obr. 4.4: Vzpřimovací reflex ze vzduchu. Úspěšné splnění úkolu - mládě dopadlo na všechny 4 končetiny (rotace hlavy se objevuje jako první, rotace zadních končetin jako poslední). (Převzato z Altman a Sudarshan (1975)). 34

Obr. 4.5: Rotující válec Obr. 4.6: Hrazda 35

4.7.7 Hrazda (Obr. 4.6) Funkce vestibulárního systému a senzorimotorické koordinace (Murphy et al. 1995) byly testovány na hrazdě studiem udržení rovnováhy bez aktivního pohybu. Mláďata byla umístěna na hrazdu a testována po dobu 120 s. Byl měřen čas, po který se mládě dokázalo udržet na hrazdě ve třech po sobě následujících pokusech. Pro statistické hodnocení byl použit nejlepší čas každého zvířete a průměrný čas za všechny 3 pokusy. Dále byl hodnocen i počet pádů mláďat. Mláďata byla testována v PD 23. 4.8 TESTOVÁNÍ V DOSPĚLOSTI (PD 60-90) V behaviorálních testech a v testech prokazujících vnímání bolesti, bylo testováno 72 dospělých samců (ve skupinách po 8 samcích) a 144 dospělých samic (ve skupinách po 16 samicích). U pohlavně intaktních samic byl vždy před testováním proveden vaginální výplach tak, aby bylo možné zjistit rozdíly vyvolané pohlavními hormony. Fáze estrálního cyklu byly určovány za pomoci světelného mikroskopu. Na základě kolísání hladin estrogenů a progesteronu (Obr. 4.7) (Hurn a Macrae 2000) byly samice testovány tehdy, pokud byli v některé z následujících fází. (1) Samice, které byly ve fázi proestru (P) - hladina pohlavních hormonů je nejvyšší, v cytologickém vzorku se nacházelo velmi mnoho epiteliálních buněk obsahujících jádro a málo zrohovatělých buněk s degenerovaným jádrem (Marcondes et al. 2002); (2) Samice, které byly ve fázi diestru (D) - hladina pohlavních hormonů je nižší a v cytologickém vzorku se nacházelo mnoho leukocytů a velmi málo zrohovatělých buněk (Marcondes et al. 2002). Protože byly kognitivní funkce v Morrisově vodním bludišti testovány 15 dní, byli ze shora uvedeného důvodu podrobeni testu pouze samci. Každé zvíře bylo testováno pouze jednou. 36

Obr. 4.7: Kolísání hladin samičích pohlavních hormonů během estrálního cyklu. Převzato z Hurn a Macrae (2000). 4.8.1 Behaviorální testy Samci a samice laboratorního potkana (PD 60 70) byli testováni na lokomoci, explorativní chování, komfortní chování a anxietu v otevřené aréně (OF - open field ). Anxieta byla testována také ve vyvýšeném křížovém bludišti (EPM - elevated plus maze ), neboť z předchozích studií vyplynulo, že tento test je pro studium anxiety citlivější a tudíž vhodnější (Crawley 1985). Oba testy proběhly za podmínek nízké intenzity osvětlení. Zvířata byla vystavena neznámému prostředí arény i bludiště, neboť před testováním nebyla habituována. Pokusná zvířata byla testována vždy ve stejnou dobu, a to od 9 do 12 hodin. 30 minut před začátkem experimentu byla přemístěna do testovací místnosti, aby se adaptovala na změnu prostředí. Zvířata byla umístěna do centra arény nebo bludiště a jejich chování bylo zaznamenáváno videokamerou po dobu 10 minut v OF a po dobu 5 minut v EPM. 37

Videozáznam pak byl hodnocen dvěma laborantkami pomocí počítačového programu ODLog (Macropod Software). Po skončení pokusu byl potkan navrácen do své domácí klece. OF i EPM jsme před umístěním dalšího zvířete důkladně očistili roztokem ajatinu a vysušili, aby chování dalšího zvířete nebylo ovlivněno pachovými stopami. 4.8.1.1 Otevřená aréna (OF) Otevřená aréna (45 x 45 x 30) byla obklopena 4 plastovými stěnami zabraňujícími úniku. Tři stěny byly neprůhledné, přední stěna byla průhledná. Podlaha arény byla vizuálně rozdělena vertikálními a horizontálními čarami na čtverce a ve středu arény se nacházel centrální kruh (20 cm v průměru). Velikost OF byla vybrána na základě studií Fraňkové a Mikulecké (1990) a Mikulecké a Mareše (2009) (Obr. 4.8). Hodnocenými parametry byly: (a) lokomoce - tj. množství překročených čar v aréně (b) explorativní chování - celkový čas strávený vztyčováním (c) komfortní chování tj. celkový čas strávený čištěním obličeje ( facing ) nebo celého těla ( grooming ) (d) anxieta - čas strávený v rozích arény, čas strávený v centrálním kruhu, čas strávený imobilitou (potkan nevykazuje žádnou z výše uvedených aktivit). 4.8.1.2 Vyvýšené křížové bludiště (EPM) Vyvýšené křížové bludiště se skládalo ze čtyřramenného kříže, jehož dvě protilehlá ramena byla otevřená a ohraničená 0,5 cm vysokými průhlednými plastovými stěnami a dvě další ramena byla uzavřená a opatřena neprůhlednými 30 cm vysokými stěnami. Celé zařízení bylo umístěno ve výšce 50 cm nad povrchem. Všechna ramena se spojovala ve středu bludiště tak, že zvíře mohlo chodit z jednoho ramena do druhého (Obr. 4.9). Hodnocenými parametry byly: (a) celkový čas strávený v uzavřených ramenech (zvíře muselo mít všechny 4 končetiny v uzavřených ramenech) (b) celkový čas strávený v otevřených ramenech (zvíře muselo mít všechny 4 končetiny v otevřených ramenech) (c) frekvence natahování ze zavřeného do otevřeného ramene a následné trhnutí sebou zpět (SAP - stretched attened posture ) (Weiss et al. 1998)). Dále byly sledovány jednotlivé vzorce chování, jimiž jsou (a) lokomoce tj. frekvence vstupů do 38

jednotlivých ramen a (b) explorace vztyčování a čichání v otevřených ramenech a ve středu ramene. Obr. 4.8: Potkan sedí a je tzv. imobilní v rohu otevřené arény, což je považováno za anxiogenní chování. Obr. 4.9: Vyvýšené křížové bludiště. Potkan se pohybuje v otevřených ramenech, což je projevem anxiolytického chování. 39

4.8.2 Kognitivní testy Kognitivní funkce u dospělých samců laboratorního potkana (PD 85-90) jsme testovali v Morrisově vodním bludišti (MWM Morris water maze ). MWM je kruhový bazén o průměru 2 m naplněný vodou, v němž je ostrůvek (o průměru 13 cm), který je buď ponořený, nebo vyčnívajícím z vody. Na okraji bazénu byly vyznačeny 4 startovací pozice: sever (S), jih (J), východ (V) a západ (Z), které rozdělovaly bazén na 4 kvadranty (Obr. 4.10). MWM je pro zvíře averzivním prostředím. Proto je motivováno nalézt ostrůvek a tím uniknout nebezpečí, přičemž se orientuje na základě informace o prostorových vztazích mezi statickými předměty umístěnými kolem bazénu. Celý pokus byl zaznamenáván kamerou umístěnou nad bazénem a získaná data byla hodnocena za použití speciálního programu Ethovision (Noldus Information Technology, Nizozemí). Potkani byli testováni po dobu 15 dní. Testování se skládalo: (1) z testu učení; (2) z probe testu; (3) z testu paměti a (4) z testu motoriky. Po skončení pokusu bylo zvíře osušeno ručníkem, na 2 minuty vloženo do čisté klece a následně vráceno do své domácí klece. Obr. 4.10: Morrisovo vodní bludiště 40

V testu učení a paměti byly hodnoceny následující parametry: (a) čas, za který zvíře nalezlo ostrůvek; (b) délka uplavané trajektorie; (c) chyba hledání ( search error ) součet přímé vzdálenosti od ostrůvku v určitý časový úsek; (d) rychlost plavání. Za účelem potvrzení, resp. prokázání vlivu prenatální a postnatální expozice na chybu hledání, bylo nutné vyhodnocovat navíc strategie, které potkan použil v jednotlivých pokusech. Tato metoda byla již dříve aplikována při testování myší (Janus 2004). Jednotlivé, níže uvedené strategie, byly manuálně hodnoceny dvěma laborantkami. Nejprve byla v každém pokusu zjištěna převládající strategie a následně frekvence daných strategií za den. Těmito strategiemi byly: (1) Tigmotaxe = neorganizované plavání podél okraje MWM, přičemž se může objevit ojedinělé plavání do středu MWM (Obr. 4.11A); (2) Náhodné hledání = neorganizované plavání po celé ploše MWM buď plaváním ve směru přímek nebo v kruhu (Obr. 4.11B); (3) Skenování = neorganizované plavání ve středu MWM a náhodné nalezení ostrůvku (Obr. 4.11C); (4) Hledání v kruhu = plavání v kruhu ve stejné vzdálenosti od MWM a náhodné nalezení ostrůvku (Obr. 4.11D); (5) Hledání v nesprávném kvadrantu = přímé plavání do nesprávného kvadrantu a náhodné hledání ostrůvku v něm (Obr. 4.11E); (6) Hledání ve správném kvadrantu = přímé plavání do cílového kvadrantu a nalezení ostrůvku v něm (Obr. 4.11F); (7) Prostorové hledání = přímé plavání na ostrůvek (Obr. 4.11G). V testu probe byly hodnoceny následující parametry: (a) rychlost plavání; (b) frekvence vstupů do cílového kvadrantu a (c) čas strávený v cílovém kvadrantu. Parametry hodnocené v testu motoriky byly tyto: (a) čas, za který zvířata nalezla ostrůvek; (b) délka uplavané trajektorie a (c) rychlost plavání. 4.11A 4.11B 41

4.11C 4.11D 4.11E 4.11F 4.11G Obr. 4.11: Strategie hledání ostrůvku v MWM v testech učení a paměti. A) Tigmotaxe; B) Náhodné hledání; C) Skenování D) Hledání v kruhu; E) Hledání v nesprávném kvadrantu; F) Hledání ve správném kvadrantu; G) Prostorové hledání 42

4.8.2.1 Test učení V testu učení se zvíře po dobu 5 dní učilo nalézt v co nejkratším časovém limitu ostrůvek. Úkolem zvířete při testu bylo nalézt během 60 sekund skrytý ostrůvek, který byl v MWM umístěný v oblasti S - V kvadrantu, asi 1-2 cm pod vodní hladinou tak, aby byl pro zvíře neviditelný. V případě, že potkan během časového limitu ostrůvek nenalezl, byl na ostrůvek manuálně naveden experimentátorem. Každé zvíře bylo testováno 8 x denně při použití čtyř různých startovacích pozic. Pozice ostrůvku byla ve všech pokusech stejná. Pro zapamatování prostorové orientace zůstalo po každém pokusu zvíře na ostrůvku 30s. 4.8.2.2 Test probe 6. den byl proveden test probe. Pomocí testu probe jsme testovali, zda si zvíře zapamatovalo umístění ostrůvku v cílovém kvadrantu. Ostrůvek byl z MWM odstraněn a zvíře bylo necháno, aby 60s plavalo v MWM. Pokud si zvíře lokalizaci ostrůvku zapamatovalo, tak v cílovém kvadrantu strávilo více času a do tohoto kvadrantu mělo rovněž větší frekvenci vstupů. 4.8.2.3 Test paměti 12. den probíhal test paměti, ve kterém byla testována dlouhodobá paměť potkanů. Potkani měli za úkol během 60s nalézt skrytý ostrůvek v co nejkratším časovém limitu. Ostrůvek byl umístěný ve stejném kvadrantu jako při testu učení (S-V kvadrant). Každé zvíře bylo testováno 8x denně ze čtyř různých startovacích pozic. 4.8.2.4 Test motoriky 15. den byly testovány motorické funkce potkanů v souvislosti s viditelným ostrůvkem. Ostrůvek byl v bazénu umístěný v oblasti J - Z kvadrantu, asi 1-2 cm nad vodní hladinou a byl tudíž pro zvíře viditelný. Ostrůvek byl pro lepší odlišení od vodní hladiny zvýrazněn černou ponožkou. Potkani se podrobili 8 pokusům denně, při použití čtyř různých startovacích pozic. 43

4.8.3 Testování nocicepce Ve stáří 85-90 dnů byl všem potkanům proveden plantar test (Ugo Basil, Comerio, Itálie) a modifikovaný tail flick test na zjištění termické bolesti. Modifikace spočívala v tom, že zvířata nebyla při testu fixována, ale mohla se volně pohybovat. Pomocí testu plantar test byly potkanům testovány supraspinální reflexy a pomocí modifikovaného tail flick testu, reflexy spinální míchy. 4.8.3.1 Plantar test (Obr. 4.12) Zařízení pro plantar test je tvořeno plastovou klecí (27 cm x 17 cm x 14 cm) se skleněnou podlážkou. Principem metody je působení světelného paprsku na spodní stranu chodidel a na spodní stranu ocasu a měří se latence ucuknutí. Maximální intenzita v tomto testu byla nastavena na hodnotu 90 a cut off hodnota (maximální možný čas stimulace, aby se zabránilo termickému poškození) byla nastavena na 22 s. Všechna měření byla provedena na každé netetované končetině a ocasu 3x s časovým odstupem 5 minut. Pro analýzu byla použita průměrná hodnota ze všech třech měření. Franěk et al. (2007) zjistili, že značení končetin tetováží interferovalo s termickým nocicepčním testem. Latence ucuknutí proto byla měřena jen u netetovaných zadních končetin tak, že u prenatálně exponovaných zvířat FR byla měřena latence ucuknutí na levé zadní končetině, zatímco u zvířat s prenatální expozicí MA, na pravé zadní končetině. Tato interference byla spojena jen s tetovanými končetinami. Naproti tomu v některých dalších publikovaných studiích (Bennett a Xie 1988, Vaculín et al. 2008) nebyly mezi intaktní pravou a intaktní levou končetinou nalezeny žádné rozdíly. Z těchto důvodů byla u absolutních kontrolních zvířat měřena latence ucuknutí na obou zadních končetinách a pro analýzu byla použita průměrná hodnota z obou zadních končetin. 44

Obr. 4.12: Plantar test 4.9 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ Při statistickém hodnocení jsme nejdříve stanovili rozložení a rozptyl dat v jednotlivých skupinách. Pokud bylo rozložení normální (gaussovské), tj. s rovnoměrnými rozptyly, byla data analyzována pomocí parametrického testu pro 3 a více skupin. Použili jsme vyhodnocení pomocí Analýzy rozptylu (ANOVA) s následným Bonferroniho post-hoc testem. Četnost výskytu jevu byla porovnána pomocí Chi 2 -testu. Signifikance byla vždy prezentována pokud p<0,05. Data u testu ANOVA byla prezentována jako [F (N-1, n-n) = xx,xx; p<0,0x], kde F = hodnota testového kritéria, N-1 = stupeň volnosti skupin, n-n = stupeň volnosti individuálního subjektu a p = hladina významnosti. Data u Chi 2 -testu byla prezentována jako Chi 2 = xx,xx, p<0,0x, kde Chi 2 = testovací kritérium pro Chi 2, p = hladina významnosti. Z každého vrhu bylo pro testování a následné hodnocení použito vždy jen jedno zvíře různého pohlaví a různé expozice, aby se tak zabránilo vlivu vrhu. 45

4.9.1 Testování mláďat před odstavem Počet mláďat v každém vrhu, resp. počet samců a samic byl analyzován pomocí 1 faktorového testu ANOVA (prenatální expozice). 2-faktorová ANOVA (prenatální expozice x pohlaví) byla použita pro zjištění rozdílu porodní váhy mezi experimentálními skupinami. Pomocí 3-faktorového testu ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice x pohlaví), byly hodnoceny rozdíly, zjištěné mezi skupinami v těchto testech: negativní geotaxe, vzpřimovací reflex z podložky, hodnocení nejlepšího času a počtu pádů na rotujícím válci a hodnocení počtu pádů na hrazdě. 3-faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice x pohlaví) s opakovaným měřením, byla použita pro analýzu hmotnostního přírůstku za 23 dní a také pro zjištění průměrného času ze všech pokusů v testech rotující válec a hrazda. Otevření očí, uší, prořezání zubů, tail pull test a vzpřimovací reflex ze vzduchu jsme hodnotili pomocí Chi 2 -testu. 4.9.2 Behaviorální testy Z důvodu ovlivnění chování a anxiety estrálním cyklem u samic, byli samci a samice hodnoceny zvlášť. K analýze rozdílů chování v OF a EPM, byla u samců použita 2 - faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice). Pomocí 3-faktorového testu ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice x estrální cyklus) byly hodnoceny rozdíly mezi skupinami samic. 4.9.3 Kognitivní testy Pro hodnocení rozdílů v testu učení byla použita 2 - faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice) s víceúrovňovým, opakovaným měřením (dny x pokusy/den). Probe test byl vyhodnocen pomocí 2 - faktorového ANOVA testu (prenatální expozice x postnatální expozice). Pro test paměti a pro test motoriky byla použita 2-faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice) s opakovaným měřením. Pro analýzu frekvence jednotlivých strategií byl použit Chi 2 test. 46

4.9.4. Testování nocicepce Z důvodu ovlivnění nocicepce estrálním cyklem u samic, byli samci a samice hodnoceny zvlášť. K analýze rozdílů prahů bolesti mezi skupinami samců byla použita 3-faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice x místo měření). 4-faktorová ANOVA (prenatální expozice x postnatální expozice x estrální cyklus x místo stimulace), byla použita k hodnocení latence ucuknutí a jejího porovnání mezi sledovanými skupinami samic. 47

5 VÝSLEDKY 5.1 BŘEZOST A POROD Analýza dat ukázala, že opakované podávání MA samicím neovlivnilo jejich délku březosti [F(2,44)=1,25; p=0,30], v porovnávání se samicemi s expozicí FR a s kontrolními samicemi (Tab.5.1). Signifikantní rozdíl byl v případě samic nalezen v hmotnostním přírůstku, ke kterému u nich dochází v průběhu jejich březosti [F(2,44)=4,3615; p<0,05] (Tab.5.1). U potkaních matek, kterým byl aplikován MA, byl hmotnostní přírůstek nižší, než u kontrolních matek, či u matek, kterým byl aplikován FR. Z porovnání s kontrolními samicemi a samicemi s expozicí FR (Tab.5.1) také vyplývá, že váhový přírůstek před zabřeznutím [F(2,44)=0,99; p=0,38] i v době laktace [F(2,44)=1,87; p=0,17], nebyl ovlivněn opakovaným podáváním MA. Tab. 5.1: Vliv prenatální expozice MA na počet dní březosti, na hmotnostní přírůstek a na počet narozených mláďat. SAMICE (PRENATÁLNÍ EXPOZICE) POČET DNÍ BŘEZOSTI PŘED ZABŘEZNUTÍM HMOTNOSTNÍ PŘÍRŮSTEK PO DOBU BŘEZOSTI PO DOBU LAKTACE POČET NAROZENÝCH MLÁĎAT Kontrolní samice 22,7 ± 0,17 15,1 ± 3,26 145* ± 4,86 25,2 ± 6,67 13 ± 0,84 Samice s expozicí FR 22,9 ± 0,16 19,4 ± 3,15 150* ± 4,71 30,4 ± 6,04 15 ± 0,81 Samice s expozicí MA 22,6 ± 0,16 13,3 ± 3,15 130 ± 4,71 13,2 ± 6,67 14 ± 0,81 Při opakovaném podávání MA byl zjištěn nižší hmotnostní přírůstek samic během jejich březosti. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry ± SEM pro samice stejné prenatální skupiny dohromady; n = 14-16; *p<0,05 vs. samice s expozicí MA (ANOVA; Bonferroniho post hoc test). 5.2 TESTOVÁNÍ MLÁĎAT PŘED ODSTAVEM 5.2.1 Počet narozených mláďat Opakované podávání MA nemělo vliv na takové charakteristiké znaky vrhu, jakými jsou počet narozených mláďat [F(2,44)=1,28; p=0,29] (Tab.5.1.), resp. vzájemný poměr samic a samců ve vrhu [F(2,88)=0,34; p=0,71]. 48

5.2.2 Porodní hmotnost Porodní hmotnost mláďat byla ovlivněna prenatální expozicí [F(2,162)=87,08; p<0,0001] a pohlavím [F(1,162)=4,68; p<0,05]; interakce mezi pohlavím a prenatální expozicí nebyla nalezena [F(2,162)=0,0023; p=0,99]. Porodní hmotnost mláďat, která byla prenatálně exponovaná MA (5,65 ± 0,07), byla nižší než porodní hmotnost kontrolních mláďat (7,07 ± 0,08) i mláďat s prenatální expozicí FR (6,58 ± 0,08). Ukázalo se také, že samci (6,52 ± 0,06) byli těžší než samice (6,33 ± 0,06), a to bez ohledu na jejich prenatální expozici. Obr. 5.1: Vliv prenatální a postnatální expozice MA na hmotnostní přírůstek mláďat během laktace (PD1 PD23). Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry ± SEM pro samce a samice dohromady; n = 18-20; *p<0,05, **p<0,0001 vs. mláďata s prenatální expozicí MA, vychovávaná stejnou matkou; ++p<0,0001 vs. mláďata stejné prenatální expozice, vychovávaná MA matkou; (ANOVA; Bonferroniho post hoc test). 5.2.3 Hmotnostní přírůstek mláďat během laktace (PD 1 PD 23) Pohlaví nemělo vliv na hmotnostní přírůstek mláďat, vyhodnocovaný po dobu 23 dní [F(1,162)=0,82; p=0,37]. Hmotnostní přírůstek byl ovlivněn prenatální expozicí 49

[F(2,162)=38,39; p<0,0001], postnatální expozicí [F(2,162)=111,15; p<0,0001] a jejich interakcí [F(4,162)=3,15; p<0,05] (Obr. 5.1). Prenatální expozice: Mláďata, která byla prenatálně vystavena účinkům MA (MA/K, MA/FR, MA/MA), měla hmotnostní přírůstek nižší, nežli skupina kontrolních mláďat (K/K, K/FR, K/MA; p<0,0001) a také než skupina mláďat s prenatální expozicí FR (FR/K, FR/FR, FR/MA; p<0,0001), bez ohledu na jejich postnatální expozici a pohlaví. Postnatální expozice: Mláďata, bez ohledu na jejich prenatální expozici a pohlaví, která byla vychovávaná MA matkami (K/MA, FR/MA, MA/MA), přibývala na váze méně, než mláďata vychovávaná jak kontrolními (K/K, FR/K, MA/K; p<0,0001), tak FR matkami (K/FR, FR/FR, MA/FR; p<0,0001). Tab. 5.2: Rozdíly v ukazatelích zralosti mláďat. EXPERIMENTÁLNÍ SKUPINA PRENATÁLNÍ EXPOZICE POSTNATÁLNÍ EXPOZICE PROŘEZÁNÍ ZUBŮ (PD 10) OTEVŘENÍ UŠÍ (PD 12) ÚLEKOVÁ REAKCE (PD 12) OTEVŘENÍ OČÍ (PD 15) K K 85* 100**++ 95**++ 60*+ FR K 70* 90**+ 75**+ 70*++ MA K 50 35 5 25 K FR 75* 100**++ 100**++ 95*++ FR FR 85* 100**+ 95**++ 80*++ MA FR 60 45 15 30 K MA 70* 60* 50* 25 FR MA 60* 65* 45* 25 MA MA 45 10 0 10 Hodnoty jsou vyjádřeny jako procenta úspěšných mláďat ze stejné skupiny, bez ohledu na pohlaví (n = 18-20); *p<0,05, **p<0,0001 vs. mláďata s prenatální expozicí MA, vychovávaná stejnou matkou; +p<0.05, ++p<0,001 vs. mláďata stejné prenatální expozice, vychovávaná MA matkou (Chi 2 test). 5.2.4 Ukazatele zralosti mláďat Pohlavní rozdíly nebyly pozorovány ani v jednom ze zkoumaných parametrů. Prenatální expozice: Hlavní vliv prenatální expozice byl prokázán u prořezávání zubů [χ2=8,16; p<0,01], otevírání uší [χ2=39,63; p<0,0001], otevírání očí [χ2=18,25; 50

p<0,0001] a také v úlekové reakci [χ2=68,43; p<0,0001]. Bez ohledu na postnatální expozici a pohlaví bylo zjištěno, že počet mláďat, která měla prořezané zuby, otevřené uši a oči a splnila test úlekové reakce, byl menší ve skupině mláďat s prenatální expozicí MA, než ve skupině kontrolních mláďat a také než ve skupině mláďat s prenatální expozicí FR (Tab. 5.2). Postnatální expozice: Vliv postnatální expozice byl signifikantně významný v těchto parametrech: otevírání uší [χ2=6,81; p<0,01], otevírání očí [χ2=13,08; p<0,001] a v úlekové reakci [χ2=6,65; p<0,001]. Jak vyplývá z Tab. 5.2, byl počet zvířat, která měla otevřené uši a oči a splnila test úlekové reakce, menší u skupin kontrolních mláďat a mláďat s prenatální expozicí FR, vychovávaných MA matkami, a to v porovnání se skupinami kontrolních mláďat či mláďat s prenatální expozicí FR, vychovávaných kontrolními či FR matkami, bez ohledu na pohlaví. 5.2.5 Negativní geotaxe Co se týče pohlaví, nebyly zjištěny žádné signifikantní rozdíly jak v PD 9 [F(1,162)=0,03; p=0,85], tak v PD 11 [F(1,162)=0,25; p=0,61]. V PD 9 byl pozorován hlavní účinek prenatální expozice [F(2,162)=31,17; p<0,0001] i postnatální expozice [F(2,162)=10,18; p<0,0001]. V PD 11 byl nalezen signifikantní rozdíl v prenatální expozici [F(2,162)=6,14; p<0,01], postnatální expozici [F(2,162)=16,56; p<0,0001], a také v interakci mezi prenatální a postnatální expozicí [F(4,162)=11,56; p<0,01]. Prenatální expozice: Mláďata prenatálně exponovaná MA (MA/K, MA/FR, MA/MA) měla v PD 9 delší latence otočení, než kontrolní mláďata (K/K, K/FR, K/MA; p<0,0001) a mláďata prenatálně exponovaná FR (FR/K, FR/FR, FR/MA; p<0,0001), bez ohledu na pohlaví a postnatální expozici (Obr. 5.2A). V PD 11 byly v prenatální expozici zjištěny tyto rozdíly: Mláďata prenatálně exponována MA, vychovávaná FR matkami (MA/FR), měla v porovnání s kontrolními mláďaty a mláďaty s prenatální expozicí FR, vychovávanými FR matkami (MA/FR>K/FR; p<0,01 a MA/FR>FR/FR; p<0,01), delší latence otočení (Obr. 5.2B). Postnatální expozice: Statistická analýza ukázala, že zvířata, vychovávaná jak kontrolními (K/K, FR/K, MA/K; p<0,05), tak FR matkami (K/FR, FR/FR, MA/FR; p<0,0001), měla v PD 9 kratší latence otočení, než zvířata vychovávaná MA matkami (K/MA, FR/MA, MA/MA), bez ohledu na prenatální expozici a pohlaví (Obr. 5.2A). 51

V PD 11 bylo zjištěno, že kontrolní mláďata, která byla vychovávaná MA matkami (K/MA), měla delší latence otočení než kontrolní mláďata, vychovávaná jak kontrolními (K/MA>K/K; p<0,05), tak FR matkami (K/MA>K/FR; p<0,0001). Stejný postnatální účinek MA byl nalezen také u mláďat s prenatální expozicí FR, která byla vychovávaná MA matkami (FR/MA). Tato skupina mláďat potřebovala také delší čas k otočení, než mláďata s prenatální expozicí FR, která vychovávaly buď kontrolní (FR/MA>FR/K; p<0,05) nebo FR matky (FR/MA>FR/FR; p<0,0001) (Obr. 5.2B).. 5.2.6 Tail pull test Experimenty neprokázaly vliv pohlaví na úspěšnost v tail pull testu v PD 10 [χ2=2,36; p=0,10], prováděném na buničité vatě, ani při testování na mřížce v PD 12 [χ2=1,82; p=0,18] a v PD 14 [χ2=2,70; p=0,10]. Prenatální expozice: Zjistili jsme, že počet mláďat, která úspěšně splnila test v PD 10 na buničité vatě, byl v případě mláďat s prenatální expozicí MA, vychovávaných FR matkami nižší, než u kontrolních mláďat, či mláďat s prenatální expozicí FR, která vychovávaly FR matky (MA/FR<K/FR; p<0,01 a MA/FR<FR/FR; p<0,01) (Obr. 5.3A). Tail pull test na mřížce v PD 12 ukázal (Obr. 5.3B), že kontrolní mláďata, která vychovávaly kontrolní matky (K/K), byla v plnění testu úspěšnější, než mláďata s prenatální expozicí MA, vychovávaná kontrolními matkami (K/K>MA/K; p<0,01). Stejně tomu bylo u kontrolních mláďat a mláďat s prenatální expozicí FR, která vychovávaly FR matky (K/FR a FR/FR). Tato mláďata byla v testu úspěšnější, než mláďata prenatálně exponovaná MA, vychovávaná FR matkami (K/FR>MA/FR; p<0,0001 a FR/FR>MA/FR; p<0,01). V PD 14 některé rozdíly v úspěšnosti vymizely. Nicméně skupina kontrolních mláďat, vychovávaná kontrolními matkami (K/K), byla stále úspěšnější, než skupina mláďat prenatálně exponovaná MA, vychovávaná kontrolními matkami (K/K>MA/K; p<0,01) (Obr. 5.3C). Postnatální expozice: Statistická analýza ukázala, že počet zvířat, která úspěšně splnila test v PD 10, byl větší ve skupinách kontrolních mláďat, vychovávaných kontrolními (K/K) a FR matkami (K/FR), nežli tomu bylo u skupin kontrolních mláďat, které vychovávaly MA matky (K/K>K/MA; p<0,01 a K/FR>K/MA; p<0,01). Dále jsme zjistili, že počet mláďat, která byla prenatálně vystavena expozici MA, a úspěšná 52

v tomto testu, byl naopak větší ve skupinách, které vychovávaly kontrolní (MA/K) nebo FR matky (MA/FR), než ve skupinách vychovávaných MA matkami (MA/K>MA/MA; p<0,01 a MA/FR>MA/MA; p<0,05) (Obr. 5.3A). Postnatální expozice MA zhoršila u kontrolních mláďat (K/MA) v testu prováděném v PD 12 jejich úspěšnost, a to v porovnání se skupinami kontrolních mláďat, vychovávaných jak kontrolními (K/MA<K/K; p<0,001), tak FR matkami (K/MA<K/FR; p<0,001) (Obr. 5.3B). V PD 14 se ukázalo, že počet mláďat, která úspěšně splnila tail pull test, byl u skupin kontrolních mláďat, vychovávaných jak kontrolními (K/K), tak FR matkami (K/FR) vyšší, než u skupin kontrolních mláďat, vychovávaných MA matkami (K/K>K/MA; p<0,01 a K/FR>K/MA; p<0,01). Stejně tak byla v tomto testu úspěšnější mláďata prenatálně exponovaná MA, vychovávaná FR matkami (MA/FR), než mláďata prenatálně exponovaná MA, vychovávaná MA matkami (MA/FR>MA/MA; p<0,01). (Obr. 5.3C). 5.2.7 Vzpřimovací reflex z podložky Vliv pohlaví nebyl v tomto testu prokázán [F(4,162)=4,19; p<0,01]. Vzpřimovací reflex z podložky byl ovlivněn prenatální expozicí [F(2,162)=18,110; p<0,0001], postnatální expozicí [F(2,162)=12,27; p<0,0001] a jejich interakcí [F(1,162)=0,03; p=0,85]. Prenatální expozice: U skupiny mláďat s prenatální expozicí MA, vychovávaných kontrolními matkami (MA/K), se v porovnání se skupinami kontrolních mláďat a mláďat s prenatální expozicí FR, vychovávaných kontrolními matkami (K/K a FR/K), neprodloužila latence otočení. U skupiny mláďat s prenatální expozicí MA, která byla vychovávaná FR matkami (MA/FR) a MA matkami (MA/MA), přetrval negativní vliv prenatální expozice MA, a to bez ohledu na pohlaví (MA/FR>K/FR; p<0,05; MA/FR>FR/FR; p<0,05 a MA/MA>K/MA; p<0,0001; MA/MA>FR/MA; p<0,0001) (Obr. 5.4A). Postnatální expozice: Postnatální expozice MA se negativně projevila u těchto skupin zvířat: 1) u skupiny kontrolních mláďat, která byla vychovávaná MA matkami (K/MA), se latence otočení v porovnání se skupinami kontrolních mláďat, vychovávaných jak kontrolními (K/MA>K/K; p<0,05), tak FR matkami (K/MA>K/FR; 53

p<0,05), prodloužila; 2) u skupin mláďat s prenatální expozicí MA, vychovávaných kontrolními (MA/K) či FR matkami (MA/FR), se latence otočení, v porovnání se skupinou mláďat s prenatální expozicí MA, která byla vychovávaná MA matkami (MA/K<MA/MA; p<0,0001 a MA/FR<MA/MA; p<0,0001), zkrátila (Obr. 5.4A). 5.2.8 Vzpřimovací reflex ze vzduchu Pohlaví nemělo vliv na úspěšnost v tomto testu [χ2 = 0,53; p = 0,47]. Prenatální expozice: Statistická analýza prokázala, že počet zvířat, která úspěšně splnila vzpřimovací reflex ze vzduchu, byl vyšší ve skupině kontrolních mláďat, vychovávaných kontrolními matkami (K/K) v porovnání se skupinou mláďat s prenatální expozicí MA, která byla vychovávaná kontrolními matkami (K/K>MA/K; p<0,05). Ukázalo se také, že počet úspěšných kontrolních mláďat a mláďat s prenatální expozicí FR, která byla vychovávána FR matkami (K/FR a FR/FR), byl vyšší, než počet mláďat s prenatální expozicí MA, vychovávaných FR matkami (K/FR>MA/FR; p<0,05 a FR/FR>MA/FR; p<0,05) (Obr. 5.4B). Postnatální expozice: Počet mláďat, která úspěšně splnila tento test, se snížil u kontrolních mláďat, která vychovávaly MA matky (K/MA), a to v porovnání se skupinami kontrolních mláďat, vychovávanými kontrolními (K/MA<K/K; p<0,05) i FR matkami (K/MA<K/FR; p<0,05). Stejný negativní vliv postnatální expozice byl nalezen u skupiny mláďat s prenatální expozicí FR, vychovávaných MA matkami (FR/MA) v porovnání se skupinou mláďat s prenatální expozicí FR, která byla vychovávaná FR matkami (FR/MA<FR/FR; p<0,05) (Obr. 5.4B). 5.2.9 Rotující válec Žádné rozdíly mezi pohlavími nebyly pozorovány v testu rotujícího válce [F(1,162)=0,04; p=0,84]. V času udržení na válci byl zjištěn hlavní vliv prenatální expozice [F(2,162)=6,66; p<0,01] a interakce prenatální a postnatální expozice [F(4,162)=3,19; p<0,05]. Stejně tak byl ovlivněn prenatální expozicí [F(2,162)=4,84; p<0,001] a interakcí mezi prenatální a postnatální expozicí [F(4,162)=3,94; p<0,05], počet pádů. Všechna zvířata, bez ohledu na prenatální a postnatální expozici, se s opakovanými se pokusy zlepšovala [F(5,810)=240,07; p<0,0001]. 54

Prenatální expozice: Post hoc test ukázal, že nejméně času na válci a nejvíce pádů z rotujícího válce, měla mláďata skupiny prenatálně exponované MA, která byla vychovávaná MA matkami (MA/MA), a to v porovnání s kontrolními mláďaty a mláďaty s prenatální expozicí FR, která vychovávaly MA matky (MA/MA<K/MA; p<0,05 a MA/MA<FR/MA; p<0,05) (Obr. 5A, B). Postnatální expozice: Mláďata s prenatální expozicí MA, která byla vychovávaná jak kontrolními (MA/K), tak FR matkami (MA/FR), se déle udržela na válci a měla méně pádů z rotujícího válce, než mláďata prenatálně exponovaná MA, vychovávaná MA matkami (MA/MA) (Obr. 5.5A, B). 5.2.10 Hrazda Na čas strávený na hrazdě [F(1,162)=1,50; p=0,22], ani na počet pádů [F(1,162)=1,11; p=0,29], nemělo pohlaví vliv. V čase, stráveném na hrazdě, nebyly nalezeny žádné signifikantní rozdíly jak v případě prenatální [F(2,162)=0,59; p=0,56], tak v případě postnatální expozice [F(2,162)=0,74; p=0,48]. Stejně tak nebyl ovlivněn prenatální [F(2,162)=0,95; p=0,39], ani postnatální expozicí [F(2,162)=0,94; p= 0,38], počet pádů. 55

Obr. 5.2: Vliv prenatální a postnatální expozice MA v testu negativní geotaxe. Data vyjadřují čas, za který se mláďata otočila. Hodnoty jsou průměry ± SEM pro samce a samice dohromady; n = 18-20; (A) Test negativní geotaxe v PD 9; (B) Test negativní geotaxe v PD 11; *p<0,05, **p<0,001 vs. mláďata s prenatální expozicí MA, vychovávaná stejnou matkou; +p<0.05, ++p<0.0001 vs. mláďata stejné prenatální expozice, vychovávaná MA matkou (ANOVA; Bonferroniho post hoc test). 56

Obr. 5.3: Vliv prenatální a postnatální expozice MA v tail pull testu. Data jsou vyjádřena jako procenta úspěšných/neúspěšných pokusů samců a samic dohromady. (A) Tail pull test na buničité vatě v PD 10; (B) Tail pull test na mřížce v PD 12; (C) Tail pull test na mřížce v PD 14; *p<0,05 vs. mláďata s prenatální expozicí MA, vychovávaná stejnou matkou; +p<0,05, ++p<0,0001 vs. mláďata stejné prenatální expozice, vychovávaná MA matkou (Chi 2 test). 57