THE CONTENT OF GLUCOSINOLATES IN RAPESEED COTYLEDONS AND PATHOGEN LEPTOSPHAERIA MACULANS

THE CONTENT OF GLUCOSINOLATES IN RAPESEED COTYLEDONS AND PATHOGEN LEPTOSPHAERIA MACULANS OBSAH GLUKOSINOLÁTŮ V DĚLOŽNÍCH LISTECH ŘEPKY OLEJKY OZIMÉ A PATOGEN LEPTOSPHAERIA MACULANS Plachká E., 1 Pokorný, R. 2 1 OSEVA PRO s.r.o., odštěpný závod Výzkumný ústav olejnin Opava, Purkyňova 10, 746 01 Opava město, Česká republika. 2 Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail: plachka@oseva.cz, pokorny0@node.mendelu.cz ABSTRACT Glucosinolates (GSL) are significant group of sulphur secondary metabolites having the role as natural pesticides in plants. The aim of this experiment was to detect the reaction of glucosinolates synthesis in rapeseed cotyledons connected with infection of Leptosphaeria maculans. Experiment are realised using laboratory inoculation tests. Three rapeseed genotypes and one pathogen isolate having aggresive character (Tox + ) were used. This test was based on the method from the document CRUCIFER GENETICS COOPERATIVE (information document from Dept. of Plant Pathology, University of Wisconsin) was used as source for establishment and evaluation of experiments. Infection was evaluated using scale 1-9 (1 = no darkening around wound, 9 = accompanied by profuse sporulation in large, more than 5 mm, lesions with diffuse margins). Content of glucosinolates was stained in intact, damaged and infected (inoculated) cotyledons at three terms: 1.) immediately before damaging and inoculation at the day of inoculation, 2.) 6 days after inoculation and 3.) 10 days after inoculation. It was detected, that GSL content is different in intact, damaged and infected rapeseed cotyledons. The whole content of GSL increased at damaged and infected cotyledons. The content of desulfogluconasturtiine (6th and 10th day after inoculation, aromatic glucosinolate) and desulfo-4-hydroxyglucobrassicine (10th day after inoculation, indolyl glucosinolate) increased at infected cotyledons. It was verified, that infection of Leptosphaeria maculans affects the production of glucosinolates in rapeseed cotyledons. Key words: winter rapseed, infection of Leptosphaeria maculans, content of glucosinolates, cotyledons

ABSTRAKT Glukosinoláty (GSL) představují významnou skupinu sirných sekundárních metabolitů, které v dvouděložných rostlinách plní pravděpodobně úlohu přirozených pesticidů. Cílem experimentu bylo zjistit reakci tvorby glukosinolátů v děložních listech řepky na napadení fomovou hnilobou brukvovitých - Leptosphaeria maculans. Ověřování probíhalo v laboratorních inokulačních testech. Pro vlastní práci byly použity 3 genotypy řepky olejky a izolát patogena s agresivními vlastnostmi: Tox+. K hodnocení rezistence k sledovanému patogenu byla použita metoda CRUCIFER GENETICS COOPERATIVE (informační dokument Dept. of Plant Pathology University of Wisconsin). Napadení bylo hodnoceno stupnicí 1-9 (1 = no darkening around wound, 9 = accompanied by profuse sporulation in large, more than 5 mm, lesions with diffuse margins). Obsah GSL byl stanovený v nepoškozených, poškozených a napadených (inokulovaných) děložních listech ve třech termínech: 1.) těsně před inokulací, 2.) 6 dnů po inokulaci a 3.) 10 dnů po inokulaci. Obsah GSL byl stanovený Metodikou stanovení obsahu glukosinolátů (GSL) v zelené hmotě řepky metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Bylo zjištěno, že obsah GSL je rozdílný v nepoškozených, poškozených a napadených děložních listech řepky. U poškozených a napadených děložních listů došlo ke změně obsahu GSL. U napadených děložních listů byl zvýšený celkový obsah GSL a zvýšený obsah desulfogluconasturtiinu (6. a 10. den po inokulaci) a desulfo-4-hydroxyglucobrassicinu (10.den po inokulaci). Jedná se o aromatický a indolový glukosinolát. V experimentu byl potvrzený vliv napadení L.maculans na obsah a složení glukosinolátů v děložních listech řepky. Klíčová slova: řepka olejka ozimá, napadení Leptosphaeria maculans, obsah glukosinolátů, děložní listy ÚVOD Glukosinoláty (GSL) představují významnou skupinu sirných sekundárních metabolitů, které v dvouděložných rostlinách plní pravděpodobně úlohu přirozených pesticidů. Účinky glukosinolátů mohou být řazeny do dvou významných tříd přirozených pesticidů: fytoalexiny a fytoanticipiny. Základní rozdíl mezi oběmi uvedenými třídami spočívá v mechanismu jejich vzniku. Fytoalexiny jsou definovány jako nízkomolekulární antimikrobiální sloučeniny, které se v rostlině syntetizují jako odpověď na vnější podnět (napadení) vznikají de novo. Bylo dokázáno, že zvýšená biosyntéza glukosinolátů je spouštěna po napadení některými škůdci. V druhé polovině osmdesátých let byly objeveny brassininy indolové sloučeniny, které plní v brukvovitých rostlinách funkci fytoalexinů. Fytoanticipiny jsou antimikrobiální látky vznikající z vytvořených prekurzorů, které rostlina produkuje od počátku svého růstu a tvoří aktivní ochranu proti případným škůdcům. Hydrolytickým rozkladem glukosinolátů vznikají toxické sloučeniny. Hydrolýza probíhá působením enzymu myrosinázy, která je lokalizovaná odděleně v buňkách idioblastů, zatímco glukosinoláty jsou umístěny v parenchymatických pletivech. Poškozením těchto pletiv, ať již rozemletím, trávením, mechanickým poškozením nebo poškozením hmyzem dochází k jejich spojení a k vlastní hydrolýze. Vzniklé těkavé sloučeniny mají široké spektrum antimikrobiálních účinků.

Podle charakteru postranního řetězce R- lze glukosinoláty klasifikovat do tří základních skupin: alifatické glukosinoláty, aromatické glukosinoláty, indolové glukosinoláty. V rámci řešení projektu NAZV MZe QD1350 byla vypracována Metodika pro stanovení glukosinolátů v zelené hmotě řepky pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), která se opírá o mezinárodní normu: ISO 9167-1:1992 (E) Rapeseed Determination of glukosinolates content, Part 1: Metod using high-perfomance liquid chromatografy. Pomocí této metodiky bylo celkem determinováno 13 glukosinolátů: IBER, PROG, EPROG, RAFA, NAPO, ALL, NAPI, HGB, BRNA, GB, NAST, MGB, NGB (Viz tab.č.1). Ve větším množství byly v zelené hmotě zaznamenány indolové glukosinoláty. Tento stav odpovídá poznatkům uváděným v literatuře: V semenech jsou zastoupeny hlavně alifatické glukosinoláty, v zelené hmotě pak ve větším obsahu indolové glukosinoláty (Hrnčiřík, 1999, Zukalová et al. 2002, Vrbovský et al., v tisku). Leptosphaeria maculans patří ve světě i u nás k nejvýznamnějším patogenům řepky. Je původcem choroby fomová hniloba brukvovitých. Za jediného původce způsobující tuto velmi významnou chorobu byl dlouho považován druh Leptosphaeria maculans (Desmaz.) Ces. & De Not. (anamorfa Phoma lingam Tode ex Fr.) (Fitt et al., 2006). Na základě virulence patogena, která se projevovala různou intenzitou příznaků na hostitelské rostlině a schopnosti vytvářet tzv. rakovinu stonku řepky, byl patogen rozdělen na dva patotypy či dvě skupiny, a to vysoce virulentní (agresivní) patotyp označovaný také jako skupina A či Tox + a slabě virulentní (neagresivní) patotyp označovaný jako skupina B či Tox 0 (Koch et al., 1989, Balesdent et al., 1992, Sippell a Hall, 1995). V současnosti je patotyp vysoce virulentní (agresivní) klasifikován jako samostatný druh Leptosphaeria maculans a patotyp slabě virulentní (neagresivní) je klasifikován jako Leptosphaeria biglobosa. Obě uvedené houby mají nepohlavní stadium známé jako Phoma lingam. U mladších rostlin způsobují oba druhy na podzim listové skvrnitosti. Na jaře se však příznaky liší. Při napadení řepky houbou L. maculans dochází k infekci stonkových bází, jejímž následkem je přerušení průchodnosti cévních svazků a následné odumírání celých rostlin. Druh L. biglobosa je hlavní příčinou stonkových lézí, infekce rostlinných pletiv je ale pouze povrchní. Jsou rozlišovány dva typy genetické rezistence proti Leptosphaeria maculans kvalitativní, úplná rezistence v časných stádiích rostlin, která je ovládána jednotlivými, rasově specifickými geny (Rlm) a kvantitativní, částečná rezistence u dospělých rostlin, která je pod kontrolou mnoha genetických faktorů mapovaných pomocí studií QTL (Delourme et al. 2003). Studium změn obsahu a složení glukosinolátů v zelené hmotě řepky po napadení patogenem L.maculans si klade za cíl posoudit úlohu glukosinolátů v obranných mechanismech řepky proti sledovanému patogenu. V 1.etapě byly práce zaměřeny na posouzení reakce obsahu a složení glukosinolátů na napadení L. maculans.

MATERIÁL A METODIKA Pro vlastní práci byl použitý izolát patogena L.maculans s agresivními vlastnostmi a 3 genotypy řepky olejky. Obsah GSL v pletivech řepky byl stanoven metodou HPLC. Izolát LEPTMA01/00OL byl získán izolací z pravých listů řepky odebraných na podzim v roce 2000. Jedná se o izolát vykazující vlastnosti Tox + - agresivní tj. tvorba pyknid a produkce žluttého pigmentu. Izolát byl klasifikován jako agresivní na základě vizuálního hodnocení izolátu a na základě reakce děložních listů řepky na inokulaci. Izolát byl získán kultivací pyknid na živné půdě PDA (Potato Dextrose Agar). Izolát je původem z ČR. Pracováno bylo s geneticky ustálenými materiály označenými pro tento experiment BRSNA01/07, BRSNA02/07 a BRSNA03/07. Materiály byly poskytnuty ze šlechtitelské kolekce pracoviště v Opavě. Jedná se o genotypy řepky olejky ozimé typu kanola: nízký obsah glukosinolátů a kyseliny erukové. Inokulace byla provedena suzpenzí spor patogena. Suzpenze byla připravena stěrem cca 30 denní kultury patogena ze živné půdy. Stěr ze dvou petriho misek o průměru 9 cm byl naředěný destilovanou vodou (20 ml). Hustota spor nebyla stanovena. Děložní listy řepky byly inokulovány ve vývojové fázi BBCH 10 děložní listy plně vyvinuty. Jako kontrola bez inokulace sloužily rostliny pouze poškozené. Samotné poškození bylo provedeno propíchnutím pletiva děložních listů řepky ostrou špičkou bambusového párátka. Na děložních listech jedné rostliny byly provedeny celkem čtyři vpichy, inokulace. U rostlin určených pro inokulaci byla bezprostředně po poškození provedena inokuace 2 µl suzpenze spor. Všechny rostliny byly po dobu třech dnů po inokulaci uzavřeny v plastových kontejnerech z důvodu zajištění zvýšené relativní vlhkosti vzduchu. Testy probíhaly v řízených tepelných a světelných podmínkách den/noc 12/12 hodin a teplota 22/15 ºC. K hodnocení rezistence k sledovanému patogenu byla použita metoda CRUCIFER GENETICS COOPERATIVE (informační dokument Dept. of Plant Pathology University of Wisconsin, Delwiche, 1980). Napadení bylo hodnoceno stupnicí 1-9 (1 = no darkening around wound, 9 = accompanied by profuse sporulation in large, more than 5 mm, lesions with diffuse margins). U rostlin zařazených do testů nebyly odstraněny pravé listy. Hodnocení napadení bylo prováděno v době 2. a 3.odběru rostlin na analýzy. Napadení v době odběrů bylo u inokulovaných materiálů řepky vyrovnané: 2.stupeň u 2.odběru a 2. až 4.stupeň u 3. odběru. Přesné výsledky testů rezistence nejsou v této práci prezentovány, protože toto hodnocení nebylo cílem této práce. Obsah GSL byl stanovený v nepoškozených, poškozených a napadených (inokulovaných) děložních listech ve třech termínech: 1.) těsně před inokulací, 2.) 6 dnů po inokulaci a 3.) 10 dnů po inokulaci. Obsah GSL v pletivech řepky byl stanoven metodou HPLC. Postupováno bylo dle Metodiky pro stanovení glukosinolátů v semeni řepky pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), (Kolovrat, 2001), která se opírá o mezinárodní normu: ISO 9167-1:1992 (E) Rapeseed Determination of glukosinolates content, Part 1: Metod using high-perfomance liquid chromatografy. Postup extrakce glukosinolátů v metodice vychází z práce K. Hrnčiříka (1999). Obsahy GSL v pletivech děložních listů řepky byly stanoveny v 1 g čerstvé hmoty a přepočteny na sušinu. Údaje jsou uvedeny v µmolech na 1g sušiny.

VÝSLEDKY A DISKUZE Při sledováních bylo zjištěno, že mechanické poškození řepky i napadení houbovým patogenem L.maculans má vliv na obsah a složení glukosinolátů v jejich děložních listech. Změny po mechanickém poškození listů řepky byly zaznamenány již v dřívějších pracích a současně bylo zaznamenáno i obdobné spektrum glukosinolátů v pletivech řepky (Zukalova et al., 2002, Projekt NAZV Mze QD1350, 2004, Plachká et al., 2006, Vrbovský et al., v tisku). U napadených děložních listů byl zvýšený celkový obsah GSL a zvýšený obsah desulfogluconasturtiinu (6. a 10. den po inokulaci) a desulfo-4-hydroxyglucobrassicinu (10.den po inokulaci) v děložních listech napadených patogenem. V případě desulfogluconasturtiinu (aromatický glukosinolát) bylo navýšení vyšší o 2,02 až 3,78 µmol/1 g sušiny šestý den po inokulaci a o 4,53 až 6,6 µmol/1 g sušiny desátý den po inokulaci ve srovnání s nepoškozenými listy. Desátý den po inokulaci bylo zvýšení obsahu tohoto aromatického glukosinolátů v napadených děložních listech výrazně vyšší. V případě desulfo-4-hydroxyglucobrassicinu (indolový glukosinolát) nebylo navýšení tak výrazné. Jednalo se o zvýšení obsahu o 0,41 až 0,99 µmol/1 g sušiny ve srovnání s nepoškozenými listy. V experimentu byl potvrzený vliv napadení L.maculans na obsah a složení glukosinolátů v děložních listech řepky. Pro posouzení korelací mezi změnou v obsahu celkových a jednotlivých GSL a napadením L.maculans bude nutné získané údaje ověřit u většího souboru genotypů řepky olejky. V experimentu nebyl posuzován obsah GSL ve stárnoucích a odumřelých děložních listech přirozenou cestou ve vztahu k napadeným děložním listům patogenem L.maculans, také nebyl hodnocen vliv napadení pravých listů řepky na složení a obsah glukosinolátů v nich. Tato sledování budou cíly navazujících experimentů. Tabulka č. 1: Název a struktura nejvíce rozšířených glukosinolátů Označení Triviální název Systematický název Alifatické glukosinoláty SINI Sinigrin 2-Propenyl- NAPI Glukonapin 3-Butenyl- BRNA Glukobrassikanapin 4-Pentenyl- PROG Progoitrin (2R)-2-Hydroxy-3-butenyl- EPROG Epi-progoitrin (2S)*2Hydroxy-3-butenyl- NAPO Glukonapoleiferin 2-Hydroxy-4-pentenyl- IBEV Glukoibervirin 3-Methylthiobutyl- ERUC Glukoerucin 4-Methylthiobutyl- RAFS Glukorafasatin (dehydroerucin) 4-Methylthio-3-butenyl- IBER Glukoiberin 3-Methylsulfinylpropyl- RAFA Glukorafanin 4-Methylsulfinylbutyl RAFE Glukorafenin 4-Methylsulfinylpentyl- ALLY Glukoallysin 5-Methylsulfinylpentyl CHEI Glukocheirolin 3-Methylsulfonylpropyl Aromatické glukosinoláty

TROP Glukotropaeolin Benzyl- SINA Sinalbin 4-Hydroxybenzyl- NAST Glukonasturtiin Fynethyl- Indolové glukosinoláty GB Glukobrassicin 3-Indolylmethyl- NGB Neoglukobrassicin 1-Methoxy-3-indolylmethyl- SGB 1-Sulfoglukobrassicin 1-Sulfo-3-indolymethyl- MGB 4-Methoxyglukobrassicin 4-Methoxy-3-indolylmethyl HGB 4-Hydroxyglukobrassicin 4-Hydroxy-3-indolylmethyl Tabulka č. 2: Obsah glukosinolátů v děložních listech řepky před a po inokulaci L.maculans OBSAH GLUKOSINOLÁTŮ (GSL) [µmol/g sušiny zelené hmoty] Označení materiálů [A - bez poškození] [B - mechanicky poškozené] [C - mechanicky poškozené a inokulované] Desulfoglucoiberin Desulfoprogoitrin Desulfoepi-progoitrin Desulfoglucoraphanin Desulfogluconapoleiferin Desulfoglucoalyssin Desulfogluconapin Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin Desulfoglucobrassicanapin Desulfoglucobrassicin Desulfogluconasturtiin Desulfo-4-methoxyglucobrassicin Desulfoneoglucobrassicin Celkový obsah GSL 0.den - den inokulace BRSNA01/07 0,08 0,52-0,10 0,08 0,06 0,72 2,85 0,07 5,71 1,22 0,02 0,01 11,44 BRSNA02/07 0,39 0,45-0,39 0,11 0,04 0,69 1,44 0,12 4,81 0,62 st.* 0,02 9,08 BRSNA03/07 0,07 3,32 0,08 0,13 0,60 0,07 0,70 1,76 0,31 7,81 0,91 0,04 0,07 15,87 6.den po inokulaci BRSNA01/07 A 0,14 0,13-0,14 0,07 0,03 0,13 0,59-5,61 0,54-0,02 7,40 BRSNA01/07 B 0,14 0,12-0,13 0,05 0,04 0,14 0,78-6,06 0,78-0,06 8,30 BRSNA01/07 C 0,14 0,16-0,12 0,04 0,04 0,11 0,47-5,53 2,56-0,08 9,25 BRSNA02/07 A 0,18 0,13-0,17 0,05 0,06 0,18 0,46-6,50 0,70 - st.* 8,43 BRSNA02/07 B 0,21 0,13-0,17 0,08 0,03 0,09 0,25-10,5 0,47-0,03 11,99 BRSNA02/07 C 0,30 0,16-0,19 0,05 st.* 0,12 0,31-9,73 3,17-0,04 14,07 BRSNA03/07 A 0,14 0,16-0,11 0,06 0,03 0,07 0,43-7,56 0,83-0,01 9,40 BRSNA03/07 B 0,13 0,19-0,14 0,09-0,08 0,40-10,3 0,58-0,02 11,92 BRSNA03/07 C 0,25 0,33-0,20 0,13 0,04 0,14 0,61-13,7 4,61-0,02 20,04 10.den po inokulaci

BRSNA01/07 A 0,20 0,11-0,16 st.* 0,02 0,08-4,56 0,79-0,02 4,56 6,56 BRSNA01/07 B 0,19 0,10-0,14 st.* st. 0,07-5,79 0,59-0,03 5,79 7,56 BRSNA01/07 C 0,59 0,20-0,21 - - 0,12-5,19 7,39-0,15 5,19 15,46 BRSNA02/07 A 0,14 0,08-0,12 st.* 0,03 0,05-3,00 0,35 - st.* 3,00 4,09 BRSNA02/07 B 0,33 0,14-0,20 st.* st. 0,07-7,14 0,48 - st.* 7,14 8,73 BRSNA03/07 A 0,35 0,13-0,16 - st. 0,05-4,55 5,24 - - 4,55 11,71 BRSNA03/07 B 0,25 0,16-0,19 st.* - 0,06-6,57 0,78 - - 6,57 8,84 BRSNA03/07 C 0,29 0,21-0,25 0,04 st. 0,08-9,01 1,54 - - 9,01 12,25 *stopové - neměřitelné množství ZÁVĚR Bylo potvrzeno, že napadení Leptosphaeria maculans má vliv na obsah a složení glukosinolátů v děložních listech řepky. U napadených děložních listů byl zvýšený celkový obsah GSL a zvýšený obsah desulfogluconasturtiinu (6. a 10. den po inokulaci) a desulfo-4- hydroxyglucobrassicinu (10.den po inokulaci). Jedná se o aromatický a indolový glukosinolát. Experiment řešil 1.etapu prací zaměřených na posouzení role glukosinolátů v obranných mechanismech řepky olejky proti houbovým chorobám. Práce na experimentu byly realizovány za podpory MZe NAZV projektu 1G46061 Využití inovovaných metod a specifických šlechtitelských materiálů pro zvýšení efektivnosti tvorby nových odrůd ozimé řepky. LITERATURA Balesdent, M. H., Gall, C., Robin, P., Rouxel, T. (1992): Intraspecific variation in soluble mycelial protein and esterase patterns of Leptosphaeria maculans French isolates. Mycological Research, 96: 677 684. Delourme, R., Pilet-Nayel, M. L., Archipiano, M., Horvais, R., Balesdent, M. H., Tangui, X., Rouxel, L., Brun, H., Renard, M. (2003): Mapping specific resistence genes to Leptosphaeria maculans in rapeseed (Brassica napus L.): Proceedings of the 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 6.-10.July 2003:102-104. Delwiche P. (1980): Genetic aspects of blackleg (Leptosphaeria maculans) resistance in rapeseed (Brassica napus). PhD thesis University of Wisconsin, Madison, Wis., USA. Fitt, B. D. L., Brun, H., Barbetti, M. J., Rimmer, S. R. (2006): World-wide importance of phoma stem canker (Leptosphaeria maculans and L. biglobosa) on oilseed rape (Brassica napus). European Journal of Plant Pathology, 114 (1): 3-15. Hrnčiřík, K. (1999): "Významné produkty degradace glukosinolátů", disertační práce, VŠCHT Praha, 1999.

Koch, E., Badawy, M. A., Hoppe, H. H. (1989): Differences between aggressive and nonaggressive single spore lines of Leptosphaeria maculans in cultural characteristics and phytotoxin production. Journal of Phytopathology, 124: 52 62. Kolovrat, O. (2001): Metodika pro stanovení glukosinolátů v semeni řepky pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Dokument OSEVA PRO s.r.o., odštěpný závod Výzkumný ústav olejnin Opava, 2001 Plachka, E., Kolovrat, O., Vrbovský, V. (2006): The influence of glucosinolate content variability in the seeds and green matter of winter rapeseed on the attack by selected pests. IOBC Bulletin Vol. 29(7) 2006: 101-103. Projekt NAZV Mze QD1350 (2004): Vývoj komplexních systémů ochrany proti významným chorobám a škůdcům obilnin, řepky a hrachu s cílem širokého uplatnění integrovaných způsobů ochran. Redakčně upravená závěrečná zpráva. 2004 Sippell, D. W., Hall, R. (1995): Glucose phosphate isomerase polymorphisms distinguish weakly from highly virulent strains of Leptosphaeria maculans. Canadian Journal of Plant Pathology, 17: 1 6. Vrbovský, V. (v tisku): Spektrum glukosinolátů v zelených částech řepky ozimé a jejich úloha v přirozené rezistenci k vybraným škůdcům. In: Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění a ochraně rostlin. Sborník referátů z konference, Brno 8.-9.11.2007. Výzkumný ústav pícninářský, spol. s r.o., Zemědělský výzkum, spol. s r.o., Troubsko, v tisku. Zukalová H., Vašák J., Nerad D., Štranc P. (2002): The role of glucosinolates of Brassica genus in the crop systém. Úloha glukosinolátů rodu Brassica v pěstebním systému. Plant production 48: 181.