UTILIZATION OF OGU-INRA HYBRID SYSTEM IN WINTER RAPESEED BREEDING VYUŽITÍ HYBRIDNÍHO SYSTÉMU OGU-INRA PŘI ŠLECHTĚNÍ ŘEPKY OZIMÉ

Transkript

1 UTILIZATION OF OGU-INRA HYBRID SYSTEM IN WINTER RAPESEED BREEDING VYUŽITÍ HYBRIDNÍHO SYSTÉMU OGU-INRA PŘI ŠLECHTĚNÍ ŘEPKY OZIMÉ Koprna R. 1, Macháčková I. 2, Horáček J. 3, Ehrenbergerová J. 4 1 OSEVA PRO s.r.o., odštěpný závod Výzkumný ústav olejnin Opava, Purkyňova 10, Opava. 2 Selgen, a.s., Šlechtitelská stanice Chlumec nad Cidlinou, AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Zemědělská 1, Šumperk 4 Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno. 1 koprna@oseva.cz, 2 chlumec@selgen.cz, 3 horacek@agritec.cz, 4 ehren@mendelu.cz ABSTRACT Restorer lines of Ogu-INRA hybrid system with RfRf gene and low glucosinolates content in seed were selected. On the begining selection of the restorer lines were carried out according to GSL content. Following selection was aimed at restoring ability in F1 generation after pollination of sterile CMS component. Total 284 restorer lines were tested according their restoring ability. The 65 restorer lines (i.e %) with restoring ability above 90 % were founded. The 45 restorer lines (i.e %) had also GSL content below 18 µmol/g seed. Molecular method using of SCAR marker SG34 was optimallized and successfuly used for markering of Rf restorer gene. Check test evaluation on 50 random selected restorer plants confirmed accuracy of detection dominant Rf gene using these molecular marker. Because of impossibility for recognize dominant homozygous and heterozygous forms of the Rf gene using of fertility restoring test according to fertile flowers in F1 generation in addition to molecular methods is considered in future. Correlation coefficient r=0.24** between GSL content in restorer lines and their restoring ability in F1 generation were evaluated using of 284 lines and their progeny. Close connection between gene for high GSL content in restorer lines and Rf gene was confirmed. Finally the 7 restorer lines selected according to healthness and other convenient agronomical traits were used for creating the 196 experimental 3-lines Ogu-INRA hybrids. Key words: winter rapeseed, hybrid, Ogu-INRA, restorer, Rf gene, seed quality, glucosinolates, molecular markers

2 ÚVOD V hybridním šlechtění řepky olejné (Brassica napus L. conv. napus) se využívá heterozního efektu ve formě nárůstu výnosu semene, výnosu oleje, výšky rostlin, vitality a jistoty přezimování. Naopak na znaky jako obsah oleje, hmotnost tisíce semen, odolnost proti poléhání, rezistenci a obsah glukosinolátů heteroze vliv nemá (Paulmann, 1999). Heterozní efekt byl u řepky olejné prokázán mnoha studiemi (Röbbelen, 1985; Brandle, McVetty, 1989). Kudla (1996) uvádí průměrný heterozní efekt pro výnos semene v generaci F1 u řepky na úrovni 10%. Na základě výsledků Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského, reálná úroveň heterozního efektu u hybridů registrovaných v ČR se projevuje zvýšeným výnosem ve srovnání s liniovými odrůdami o 4 10%, z toho u systému Ogu- INRA o 4 9% (Zehnálek et al., ). Podíl hybridních odrůd řepky stoupl od hospodářského roku 1998/99, kdy se začali hybridní odrůdy u nás pěstovat na podíl 25,2 % v zásevu na rok 2006/07 (Baranyk, 2007). Od roku 2000 se sklizňové plochy řepky ozimé pohybují kolem hranice 300 tis. ha a nadále mírně stoupají. V současnosti jsou v Evropě nejvíce rozšířené hybridní systémy MSL (Mänlicher Sterilität Lembke) a CMS (Cytoplasmatic Male Sterility) Ogu-INRA. Výhodou systému Ogu- INRA oproti rozšířenému systému MSL je vysoká stabilita samčí sterility a relativně nízké náklady na výrobu osiva (Frauen et al., 2001). Naopak nevýhodou tohoto systému je nespolehlivá obnova fertility a problémy s obsahem GSL u obnovitele. Oba systémy mají omezenou genetickou bázi. Systém cytoplazmatické samčí sterility (CMS) vznikl fůzí protoplastů z ředkve japonské odrůdy Ogura do řepky ozimé (Pelletier et al., 1983, 1987). Hlavním cílem od 80tých let byla tvorba obnovitele fertility pro systém CMS Ogu-INRA (Pelletier et al., 1987). Tento systém je ovlivněn sterilní cytoplazmou (S), naopak pylově fertilní rostliny mají fertilní cytoplazmu (F). V případě obnovitele fertility dochází k interakci mezi geny obnovy fertility RfRf a sterilní cytoplazmou (S). V takovém případě je F1 generace fertilní Rfrf (S). Pokud dojde k opylení sterilní linie heterozygotním obnovitelem fertility Rfrf, resp. rfrf výsledkem je generace F1, která je z 50 % fertilní Rfrf (S) a z 50 % sterilní rfrf (S). Alelický pár v jádru F1 restaurovaného hybrida je pak heterozygotní Rfrf (S). Udržovatelem sterility je jakákoliv pěstovaná linie řepky, která po opylení sterilního komponentu má v generaci F1 vždy sterilní cytoplazmu (S) a tudíž neprodukuje pyl (Delourme et al., 1998). Negativním jevem při šlechtění Ogu-INRA hybridů je těsná vazba mezi genem restaurujícím fertilitu a genem pro vyšší obsah glukosinolátů (GSL) v semeni. Vysoký obsah GSL u linií obnovitele je způsoben přenosem genu obnovy fertility z ředkve Ogura do řepky (Delourme et al., 1998). První Ogu-INRA hybridy byly kompozitní, tj. do sterilního hybridu byl přidán určitý podíl opylovače. Nová generace Ogu-INRA hybridů je v F1 hybridní generaci plně fertilní, problémem však zůstává hraniční, resp. i nadlimitní obsah nežádoucích glukosinolátů (GSL) v semeni. Proto je dlouhodobým cílem tvorba dvounulových obnovitelů fertility s dobrými agronomickými vlastnostmi (Primard-Bisset et al., 2003). První hybridní odrůdy založené na systému Ogu-INRA registrované v České republice byly kompozitní, tj. osivo bylo tvořeno ze % pylově sterilním hybridním komponentem a z % opylovačem nejčastěji

3 výkonnou odrůdou. Těmito hybridy byly Synergy (1998) a Betty (1999) (Zehnálek, Holubář, 2000). Další vývojovou řadou byly u nás registrované 3-liniové hybridy Embleme (2002), jehož finální generace štěpí v poměru 1 : 1 na plně fertilní a sterilní, dále topcross hybrid Spirit (2003), jehož finální generace štěpí na cca 70% pylově fertilních rostlin a 30% pylově sterilních. Nejmladšími a z hlediska výnosu i stability opylení bez ohledu na průběh počasí nejdokonalejšími, jsou pylově fertilní (restaurované) hybridy Extra (2003), Executive (2004), Vectra (2004) (Zehnálek et al., 2005). V souvislosti s přerušením vazby mezi vysokým obsahem GSL a geny obnovy fertility se vyvíjely techniky za účelem efektivní selekce linií obnovitele nesoucích Rf gen. Využívány jsou izoenzymové a molekulární analýzy i fenotypové pozorování hybridní generace a její schopnosti produkovat pyl. Gen obnovy fertility Rf byl lokalizován v těsné vazbě alely Pgi-2 pocházející z ředkve (Delourme and Eber, 1992). Tyto vazba umožňuje využití molekulárních a izoenzymových technik při selekci linií obnovitele fertility. Selekce linií obnovitele pomocí izoenzymové metody u linií s velmi nízkým obsahem GSL je problematická, protože snižovánám GSL se ztrácí alela Pgi-2 (Bartkowiak-Broda et al., 2003). Ztráta Pgi-2 je zejména u žádoucích linií s nízkým obsahem GSL. Proto je problematická selekce linií obnovitele s dvounulovou kvalitou a homozygotním alelickým párem Rf. Při použití izoenzymové analýzy na detekci Pgi-2 bylo ve skupině materiálů s obsahem GSL do 18,8 µm/g semene detekováno jen 40,1% rostlin. Naproti tomu ve stejném souboru byl marker OPC 02 detekován u všech testovaných rostlin. Izoenzymová analýza Pgi-2 byla zavedena pro potřeby šlechtitelů i v České republice (Horáček and Ačanová, 2003). Jako využitelná metoda selekce linií obnovitele s nízkým obsahem GSL se jeví použití metody PCR-RAPD s využitím markeru OPC 02, který není závislý na obsahu GSL v semeni (Barkowiak-Broda et al., 2003). Nevýhodou RAPD markerů je jejich dominantní charakter, proto jimi není možné rozlišit heterozygotní Rfrf, resp. rfrf formy genu obnovy fertility od homozygotní RfRf. Jako nejlepší pro detekci linií obnovitele se jevil SCAR marker SG 34 (Horáček, 2007). Využití nových primerů a techniky PCR potvrdily Hu et al. (2007). Pro detekci linií obnovitele použili primery BnRFO-DL2R, BnRFO-AS2F, BnRFO-AS1 a BnRFO-AS2R. Další možností selekce linií obnovitele na základě fenotypového projevu RfRf genu v F1 generaci po nakřížení linie obnovitele na sterilní mateřský komponent je tzv. test obnovy fertility (Koprna and Macháčková, 2006). Ten využívá procentické kvantifikace fertilních a sterilních rostlin v F1 generaci po nakřížení linie nesoucí Rf gen na sterilní komponent. Hlavním problémem u linií obnovitele v posledních letech byl vysoký obsah antinutričních glukosinolátů (GSL). Ty patří mezi nejsledovanější antinutriční látky v řepkovém šrotu. Jsou to jsou rostlinné glykosidy, které v rostlině plní mimo jiné ochrannou funkci. Jejich rozkladné produkty (izothiokyanáty a 2-oxazolidinethion) mají fungicidní a antibakteriální účinky, čímž sice do určité míry rostlinu chrání, jsou ale škodlivé pro organismus konzumentů. Současný obsah GSL u odrůd registrovaných v ČR je kolem 8 20 µmol/g sušiny semene při 9 % vlhkosti a 46 % olejnatosti. Norma pro registraci odrůd je u nás v současnosti do 18 µmol/g sušiny semene při 9 % vlhkosti a 46 % olejnatosti. Obsah GSL je dán hlavně genotypem a

4 mezi odrůdami existují poměrně veliké rozdíly. Rücker and Röbbelen (1994) uvádějí koeficienty dědivost pro obsah glukosinolátů v semeni h2ns=0.87, resp. h2bs=0.95. Nízký obsah GSL je podle autorů podmíněn 4-5 recesivními geny s aditivním účinkem. MATERIÁL A METODIKA 1. Kontrola kvality semene Všechny izolované rostliny linií obnovitele fertility nesoucí Rf gen a F 1 hybridní rostliny u kterých byl proveden odečet fertility, byly analyzovány nedestrukční metodou NIRS (Near Infrared Spectroscopy) ve VÚRV v.v.i. - pracoviště Výzkumná stanice travních ekosystémů Jevíčko na obsah celkových glukosinolátů (GSL). Obsah GSL je uveden v µmol/g semene a standardizován na 9 % vlhkost. Vzorky byly měřeny na analyzéru Foss- NIRSystems 6500 při vlnové délce nm v krocích po 2 nm. Koeficient determinace je pro měření celkových GSL na přístroji NIRS R 2 =0,84 (Míka et al., 2003). Jako referenční metoda stanovení celkového obsahu GSL pro kalibraci NIRS, ale také pro měření vybraných linií obnovitelů fertility nesoucích Rf gen byla použita metoda kapalinové chromatografie (HPLC High Pressure Liquid Chromatography) - podle normy ISO na pracovišti OSEVA PRO s.r.o., VÚOl Opava. 2. Selekce linií obnovitele fertility 2.1. Selekce linií obnovitele fertility podle testu obnovy fertility Výchozí materiál Ogu-INRA hybridu nesoucí gen obnovy fertility Rf byl získán v roce Tento genový zdroj nesl heterozygotní alelický pár genu obnovy Rfrf a měl nadlimitní obsah GSL (31,07 µmol/g semene). Selekce linií obnovitelů fertility byla prováděna na pracovištích SELGEN a.s., ŠS Chlumec nad Cidlinou a OSEVA PRO s.r.o., o.z. Výzkumný ústav olejnin Opava. Do hodnocení byly použity sklizňové roky 2005, 2006 a 2007 z pracoviště Chlumec nad Cidlinou, dále roky 2004, 2006 a 2007 z pracoviště Opava. V letech byla selekce obnovitele zaměřena jen na kvalitu semene, tj. na obsah GSL. V prvním sklizňovém roce 2000 bylo samostatně izolováno 95 fertilních rostlin F 2 generace získaných samoopylením hybridního materiálu nesoucího alespoň jeden Rf gen. Tento hybridní materiál pocházející od firmy INRA (Francie) v rámci licenční smlouvy, byl vytvořen křížením mateřského komponentu se sterilní cytoplazmou (S) a obnovitelem fertility (RfRf). Proto jednotlivé rostliny v F 2 generaci štěpily ve formách Rfrf, resp. rfrf jako fertilní a rfrf jako sterilní. V roce 2001 bylo selekční kritérium na obsah GSL 13 µmol/g sušiny semene, roce 2002 a 2003 to bylo 15 µmol/g sušiny semene. Dalším selekčním kritériem kromě obsahu GSL v semeni byl fenotypový projev Rf genu. Ten u selektovaných rostlin způsobil produkci pylu na prašnících v době květu. Rostliny byly selektovány podle morfologie květu (obrázek č.1.): a) sterilní rostliny mají menší korunní plátky a zakrnělé prašníky bez pylových zrn

5 b) fertilní rostliny mají plně vyvinuté korunní plátky a prašníky produkují pyl Do roku 2003 byly selekce zaměřeny jen na izolaci rostlin produkujících pyl a stanovení obsahu GSL v semeni. Produkce osiva byla zabezpečena izolací rostliny během kvetení mikroperforovaným polypropylenovým sáčkem o rozměrech 65 x 35 cm. V roce 2003 byly poprvé nakříženy vybrané linie obnovitele nesoucí Rf gen na sterilní komponent tzv. tester. Jako tester byla použita linie A115, která byla vytvořena na pracovišti Chlumec nad Cidlinou metodu backcrossu výchozího novošlechtění B115 na sterilní CMS linii. Od roku 2003 byl tento tester BC5 A115 použit jako mateřský komponent pro zkoušku obnovy fertility otcovských linií nesoucích Rf gen. Po sklizni hybridního osiva vzniklého křížením otcovské linie obnovitele na sterilní CMS komponent nesoucí sterilní cytoplazmu (S), bylo toto osivo vyseto v následujícím roce do mikroparcel na ploše 3 m 2 a byl u nich proveden odečet všech fertilních a sterilních rostlin. Podle podílu fertilních a sterilních rostlin byla kvantifikována procentická schopnost obnovy fertility sledované linie obnovitele. Varianty s menším počtem rostlin v F 1 generaci než 10, byly vyloučeny z hodnocení. Po procentickém výpočtu fertilních rostlin v F 1 generaci bylo stanoveno selekční kritérium pro linie obnovitele fertility nad hranici 80 % obnovy. Stálým selekčním kritériem zůstal i obsah GSL pod 18 µmol/g semene při 9 % vlhkosti. Obrázek č.1: Sterilní květ CMS mateřské linie (vlevo) a plně fertilní květ obnovitele fertility, resp. udržovatele sterility (vpravo) 2.1.Selekce linií obnovitele fertility pomocí molekulárních markerů: Pro potřeby molekulární analýzy byl z mladých rostlin odebrán druhý pravý list. Izolace genomové DNA byla provedena pomocí afinitních kolon Invisorb Spin Plant Kit (Invitek). Získaná DNA byla použita jako templát při PCR. Sekvence specifických primerů pro marker SG34 typu SCAR byly získány z literatury (Primard-Brisset et al. 2005). Produkt PCR byl analyzován pomocí elektroforézy na agarozovém gelu (1,5% agaroza (Serva), TBE pufr), proužky byly vizualizovány pomocí ethidiumbromidu (Sigma) v UV-světle. Pro určení

6 velikosti fragmentu byl použit žebřík 100bp Ladder Plus (MBI Fermentas). Přítomnost proužku znamenala pylovou fertilitu, nepřítomnost proužku pak pylovou sterilitu. 3. Tvorba sterilních mateřských CMS linií a experimentálních 3-liniových hybridů Výchozí mateřská sterilní CMS linie z roku 1998 měla nadlimitní obsah GSL (34,73 µmol/g semene při 9 % vlhkosti podle HPLC). Základní metodou zlepšení kvality bylo 6 7 zpětných zpětných křížení s donory kvality. Zpětná křížení u 250 kombinací byla prováděna na pracovišti ŠS Chlumec nad Cidlinou. Kvalita rodičovských komponent byla každoročně kontrolována pomocí skríningové analýzy NIRS. Během šestiletého cyklu zpětných křížení bylo dvakrát provedeno kontrolní analytické měření kvality sterilních mateřských linií metodou HPLC. Kritériem pro konečný výběr perspektivních CMS linií byla kvalita semene, stabilní úroveň sterility a dobré agronomické vlastnosti. Tvorba experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů začala v roce 2006 křížením 28 výkonných udržovatelů sterility z pracovišť ŠS Chlumec nad Cidlinou a VÚOl Opava na CMS linii A115. Tyto kombinace byly vyprodukovány systémem setí dvou krajních řádků opylovač o délce 1,5 m a dvou řádků sterilní CMS linie umístěných uprostřed. Každá kombinace byla zaizolována izolátorem o velikosti 1,5 x 1,5 m a výšce 1,8 m. Po sklizni hybridního osiva byl v roce 2006 založen na obou pracovištích blok předstihového množení experimentálních hybridů v prostorové izolaci (obrázek č. 3.). V jednotlivých blocích rozdělených podle původu opylovačů došlo k opylení sterilních F 1 hybridů příslušnou linií obnovitele fertility. 4. Ověření korelace mezi obsahem GSL v semeni linií obnovitelů a jejich schopností obnovy fertility v F 1 generaci Po vyhodnocení obnovy fertility otcovských linií nesoucích Rf gen a analýze kvality semene byly ze sklizňových let 2004, 2005 a 2006 z pracoviště Chlumec nad Cidlinou, dále z let 2004, 2006 a 2007 z pracoviště Opava vypočteny korelační koeficienty mezi obsahem GSL v liniích obnovitele a jejich schopností obnovovat fertilitu v generaci F 1. Pro konečný výpočet korelačního koeficientu (r) bylo použito celkem 284 kombinací testovacího křížení linií obnovitelů na sterilní tester (linie A115). VÝSLEDKY A DISKUZE 1. Kontrola kvality semene V jednotlivých letech byly selektovány linie obnovitele fertility podle selekčních kritérií uvedených v tabulce č.1. Ze 166 rostlin bylo v roce 2001 selektováno na základě obsahu GSL v semeni 34 rostlin (20,48 %), v roce 2002 z 21 celkem bylo selektováno 9 rostlin (45 %) a v roce 2003 bylo ze 20 rostlin vybráno 8 (40 %). Současně bylo vybráno na základě kvality dalších 55 rostlin (76,37 %) z celkového počtu 76 rostlin F 2 generace, které vznikly samoopylením hybridních rostlin. V roce 2003 bylo vybráno na základě nízkého

7 obsahu GSL v semeni celkem 63 linií obnovitele fertility s obsahem GSL do 15 µmol/g semene určených na test obnovy fertility v následujícím roce. Průměrný obsah GSL ve skupině obnovitele fertility byl ve sledovaném období let od 16,17 do 19,23 µmol/g semene (tabulka č.2). V této skupině obnovitelů fertility nebyla do roku 2003 kontrolována jejich schopnost obnovovat fertilitu v F 1 generaci. Nejvyšší ohlas na selekci byl po roce 2001, kdy bylo vybráno jen 20,48 % rostlin na základě obsahu GSL. Po poklesu selekčního kritéria na obsah GSL v roce 2002 u potomstva v roce 2003 obsah GSL mírně stoupl. Nejvyšší nárůst obsahu GSL byl zaznamenám po selekci v roce 2003, kdy u potomstva analyzovaného v roce 2004 stoupl o 2,72 µmol/g semene. Tento nárůst koresponduje se závěry Rückera and Röbbelena (1994) o recesivním založení genů pro nízký obsah GSL v semeni řepky. Tabulka č.1: Počet rostlin (N), rok selekce, selekční kritérium, selekční rozdíl (S) a ohlas na selekci (R) ve sledované skupině obnovitelů fertility. N rodiče / rok N potomci / rok S (µmol GSL/g sem.) R (µmol GSL/g sem.) selekční kritérium (µmol GSL/g sem.) 166 / / ,463 1, / / ,661 0, / / ,610 2, Tabulka č.2.: Obsah glukosinolátů (GSL) v souboru obnovitelů fertility použitých pro selekci Rf genu rok N prům ěr min max rozptyl sm. odch. var.koef ,67 3,57 32,17 24,51 4,95 28, ,17 8,37 35,45 32,34 5,69 37, ,51 6,90 41,40 59,79 7,73 49, ,23 4,56 48,13 62,39 7,90 41, Selekce linií obnovitele fertility podle testu obnovy fertility Na základě testu obnovy fertility u hybridního potomstva bylo v letech získáno 80 linií obnovitele fertility se schopností obnovy nad 80 % z celkového počtu 284 testovaných linií na přítomnost Rf genu (graf č.1). Z tohoto počtu mělo 58 linií obnovitele (72,50 %) obsah GSL v pod hranicí 18 µmol/g semene. Z celkového počtu sledovaných linií obnovitele mělo 65 schopnost obnovy fertility v F 1 generaci nad 90 %, z toho 45 linií (69,23 %) mělo obsah GSL v semeni pod stanovenou hranici 18 µmol/g semene. Po ověření kvality a schopnosti obnovy fertility nad 95 % v F 1 generaci bylo vybráno 7 linií obnovitelů fertility pro zásev množitelské plochy experimentálních Ogu-INRA hybridů v roce Obsah GSL je u vybraných linií obnovitelů od 9,81 do 17,60 µmol/g semene (podle HPLC). Vyšší výskyt linií obnovitelů nesoucích Rf gen, kteří obnovují fertilitu od 40 do 60 % v generaci F 1 (32,39 % výskytu) a linií obnovujících fertilitu nad 90 % (22,89 % výskytu) pravděpodobně potvrzuje údaje Delourme et al. (1998) o principu obnovy fertility u systému Ogu-INRA. Její úroveň závisí podle toho, zda-li má otcovský komponent geny obnovy fertility v heterozygotní formě Rfrf, resp. frrf, nebo v homozygotní dominantní formě RfRf.

8 Linie nesoucí homozygotní formu genu obnovy RfRf jsou pravděpodobně schopni obnovovat fertilitu nad hranici 90 % v generaci F 1. Graf č.1: Celkový počet linií obnovitele fertility podle schopnosti obnovovat fertilitu v F1 generaci počet linií obnovitele % obnovy fertility v F1 generaci 2.2. Selekce linií obnovitele fertility pomocí molekulárních markerů: Rutinnímu využití markeru SG34 pro selekce linií obnovitele fertility předcházelo rozsáhlé hledání a testování různých typů markerů. Po opuštění techniky využívající isoenzymových markerů PGI bylo otestováno 60 RAPD markerů, z nichž některé byly schopné odlišit pylově sterilní a pylově fertilní rostliny řepky. Nevýhodou RAPD markerů však byla malá reprodukovatelnost analýz a komplikovaná spektra proužků. Proto byly vybrány nejvhodnější RAPD markery a převedeny do formy markerů typu SCAR (Horáček 2007). Tyto jsou již poměrně robustní a výsledkem analýzy je pouze jediný proužek. Nově vyvinuté SCAR markery byly porovnány s markery získanými z literatury (Primard-Brisset et al. 2005). Jako nejvhodnější byl vybrán marker SG34 (obrázek č.2). Pomocí markeru SG34 bylo analyzováno 5 genotypů řepky, každý genotyp po 10 vzorcích. Rostliny byly poté dopěstovány do fáze květu. Byla ověřena 100% korelace mezi výsledky molekulárních analýz a pylovou fertilitou/sterilitou jednotlivých rostlin.

9 Obrázek č.2: Analýza SCAR markeru genu Rfo (marker SG34). Přítomnost proužku znamená fertilní kombinaci alel (RfoRfo nebo Rforfo), nepřítomnost proužku pak pylovou sterilitu (rforfo). 3. Tvorba sterilních mateřských CMS linií a experimentálních 3-liniových hybridů Po sklizni 28 kombinací F 1 sterilních Ogu-INRA hybridů v roce 2005 byly tyto následně zasety v roce 2006 do bloku předstihového množení s vybranými 7 liniemi obnovitelů fertility (obrázek č.3.). Sklizené osivo všech kombinací bylo sklizeno v roce 2007 a ve stejném roce zaseto ve 2 opakováních na 2 pokusných lokalitách do bloku zkoušek užitné hodnoty s kontrolními hybridy Sitro a Baldur. Vzniklo tak celkem 196 kombinací experimentálních Ogu-INRA hybridů. Obrázek č.3: Schéma množení experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů v roce 2006/07 CMS č.1. CMS č.2. CMS č.3. CMS č.4. CMS č.5. CMS č.6. CMS č.7. CMS č.8. CMS č.9. CMS č.10. CMS č.11. CMS č.12. CMS č.13. CMS č.14. CMS č.28. CMS č.27. CMS č.26. CMS č.25. CMS č.24. CMS č.23. CMS č.22. CMS č.21. CMS č.20. CMS č.19. CMS č.18. CMS č.17. CMS č.16. CMS č.15. CMS č.1. CMS č.2. CMS č.3. CMS č.4. CMS č.5. CMS č.6. CMS č.7. CMS č.8. CMS č.9. CMS č.10. CMS č.11. CMS č.12. CMS č.13. CMS č.14. CMS č.28. CMS č.27. CMS č.26. CMS č.25. CMS č.24. CMS č.23. CMS č.22. CMS č.21. CMS č.20. CMS č.19. CMS č.18. CMS č.17. CMS č.16. CMS č.15.

10 4. Ověření korelace mezi obsahem GSL v semeni linií obnovitelů a jejich schopností obnovy fertility v F 1 generaci U celkového počtu 284 linií obnovitele fertility byly vypočteny korelační koeficienty mezi jejich obsahem GSL a schopností obnovovat fertilitu v F 1 generaci (graf č.2., tabulka č.3.). Ve 4 souborech pozorování byly zjištěny korelační koeficienty r=0,15 až r=0,53**. Průměrná hodnota korelačního koeficientu za celý sledovaný soubor (r=0,23**) potvrzuje údaje Delourme and Ebera (1992) a Delourme et al. (1998) o vazbě genu obnovy fertility s vyšším obsahem GSL v semeni. I přes tuto vazbu se však podařilo nalézt linie obnovitele fertility s vysokou úrovní obnovy v F 1 generaci a podlimitním obsahem GSL. Tabulka č.3: Charakteristika materiálů použitých pro výpočet korelačního koeficientu mezi obsahem GSL obnovitelů a jejich schopností obnovy fertility v generaci F1 schopnost obnovy fertility v F1 generaci (%) obsan GSL v semeni linií obnovitele (mikromoly /g sem.) korelace mezi obsahem GSL obnovitele a scopností obnovovat rok, lokalita N průměr min max průměr min max ferilitu v F1 2004, Opava 64 53,01 16, ,10 5,33 32,15 0,48** 2006, Opava 43 68,24 3, ,59 8,51 36,54 0,22** 2007, Opava 45 60, ,61 0,37 22,54 0, , Chlumec 36 58, ,1 3,27 38,66 0,59** 2006, Chlumec 39 58,31 1,56 98,4 13,08 0,58 35,61 0,54** 2007, Chlumec 57 59, ,00 2,18 23,71 0,02 Celkem , ,69 0,37 38,66 0,24** Graf č.2: Závislost obsahu GSL u linií obnovitele a jejich schopnosti obnovy fertility v F1 generaci Obsah GSL u linií obnovitelů fertility y = 0,0536x + 11, % obnovy fertility v F1 generaci

11 ZÁVĚR Pomocí postupné selekce na nízký obsah glukosinolátů (GSL) a později na schopnost obnovovat fertilitu v F 1 generaci po opylení sterilního CMS testera, se podařilo nalézt celkem linie obnovitele fertility s RfRf genem a dobrou kvalitou semene. Celkový počet testovaných linií na schopnost obnovy fertility byl 284. Z tohoto bylo vybráno 65 linií obnovitelů (22,89 %), kteří v F 1 generaci restaurovali fertilitu nad 90 %, z toho 45 linií obnovitelů (15,84 %) mělo současně i obsah GSL v semeni pod 18 µmol/g semene. Podařilo se optimalizovat metodu molekulárního markerování Rf genu obnovy fertility s použitím SCAR markeru SG34. Kontrolní hodnocení na 50 náhodně vybraných rostlinách potvrdilo 100 % detekci dominantního Rf genu. Z důvodu problematickém odlišení homozygotního (RfRf) a heterozygotního (Rfrf) alelického páru nesoucího Rf gen, se však nadále uvažuje o využití klasické metody selekce obnovitelů pomocí kontroly fertility v F 1 generaci v kombinaci s technikou molekulárního markerování. Po analýze kvality 284 linií obnovitelů a jejich schopnosti obnovy fertility v F 1 generaci po nakřížení na sterilní tester A115, byla korelačním koeficientem r=0,24** potvrzena vazba mezi geny pro vysoký obsah GSL v semeni obnovitelů a Rf genem pro obnovu fertility. Na základě zdravotního stavu a dalších agronomických vlastností bylo nakonec vybráno 7 linií obnovitelů fertility pro tvorbu 196 experimentálních 3-liniových Ogu-INRA hybridů. Publikované výsledky vznikly za finanční podpory projektu MZe ČR NAZV, projekt č. 1G46061 Využití inovovaných metod a specifických šlechtitelských materiálů pro zvýšení efektivnosti tvorby nových odrůd ozimé řepky. LITERATURA Baranyk P. (2007): Stanovisko k odrůdové skladbě řepky pro rok 2007/08. SPZO Praha, ISBN Bartkowiak-Broda I., Poplawska W., Furguth A. (2003). Characteristic of winter rapeseed double low restorer lines for cms ogura system. In: Proceedings from the 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, 6-10th July, 2003, Brandle J.E., McVetty P.B.E. (1989): Heterosis and combining ability in hybrids derived from oilseed rape cultivars and inbred lines. Crop Science, 29: Delourme R., Foisset N., Horvais R. Barret P., Champagne G., Cheung W.Y., Landry B.S., Renard M. (1998): Characterisation of the radish introgression carrying the Rfo restorer gene from the Ogu-INRA cytoplasmatic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet. 97: Delourme R., Eber F. (1992): Linkage between an isosyme marker and a restorer gene in radish cytoplasmatic male sterility of rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet., 85., Frauen M., Winkelmann H.E., Baer A., Brauer D. (2001): Hybridní odrůdy ozimé řepky: současný stav a budoucnost. Sborník, Seminář Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin , Hluk, sborník s

12 Horáček J. (2007): Isozyme and DNA markers of male fertility restorer gene in the rape. Sborník abstraktů 7th International Symposium in the Series Recent advances in plant biotechnology, pp. 89, Stará Lesná. Horáček J., Ačanová M. (2003). Glucose-6-phosphate Isomerase as a marker of Fertility Restorer Gene in Rape. Czech J. Genet. Plant Breed., 39, 2003 (4): Hu X., Sullivan-Gilbert M., Kubik T, Danielson J, Hnatiuk N., Marchione W., Gupta M., Armstrong K., Thompson S. (2007): Development of moleculat markers specific to Ogura fertility restorer gene Rfo in canola (Brassica napus L.). In: Proceedings, The 12th International Rapeseed Congress, Vol.II., , Wuhan, China, Koprna R., Macháčková I. (2006): Aktuální výsledky šlechtění hybridů ozimé řepky na bázi systému Ogu-INRA. Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění a ochraně rostlin, Sborník referátů z konference, Brno ,str ISBN Kudla M. (1996): General combining ability of inbred lines and heterosis effect of winter oilseed rape F1 and F2 hybrids. In: Rośliny Oleiste, 1996, 17:1, Míka V., Tillmann P., Koprna R., Nerušil P., Kučera V. (2003) Fast prediction of quality in whole seeds of oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Soil Environ., 49, (4): Paulmann W. (1999): Pokrok ve šlechtění hybridní řepky a pěstování MSL hybridních odrůd. Sborník, Seminář Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin , Hluk, sborník s Pelletier G., Primard C., Vedel F., Chétrit P., Renard M., Delourme R. (1987). Molecular, phenotypic and genetic characterization of mitochondrial recombinants in rapeseed. Proceedings from 7th International Rapeseed Congress, Vol.I., Poznań, 1987, Pelletier G., Primard C., Vedel F., Chetrit P., Remy R., Rouselle P., Renard M. (1983): Intergeneric cytoplasmatic hybridization in Cruciferae by protoplast fusion. Mol. Genet. 191: Primard-Brisset C., Poupard J.P., Horvais R., Budar F., Pelletier G., Rennard M., Delourme R. (2003). A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed. In: Proceedings from the 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, 6-10th July, 2003, Primard-Brisset C., Poupard P., Horvais R., Eber F., Pelletier G., Renard M., Delourme R., (2005). In: Theor.Appl.Genet 111: Renard M., Delourme R., Valleé P., Pierre J. (1997): Hybrid rapeseed breeding and production. Proceedings of the International Symposium on Brassicas. Rennes, France, 23-27th Sept. 1997, Röbbelen G. (1985): Züchtung von Hybridraps. Bericht der Arbeitstagung Saatzuchtleiter, Gumpenstein, Rücker R., Röbbelen G. (1994): Inheritance of total and individual glucosinolate contents in seeds of winter oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Breed.., 1994, 113:3, Zehnálek P., Holubář J. (2000): Přehled odrůd olejnin a kmínu ÚKZÚZ Brno, ISBN Zehnálek P., Holubář J. (2004): Přehled odrůd olejnin a kmínu ÚKZÚZ Brno, ISBN

13 Zehnálek P., Holubář J., Mezlík T. (2005): Přehled odrůd olejnin a kmínu ÚKZÚZ Brno, ISBN Zehnálek P., Holubář J., Mezlík T. (2006): Seznam doporučených odrůd 2006: Řepka olejka. ÚKZÚZ Brno, ISBN