Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KVASINEK RODU SACCHAROMYCES

Transkript

1 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KVASINEK RODU SACCHAROMYCES 1 Rozsah a účel Metodika slouží ke stanovení počtu probiotických kvasinek v doplňkových látkách, premixech a krmivech. Postup stanovení není použitelný pro minerální krmiva, tj. krmiva doplňková složená převážně z minerálních látek a obsahující minimálně 40 % hrubého popela. 1 Jedná se o metodu, ve které je použita technika inokulace zalitím agarem s kvasničním extraktem, glukózou a chloramfenikolem. Tato metoda není selektivní pro probiotické kvasinky, ale může být použita pro stanovení jejich počtu v krmivech za předpokladu, že probiotické kvasinky jsou přítomny v mnohem vyšších počtech, než jakékoli jiné kvasinky. 2 Kromě uvedené techniky lze použít techniku očkování roztěrem na povrch chromogenního agaru (např. CHROMagar Candida from CHROMagar), který umožňuje selektivní stanovení počtu druhů probiotických kvasinek, např. Saccharomyces cerevisiae. 3 Kategorie vzorků krmiv: Doplňkové látky - obsahují okolo ( ) CFU/g. Premixy - obsahují okolo 10 8 CFU/g. Krmiva, mouky a pelety - obsahují okolo 10 6 CFU/g. 2 Princip Základem této metody je homogenizace vzorku, příprava výchozí suspenze, ředicí řady a inokulace ploten (Petriho misek) zalitím inokula médiem nebo roztěrem inokula na povrch ploten. Plotny inokulované roztěrem se inkubují v aerobních podmínkách 3 dny při teplotě (30 ± 1) C. Plotny inokulované zalitím se inkubují v aerobních podmínkách 2 dny při teplotě (35 ± 1) C. Narostlé kolonie se spočítají, ověří podle mikroskopické morfologie a vyjádří se jako kolonie tvořící jednotky (CFU) v g nebo kg krmiva. 3 Chemikálie a roztoky Používají se chemikálie čistoty p. a., pokud není uvedeno jinak. 1 Chlorid sodný, NaCl. 2 Chlorid draselný, KCl. 3 Hydrogenfosforečnan sodný, Na2HPO4. 4 Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4.

2 Národní referenční laboratoř Strana 2 5 Bakteriologický pepton. 6 Kvasniční extrakt. 7 Glukóza. 8 Chloramfenikol. 9 Agar. 10 (re)destilovaná voda. 11 Základní ředicí roztok. Příprava: 8 g chloridu sodného (1), 0,2 g chloridu draselného (2), 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného (3) a 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4) se rozpustí v asi 200 ml vody (10). ph se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,3 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značce. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 12 Peptonová voda (pepton). Příprava: 1 g bakteriologického peptonu (5) a 8,5 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 200 ml vody (10). ph se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,0 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 13 Kultivační médium (agar s kvasničním extraktem, glukózou a chloramfenikolem). Příprava: 5 g kvasničního extraktu (6), 20 g glukózy (7), 0,1 g chloramfenikolu (8) a (12 15) g agaru (9) se rozpustí v asi 200 ml vody (10) za varu. ph se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 6,6 ± 0,4 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím k zalévání inokula se médium uchovává při teplotě (48 ± 1) C. 14 Fyziologický roztok. Příprava: 0,85 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 50 ml vody (10). ph se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,4 ± 0,2 a doplní se ve 100ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 15 Denaturovaný etanol, 70%. 16 Hydroxid sodný, NaOH, c = 1 mol/l. Příprava: 10 g hydroxidu sodného se rozpustí asi ve 100 ml vody (10) a doplní se v 250ml odměrné baňce po značku. 17 Imerzní olej.

3 Národní referenční laboratoř Strana 3 4 Pro stanovení kvasinek lze použít komerčně dodávaný chromogenní agar, který se připravuje podle návodu výrobce. 4 Přístroje a pomůcky 1 Analytické váhy. 2 Váhy s přesností 0,01 g. 3 ph metr. 4 Magnetické míchadlo. 5 Přístroj ke sterilizaci teplem - autokláv, sušárna nebo tlakový hrnec. 6 Termostat s teplotou udržovanou na (30 35) ± 1 C. 7 Vodní lázeň. 8 Vortex. 9 Mikroskop s imerzním objektivem (zvětšení 100 ). 10 Sterilní laboratorní sklo lahve s uzávěrem, odměrná baňka Erlenmeyerovy baňky, zkumavky, Petriho misky. 11 Automatické pipety s nastavitelnými objemy ( ) µl a špičky bez filtru. 12 Jednorázové plastové nebo sterilní skleněné hokejky. 13 Latexové rukavice bezpudrové, obalový materiál, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby. 5 Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně, tj. 1 h v sušárně při ( ) C nebo 15 min v autoklávu při (121 ± 1) C nebo chemicky (např. 70% etanol, Savo, apod.). 5 Postup 5.1 Příprava výchozího ředění Vzorky se připravují ve třech opakováních. Do Erlenmeyerových baněk se navažuje množství vzorku a přidává základní ředicí roztok (11) podle tabulky 1. Vzorek se základním ředicím roztokem (11) se promíchá a upraví se ph na hodnotu 7,3 8,1. Takto připravené vzorky se míchají 5 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Poté se nechají 30 min stát a nakonec se opět míchají 2 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Tímto postupem se získá základní ředění 10-1.

4 Národní referenční laboratoř Strana 4 Tabulka 1. Navážky vzorku a objemy základního ředicího roztoku (11). Druh krmiva Navážka Objem základního (g) ředicího roztoku (ml) Doplňková látka, premix 20 ± 0,1 180 ± 0,1 Doplňková látka ve formě mikrogranulí 2 ± 0,1 198 ± 0,1 Kompletní krmná směs 50 ± 0,5 450 ± 1 6 Suspenze obsahující probiotika mají tendenci po homogenizaci rychle sedimentovat. Tomu se zabrání rychlým pipetováním z řádně zhomogenizovaných vzorků. 5.2 Příprava ředicí řady Ředicí řada se přizpůsobuje předpokládanému obsahu kvasinek Saccharomyces cerevisiae ve vzorku. Připraví se ředicí řada zkumavek s 9 ml peptonu (12). Z připraveného základního ředění se napipetuje 1 ml do první zkumavky (získá se ředění 10-2 ). Dobře se promíchá na vortexu. Tento postup se opakuje pro další zkumavky ředicí řady. Na každé ředění se použije nová sterilní špička. 5.3 Inokulace a inkubace Pro inokulaci se vybírají dvě po sobě jdoucí ředění, a to od každého ředění dvě plotny. Do každé Petriho misky se pipetou přenese 1 ml vhodného ředění. Toto inokulum se zalije asi 15 ml agaru (13), který byl zchlazen na (48 ± 1) C. Promíchá se krouživým pohybem pětkrát doprava a pětkrát doleva a nechá se zatuhnout. Plotny se inkubují v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu 2 3 dny při teplotě (35 ± 1) C. 7 Pokud se použije komerčně dodaný chromogenní agar, postupuje se takto: Na zaschlý povrch Petriho misky se napipetuje 0,1 ml naředěné suspenze zvoleného ředění a sterilní hokejkou se suspenze rovnoměrně rozetře po celém povrchu. Plotny se nechají zaschnout. Plotny se inkubují v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu 3 5 dnů při teplotě (30 ± 1) C. 8 Doba mezi ukončením přípravy výchozí suspenze a zalitím inokula v Petriho miskách nesmí překročit 15 min.

5 Národní referenční laboratoř Strana 5 6 Počítání kolonií a vyjádření výsledku Pro výpočet se použijí misky, které obsahují nejvýše 300 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. U vybraných kolonií se provádí fenotypová charakteristika. Jedná se o kontrolu mikroskopické morfologie. Z části kolonie se připraví suspenze ve sterilním fyziologickém roztoku s obsahem 0,85 % chloridu sodného (14), překryje se krycím sklíčkem a použije se vhodné zvětšení za použití olejové imerze (17). Kvasinky jsou tvořeny velkými buňkami různého vzhledu a velikosti, mnohdy s projevy pučení. Kolonie jsou smetanově zbarvené a neprůhledné, mají nepravidelný tvar a jejich velikost kolísá od 1 mm do 6 mm. Ve spodní vrstvě agaru mohou narůst i kolonie Saccharomyces cerevisie ze spodního kvašení, které jsou smetanově zbarvené, neprůsvitné a mají nepravidelný tvar i okraje. 7 V případě použití komerčně dodaného chromogenního agaru jsou kolonie okrouhlé, konvexní nebo kuželovité, celokrajné, světle až sytě fialově zbarvené. Mají matný nebo lesklý povrch, jsou neprůhledné a jejich velikost kolísá od 1 mm do 3 mm. Celkový počet mikroorganismů na g vzorku se vypočte podle vztahu součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml, počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Výsledek se vyjádří jako celkový počet mikroorganismů na g nebo kg vzorku jako číslo 1,0 až 9,9 násobené 10 x, kde x je příslušná mocnina Literatura 1 ČSN EN 15789, Krmiva Izolace a stanovení počtu probiotických kvasinek, Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, 2010.