ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů katedra ochrany rostlin

Transkript

1 ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů katedra ochrany rostlin Interakce mezi Cydia pomonella granulovirus (CpGV) a jeho hostitelem obalečem jablečným disertační práce Autor: Ing. Tereza Zichová Školitel: Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CSc. Konzultant: Ing. Jiban Kumar Kundu, Ph.D., VÚRV, v.v.i. Ing. Jitka Stará, Ph.D., VÚRV, v.v.i. Praha

2 Prohlašuji, ţe jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškerou literaturu a ostatní prameny, z nich jsem při přípravě práce čerpala, řádně cituji a uvádím v seznamu pouţité literatury. Datum a podpis 1

3 Poděkování Děkuji vedoucímu disertační práce doc. Ing. Pavlu Ryšánkovi, CSc. a konzultantům Ing. Jibanu Kumar Kundu, Ph.D. a Ing. Jitce Staré, Ph.D. za vedení práce a podnětné připomínky. Dále bych chtěla poděkovat dr. Johannesovi A. Jehle za laskavé poskytnutí izolátů CpGV, cenné rady, vlídné zacházení a celému jeho týmu, jmenovitě dr. Sabine Asser-Kaiser, Stefanie Schulze-Bopp, dr. Karolin A. Eberle a Britta Wahl-Ermels za seznámení s metodikou biologických testů a dále kolegům z JKI institutu v Darmstadtu jmenovitě dr. Jürg Huber, dr. Annegret Schmitt, dr. Eva Fritsch a dr. Karin Undorf-Spahn za cenné rady k problematice odchovu přírodní populace obaleče jablečného. Za poskytnutí dvou nových preparátů na bázi CpGV bych chtěla poděkovat také švýcarské firmě Andermatt biocontrol. Za pomoc při sběru vzorků a udrţování chovu obaleče jablečného bych chtěla poděkovat především Ireně Kubečkové a Lence Slámové a děkuji také všem kolegům z VÚRV za vytvoření příjemných podmínek pro práci. Poděkování patří také mé rodině a partnerovi za bezmeznou podporu. Práce byla řešena za finanční podpory grantů Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. v Praze Ruzyni: výzkumný záměr MZe ČR Systémy ochrany rostlin a skladovaných produktů před škodlivými organismy zajišťující zdravotní nezávadnost a kvalitu rostlinných produktů a neohroţující ţivotní prostředí; NAZV 1G Inovace ochrany jádrovin vůči škůdcům v systému integrované produkce a v organickém zemědělství; a za finanční podpory grantů České zemědělské univerzity v Praze: MSM Setrvalé zemědělství, kvalita zemědělské produkce, krajinné a přírodní zdroje; GA FAPPZ 21180/1312/ Citlivost populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k biopreparátům na bázi Cydia pomonella granulovirus; GA FAPPZ 21180/1312/ Citlivost přírodních populací obaleče jablečného (Cydia pomonella) k Cydia pomonella granulovirus (izolát CpGV-M); a FRVŠ G Molekulární diagnostika bakuloviru Cydia pomonella granulovirus a vyuţití bakulovirů v biologické ochraně proti hmyzím škůdcům. 2

4 Obsah Obsah... 3 Seznam zkratek a symbolů Úvod Literární přehled Entomopatogenní viry vyuţitelné v ochraně proti hmyzím škůdcům Bakuloviry Historie bakulovirů Morfologie bakulovirů Systém bakulovirů Exprese časných a pozdních genů a geny významné pro manipulace viru s hostitelem Metody detekce bakulovirů Hostitelský okruh bakulovirů a jejich názvosloví Přípravky na bázi bakulovirů Rekombinantní bakuloviry Masová produkce bakulovirů pro přípravu biopreparátů Formulace a aplikace bakulovirů Cydia pomonella granulovirus původce granulózy obaleče jablečného Charakteristika CpGV Infekční cyklus CpGV Hostitelský okruh CpGV Obaleč jablečný nejvýznamnější hostitel CpGV Popis obaleče jablečného Ţivotní cyklus obaleče jablečného Škodlivost obaleče jablečného a moţnosti biologické ochrany Interakce mezi CpGV a jeho hostitelem obalečem jablečným Přenos CpGV Transpozony v CpGV Citlivost obaleče jablečného k CpGV - laboratorní hodnocení Rezistence obaleče jablečného k CpGV Cíle práce Cíl I: Porovnání vlivu pouţité diety a metody aplikace na účinnost CpGV Metodika Zdroj obaleče jablečného Zdroj CpGV Kvantifikace CpGV pro biologické testy Příprava umělých diet obsahujících CpGV Příprava umělých diet s povrchovou aplikací CpGV

5 4.1.6 Testování vlivu sloţení diety a metody aplikace CpGV na mortalitu v biologickém testu Testování vlivu sloţení diety na vývoj obaleče jablečného Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Výsledky Mortalita na dietách obsahujících CpGV Mortalita na dietách povrchově ošetřených CpGV Vývoj obaleče jablečného na různých dietách Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Diskuze Cíl II: Biologické testy citlivosti obaleče jablečného k CpGV Metodika Zdroje obaleče jablečného Zdroj CpGV Testování citlivosti obaleče jablečného k CpGV Statistické vyhodnocení Původ populací testovaných v roce Původ populací testovaných v roce Výsledky Citlivost laboratorního kmene CpKrym k CpGV Citlivost polních populací obaleče jablečného k CpGV Statistické porovnání mortality VBII a kříţenců VBII xcpkrym Diskuze Cíl III: Účinnost nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného Metodika Zaloţení rezistentního kmene obaleče jablečného Ověření zaloţení rezistence CpR-CZ k CpGV-M Zdroj obaleče jablečného Zdroj CpGV Biologický test účinnosti nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného Výsledky Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného Ověření zaloţení rezistence u CpR-CZ Purifikované izoláty Formulované přípravky Diskuze Cíl IV: Detekce CpGV Metodika

6 7.1.1 Metody izolace nukleové kyseliny pro detekci CpGV v hostiteli Detekce CpGV Výsledky Izolace NK PCR a RT-PCR detekce CpGV Diskuze Závěr Literatura Publikační aktivita autorky Seznam publikací souvisejících s disertační prací Seznam ostatních publikací Přílohy... I A Semisyntetické diety pro vývoj obaleče jablečného... I A.1 Umělá dieta pro laboratorní chov obaleče jablečného v České republice... I A.2 Umělá dieta podle Ivaldi-Sender (1974) pro laboratorní chov v Německu... I A.3 Umělá dieta podle Guennelon a kol. (1981)... II B Pufry a chemikálie pro molekulární biologii... II B.1 0,5 M EDTA (ph 8,0)... II B.2 50x TAE pufr (zásobní roztok)... II B.3 10x ficoll nanášecí pufr... III B.4 Pouţívané komerční kity a chemikálie... III C Biologické testy... IV C.1 Tabulka pro kvantifikaci purifikovaného izolátu viru před biologickým testem... IV C.2 Tabulka pro hodnocení biologického testu v různých termínech... V D Rozměrné tabulky, obrázky a schémata... VI D.1 Přehled virů bezobratlých... VI D.2 Seznam preparátů na bázi bakulovirů pouţitelných v ochraně rostlin... VII D.3 Genom CpGV (Luque a kol., 2001)... XII D.4 Fotografie okluzních tělísek (OB) z rastrovacího mokroskopu (J. T. Wennmann, JKI Darmstadt)... XIII 5

7 Seznam zkratek a symbolů obecné zkratky pouţité v textu BV sekundární forma částice (budded virus) bdh 2 O dvakrát destilovaná voda bp pár bází (base pair) cdna komplementární deoxyribonukleová kyselina COI cytochromoxidáza podjednotka 1 DEPC diethyl pyrokarbonát DNA deoxyribonukleová kyselina EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová ELISA imunosorpční enzymové stanovení (enzyme-linked immunosorbent assay) F1 první filiální generace = první generace potomků GMO geneticky modifikovaný organismus GV granulovirus h hodina ha hektar kbp kilopár bází (kilo base pair) l litr LC 50 LD 50 min MNPV mrna mtdna NPV OB ODV ORF PCR RFLP RIA RT-PCR RNA střední letální koncentrace (median lethal concentration) střední letální dávka (median lethal dose) minuta multiple nucleopolyhedrovirus mediátorová ribonukleová kyselina mitochondriální deoxyribonukleová kyselina nucleopolyhedrovirus okluzní tělísko (occlusion body) primární forma částice (occlusion derived virus) otevřený čtecí rámec (open reading frame) polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism) imunochemické stanovení vyuţívající značení antigenu či protilátky radionuklidem (radioimmunoassay) PCR s reverzní transkripcí ribonukleová kyselina 6

8 SD SNPV SNP ST 50 TAE výběrová směrodatná odchylka (standard deviation) single nucleoplyhedrovirus jednonukleotidový polymorfismus (Single Nucleotide Polymorphism) střední letální čas (median lethal time) Tris-acetát-EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová Zkratky organizací DLR Rheinpfalz ICTV JKI SISPO SRS Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz Mezinárodní komise pro klasifikaci virů (International Committee of Taxonomy of Viruses) Julius Kühn-Institut Svaz pro integrované systémy pěstování ovoce Státní rostlinolékařská zpráva zkratky názvů bakulovirů pouţitých v textu AcMNPV Autographa californica MNPV AdorGV Adoxophyes orana GV AgMNPV Anticarsia gemmatalis MNPV AgseNPV Agrotis segetum NPV BmNPV Bombyx mori NPV CrleGV Cryptophlebia leucotreta GV CpGV Cydia pomonella GV CuniNPV Culex nigripalpus NPV GmNPV Galleria mellonella NPV HaSNPV Helicoverpa armigera SNPV HzSNPV Helicoverpa zea SNPV MabrNPV Mamestra brassicae NPV OpMNPV Orgyia peudotsugata MNPV PiGV Plodia interpunctella GV PlxyNPV Plutella xylostella NPV RoNPV Rachiplusia ou NPV SeMNPV Spodoptera exigua MNPV 7

9 1 Úvod V současné době stoupá ve vyspělých zemích zájem veřejnosti o původ a kvalitu potravin. Přestoţe je pro spotřebitele významným kritériem cena potravin, lidé se stále více ptají také na jejich původ, bezpečnost a nezávadnost. Produkce ovoce v ČR se od 90. let 20. století postupně odklání od konvenční, intenzivní produkce, která je zaloţena na pouţívání chemických prostředků na ochranu rostlin a umělých hnojiv. Spolu s tímto systémem produkce se zvyšuje znečištění ţivotního prostředí, sniţuje se diverzita uţitečných organismů v sadech, opakované pouţívání stejných účinných látek pesticidů vede k selekci rezistentních populací škodlivých organismů a také se ve sklízených plodech mohou vyskytovat rezidua pesticidních látek. Novými směry pro pěstování ovoce se staly systémy integrované a organické (ekologické) produkce ovoce, u kterých je kladen důraz na ochranu ţivotního prostředí a zdraví spotřebitele. Oba systémy produkce ovoce vyuţívají k ochraně před škodlivými organismy účinných biopreparátů, které nezanechávají rezidua v plodech, jsou selektivní a šetrné k ţivotnímu prostředí. Virus granulózy obaleče jablečného (Cydia pomonella granulovirus - CpGV) je základním bioagens vyuţitelným v ochraně proti obaleči jablečnému (Cydia pomonella, L. 1758). Zatímco ve světě je tento preparát vyuţíván desítky let, v ČR probíhaly po mnoho let registrační pokusy, které byly v roce 2010 zakončeny zařazením dvou preparátů na bázi CpGV: Madex (Andermatt Biocontrol, Švýcarsko) a Carpovirusine (Arysta Lifescience, Francie) do registru přípravků na ochranu rostlin vydávaného Státní rostlinolékařskou správou (SRS). Tím došlo k rozšíření spektra účinných látek pouţívaných v sadech se systémem integrované produkce ovoce a produkce určené pro zpracování na dětskou výţivu, která má velmi přísné limity pro obsah reziduí pesticidů. Pro ekologické pěstitele je CpGV základním přípravkem, který mohou proti obaleči jablečnému vyuţít. Cílem disertační práce bylo studovat v laboratorních podmínkách vzájemné vztahy mezi virem a hostitelem na úrovni biologických testů, ve kterých byly porovnány dvě metody aplikace viru pro testování účinnosti různých izolátů CpGV, vliv pouţité diety na tyto pokusy a také porovnání citlivosti přírodních populací škůdce k CpGV. Vztahy zkoumané na molekulární úrovni představují různé přístupy detekce CpGV. Disertační práce pojednává také o současné problematice související s výskytem lokálních populací obaleče jablečného rezistentních k CpGV a předkládá výsledky monitoringu citlivosti vybraných populací obaleče jablečného k CpGV s vyuţitím metod, které byly převzaty z renomovaných zahraničních pracovišť v Německu (DLR Rheinpfalz, Neustadt a. d. W; JKI, Darmstadt). 8

10 Výsledky práce zabývající se monitoringem rezistence k CpGV přispějí k výběru vhodné antirezistentní strategie při dlouhodobém pouţívání biopreparátů na bázi CpGV. V roce 2009 byly první informace o potenciální selekci rezistentních populací škůdce k CpGV zpracovány do metodiky pro praxi a předány členům Svazu pro integrované systémy pěstování ovoce (SISPO) a pěstitelům v reţimu organické produkce. Práce navazuje na výzkum, který byl zaměřen na vyuţití viru granulózy obaleče jablečného v ochraně sadů proti obaleči jablečnému, metody pro hodnocení kvality biopreparátů na bázi CpGV a určení optimálních termínů jejich aplikace (Stará, 2002). 9

11 2 Literární přehled 2.1 Entomopatogenní viry vyuţitelné v ochraně proti hmyzím škůdcům Doposud bylo izolováno více neţ 700 druhů entomopatogenních virů. Tyto viry lze charakterizovat jako obligátní intracelulární infekční agens, které nenapadají buňky obratlovců ani rostlin (Khachatourians, 2009). Viry napadající hmyz patří do skupiny DNA i RNA virů (příloha D.1). Některé čeledi těchto virů napadají výhradně bezobratlé, zatímco jiné čeledi zahrnují i rody patogenní pro obratlovce či rostliny (Hunter-Fujita, 1998). Pro ochranu rostlin před hmyzími škůdci jsou v současné době vhodné pouze DNA viry z čeledi Baculoviridae - bakuloviry (Miller, 1997; Moscardi, 1999). 2.2 Bakuloviry Zástupci této čeledi jsou patogenní pro tři řády hmyzu, především pro motýly (Lepidoptera), ale také pro blanokřídlé (Hymenoptera) a dvoukřídlé (Diptera). Dříve byly do bakulovirů řazeny i viry napadající zástupce dalších skupin členovců (korýši, brouci, chrostíci, rovnokřídlí), ale tyto viry byly později zařazeny do jiných skupin (Jehle a kol., 2006a; Rohrmann, 2008). Do dnešní doby bylo popsáno více neţ 600 druhů bakulovirů (Szewczyk a kol., 2006) a více neţ 90 % z nich infikuje zástupce 34 čeledí motýlů (Lange a kol., 2004). Viry představují vhodnou alternativu chemickým insekticidům, které mají nepříznivý vliv na ţivotní prostředí a mohou zanechávat v produkci škodlivá rezidua. Povětšinou jsou bakuloviry vysoce selektivní a lze je také vyuţít při antirezistentních strategiích tam, kde se selektovaly populace škůdce rezistentní k chemickým insekticidům. Bakuloviry jsou poměrně rozmanitou skupinou virů hmyzu, jejichţ genom je tvořen dvouřetězcovou kruhovou DNA sbalenou do kapsidy tyčinkovitého tvaru (Miller, 1997; Theilmann a kol., 2005; Rohrmann, 2008). Jsou hostitelsky specifické, nemají škodlivý vliv na ţivotní prostředí a nepředstavují ţádné riziko pro člověka ani necílové druhy ţivočichů (Black a kol., 1997; Szewczyk a kol., 2006). Další výhodou této skupiny virů je stabilita částic chráněných okluzním tělískem, která umoţňuje aplikovat virové preparáty běţnými postřikovači (Bulach a kol., 1999) Historie bakulovirů První záznamy o bakulovirech pochází z dob, kdy se v Číně začalo produkovat hedvábí, tedy před více neţ 5000 lety. Tehdy vznikly i první popisy onemocnění bource morušového (Bombyx mori) bakulovirem Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV). Popis zahrnoval paralýzu housenek a pozdější rozpad těla housenky umoţňující další šíření 10

12 onemocnění (Kalmakoff a Ward, 2003; Rohrmann, 2008). Pro toto onemocnění bource morušového se ve dvacátých letech 19. století pouţíval název grasserie (Jehle, 2009), dnes je pouţíván obecnější název polyedrie (Kalmakoff a Ward, 2003). V roce 1925 popsal francouzský entomopatolog André Paillot virové onemocnění u housenek běláska zelného (Pieris brassicae), které připomínalo polyedrii bource morušového, avšak v infikovaných tkáních se vyskytovaly neznámé granule. Paillot toto onemocnění nazval pseudo-grasserie (Jehle, 2009). V roce 1947 popsal Steinhaus podobné onemocnění u Peridroma margaritosa (nyní Peridroma saucia). Granule o velikosti 0,4-0,6 μm, které nalezl v tukovém tělesu a dalších tkáních, připomínaly granule popsané Paillotem (Steinhaus, 1947). V roce 1949 nazval onemocnění granulózou a tuto skupinu virů pojmenoval granuloviry (Jehle, 2009). V této době byly také prvně popsány tyčinkovité viriony uzavřené do sekundárního proteinového obalu (okluzního tělíska). Tvar virionů dal později vzniknout názevu čeledi Baculoviridae [baculum = tyčinka] (Rohrmann, 2008). Protoţe jsou okluzní tělíska (polyedra/granule) stabilní i bez přítomnosti hostitele, začalo se uvaţovat o moţnostech vyuţití bakulovirů v ochraně rostlin proti hmyzím škůdcům s technikou aplikace jako u konvenčních insekticidů (Bulach a kol., 1999). V roce 1975 byl registrován první bakulovirový preparát Elcar na bázi Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus (HzSNPV). Tento preparát se v roce 1984 přestal vyrábět, protoţe se infekce rozvíjela pomalu a také byly k dispozici nové chemické přípravky na bázi syntetických pyretroidů. Ovšem v průběhu 90. let vzrostla poptávka po organicky pěstovaných plodinách a také došlo k selekci rezistentních populací šedavky kukuřičné (Helicoverpa zea) k mnoha insekticidům včetně pyretroidů, a tak se začal preparát znovu vyrábět, tentokrát pod obchodním názvem GemStar (Moscardi, 1999; Szewczyk a kol., 2006). V roce 1976 se podařilo registrovat další biopreparát TM BioControl-1 na bázi Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) proti bekyni Orgyia pseudotsugata (Szewczyk a kol., 2006). Tento úspěch vedl k dalšímu podrobnému studiu bakulovirů a k vývoji nových biopesticidů na bázi bakulovirů. V současné době jsou bakuloviry vyuţívány také v biomedicíně jako vhodný expresní vektor cizorodých eukaryotních genů (Kalmakoff a Ward, 2003) a studují se moţnosti genetických modifikací bakulovirů pro zvýšení jejich pesticidního účinku (Inceoglu a kol., 2001). 11

13 2.2.2 Morfologie bakulovirů Genom bakulovirů (příloha D.3) je sloţen z Kbp a kóduje 90 aţ 180 genů (Jehle a kol., 2006a, Rohrmann, 2008). Konce mnoha genů bakulovirů se překrývají a kódují v obou směrech, coţ je umoţněno otevřenými čtecími rámci (open reading frame - ORF) (Kalmakoff a Ward, 2003). Genom je sbalen do nukleokapsidy tyčinkovitého tvaru o velikosti nm x nm (Jehle a kol, 2006a). Bakuloviry mají obvykle dva typy částic, které mají různou funkci v infekčním cyklu (Jehle a kol., 2006a). První typ částice occlusion derived virus (ODV) slouţí jako infekční virion, který vyvolá primární infekci hostitele v buňkách středního střeva a druhý typ, budded virus (BV) pučí z napadených buněk a šíří infekci do dalšch buněk hostitele (obrázek 2.1) (Miller, 1997). Částice typu ODV jsou uzavřeny do proteinové matrice (obrázek 2.1 A) tzv. okluzního tělíska - occlusion body (OB), které zajištuje stabilitu částice v době, kdy se vyskytuje ve vnějším prostředí (Mayer a Cory, 2003). Sekundární pučící forma částice BV nemá obal virového původu jako ODV (obrázek 2.1 B). Částice získá obal aţ při pučení z buňky, u které modifikuje cytoplasmatickou membránu pomocí svého obalového fúzního proteinu (Jehle a kol., 2006a). Obrázek 2.1: A) Rozdíl v utváření okluzních tělísek granulí virů granulózy (GV) a okluzních tělísek polyheder virů polyedrózy (SNPV, MNPV). V okluzním tělísku jsou uzavřeny částice prvního typu (ODV) vyvolávající infekci hostitele. B) Odlišnosti v morfologii částic typu pučící virion (budded virus-bv) a infekčního virionu (occlusion derived virus-odv). Obrázek zpracován podle Steineke (2004) a Kalmakoff a Ward (2003) Systém bakulovirů Na základě morfologie OB byly bakuloviry donedávna děleny na dva rody: Granulovirus (GV) a Nucleopolyhedrovirus (NPV) (Kalmakoff a Ward, 2003; Theilmann a kol., 2005). Zástupci GV mají částice typu ODV uzavřeny jednotlivě do vejčitých okluzních tělísek tzv. granulí o rozměrech 0,13 µm x 0,5 µm, zatímco NPV mají okluzní tělíska tvaru mnohostěnu (polyedru), jsou přibliţně 0,15-15 µm velká a obsahují jeden či více částic typu 12

14 ODV (obrázek 2.1). Z fotografií okluzních tělísek zástupců GV a NPV z rastrovacího elektronového mikroskopu je dobře patrný velikostní rozdíl OB těchto dvou skupin (příloha D.4). Okluzní tělíska všech bakulovirů jsou natolik velká, ţe je moţné je pozorovat i světelným mikroskopem (Kalmakoff a Ward, 2003). Základní bílkovinou okluzního tělíska GV je granulin a většina NPV má bílkovinnou matrici z bílkoviny polyhedrin (Jehle a kol., 2006b). Geneticky jsou si tyto dvě krystalické bílkoviny velmi blízké a patří mezi nekonzervovanější bílkoviny bakulovirů (Rohrmann 2008). Někteří zástupci NPV (obrázek 2.1 A) mají v OB uzavřené viriony s jednou nukleokapsidou (single nucleopolyhedrovirus - SNPV), u ostatních virion obsahuje více nukleokapsid (multiple nucleopolyhedrovirus - MNPV) (Williams a Faulkner, 1997; Theilmann a kol., 2005). S rozvojem technik molekulární biologie byla pozornost věnována talé příbuznosti bakulovirů (Bulach a kol., 1999, Herniou a kol., 2001, Herniou a kol., 2003, Lange a kol., 2004; Jehle a kol., 2006a,b). Na základě fylogenetických studií vycházejících z kompletně osekvenovaných třinácti bakulovirů izolovaných z řádů motýli (12) a dvoukřídlí (1) bylo navrţeno rozdělení rodu NPV do třech skupin: I NPV a II NPV, které jsou specifické pro motýly a skupiny NPV specifické pro dvoukřídlé, která byla navrţena podle sekvence viru komára Culex nigripalpus nucleopolyhedrovirus (CuniNPV). U rodu GV nedošlo k ţádným změnám (Herniou a kol., 2003). CuniNPV byl zařazen do samostatné skupiny, protoţe se výrazně geneticky lišil od NPV specifických pro motýly (Herniou a kol., 2003) a také OB tohoto viru je tvořeno bílkovinou odlišnou od granulinu i polyhedrinu (Rohrmann 2008). Zástupci skupin I NPV a II NPV se významně liší v genech, především pak v typu obalového fuzního proteinu, který napomáhá částicím druhého typu (BV) modifikovat membránu hostitelské buňky a vyuţít ji jako obal nukleokapsidy. Skupina I NPV pouţívá pro fúzi výlučně protein Gp64, přestoţe většina z nich obsahuje také F protein. Skupina II NPV a také GV vyuţívají analogy proteinu F (Pearson a Rohrmann, 2002; Rohrmann, 2008). Toto navrhované rozdělení bylo předzvěstí vzniku nového systému bakulovirů, který byl vytvořen v roce 2006 na základě porovnání příbuznosti vysoce konzervativních genů late expression factor 8 (lef-8), late expression factor 9 (lef-9) a polyhedrin/granulin (polh/gran) u 117 bakulovirů vyvolávajících onemocnění u motýlů (114), blanokřídlých (2) a dvoukřídlých (1) (Jehle a kol., 2006b) a řady genů pocházejících z 29 celých genomů bakulovirů izolovaných z řádů motýli (26), blanokřídlí (2) a dvoukřídlí (1) (Jehle a kol., 2006a). Mezinárodní komise pro klasifikaci virů (ICTV) uvedla v platnost toto rozdělení v roce 2008 (zdroj ICTV - Virus Taxonomy list 2008). Čeleď Baculoviridae je nyní rozdělena 13

15 do čtyř rodů: Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Gammabaculovirus a Deltabaculovirus (obrázek 2.2; tabulka 2.1). Nové rozdělení respektuje nejen příbuznost jednotlivých zástupců čeledi, ale také lépe vystihuje jejich hostitelskou specifitu (Jehle a kol., 2006a). V současné době je v GenBank databázi dostupných více neţ 50 kompletních genomových sekvencí (databáze online NCBI GenBank, ), které umoţňují dále studovat a porovnávavat geny bakulovirů (Jiang a kol., 2009). Rod Původní rod Hostitelská specifita Alphabaculovirus NPV Lepidoptera Betabaculovirus GV Lepidoptera Gammabaculovirus NPV Hymenoptera Deltabaculovirus NPV Diptera Tabulka 2.1: Nové rozdělení bakulovirů platné od roku 2007 (zdroj ICTV - Virus Taxonomy list 2008) Obrázek 2.2: Nový systém bakulovirů zaloţený na příbuznosti 29 druhů bakulovirů (Jehle a kol., 2006a) Exprese časných a pozdních genů a geny významné pro manipulace viru s hostitelem Genová exprese je u bakulovirů rozdělena do čtyř časových období: okamţitá časná (immediate early), zpoţděná časná (delayed early), pozdní (late) a velmi pozdní (very late) (Guarino a Summers, 1987). Geny časné fáze infekce jsou přepisovány před replikací viru za pomoci hostitelské RNA polymerázy II, zatímco pozdní geny jsou přepisovány aţ po začátku replikace virové DNA a jsou kódovány virovu RNA polymerázou, rezistentní 14

16 k α-amanitinu. Alfa amanitin inhibuje hostitelskou RNA polymerázu II (Rohrmann, 2008). Velmi pozdní geny přepisují například geny významné pro tvorbu strukturálních proteinů okluzních tělísek (granulin/polyhedrin) (Funk a kol., 1997). Schéma na obrázku 2.3 popisuje děj v jednotlivých fázích infekce. Obrázek 2.3: Schéma exprese genů bakulovirů v průběhu infekčního cyklu. Časné geny jsou přepisovány pomocí hostitelské RNA polymerázy II. Pozdní a velmi pozdní geny mají promotory odlišné od těch, které rozpoznává hostitelská RNA polymeráza II, a jsou přepisovány virovou RNA polymerázou. V pozdní fázi infekčního cyklu se vytvářejí pučící viriony (BV) šířící infekci v těle hostitele. Ve velmi pozdní fázi infekce se začínají produkovat nové částice (ODV), které se uzavírají do okluzních tělísek (OB) a slouţí k infekci nového hostitele. Bakuloviry mají celou řadu genů, které jim pomáhají ovládat hostitele. Vysoce propracované systémy například brání jiţ od časné fáze infekce apoptóze tedy programované smrti buněk, která se spustí, aby zastavila šíření viru z napadených buněk hostitele. Hlavní roli zde hrají geny p35 a skupina inhibitorů apoptózy aip (Clem, 1997; Rohrmann 2008). Prikhod ko a Miller (1996) uvádí, ţe časný virový tansaktivátor IE-1 produkt genu ie-1 také souvisí s apoptózou. Gen egt kóduje enzym ekdysteriod UDP-glukosyltransferázu, která blokuje funkci svlékacího hormonu ekdysonu, čímţ dochází k prodlouţení fáze, kdy larva přijímá potravu a virus se tak můţe déle mnoţit. Koncem infekčního cyklu jsou produkovány enzymy katepsin a chitináza, které desintegrují buňky hostitele a okluzní tělíska se snáze rozšíří do prostředí (Funk a kol., 1997; Rohrmann, 2008) Metody detekce bakulovirů První detekční metodou, která umoţnila potvrdit přítomnost bakuloviru byla světelná a elektronová mikroskopie (Hunter-Fujita a kol., 1998). Později byla optimalizována řada metod vyuţívajících pro detekci značených protilátek (Wo, 2001). Mezi nejvýznamnější z těchto metod patřily různé varianty imunosorpčního enzymového stanovení (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay) (Crook a Payne, 1980) a imunochemické stanovení vyuţívající značení protilátky radionuklidem RIA (radioimmunoassay) (Smith a Summers, 15

17 1981). Vyuţití těchto technik však bylo omezené, protoţe byly buďto zdlouhavé a nespolehlivé nebo vyuţívaly radioaktivních materiálů (Wo, 2001). Nový rozměr detekce bakulovirů byl dosaţen s rozvojem velmi citlivé metody polymerázové řetězové reakce (PCR-polymerase chain reaction) zaloţené na opakovaném zmnoţení (amplifikaci) známého úseku DNA za pomoci termostabilní DNA polymerázy. Tento úsek je ohraničen dvěma specifickými primery, tedy krátkými úseky komplementární DNA, které jsou navrţeny do vysoce konzervativních oblastí genomu bakulovirů, např. genů polh/gran (Wo, 2001; Kundu a kol., 2003). Novou a ještě citlivější variantou PCR je kvantitativní PCR v reálném čase (Real-Time PCR či qpcr), která je zaloţena na sledování průběhu PCR přímo během reakce pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují mnoţství PCR produktu zvýšením své fluorescenční aktivity. Této vysoce citlivé metody lze vyuţít například pro kvantitativní porovnání replikace viru v různých tkáních hmyzu (Asser-Kaiser, 2010) Hostitelský okruh bakulovirů a jejich názvosloví Různé bakuloviry mají odlišný počet hostitelských druhů, které mohou usmrtit (Cory a Mayers, 2003). Například alfabakuloviry, které infikují bekyňovité (Lymantriidae), jsou hostitelsky vysoce specifické, na druhou stranu Mamestra brassicae NPV (MabrNPV), který byl pojmenován po svém hostiteli můře zelné (Mamestra brassicae), infikuje druhy čtyř řádů motýlů a Autographa californica MNPV (AcMNPV) má dokonce hostitele nejméně v 15 řádech motýlů. Ostatní bakuloviry včetně betabakulovirů však bývají hostitelsky specifické a mají jen jednoho hostitele či několik hostitelů z úzce příbuzných druhů či rodů (Cory a Mayers, 2003). Díky těmto vlastnostem lze bakuloviry pouţít jako vysoce selektivní agens pro regulaci cílového škůdce bez negativních dopadů na necílové organismy. Nomenklatura bakulovirů je ustanovena ICTV a nebyla s novým systémem změněna. Druhové jméno viru je tvořeno z celého latinského názvu hostitele, ze kterého byl virus prvně izolován a rodové jméno tvoří název rodu bakuloviru podle starého systému (NPV popř. SNPV, MNPV nebo GV) (Rohrmann, 2008). Jak jiţ bylo naznačeno, hostitelský okruh některých bakulovirů je široký. Pokud virus napadá i další hostitele, zůstává název viru podle původního hostitele. V některých případech byl ovšem virus izolován z různých hostitelů a pojmenován několika jmény, ačkoliv rozdíl v aminokyselinách byl mezi těmito viry jen 1,5 4 %, coţ naznačuje, ţe se jedná jen o různé izoláty jednoho viru. Příkladem toho jsou viry Galleria mellonella NPV (GmNPV), Rachiplusia ou NPV (RoNPV) a Plutella xylostella NPV (PlxyNPV), které jsou blízce příbuzné s Autographa californica MNPV (AcMNPV) (Rohrmann, 2008). 16

18 2.2.7 Přípravky na bázi bakulovirů Komerčně vyráběné biopreparáty na bázi bakulovirů představují vhodnou alternativu k insekticidům v lesních porostech, sadech, sklenících, ale i v polních plodinách. Jejich předností je selektivní účinek a zdravotní nezávadnost, která tyto produkty předurčuje pro pouţití v systémech organické a integrované produkce plodin (Szewczyk a kol., 2009). Insekticidní účinek bakulovirů je niţší a mnohdy pomalejší neţ v případě syntetických insekticidů, avšak při dlouhodobějším vyuţívání bakulovirů v systémech ochrany se významně sniţuje populační hustota škůdce v dalších letech (Lacey a Unruh, 2005). Podobný účinek mají také preparáty na bázi grampozitivní bakterie Bacillus thuringiensis (Bt), kterou proti bakulovirům zvýhodňuje snadnější produkce preparátu a širší hostitelský okruh (Rohrmann, 2008). V některých případech však účinnost bakulovirů účinek Bt významně převyšuje. Například v jabloňových sadech se proti obaleči jablečnému (Cydia pomonella) osvědčil bakulovirus Cydia pomonella GV (CpGV) a preparáty na bázi Bt nejsou v praktické ochraně proti obaleči jablečnému příliš účinné, protoţe se housenky tohoto škůdce velmi brzy zavrtávají do jablka a obvykle tak nepřijmou letální dávku Bt toxinu (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). CpGV navíc patří mezi tři neúspěšnější bakulovirové preparáty a je pouţíván po celém Světě (Rohrman, 2008). Dašími dvěma významnými bakuloviry jsou Anticarsia gemmatalis MNPV (AgMNPV), který je vyuţíván v ochraně sóji proti můře Anticarsia gemmatalis v Brazílii a Helicoverpa armigera SNPV (HaSNPV), který se Číně pouţívá k ochraně bavlny proti polyfágní černopásce bavlníkové (Helicoverpa armigera) (Rohrman, 2008). Seznam preparátů na bázi těchto a dalších druhů bakulovirů je uveden v příloze D.2. Nejširší spektrum bioinsekticidů bylo do dnešní doby formulováno z CpGV, který byl prvně izolován v roce 1963 z infikovaných housenek pocházejících ze severu Mexika (Tanada, 1964 cit. podle Asser-Kaiser, 2010). Biopreparáty na bázi mexického izolátu (CpGV-M) začala později produkovat a nabízet pod různými obchodními názvy řada světových firem. První preparát SAN 406 vytvořila v USA firma Sandoz v roce V Evropě byl v roce 1988 prvně uveden na trh přípravek Madex švýcarské firmy Andermatt Biocontrol. Dalšími registrovanými preparáty, které jsou v Evropě pouţívány i dnes, jsou Granupom (Hoechst, Německo, registrace: 1991) a Carpovirusine (Calliope, Francie, registrace: 1993) (Rohrmann, 2008). V USA a Kanadě byly později registrovány preparáty Cyd-X (Thermo Trilogy nyní Certis, USA, registrace: 1995) a VirosoftCP4 (Biotepp, Kanada, registrace: 2000). VirosoftCP4 ovšem na rozdíl od ostatních preparátů neobsahuje CpGV-M, ale izolát pocházející z Quebeku (Kanada) (Vincent a kol., 2007; Rohrmann, 2008). Eberle 17

19 (2010) označila izolát pocházející z preparátu Virosoft CpGV-S. Vývoj preparátů probíhal také v dalších zemích, například v Rusku to byl preparát Virin-CyAP (Moscardi, 1999; Rohrmann, 2008) či v České republice byl testován preparát firmy Biola Chelčice (Stará a Kocourek, 2003), u kterého však vzhledem k vysoké konkurenci zahraničních výrobků nebyl dokončen proces registrace. Přípravek Producent Izolát viru Registrováno Carpovirusine Calliope, nyní Arysta LifeScience Mexický Kanada, USA Carpovirus Plus INTA, Agro Roca Mexický Argentina Cyd-X Thermo Trilogy, nyní Certis Mexický Kanada, USA Granupom Biobest Mexický Pouze Belgie Granupom neu OMYA Mexický Švýcarsko Granupom Hoechst AgrEvo, nyní Probis Mexický Německo Madex Andermatt Biocontrol Mexický Západní Evropa, Nový Zéland, JAR, Kypr aj. Madex Max Andermatt Biocontrol neuveden Německo Madex Plus Andermatt Biocontrol Mexický selektovaný Švýcarsko VirosoftCP4 BioTEPP Kanadský Kanada, USA Tabulka 2.2: Přehled komerčně dostupných biopreparátů na bázi CpGV. Další vlna produkce nových preparátů na bázi CpGV započala v roce 2007, kdy byl registrován první izolát CpGV účinný proti populacím obaleče jablečného rezistentních k CpGV-M (viz podkapitola 2.5.4). Současné spektrum produktů na bázi CpGV uvádí tabulka 2.2. Přípravky na bázi CpGV jsou pouţívány v mnoha evropských zemích, Severní a Jiţní Americe, na Novém Zélandu, či v Jihoafrické republice (Jehle a Schmitt, 2009). V České republice byly první preparáty na bázi CpGV (Madex, Carpovirusine) registrovány aţ v roce Rekombinantní bakuloviry Oproti chemickým insekticidům je pesticidní účinek bakulovirů pomalý (Inceoglu a kol., 2001; Szewczyk a kol., 2006; Szewczyk a kol., 2009). Bakuloviry usmrtí larvu hostitele obvykle za 5 dní (většina NPV), ale také aţ za 7-14 dní (většina GV), coţ vede mnohdy k citelným ztrátám produkce (Inceoglu a kol., 2001). Příkladem pomalého bakuloviru vyuţitelného do jabloňových sadů je Adoxophyes orana GV (AdorGV), který zabíjí housenky svého hostitele obaleče zimolezového (Adoxophyes orana) aţ v posledním larválním instaru bez ohledu na to, kdy byla housenka infikována a jakou dávku viru přijala (Wormleaton a 18

20 kol., 2003). Naproti tomu CpGV, který patří mezi rychlé bakuloviry, usmrcuje housenky obaleče jablečného do 5-10 dnů po infekci a infikované housenky navíc rostou pomaleji a také příjmají méně potravy (Luque a kol., 2001; Jehle a kol., 2006c). Přesto stihnou housenky obaleče jablečného před úhynem vytvořit povrchové závrtky na plodech (Cross a kol., 1999, Lacey a Unruh, 2005). Vzájemné vztahy systému virus-hostitel jsou stále studovány a hledají se moţnosti, jak zvýšit účinnost jednotlivých bakulovirů. Existují tři základní způsoby rekombinace bakulovirů, kterými lze zvýšit jejich účinnost. První moţností je vloţit do genomu bakuloviru gen kódující vybrané hormony hmyzu, například diuretický hormon či esterázu juvenilního hormonu (Inceoglu a kol., 2001). Druhou moţností je odebrat gen pro ekdysteroid UDP- glukosyltransferázu (egt), jejíţ produkt zabraňuje svlékání larvy a tím prodluţuje dobu, kdy housenka přijímá potravu a virus se můţe v hostiteli déle mnoţit. Tato manipulace, která zrychluje účinek viru, byla také úspěšně provedena u CpGV (Cross a kol., 1999), a to i přesto, ţe se manipulace u GV provádějí obtíţněji (Inceoglu a kol., 2001). Třetím typem modifikace bakulovirů je vloţení nových genů kódujících toxiny specifické pro hmyz (např. gen cry toxin z Bacillus thuringiensis, gen pro toxiny roztočů, pavouků či škorpionů) (Black a kol., 1997; Hughes a kol, 1997; Moscardi, 1999, Szewczyk a kol., 2006). Například Sun a kol. (2002) vyuţili pro urychlení infekce vyvolané Helicoverpa armigera SNPV (HaSNPV) dva různé typy rekombinace. U prvního typu (HaCXW1) byl odebrán egt a u druhého typu (HaCXW2) byl tento gen nahrazen neurotoxinem AaIT ze škorpiona Androctonus australis. Výše popsané rekombinace byly zkoušeny při vývoji komerčního biopreparátu, který by rychleji a účinněji reguloval škůdce černopásku bavlníkovou (Helicoverpa armigera) v Číně. V polním pokusu zaloţeném v bavlníku ošetřeném rekombinantními HaCXW1 nebo HaCXW2 byly housenky černopásky zabíjeny rychleji neţ housenky, které byly ošetřeny původním izolátem HaSNPV. Zasaţené housenky byly sbírány a chovány na umělé dietě. Střední letální čas (ST 50 ) se proti pouţití původního izolátu zkrátil o 15,3 % (HaCXW1) a 26,3 % (HaCXW2). Také úbytek listové plochy hodnocený 108 hodin po ošetření se sníţil přibliţně o 50 % HaCXW1 a o 63 % u HaCXW2 proti původnímu přírodnímu izolátu HaSNPV. Tyto výsledky naznačují, ţe rekombinantní typy bakulovirů by mohly úspěšněji a efektivněji chránit pěstované plodiny, především jedná-li se o pomalé bakuloviry. Avšak vzhledem k všeobecné nedůvěře k GMO nebyl dosud registrován ţádný preparát na bázi rekombinovaného bakuloviru (van Beek a Davis, 2007; Szewczyk a kol., 2009). 19

21 2.2.9 Masová produkce bakulovirů pro přípravu biopreparátů Produkce bakulovirů můţe probíhat v in vivo nebo in vitro podmínkách, ovšem vzhledem k finanční a také materiálové náročnosti in vitro technik, je masová produkce pro výrobu biopreparátů zaloţena na propagaci viru v hostiteli (Khachatourians, 2009). Pro propagaci viru in vivo je vybrán hostitel, kterého lze snadno chovat (krátký vývoj, vysoká reprodukční schopnost, nevyskytuje se kanibalismus larev, moţnost chovu na umělé dietě apod.) a je vysoce citlivý k vybranému bakuloviru. Ovšem při pouţití alternativního hostitele je nutné sledovat účinnost pasáţovaného viru proti cílenému škůdci, protoţe se virulence můţe produkcí v jiném hostiteli sníţit (Hunter-Fujita a kol., 1998). Hmyz bývá chován na umělé potravě (dietě), popřípadě na přirozené potravě a je infikován v pozdějším vývojovém stádiu, aby housenky uhynuly aţ těsně před kuklením, kdy vyprodukují nejvíce viru. Sběr infikovaných housenek bývá prováděn obvykle krátce před úhynem (Khachatourians, 2009). Chov hostitele a příprava diety by měly být odděleny od vlastní produkce viru, aby nedošlo ke kontaminaci chovu virem. Ideální je mít tyto procesy v různých budovách (Hunter-Fujita a kol., 1998). Výroba preparátů vyţaduje mnoho pracovních sil (odchov hostitele, propagace viru, sběr infikovaných jedinců) a také je třeba udrţovat vysokou hygienu chovu, coţ zvyšuje cenu produktu. I přesto se v současné době stále jedná o jedinou ekonomicky dostupnou metodu produkce (Grzywacz a kol., 1997; Cadogan a kol., 2003). Druhá metoda produkce bakulovirů in vitro je zaloţena na propagaci viru v hmyzích buňkách udrţovaných v buněčných kulturách (Khachatourians, 2009). Tato metoda bývá vyuţívána zejména při produkci rekombinantních bakulovirů (Inlow a kol., 1989) a pro různé laboratorní experimenty (Kariuki a kol., 2000). Výhodou proti metodě in vivo je produkce čistého virového preparátu bez příměsi mikroorganismů, které se mohou vyskytovat při produkci in vivo, a proto musí být v chovu hmyzu dodrţována vyjímečná hygienická opatření (Hunter-Fujita a kol., 1998). Nevýhodou je kromě vysoké ceny také riziko sniţující se účinnosti neustálým pasáţováním (Kariuki a kol., 2000) Formulace a aplikace bakulovirů Základem biopreparátů jsou okluzní tělíska, která se vytváří na konci infekčního cyklu viru v hostiteli. Aby mohl být preparát úspěšně pouţíván, je nutné zajistit, aby se při dlouhodobém skladování nesniţovala aktivita částic a prezistence přípravku po aplikaci byla co nejdelší (Hunter-Fujita a kol., 1998). 20

22 Kvalitu přípravků na bázi bakulovirů je moţné zachovat skladováním ve zmraţeném stavu při -20 C. Takto se bakuloviry dlouhodobě skladují v laboratoři, ovšem to není v praxi běţné, a proto je nutné formulovat přípravky tak, aby je bylo moţné skladovat po dobu alespoň 18 měsíců za vyšších teplot a přitom nedošlo ke sníţení kvality rozvojem bakterií a hub (Hunter-Fujita a kol., 1998). Přípravky na bázi bakulovirů jsou formulovány nejčastěji jako suspenzní koncentráty (SC) nebo smáčitelné prášky (WP) (Khachatourians, 2009). U smáčitelných prášků je rozvoji mikroorganismů zabráněno nízkou vlhkostí (do 5 %) a hermetickým uzavřením jednotlivých balení preparátů, u suspenzních koncentrátů je růstu většiny mikroorganismů zabráněno zajištěním nízkého ph ( 4) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Aplikované preparáty na bázi mikroorganismů jsou nejvíce degradovány vlivem ultrafialového záření (UV), a to jak UV-A ( nm), tak i UV-B ( nm) (Burges a Jones, 1998; Hunter-Fujita a kol., 1998). Perzistenci biopreparátů po aplikaci zvyšuje celá řada chemických UV protektantů, které absorbují, reflektují nebo blokují UV záření (Burges a Jones, 1998). Hunter-Fujita a kol. (1998) uvádí látky, kterými lze zvýšit odolnost proti UV záření. Mezi významné řadí optické zjasňovače, které však současně působí nepříznivě na fotosyntézu a opylování zjasňovači pokrytých rostlin (Salamouny a kol., 2009). Je však známa také řada přírodních absorbantů UV záření. Salamouny a kol.(2009) testovali v laboratorních podmínkách účinnost ligninu (Reax85A) a černého čaje na prodlouţení účinnosti SeMNPV proti blýskavce červivcové (Spodoptera exigua). SeMnNPV o koncentraci 2x10 5 OB/ml byl před biologickým testem vystaven zdroji UV-A a UV-B záření po dobu aţ 5 hodin. Mortalita housenek vlivem SeMNPV v biologickém testu bez ochrany ligninu nebo černého čaje dosáhla jiţ po dvouhodinovém záření 100 %, zatímco při ochraně těmito přírodními látkami zůstala 100 % účinnost zachována i po 5 hodinách záření. Dalšími významnými adjutanty preparátů na bázi viru jsou látky zvyšující adhezi či látky zabraňující odpařování vody a tím úletu malých kapek při postřiku (anti-drift) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Také je třeba zmínit látky zvyšující chuťovou atraktivnost preparátu (např. melasa), která zvýší příjem potravy s virem dříve, neţ začne degradovat např. vlivem UV záření (Lacey a Unruh, 2005). Aplikace biopreparátů je obdobná jako u chemických insekticidů. Je moţné pouţít běţné postřikovače (Hunter-Fujita a kol., 1998), či při ochraně lesů aplikovat preparáty letecky (Švestka a Pultar, 2002). Bakuloviry jsou aplikovány ve vysokých koncentracích metodou inundace (zaplavení, zamoření), kdy je cílem decimovat škůdce, kteří se v určitém čase vyskytují na určitém místě a neočekává se dlouhodobá regulace pomocí tohoto bioagens 21

23 (Holuša a Weiser, 2005). Například proti obaleči jablečnému jsou aplikovány dávky OB/ha, aby okamţitě došlo k potlačení škůdce (Lacey a Unruh, 2005). Preparáty je moţné aplikovat v tankmixu, avšak ne s příliš kyselými či zásaditými látkami (optimální ph pro aplikaci se pohybuje od 4 do 9) (Hunter-Fujita a kol., 1998). Postřiky jsou prováděny několikrát za sezónu, v závislosti na hustotě výskytu škůdce a průběhu počasí, ovšem vzhledem k prvním zprávám o výskytu k viru rezistentních populací škůdce (Jehle a kol., 2006c), by měly být prováděny v kombinaci s odlišně působícími přípravky (Jehle, 2008b; Stará a kol., 2009). Bakuloviry mají pouze poţerový účinek, a proto je nutné zacílit aplikaci proti nejvnímavějšímu stádiu škůdce, tedy čerstvě vylíhnutým housenkám v případě hostitelů se skrytým způsobem ţíru a prvních několika instarů škůdců s povrchovým ţírem (Lacey a Unruh, 2005). Perzistence okluzních tělísek je po aplikaci niţší neţ u chemických insekticidů a sniţuje se, zejména jak jiţ bylo uvedeno zvyšující se intenzitou UV záření (Hunter-Fujita a kol., 1998). Při silném slunečním záření musí být aplikace opakována přibliţně po 3-8 dnech (Lacey a Unruh, 2005). 2.3 Cydia pomonella granulovirus původce granulózy obaleče jablečného Cydia pomonella granulovirus (CpGV) patří mezi zástupce rodu Betabaculovirus (dříve Granulovirus) a je zároveň typovým druhem tohoto rodu (Theilmann a kol., 2005). Podobně jako ostatní bakuloviry vyniká CpGV šetrností k ţivotnímu prostředí a necílovým organizmům a zaujímá tak významné místo v ochraně sadů se systémem integrované produkce ovoce a je nepostradatelnou součástí organického zemědělství (Jehle a kol., 2006c) Charakteristika CpGV Genom CpGV je tvořen cirkulární dvouřetězcovou DNA (123,5 kb) sbalenou do kapsidy tyčinkovitého tvaru. Genom obsahuje 143 orf (otevřených čtecích rámců). Velikost genomu a počet orf byl zjištěn v roce 2001 osekvenováním in vivo klonovanéno M1 genotypu mexického izolátu CpGV-M (Luque a kol., 2001). Sekvence tohoto izolátu (NC_002816) je volně přístupná v GenBank databázi National Center for Biotechnology Information (NCBI). Schéma genomu CpGV je uvedeno v příloze D.3. Restrikční profil CpGV-M a dalších dvou izolátů původem z Ruska (CpGV-R) a Anglie (CpGV-E) byl znám jiţ od 80. let 20. století (Crook a kol., 1985). K mapování pouţili Crook a kol restrikční endonukleázy EcoRI, BamHI, SmaI, HindIII a ApaI. Další důkladné mapování genomu CpGV-M bylo publikováno v roce 1996 (Crook a kol., 1996). Přestoţe byly známy různé izoláty viru, komerční biopreparáty pouţívané v Evropě obsahovaly jen částice nejlépe 22

24 popsaného izolátu CpGV-M (Crook a kol., 1985; Crook a kol., 1997; Luque a kol., 2001). Protoţe byly v roce 2003 zaznamenány potíţe s účinností CpGV-M (Fritsch a kol., 2005; Jehle a kol., 2006c; Zingg a Kessler, 2007; Asser-Kaiser a kol., 2007), znovu započalo hledání izolátů viru, a to takových, které by dokázaly regulovat i nově selektované rezistentní populace obaleče jablečného (více k rezistenci v podkapitole 2.5.4). V roce 2008 byly popsány nové izoláty pocházející z Íránu (Rezapanah a kol., 2008). V různých oblastech Íránu byly nalezeny desítky izolátů. Jedenáct z nich (CpGV-I01, I07, I08, I15, I22, I28, I30, I66, I67, I68, I70) vykazovalo genetické i biologické odlišnosti. Genetické rozdíly byly nalezeny pomocí restrikce virové DNA endonukleázami EcoRI, PstI a XhoI a biologické vlastnosti byly hodnoceny biologickým testem (bioassay). Další práce Eberle a kol. (2009) představuje restrikční profil a biologické vlastnosti šesti izolátů viru z Íránu (CpGV- I01, I07, I08, I12, I66, I68), dvou z Gruzie (CpGV-G01, G02) a jednoho z Anglie (CpGV-E2), který prvně popsal Crook a kol. (1985). Ve své disertační práci uvádí Eberle (2010) restrikční profily celkem 14 CpGV izolátů hodnocených restrikční analýzou s následujícími restrikčními endonukleázami SalI, EcoRI, BamHI, XhoI, PstI, KpnI, SacI, SmaI, ApaI a HindIII Infekční cyklus CpGV Infekční cyklus CpGV (obrázek 2.4) začíná přijetím granule (okluzní tělísko, OB) housenkou vnímavého hostitele. Housenka přijme OB spolu s potravou. Kdyţ se OB dostanou do středního střeva hostitele, dochází vlivem alkalického ph k rozpuštění granulinu a uvolněné částice prvního typu (ODV) procházejí peritrofickou membránou a pronikají aţ do buněčných jader střevního epitelu, kde dochází k primární infekci. Sekundární infekci vyvolávají částice druhého typu (BV), které pučí z napadených buněk. Při pučení modifikují BV svým obalovým fúzním proteinem F (u CpGV transkript genu Cp31) cytoplasmatickou membránu buňky hostitele a vyuţívají ji jako obal (obrázek 2.1 B). Poté se infekce za pomoci BV rozšiřuje do dalších tkání hostitele. Zatímco BV se vytvářejí v pozdní fázi infekce, ve velmi pozdní fázi dochází opět k vytváření částic typu ODV, produkci proteinové matrix (granulin) a vzniku nových OB. Virové proteinázy: chitináza (u CpGV transkript genu Cp10) a katepsin (u CpGV transkript genu Cp11) se podílejí na degradaci chitinu exoskeletu a rozloţení těla hostitele (obrázek 2.5 C), při kterém se nově vytvořené OB uvolní do prostředí (Funk a kol., 1997; Luque a kol., 2001; Kalmakoff a Ward, 2003; Jehle a kol., 2006c). Obrázek 2.5 A B ukazuje rozdíl mezi zdravou a infikovanou housenku. Typickým příznakem posledního stádia granulózy je zduření tělních segmentů housenky, mléčné zabarvení a sníţení její pohyblivosti. 23

25 Obrázek 2.4: Infekční cyklus CpGV. Infekce začíná příjmem a následným rozpuštěním okluzních tělísek (OB) ve středním střevu housenky. Uvolněné infekční viriony (ODV) prochází peritrofickou membránou a fúzují s membránou buněk střevního epitelu. Nukleokapsidy vstupují do jádra a začnou se replikovat. Nově vytvořené nucleokapsidy pučí z buněčné membrány a vznikají tak částice druhého typu (BV), které vyvolávají sekundární infekci v nově napadených buňkách hostitele. Do dalších buněk se BV dostávají za pomoci fúze s buněčnou membránou. V pozdní fázi infekce se formují znovu ODV, které se obalují a vytváří se OB. V konečné fázi infekce dochází k uvolnění OB do prostředí. (obrázek podle Arends, 2004). Obrázek 2.5: Infekce housenek L1 obaleče jablečného nízkou dávkou (300 OB/ml) vede k úhynu posledních instarů. A) Zdravá housenka L5; B) Infikovaná housenka L5 v posledním stádiu infekce; C) Housenka s prasklou kutikulou Hostitelský okruh CpGV Nejdůleţitějším a také nejvnímavějším hostitelem CpGV je celosvětově rozšířený škůdce jádrovin a dalších dřevin, obaleč jablečný Cydia pomonella (biologie škůdce v podkapitole 2.4). Pouze několik částic viru (3-17) pozřených housenkou prvního instaru 24

26 (L1) stačí k tomu, aby započala infekce končící smrtí hostitele (Cossentine a kol., 2005). Dalším citlivým hostitelem CpGV je Cryptophlebia leucotreta, (anglicky false codling moth falešný obaleč jablečný ). C. leucotreta je významným škůdcem citrusů, bavlníku, kukuřice a dalších ekonomicky významných plodin tropické a subtropické Afriky (Reiser a kol., 1993; Lange a Jehle, 2003). Velkochov tohoto škůdce je snazší neţ u obaleče jablečného, proto je moţné pouţít housenky posledních instarů (L4-L5) pro masovou produkci CpGV (Reiser a kol., 1993). C. leucotreta je také hostitelem C. leucotreta granulovirus (CrleGV), který však obaleče jablečného nenapadá (Jehle a kol., 1992). Oba viry CrleGV a CpGV mají k sobě z fylogenetického hlediska blízko (Lange a Jehle, 2003). Eastwell a kol. (1999) uvádí, ţe CpGV dokáţe v laboratorních podmínkách infikovat i další blízké druhy obalečů, avšak jen při několikanásobně vyšších dávkách viru. Mezi tyto hostitele uvádí obaleče východního (Grapholita molesta), obaleče prýtového (Rhyacionia buoliana), obaleče Rhyacionia frustrana a obaleče hrachového (Cydia nigricana). Pro obaleče východního infikovaného v L1 instaru CpGV uvádí Lacey a kol. (2005) hodnoty střední letální koncentrace (LC 50 ) 35,1 okluzních tělísek na milimetr čtvereční (OB/mm 2 ), coţ je 557 krát vyšší hodnota, neţ udává pro obaleče jablečného (LC 50 0,063 OB/mm 2 ). Peyne (1981) porovnával citlivost L1 housenek obaleče hrachového a obaleče jablečného k šesti různým koncentracím CpGV. Na virem kontaminované dietě byly housenky po dobu 24 hodin. Poté byly přeneseny na dietu bez viru a po 6 dnech byla stanovena LC 50, která byla u obaleče jablečného (1,54x10 4 OB/ml) a u obaleče hrachového (1,90x10 5 OB/ml). LC 50 obaleče jablečného byla jen 12,3 krát niţší neţ obaleče hrachového, ovšem kdyţ se housenky L1 vyvíjely na dietě obsahující různé koncentrace CpGV po dobu 14 dní, u obaleče jablečného došlo i v nejniţší testované koncentraci (1,56x10 3 OB/ml) k 100 % mortalitě, zatímco housenky obaleče hrachového uhynuly jen při nejvyšší koncentraci (1,56x10 6 OB/ml). V nejniţší koncentraci 1,56x10 3 OB/ml jejich mortalita po 14 dnech nepřesáhla 10 %. Nově popsaným hostitelem CpGV se stal obaleč švestkový (Cydia funebrana) (Reineke a kol., 2010). Autoři testovali 10 různých izolátů CpGV a nalezli dva izoláty CpGV-V15 a CpGV- V18, které při povrchové aplikaci na švestky v koncentraci 10 7 OB/ml způsobovaly mortalitu housenek obaleče švestkového 58 % (CpGV-V15) a 63 % (CpGV-V18). 2.4 Obaleč jablečný nejvýznamnější hostitel CpGV Obaleč jablečný, Cydia pomonella (Linnaeus, 1758) patří do třídy hmyz (Insecta), řádu motýli (Lepidoptera) a čeledi obalečovití (Tortricidae). Housenky obaleče jablečného poškozují především plody jádrovin, ale mohou příleţitostně napadat i plody dalších ovocných dřevin, například ořešáků, meruněk, broskvoní a vzácně také plody třešní, slivoní, 25

27 mandloní či jedlých kaštanů (Sorauer, 1953). Přestoţe obaleč jablečný pochází z jihovýchodní Evropy (Shel Deshova, 1967), je rozšířen téměř po celém světě a patří mezi hospodářsky nejvýznamnější škůdce jabloňových sadů (Thaler a kol., 2008) Popis obaleče jablečného Vajíčka jsou zploštělá, čočkovitého tvaru a bývají 1,3 x l,0 mm velká. Po nakladení mají mléčně stříbřitou (opalescentní) barvu, ale v průběhu vývoje je moţné přes průhledný chorion pozorovat ve vajíčku vývojové změny. Nejsnáze jsou pozorovatelné dvě embryonální fáze vajíčka, které slouţí pro orientační stanovení termínu ošetření larvicidy (Hluchý a kol., 1997). První fází je tzv. červený prstenec, kdy se druhý aţ třetí den po nakladení vytváří po obvodu vajíčka úzký červený krouţek. Druhou fází je černá hlavička, kterou lze ve vajíčku pozorovat přibliţně jeden aţ dva dny před líhnutím. Vývoj housenky obaleče jablečného prochází pěti instary (L1-L5). Tělo prvních čtyř instarů je bělavé s tmavě hnědou aţ černou hlavou. Poslední pátý instar má růţové zbarvení, hlava s hrudním štítem jsou světleji hnědé a lesklé. Housenky L5 jsou mm dlouhé. Hrudní články nesou po jednom páru panoţek, anální článek je s pošinkami. U housenek obaleče jablečného není vytvořen anální hřeben. Od pozdějšího instaru L4 lze u housenek rozlišit pohlaví, protoţe samcům při pohledu na dorzální stranu těla prosvítají skrz pokoţku pátého abdominálního segmentu dvě oddělené červenofialové gonády (Howell, 1991; Fuková a kol., 2008). Na obrázku 2.6 A je samičí a samčí housenka L5. Obrázek 2.6: Rozdíl mezi samcem a samicí ve stádiu housenky L5 a kukly. A) Samčí housenky L5 lze od samičích rozlišit podle prosvítajících gonád skrz pokoţku pátého abdominálního segmentu. B) Rozdíl mezi samčí a samičí kuklou je dán počtem abdominálních segmentů. U samice jsou viditelné tři, zatímco u samce čtyři. Kukla motýlů je nekousací mumiová (pupa adectica obtecta). Obaleč jablečný má kuklu 9 aţ 10 mm dlouhou, nejprve světle hnědé barvy, která do líhnutí ztmavne. Kukla samic 26

28 bývá větší a těţší, ale toto kritérium není vhodné pouţít pro rozlišení pohlaví. Pohlaví lze snadno odlišit při pohledu na ventrální stranu kukly (obrázek 2.6 B). Samice má tři volně spojené abdominální segmenty a terminální segment je vytvořen fúzí několika segmentů, zatímco kukla samce má vytvořené čtyři volně spojené abdominální segmenty (Howell, 1991). Motýli, kteří vylétnou z kukel, mají rozpětí křídel mm. Samice bývají větší a těţší (16-42 mg) a nelétají příliš daleko. Samci jsou díky niţší váze (12-21 mg) pohyblivější (Howell, 1991). Přední křídla jsou popelavě šedá s tmavými příčkami. Blízko jejich hrotu je červenavě tmavohnědá skvrna, tzv. zrcátko, které je světle leskle orámované. Zadní křídla jsou šedohnědá. Hlava a hruď jsou popelavě hnědé, zadeček šedohnědý (Miller, 1956). Pohlavní dimorfismus není výrazný. Samec má na spodní straně předních křídel hranatou černou skvrnu a proti samičce má uţší zadeček. Lépe lze pohlaví rozlišit při kaudálním pohledu na vnější genitálie. U samice je na konci zadečku viditelný kruhový otvor (obrázek 2.7 A), zatímco vnější pohlavní orgány samce jsou tvořeny párem valvae (obrázek 2.7 B) (Howell, 1991). Obrázek 2.7: Rozlišení pohlaví u dospělců obaleče jablečného. A) samice, B) samec Ţivotní cyklus obaleče jablečného Ţivotní cyklus obaleče jablečného popisuje obrázek 2.8. Tento škůdce přezimuje ve stádiu housenky posledního larválního instaru (L5). Housenky si upředou pevný zámotek, ve kterém přezimují v prasklinách kůry stromů či v půdě. Na jaře se housenky v zámotku kuklí a v závislosti na teplotě zhruba od poloviny května vylétávají první motýli. Dříve se líhnou samci (Lacey a Unruh, 2005). Motýli se obvykle páří při soumraku, kdy intenzita světla klesá pod 150 lux. Při vysoké oblačnosti se páří i dříve (Howell, 1991). Samičky kladou vajíčka jednotlivě nebo v malých skupinách po 2-3 na listy a plody. Z vajíček se po 3-7 dnech líhnou housenky, které okamţitě začnou hledat vhodné místo pro vytvoření závrtku. Jsou li vajíčka nakladena na listech a doba neţ naleznou plod, je dlouhá, mohou se krátce ţivit i listem, ovšem po nalezení plodu vytváří závrek. Nejprve den či dva vytvářejí poţerek těsně pod slupkou plodu a pak se ve stádiu druhého instaru zaţírají dovnitř plodu 27

29 (Lacey a Unruh, 2005). Pronikají nejčastěji aţ do jádřince, kde mohou vyţírat i semena. Vstupní otvor i chodbička jsou vyplněny trusem. Vývoj housenek trvá v závislosti na teplotě dní (Lacey a Unruh, 2005). Potom housenky L5 opouštějí plody a vyhledávají úkryty vhodné pro přezimování (kůra stromu, půda, tráva). V teplejších oblastech nevstupují všechny housenky první generace do diapauzy, ale většina se brzy zakuklí a dá vzniknout 2. generaci. V závislosti na klimatických podmínkách můţe mít obaleč jablečný aţ čtyři generace (Asser-Kaiser, 2010). V našich podmínkách škodí housenky druhé generace na dozrávajících plodech především v teplejších oblastech, např. na Jiţní Moravě, v chladnějších oblastech je druhá generace jen částečná nebo zcela chybí. L5 Obrázek 2.8: Ţivotní cyklus obaleče jablečného. Z vajíček se vylíhnou housenky prvního instaru (L1), které se zavrtají do plodu a další vývoj aţ do L5 probíhá skrytě. Housenky L5 se buďto kuklí a vylétnou motýli 2. generace, kteří nakladou další vajíčka, nebo vstupují do diapauzy a přezimují v zámotku pod kůrou stromů či v půdě. Na jaře se housenky zakuklí a vylétnou motýli první generace., kteří nakladou vajíčka. Autorem obrázku je V. Falta; publikováno Stará a kol. (2009) Škodlivost obaleče jablečného a moţnosti biologické ochrany První generace škůdce způsobuje předčasný opad mladých plodů. Později napadené plody zůstávají na stromě, časněji se vybarvují a jsou náchylnější k napadení houbovými chorobami, především moniliovou hnilobou jádrovin (Monilinia fructigena). Holb (2004) uvádí ve své studii ze sadu v organickém reţimu pěstování, ţe % plodů napadených M. fructigena bylo poškozeno od obaleče jablečného. 28

30 V důsledku intenzivní chemické ochrany v jabloňových sadech došlo v průběhu 90. let minulého století k selektování mnoha populací obaleče jablečného rezistentních k insekticidům s různými typy účinných látek. V České republice byl zaznamenán výskyt populací tohoto škůdce rezistentních k organofosfátům a inhibitorům růstu v oblastech s intenzivním pěstováním jabloní, především na Jiţní Moravě (Stará a Kocourek, 2007). Vzhledem ke snaze eliminovat rezidua pesticidů v plodech a také zabránit rozvoji rezistence k pouţívaným insekticidům, je vhodné obohatit spektrum pouţívaných preparátů proti obaleči jablečnému o mikrobiální pesticidy. V ČR byl donedávna povolen pouze Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki formulovaný v přípravku Biobit XL (Valent BioSciences Corporation), který je ovšem účinný spíše proti škůdcům, kteří se nevyvíjí skrytě (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). Od roku 2010 je moţné pouţít také preparáty na bázi CpGV, ovšem vzhledem k moţné selekci rezistence škůdce (více podkapitola 2.5.4) by bylo vhodné rozšířit seznam povolených bioagens o další preparáty. Mnoho experimentů je v poslední době prováděno s entomopatogenními hlísticemi Steinernema carpocapsae a S. feltiae, které lze pouţít na podzim proti přezimujícím housenkám obaleče jablečného (Lacey a Unruh, 2005; Kienzle a kol., 2008; Brown 2010). Ve světě byla provedena také řada experimentů s entomopatogenními houbami (Cross a kol., 1999; Lacey a Unruh, 2005). U druhů Beauveria bassiana a Peacilomyces farinosus byla zjištěna nejlepší účinnost, ovšem v ochraně proti obaleči jablečnému se běţně nepouţívají (Lacey a Unruh, 2005). 2.5 Interakce mezi CpGV a jeho hostitelem obalečem jablečným Přenos CpGV Udrţování viru v populaci hostitele je v přírodě zajišťováno kombinací horizontálního a vertikálního přenosu (Kukan, 1999; Cory a Mayers, 2003) Horizontální přenos Horizontální přenos je nejběţnějším způsobem přenosu bakulovirů. Je závislý na interakcích mezi infikovanými a zdravými housenkami a populační hustotě škůdce. Přenos probíhá v rámci jedné generace, kdy obecně platí, ţe s vyšší hustotou škůdce se zvyšuje šance pro přenos viru (Kukan, 1999; Cory a Mayers, 2003). Zdrojem OB v přírodě mohou být usmrcené larvy, exkrementy infekčních larev a výkaly jejich predátorů (Szewczyk a kol., 2006). Horizontální přenos viru se snadno uskutečňuje u škůdců, kteří poškozují listovou plochu povrchovým ţírem, protoţe se infikované larvy mohou potkávat se zdravými ve všech vývojových stádiích. Obaleč jablečný ale poškozuje plody vnitřním ţírem a proto je u něj tento typ horizontálního přenosu viru méně častý (Steineke, 2004). Období, ve kterém se 29

31 housenka obaleče můţe setkat s virovou partikulí, je omezeno jen na první (L1), maximálně časný druhý (L2) instar. Housenka v té době hledá vhodné místo na plodu, kde začne poţerek a protoţe vajíčka bývají nakladena i na listech, je pravděpodobné, ţe se cestou k plodu potká s OB kontaminujícími prostředí. Poté, co se housenka prokouše slupkou plodu, probíhá celý vývoj do L5 skrytě a navíc v jednom jablku se obvykle vyvíjí jen jedna housenka obaleče jablečného Vertikální přenos Druhým typem přenosu je přenos vertikální, kterým virus přechází z rodičů na potomstvo, a proto není závislý na populační hustotě škůdce (Steineke, 2004). Aby mohl být virus přenesen do další generace, musí být larva infikována subletální dávkou viru obvykle aţ ve vyšším instaru, kdy se významně sniţuje vnímavost housenek k viru (Burden a kol., 2002; Il'inykh a Ul'yanova, 2004). Doposud byl vertikální přenos potvrzen jen u několika druhů bakulovirů, především ze skupiny alfabakulovirů (Kukan, 1999; Burden a kol., 2003; Cory a Mayers, 2003). Ve skupině betabakulovirů byl molekulárně potvrzen vertikální přenos Plodia interpunctella GV (PiGV) subletálně infikovanými housenkami zavíječe paprikového Plodia interpunctella (Burden a kol., 2002). Vertikální přenos byl také studován u CpGV, avšak výsledky prací nebyly vţdy zcela jasné. Například výsledky experimentů Steineke (2004) byly znehodnoceny CpGV kontaminací negativní kontroly. Podobně nejasné kontaminace housenek negativních kontrol uvádí ve své diplomové práci i Perchat (1998). To můţe znamenat, ţe housenky v kontrolní skupině neošetřené virem měly v sobě přítomen virus v latentní či perzistentní formě. Latence je charakterizována expresí jen několika či dokonce jen jednoho genu, zatímco při perzistenci probíhá exprese všech genů, ale na velmi nízké úrovni (Burden a kol., 2003). Latentní infekci v laboratorním chovu obaleče jablečného v Britské Kolumbii (Kanada) popisují Cossentine a kol. (2005) a domnívají se, ţe přenos na potomstvo je zajištěn transovariálně (ve vajíčku). Je tedy zřejmé, ţe vertikální přenos bude hrát roli také v přenosu CpGV, ovšem do dnešní doby nebyl jednoznačně potvrzen Transpozony v CpGV V roce 1995 byli identifikováni mutanti viru CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5, kteří obsahovali transponovatelný element (transpozon) pocházející z hostitele. Tyto transpozony se do CpGV dostaly horizontálně v průběhu infekce obaleče jablečného a obaleče Cryptophlebia leucotreta. Mutant CpGV-MCp4 obsahoval transpozon TCp3.2, coţ je 3,2 Kbp dlouhý úsek DNA začleněný původně do genomu obaleče jablečného (Jehle a kol., 1997). 30

32 V pozdější studii Arends a Jehle (2002) zjistili, ţe v průběhu klonování CpGV-MCp4 in vivo došlo k inverznímu vloţení TCp3.2. Tento mutant byl nazván CpGV-MCp4inv. Druhý mutant CpGV-MCp5 získal transpozon TCl4.7 z genomu obaleče C. leucotreta. Tento transpozon je 4,7 Kbp dlouhý (Jehle a kol., 1997). Arends (2004) stanovil u CpGV-M a mutantů CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5 střední letální dávku (LD 50 ) pro pátý instar (L5) housenek obaleče jablečného a nenalezl rozdíly ve virulenci, avšak stanovení středního letálního času (ST 50 ) u L5 housenek obaleče jablečného ukázalo, ţe ST 50 je u CpGV-M signifikantně kratší neţ u mutantů CpGV-MCp4 a CpGV-MCp5. V letech sledovali Kundu a kol. (2003) přítomnost TCp3.2 v housenkách čtyř přírodních populací obaleče jablečného v ČR. Četnost výskytu transponovatelného elementu TCp3.2 se lišila mezi populacemi a lety sběru housenek. Nebyla nalezena souvislost mezi ošetřením housenek obaleče jablečného CpGV preparáty a četností výskytu TCp Citlivost obaleče jablečného k CpGV - laboratorní hodnocení Je všeobecně známo, ţe vnímavost larev k bakulovirové infekci klesá s jejich vývojem, a to nejen mezi instary, ale i v průběhu růstu jednotlivých instarů (Cory a Mayers, 2003). Také u housenek obaleče jablečného je k CpGV nejvnímavější první instar (L1), který je navíc jako jediný z instarů snadno zasaţitelný přípravkem na bázi CpGV, protoţe jinak se obaleč jablečný vyvíjí skrytě (Steineke, 2004). Údaje o citlivosti L1 housenek infikovaných CpGV v laboratorních podmínkách uvádí celá řada autorů (Lacey a kol., 2002; Lacey a kol., 2005; Asser-Kaiser a kol., 2007; Eberle a kol., 2008, Berling a kol., 2009). Nejběţnější metodou pro hodnocení citlivosti obaleče k CpGV nebo porovnání virulence různých izolátů CpGV je biologický test na umělé dietě kontaminované virem. Existují dva základní postupy pro přípravu virem kontaminované umělé diety. Buď je virus míchán přímo do diety, nebo je aplikována suspenze viru na povrch diety (Hunter-Fujita a kol., 1998). V obou případech je vytvořena koncentrační řada viru a u housenek je v různé době po infekci hodnocena mortalita statisticky probitovou analýzou, kterou prvně formuloval Chester Ittner Bliss v roce 1934 (Bliss, 1935; Bliss, 1938). Finney (1971) vytvořil model probitové analýzy, která je pouţívána dodnes. Nejčastěji je probitovou analýzou zjišťována střední letální koncentrace (LC 50 ) popřípadě střední letální dávka (LD 50 ), coţ je vypočítaná koncentrace/dávka OB CpGV, při které je usmrcena polovina jedinců. V případě, ţe je virus míchán do diety, je LC 50 uváděna OB/ml, při aplikaci na povrch bývají jednotky OB/mm 2 (Hunter-Fujita a kol., 1998). S povrchovou aplikací CpGV se setkáme například v pracích Lacey a kol. (2002), Lacey a kol. (2005) a Berling a kol. (2009). Metodě aplikace viru do diety dali přednost Fritsch a kol. (2005), Asser-Kaiser a kol. (2007) či Eberle a kol. (2008). Metody aplikace viru jsou dvě, ale 31

33 termínů pro hodnocení mortality je celá řada. Jehle a kol. (2006c) uvádí, ţe housenky obaleče jablečného nakaţené krátce po vylíhnutí podléhají infekci za 5-7 dnů, proto autoři vyuţívají k hodnocení 6. den (Fritsch a kol., 2005), 7. den (Lacey a kol., 2005; Asser-Kaiser a kol., 2007; Eberle a kol., 2008, Berling a kol., 2009) či 10. den (Lacey a kol., 2002). Z důvodu selekce k CpGV rezistentních populací obaleče byl zaveden také termín hodnocení po 14 dnech, kdy jsou kontrolní housenky při standardní teplotě C v posledním 5. instaru (Fritsch a kol., 2005), popřípadě aţ po 21 dnech, kdy je většina housenek v kontrole zakuklena (Asser-Kaiser a kol., 2007) Rezistence obaleče jablečného k CpGV První případy sníţené účinnosti biopreparátů na bázi CpGV proti obaleče jablečnému byly zaznamenány v roce 2002 ekologickým pěstitelem v jiţním Bádensku (Německo). CpGV zde byl aplikován od roku 1996 (Fritsch a kol., 2005). Další populace se sníţenou náchylností k CpGV byly objeveny v několika sadech nejen v Německu, ale i ve Francii a později také ve Švýcarsku, Itáli, Holandsku a Rakousku (Fritsch a kol., 2005; Sauphanor a kol., 2006; Jehle a kol., 2006c; Zingg a Kessler, 2007; Asser-Kaiser a kol., 2007, Jehle a Schmitt, 2009). Ve všech v Evropě dostupných CpGV biopreparátech je pouţit mexický izolát CpGV-M, který nedokáţe housenky rezistentní populace obaleče jablečného usmrtit (Jehle, 2008a). Účinnost CpGV-M byla hodnocena v průběhu třech let ( ) biologickými testy u housenek (L1) pocházejících ze 13 ze sadů na jihu Německa, kde byla pozorována sníţená účinnost biopreparátů a u několika populací citlivých L1 housenek z přírody resp. laboratorního chovu. Biologický test byl hodnocen po 14 dnech probitovou analýzou a byly stanoveny střední letální koncentrace (LC 50 ). Housenky jedenácti sledovaných přírodních populací byly 1000 krát a ve dvou případech dokonce krát méně citlivé neţ k viru senzitivní housenky z přírody a laboratorního chovu a bylo prokázáno, ţe se jedná o dědičnou rezistenci obaleče jablečného k CpGV-M (Asser-Kaiser a kol., 2007). Původní hypotéza, ţe je rezistence k CpGV zaloţena autozomálně s neúplnou dominancí (Eberle a Jehle, 2006), byla o rok později vyvrácena Asser-Kaiser a kol. (2007). Eberle a Jehle (2006) kříţili citlivé (CpS) a rezistentní (CpR) obaleče ve skupinách (cca 30 x 30 ) (Jehle 2008a), zatímco Asser-Kaiser a kol. (2007) kříţili jednotlivé páry. Při kříţení zjistili, ţe CpR stále obsahuje citlivé jedince, proto pod dalším selekčním tlakem (CpGV-M v diskriminační koncentraci 5,8x10 4 OB/ml) získali čistě rezistentní kmen CpRR1. Poté kříţili jednotlivé páry CpS x CpRR1 a CpS x CpRR1 a jejich hybridní potomstvo zpětně kříţili s CpRR1 nebo CpS. Podle výsledků testů potvrdili hypotézu, ţe rezistence k CpGV-M je zaloţena dominantně na pohlavním chromozomu Z. U většiny motýlů a také u 32

34 obalečovitých je u samic pohlaví zaloţeno heterogameticky ZW, zatímco samci mají dva stejné chromozomy ZZ (Traut a Marec, 1997). Toto dominantní zaloţení rezistence na pohlavním chromozomu Z vede při selekčním tlaku biopreparáty na bázi CpGV-M k rychlejšímu rozšíření rezistentních jedinců neţ kdyby byla rezistence zaloţena autozomálně (Asser-Kaiser a kol., 2007). Ovšem dominantně se rezistence dědí jen při dávkách viru do koncentrace ~ 1x10 4 OB/ml. Při vysokých dávkách přeţívají samičky Z R W a samci Z R Z R, ale heterozygotní samci Z S Z R hynou v posledním instaru housenky (obrázek 2.9). Dominance je tedy závislá na koncentraci viru, kdy je faktor rezistence u heterozygotních samců Z S Z R 1000 a u samic Z R W a samců Z R Z R dosahuje faktor rezistence dokonce Faktor rezistence byl stanoven jako podíl LC 50 laboratorního kmene CpRR1 a LC 50 referenčního citlivého kmene CpS (Jehle a Schmitt, 2009). Další práce na téma zaloţení rezistence u heterogenní populace (CpR) z přírody byla vydána v roce 2010 (Asser-Kaiser a kol., 2010). V této práci byly kříţeny různé páry CpR populace (CpR xcpr ), hybridní páry CpR (CpS xcpr či CpR xcps ) a také bylo provedeno zpětné kříţení potomstva hybridního kříţení. Následné biologické testy při diskriminační koncentraci 5,8x10 4 OB/ml prokázaly, ţe je i zde dědičnost rezistence zaloţena pouze dominantně na pohlavním chromozomu Z, a ţe při diskriminační koncentraci platí dědičnost tak, jak je uvedeno na obrázku 2.9 ve sloupci běţná dávka (Asser-Kaiser a kol., 2010; Stará a kol., 2009). Ze závěrů Asser-Kaiser (2010) vyplývá, ţe rezistence k CpGV, na rozdíl od jiných pozorovaných rezistencí, nesniţuje jedinům jejich fitness. Tyto informace jsou podloţeny třemi lety, kdy byl chov kmene CpR udrţován bez selekce virem a nedošlo u něho ke změně poměru citlivých a rezistentních jedinů. Lze předpokládat, ţe i v sadech, kde se selektují rezistentní jedinci, nedojde po odstranění selekčního tlaku k zpětnému nastolení převahy citlivých jedinců. Kromě dědičnosti rezistence byl studován také mechanismus rezistence k CpGV (Asser-Kaiser a Jehle, 2009; Asser-Kaiser, 2010). Byly provedeny tři různé experimenty, které měly vysvětlit mechanismus rezistence. Zjistilo se, ţe rezistentní housenky nelze infikovat OB (obsahují typ částic ODV) přijatými potravou ani druhým typem částic (BV) injektovaným do hemocoelu housenek L4. Hemolymfa infikovaných rezistentních housenek vstříknutá do citlivých housenek nevyvolala infekci, protoţe neobsahovala BV. Vstřikováním BV do hemocoelu rezistentních housenek nedošlo ke vzniku infekce, zatímco citlivé housenky hynuly do 7 dnů. Závěrem těchto pokusů bylo, ţe infekce není blokována ve středním střevě, ale je blokována sekundární infekce ve všech typech buněk. 33

35 Obrázek 2.9: Schématické zobrazení dědičnosti rezistence k CpGV podle výsledků Asser-Kaiser a kol. (2007). Rezistence je děděna přes pohlavní chromozóm Z. R=rezistentní alela, S=citlivá alela. Autorem obrázku je V. Falta; publikováno Stará a kol. (2009). Poté, co byla prokázána rezistence k izolátu CpGV-M, započalo hledání nových účinnějších izolátů viru. V laboratořích Andermatt Biocontrol AG pasáţovali izolát CpGV-M přes rezistentní housenky a selektovali tak nový účinný izolát (Zingg a Kessler, 2007; Jehle a Schmitt, 2009). Jeho účinnost byla hodnocena roku 2006 nejen laboratorně biologickými testy, ale i polními pokusy v pěti vybraných sadech. Účinnost přípravku byla vysoká na rezistentní i citlivé populace obaleče jablečného (Zingg a Kessler, 2007). Obchodní název nového biopreparátu je Madex Plus a v roce 2008 byl registrován ve Švýcarsku (Jehle a Schmitt, 2009). V současné době jsou studovány další izoláty CpGV, které se od CpGV-M liší geneticky i biologickou aktivitou a mohou být významné v antirezistentní strategii (Rezapanah a kol., 2008; Jehle a Schmitt, 2009; Eberle, 2010). 34

36 3 Cíle práce Cílem práce bylo vyhodnotit v laboratorních podmínkách vztahy mezi CpGV a jeho hostitelem obalečem jablečným. Podle dílčích cílů byla práce rozdělena na čtyři části. Dílčími cíli bylo: 1) Porovnat dvě základní metody aplikace viru a vyhodnotit vliv pouţité diety na účinnost viru (4 Cíl I). Byly testovány následující hypotézy: Pouţívání různých diet pro biologické testy nemá vliv na mortalitu housenek obaleče jablečného při zamíchání CpGV do diety. Pouţívání různých diet pro biologické testy má vliv na mortalitu housenek obaleče jablečného při povrchové aplikaci CpGV. Vývoj housenek se na odlišných dietách neliší. 2) Vyhodnotit v letech citlivost laboratorního kmene (CpKrym) a různých českých populací škůdce k izolátu CpGV-M, který je běţně pouţíván v komerčně dostupných biopreparátech (5 Cíl II). Byly testovány následující hypotézy: Housenky laboratorního kmene obaleče jablečného CpKrym jsou k CpGV-M vysoce citlivé. Citlivost populací obaleče jablečného pocházejících z různých míst ČR je k CpGV-M vysoká. 3) V případě, ţe bude zjištěna rezistence polních populací obaleče jablečného k CpGV, stabilizovat rezistentní kmen (CpR-CZ), ověřit zaloţení rezistence a otestovat nové izoláty viru (6 Cíl III). Byly testovány následující hypotézy: Rezistence CpR-CZ je zaloţena na pohlavním chromozomu Z. Citlivost homogenně rezistentního kmene CpR-CZ k novým izolátům CpGV je vysoká. 4) Optimalizovat metody rutinní detekce CpGV v hostiteli za pomoci polymerázové řetězové reakce (PCR). Mimo jednoduché PCR detekce CpGV optimalizovat také duplex PCR pro detekci viru s vnitřní kontrolou (hostitelskou DNA) v jedné reakci. Připravit metody izolace a detekce virové mrna genu pro granulin pro studium vertikálního přenosu CpGV (7 Cíl IV). 35

37 4 Cíl I: Porovnání vlivu pouţité diety a metody aplikace na účinnost CpGV 4.1 Metodika Zdroj obaleče jablečného Chov citlivého kmene obaleče jablečného (CpS) byl zaloţen v JKI (dříve BBA) v Darmstadtu (Německo). Experimenty byly prováděny v DLR Rheinpfalz, Neustadt a. d. Weinstrasse (Německo), kde byly housenky obaleče chovány individuálně na semi syntetické dietě připravené podle Ivaldi-Sender (1964) viz příloha A.2. Po 14 dnech byly housenky vyndány z diety a ponechány v páscích z vlnité lepenky ke kuklení. Za týden byly z pásků vyndány kukly, které byly po skupinách přeneseny do chovných klícek vyloţených polyethylenovým sáčkem, na který samice kladly vajíčka. Podmínky pro chov a experimenty byly: 26 C, 60% relativní vlhkost a 16L:8D h fotoperioda Zdroj CpGV Pro hodnocení citlivosti populací obaleče jablečného k viru slouţil purifikovaný izolát CpGV-M (EU standard) Kvantifikace CpGV pro biologické testy Před pouţitím izolátu viru byla provedena kvantifikace částic v zásobní suspenzi. Výchozí koncentrace okluzních tělísek (OB) purifikovaného izolátu CpGV byla stanovena počítáním OB v ředěné suspenzi viru v počítací komůrce (Petroff - Hausser couting chamber, hloubka: 0,02 mm, Hausser Scientific, PA, USA) obrázek 4.1. Obrázek 4.1: Počítací komůrka Petroff-Hausser (hloubka 0,02 mm) pro kvantifikaci izolátů CpGV. A) Celá počítací komůrka. B) Detail centrální části komůrky. Počítání okluzních tělísek bylo provedeno v úhlopříčce pěti velkých čtverců, které jsou rozděleny na 16 menších čtverců. Suspenze byla připravena postupným ředěním redestilovanou vodou (1:10) s výsledným poměrem 1: (suspenze:voda). Optickým mikroskopem Olympus CX 41 36

38 RF, Olympus Optical Co., Ltd. či Leica (DMBRE) s temným polem při celkovém zvětšení 400 x byly částice počítány úhlopříčně v pěti velkých čtvercích obrázek 4.1 B dvakrát po sobě z jednoho ředění viru a poté z druhého nezávislého ředění viru. Pro výpočet byla pouţita tabulka uvedená v příloze C.1. Postup kvantifikace byl převzat na stáţi v DLR Rheinpfalz Příprava umělých diet obsahujících CpGV Diety podle Ivaldi-Sender (1975), dále jen Iv-S a podle Guennelon a kol. (1981), dále jen Guenn byly připraveny podle předpisu v příloze A.2 a A.3 jen s tím rozdílem, ţe pro přípravu Iv-S bylo pouţito jen 5 g agaru pro snazší zamíchání viru do diety. Pro biologický test bylo pouţito 45 ml diety o teplotě 40 C, která byla skleněnou tyčinkou dobře promíchána s 5 ml vodní virové suspenze za vzniku koncentrační řady s jednotkou uvádějící počet okluzních tělísek v mililitru diety (OB/ml). Do kontrolní diety (45 ml) bylo přidáno 5 ml vody. Komerčně dostupná instantní dieta Manduca Premix-Heliothis premix (Stonefly Industries, Inc., Bryan, TX, USA) dále jen Premix, byla připravena za studena z práškového premixu a vodné suspenze viru v poměru 1:3 (12,5 g premixu, 37,5 ml suspenze viru) za vzniku koncentrační řady. Do kontrolní diety byla přidána čistá voda. Výsledný objem diety byl 50 ml. Testovací boxy (odkládací box na zkumavky, Neolab) byly plněny dietami od kontroly bez viru aţ po nejvyšší koncentraci viru, aby se zamezilo kontaminaci kontrol virem. Bylo testováno šest koncentrací viru: 3x10 2 ; 10 3 ; 3x10 3 ; 10 4 ; 3x10 4 ; 10 5 OB/ml Příprava umělých diet s povrchovou aplikací CpGV V tomto experimentu byly porovnány jen dvě diety Iv-S a Premix. Diety byly připraveny v objemu 50 ml bez obsahu viru podle přílohy A.2 a A.3. Druhý den po přípravě bylo na povrch diety v kaţdé komůrce aplikováno za pomoci dávkovací pipety (Multipette Plus, Eppendorf) 30 μl vody (kontrola) nebo vodné suspenze viru o různých koncentracích za vzniku koncentrační řady s jednotkou uvádějící počet okluzních tělísek na milimetru čtverečním diety (OB/mm 2 ). Rozsah aplikovaných koncentrací se mezi dietami lišil. Na povrch diety Iv-S bylo aplikováno šest různých koncentrací: 0,0208; 0,0625; 0,208; 0,625; 2,08; 6,25 OB/mm 2, zatímco na Premix bylo aplikováno sedm koncentrací: 0,0625; 0,208; 0,625; 2,08; 6,25; 20,8; 62,5 OB/mm 2. Povrch diety Iv-S byl po aplikaci suspenze vysušen v digestoři. 37

39 4.1.6 Testování vlivu sloţení diety a metody aplikace CpGV na mortalitu v biologickém testu Čerstvě vylíhlé housenky byly za pomoci štětečku umístěny do jednotlivých komůrek naplněných dietou. Tento den se do hodnocení biologického testu nezapočítával a byl označen jako den 0. První den po přípravě testu byla vyhodnocena mortalita způsobená manipulací s housenkami. Mrtvé housenky ze dne 1 nebyly do pokusu započítány. Sedmý a čtrnáctý den byla hodnocena mortalita v kontrole a ve virem kontaminovaných boxech. Statisticky byla mortalita vyhodnocena probitovou analýzou za pomoci statistického software XLSTAT 2010 (Addinsoft, USA). Mortalita v kontrolách byla při vyhodnocování testů přepočtena dle Abbotta (1925). Biologický test byl s kaţdou dietou a metodou aplikace proveden ve třech nezávislých opakováních. Pro jedno opakování (všechny druhy diet) byl vţdy virus nově kvantifikován. Výsledkem probitové analýzy bylo stanovení středních letálních koncentrací (LC 50 ) s 95% konfidenčními limity (pásy spolehlivosti) pro jednotlivé diety a metody aplikace viru ze všech opakování. Rozdíly mezi LC 50 a sklony křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV byly pro jednotlivé diety vyhodnoceny porovnáním 95% konfidenčních intervalů. Rozdíly v hodnotách LC 50 sklonů křivek byly povaţovány za statisticky významné v případě, ţe se nepřekrývaly jejich 95% konfidenční intervaly (Tabashnik a kol., 1987) Testování vlivu sloţení diety na vývoj obaleče jablečného Vývoj obaleče jablečného byl hodnocen na třech dietách Guenn, Iv-S a Premix třikrát ve stádiu housenky (po 1, 7 a 14 dnech) a ve stádiu kukly (po 21 dnech) ve viruprostých kontrolách biologického testu. První a druhé hodnocení bylo zaměřeno na porovnání přirozené mortality housenek na jednotlivých dietách. Den po umístění housenek na dietu byla vyhodnocena mortalita, která však byla ovlivněna fitness housenek a manipulací při přenosu housenek na povrch diety. Z tohoto důvodu byla mortalita housenek hodnocena ještě po 7 dnech a vztaţena k počtu housenek, které přeţily den po umístění na dietu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal-Wallisovým testem (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA). Další dvě hodnocení byla zaloţena na porovnání hmotnosti obaleče jablečného v různých fázích vývoje. Po 14 dnech byly všechny housenky, které dosáhly posledního instaru (L5), rozděleny podle pohlaví, zváţeny a ponechány v páscích z vlnité lepenky na zakuklení. Kukly byly 21. den vyndány z lepenky a zváţeny (opět samice a samci zvlášť). Pomocí neparametrického testu Mann-Whitney (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA) byl nejprve hodnocen rozdíl mezi hmotností housenek resp. kukel samců a samic, který by se měl lišit (Howell, 1991). Poté byla testována hypotéza, zda se hmotnost housenek resp. kukel mezi 38

40 dietami neliší u samic a samců zvlášť pomocí neparametrického testu Kruskal-Wallis (XLSTAT 2010, Addinsoft, USA). Pokus byl proveden ve třech nezávislých opakováních. Pro kaţdé opakování byly pouţity dva boxy s dietou. V jednom opakování bylo hodnoceno housenek resp. kukel Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Do diet Guenn a Iv-S je během přípravy přidáván absolutní etanol, ve kterém jsou rozpuštěny látky omezující rozvoj mikroskopických hub a kvasinek, zatímco dieta Premix etanol neobsahuje. Součástí experimentu bylo připravit diety Guenn a Iv-S standardním postupem, avšak jeden box s připravenou dietou Guenn a Iv-S uzavřít víkem jiţ po zchladnutí za 1,5 h. Pro potřeby biologických testů byly boxy s dietou ponechány nezakryté do druhého dne (minimálně 16 h). Druhý den byly na diety připravené standardně i se zkrácenou dobou větrání umístěny čerstvě vylíhlé housenky. Jako kontrola slouţila dieta Premix neobsahující etanol. Experiment byl vyhodnocen po 10 dnech, kdy se většina housenek chovných za stálé teploty 26 C nachází v L4 nebo L5 (Steineke a kol., 2002). 4.2 Výsledky Mortalita na dietách obsahujících CpGV Závislost mortality housenek na koncentraci CpGV v různých dietách 7 a 14 dní po umístění housenek na dietu byla graficky znázorněna (obrázek 4.2). Ve všech dietách se výrazně projevil trend zvyšující se mortality s koncentrací CpGV v dietě a s počtem dnů od umístění housenek na dietu. Porovnáním LC 50 stanovených po 7 a 14 dnech bylo zjištěno, ţe se LC 50 sníţila u jednotlivých diet: 5,8 krát (Guenn), 4 krát (Iv-S) a 5,6 krát (Premix). Variabilita mortality mezi jednotlivými opakováními byla nejniţší u diety Premix (graf na obrázku 4.2 C) a nejvyšší na dietě Iv-S (graf na obrázku 4.2 B). Mortalita v kontrolách byla u všech sledovaných diet nízká do 2,5 % po sedmi dnech a do 3,5 % po čtrnácti dnech. Střední letální koncentrace CpGV a jejich 95% konfidenční limity na různých dietách po sedmi a čtrnácti dnech uvádí tabulka 4.1. Na základě porovnání 95% konfidenčních limitů bylo zjištěno, ţe se mortalita housenek na dietě Premix po sedmi i čtrnácti dnech statisticky významně lišila od mortality na dietách Guenn a Iv-S. Diety Guenn a Iv-S se nelišily. LC 50 na dietě Premix byla po sedmi dnech 2,6 krát vyšší v případě porovnání s Iv-S a 1,8 krát vyšší při porovnání s Guenn. Po čtrnácti dnech se rozdíl sníţil a LC 50 byla 1,9 krát vyšší 39

41 při porovnání s Guenn i Iv-S. Sklon křivek se po 7 a 14 dnech biologického testu statisticky významně nelišil. Obrázek 4.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV zamíchaného do diety A) Guenn, B) Iv-S a C) Premix. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech nezávislých opakování testu. 40

42 druh diety počet housenek v testu (n) LC 50 (OB/ml x10 3 ) 7 dní 95% konf. limity (OB/ml x10 3 ) χ 2 sklon 95% konf. limity Guenn 599 1,807 1,487 2,174 a 167,62 1,85 1,57 2,13 a Iv-S 606 1,248 1,013 1,512 a 156,38 1,77 1,50 2,05 a Premix 605 3,236 2,685 3,892 b 220,50 1,69 1,46 1,91 a 14 dní Guenn 599 0,311 0,219 0,401 a 69,89 1,83 1,40 2,26 a Iv-S 606 0,310 0,211 0, 411 a 73,77 1,64 1,27 2,02 a Premix 605 0,581 0,455 0,714 b 109,49 1,86 1,51 2,20 a Tabulka 4.1: Střední letální koncentrace CpGV na různých dietách při míchání viru do diety. Hodnoceno po 7 a 14 dnech, tři nezávislá opakování. Konfidenční limity s rozdílnými symboly indikují statisticky významný rozdíl mezi dietami v LC 50 resp. sklonu křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV Mortalita na dietách povrchově ošetřených CpGV Závislost mortality housenek na koncentraci CpGV na dietách Iv-S a Premix povrchově ošetřených CpGV je graficky znázorněna na obrázku 4.3. U obou diet se projevil trend rostoucí mortality se zvyšující se koncentrací CpGV. U diety Iv-S se výrazně neprojevil trend zvyšující se mortality s počtem dnů od umístění housenek na virem ošetřenou dietu. LC 50 stanovená po 7 dnech na dietě Iv-S byla jen 1,6 krát vyšší neţ po 14 dnech. LC 50 zjištěná po 7 dnech na dietě Premix byla naproti tomu téměř 2,9 krát vyšší neţ po 14 dnech. V porovnání s metodou aplikace viru do diety byl rozdíl mezi LC 50 stanovenými v rozmezí sedmi dnů niţší. Výsledky jednotlivých opakování se méně lišily u diety Iv-S obrázek 4.3 A. Mortalita v kontrolách byla u obou diet nízká do 1 % po sedmi dnech a do 3,5 % po čtrnácti dnech. Mortalita housenek na dietě Premix se po sedmi i čtrnácti dnech statisticky významně lišila od mortality na dietě Iv-S (tabulka 4.2). Zatímco v testu, kde byl virus míchán do diety, byly 95% konfidenční limity různých diet blízko u sebe (tabulka 4.1), při povrchové aplikaci nedošlo k přiblíţení křivek resp. jejich 95% konfidenčních limitů (tabulka 4.2). Rozpětí aplikovaných koncentrací muselo být z tohoto důvodu odlišné. Na dietu Iv-S byl virus aplikován v koncentracích 0,0208-6,25 OB/mm 2, zatímco na premix byly aplikovány vyšší koncentrace 0, ,5 OB/mm 2. Střední letální koncentrace stanovená pro dietu Premix byla 15,1 krát (7. den) a 8,6 krát (14. den) vyšší neţ u diety Iv-S. Rozdíl mezi dietami se s délkou testu podobně jako u aplikace viru do diety sníţil, ovšem stále byl statisticky významně odlišný. Sklon křivek se po 7 a 14 dnech biologického testu statisticky významně nelišil. 41

43 Obrázek 4.3: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV aplikovaného na povrch diety A) Iv-S a B) Premix. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech nezávislých opakování testu. druh diety počet housenek v testu (n) LC 50 (OB/mm 2 ) 7 dní 95% konf. limity (OB/mm 2 ) χ 2 sklon 95% konf. limity Iv-S 561 0,257 0,207 0,315 a 191,44 1,53 1,32 1,75 a Premix 708 3,885 3,202 4,740 b 263,03 1,52 1,34 1,70 a 14 dní Iv-S 561 0,157 0,126 0,193 a 170,83 1,57 1,33 1,80 a Premix 708 1,351 1,070 1,663 b 127,39 1,61 1,33 1,89 a Tabulka 4.2: Střední letální koncentrace CpGV na různých dietách při povrchové aplikaci viru na dietu. Hodnoceno po 7 a 14 dnech, tři nezávislá opakování. Konfidenční limity s rozdílnými symboly indikují statisticky významný rozdíl mezi dietami v LC 50 resp. sklonu křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV. 42

44 4.2.3 Vývoj obaleče jablečného na různých dietách První den po umístění housenek na povrch diety byla průměrná mortalita ze třech opakování testu na dietě Genn 2,38 % (SD=2,15), Iv-S 1,90 % (SD=2,95) a Premix 3,33 % (SD=4,58). Pomocí Kruskal-Wallisova testu na hladině významnosti α=0,05 (p=0,831) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se přirozená mortalita na různých dietách nelišila. Po sedmi dnech od umístění housenek na dietu byla mortalita vztaţena k prvnímu dni, kdy uţ mortalita nebyla ovlivněna manipulací a ţivotaschopností housenek. Na dietě Genn uhynulo v průměru 1,96 % (SD=3,56), Iv-S 0,95 % (SD=1,48) a Premix 1,46 % (SD=2,41). Přirozená mortalita se proti prvnímu hodnocení sníţila a pomocí Kruskal-Wallisova testu na hladině významnosti α=0,05 (p=0,901) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se přirozená mortalita na různých dietách nelišila. Po 14 dnech bylo provedeno zhodnocení hmotnosti housenek na jednotlivých dietách. Nejprve byla stanovena průměrná hmotnost a SD ze všech 272 samců (61,51 mg; SD=11,71) a 263 samic (80,30 mg; SD=15,40) obrázek 4.4 A. Pomocí Mann-Whitney testu na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) bylo potvrzeno, ţe se hmotnost housenek samců a samic statisticky významně liší. Obrázek 4.4: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti samců a samic A) housenek L5 B) kukel ze všech diet. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota. Poté byly housenky samců resp. samic ze všech třech opakování experimentu sloučeny. Celkem byla hodnocena hmotnost 94 samců a 90 samic pocházejících z diety Guenn, 105 samců a 93 samic z diety Iv-S a 80 samců a 73 samic z diety Premix. Porovnání průměrné hmotnosti samců a samic z jednotlivých diet je graficky znázorněno v krabicovém grafu na obrázku 4.5. Průměrná hmotnost samců a výběrová směrodatná odchylka (SD) byla u Guenn 62,64 mg (SD=11,24), Iv-S 64,03 mg (SD=10,45) a Premix 56,43 mg (SD=12,60). Průměrná hmotnost samic byla vyšší: Guenn 78,82 mg (SD=14,16), Iv-S 81,83 mg 43

45 (SD=14,66), Premix 80,18 mg (SD=17,49). Rozdíl mezi hmotností housenek samců resp. samic byl vyhodnocen Kruskal-Wallisovým testem. Na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) byla zamítnuta hypotéza, ţe se hmotnost samců z různých diet neliší. Hmotnost housenek samců z diety Premix se statisticky významně lišila. V případě hodnocení housenek samic byla při α=0,05 (p=0,316) potvrzena nulová hypotéza, ţe hmotnost housenek samic se v různých dietách neliší. Obrázek 4.5: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti A) housenek samců ab) housenek samic na třech odlišných dietách. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota. Po 21 dnech byla hodnocena hmotnost kukel na jednotlivých dietách. Nejprve byla stanovena průměrná hmotnost a výběrová směrodatná odchylka (SD) ze všech 252 samců (36,85 mg, SD=5,61) a 243 samic (45,10 mg; SD=5,61), u kterých došlo k úspěšnému zakuklení obrázek 4.4 B. Pomocí Mann-Whitney testu bylo na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) potvrzeno, ţe se hmotnost kukel samců a samic statisticky významně liší. Pro statistické hodnocení rozdílu mezi dietami byly sloučeny kukly samců resp. samic ze všech třech opakování experimentu dohromady. Celkem byla hodnocena hmotnost 87 samců a 82 samic pocházejících z diety Guenn, 98 samců a 90 samic z diety Iv-S a 67 samců 71 samic z diety Premix. Porovnání průměrné hmotnosti samců a samic z jednotlivých diet je graficky znázorněno v krabicovém grafu na obrázku 4.6. Průměrná hmotnost kukel samců a výběrová směrodatná odchylka (SD) byla u Guenn 37,64 mg (SD=5,29), Iv-S 37,95 mg (SD=7,39), Premix 34,23 mg (SD=6,43). Průměrná hmotnost kukel samic byla vyšší: Guenn 46,18 mg (SD=14,16), Iv-S 45,90 mg (SD=14,66), Premix 42,79 mg (SD=17,49). Rozdíl mezi hmotností kukel samců resp. samic byl vyhodnocen Kruskal- Wallisovým testem. Na hladině významnosti α=0,05 (p<0,0001) byla zamítnuta hypotéza, ţe se hmotnost kukel samců z různých diet neliší. Hmotnost kukel samců z diety Premix byla statisticky významně niţší. V případě hodnocení kukel samic byla při α=0,05 (p=0,001) 44

46 zamítnuta hypotéza, ţe hmotnost kukel samic se v různých dietách neliší. Také zde byla hmotnost samičích kukel z diety Premix niţší. Obrázek 4.6: Krabicový graf porovnávající mediány a průměrné hmotnosti A) kukel samců a B) kukel samic na třech odlišných dietách. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota Vliv reziduálního etanolu na rychlost vývoje housenek Výsledky pokusu hodnotícího vliv reziduálního etanolu na vývoj housenek obaleče jablečného ukazují grafy na obrázku 4.7. V boxech s dietou Guenn i Iv-S, které byly uzavřeny jiţ po 1,5 h převládal instar L4 nad L5. Podíl L4 a L5 v dietách Guenn a Iv-S standardně připravených se příliš nelišil od referenční diety Premix (L4 41,8 %; L5 53,7 %). Na dietě Guenn byl vývoj pomalejší (o 13,4 % L5 méně) a na dietě Iv-S rychlejší (o 8,5 % L5 více) v porovnání s dietou Premix. Zastoupení L4 a L5 housenek na dietě Guenn s reziduálním etanolem se významně lišilo od zastoupení v standardně připravené dietě (obrázek 4.7 A). Podíl L4 housenek činil 93,9 % a L5 byly zastoupeny jen 6,1 %, zatímco v standardně připravené dietě Guenn bylo 52,2 % L4 a 40,3 % L5. Rozdíl v zastoupení instarů L4 a L5 byl odlišný také na dietě Iv-S s reziduálním etanolem a standardní přípravou (obrázek 4.7 B), ovšem nebyl tak výrazný jako v případě diety Guenn. Na dietě Iv-S s reziduálním etanolem činilo zastoupení housenek L4 53,1 % a L5 37,5 %. V standardně připravené dietě Iv-S převaţoval počet L5 nad L4 (L4 33,3 %; L5 62,3 %). Podíl housenek niţších instarů (L2, L3) nebyl významný ani na dietách připravovaných standardně, ani s reziduálním etanolem a pohyboval se od 0 do 7 %. 45

47 Obrázek 4.7: Zastoupení jednotlivých instarů po 10 dnech vývoje na dietách Guenn a Iv-S při dodrţení standardní přípravy diety a při nedostatečném odpaření etanolu z uvařené diety. A) porovnání rychlosti vývoje na dietě Guenn, Premix-referenční dieta.; B) porovnání rychlosti vývoje na dietě Iv-S, Premixreferenční dieta. 4.3 Diskuze Cílem tohoto experimentu bylo porovnat vliv diety na mortalitu housenek při pouţití dvou zákadních metod aplikace viru (Hunter-Fujita a kol., 1998) a vybrat vhodnou metodu aplikace CpGV a sloţení diety pro testování citlivosti přírodních populací obaleče jablečného k CpGV (5 Cíl II). V prvním biologickém testu byl CpGV zamíchán do diety a byl porovnáván vliv třech diet na mortalitu housenek. Stanovené LC 50 ani sklon křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV se na dietách Guenn a Iv-S statisticky významně nelišily v ţádném z termínů hodnocení. Mezi dietami Guenn resp. Iv-S a Premix byly nalezeny statisticky průkazné rozdíly LC 50 v obou termínech hodnocení, sklon křivek závislosti mortality na koncentraci CpGV se statisticky nelišil. Horní mez 95% konfidenčního limitu LC 50 stanovená pro dietu Premix se nacházela v těsné blízkosti dolních mezí 95% konfidenčních 46

48 limitů diety Guenn po 7 dnech hodnocení a obou diet po 14 dnech hodnocení (tabulka 4.1). Při aplikaci viru do diety bylo moţné porovnat výsledky všech třech diet, přestoţe mortalita housenek na dietě Premix byla niţší. Diety Guenn a Iv-S se připravují vařením a osahují směs pšeničných klíčků, kukuřičné polenty a kvasnic v odlišném poměru. Součástí diet je také agar, který dietám dává pevnou konzistenci. Housenky se na těchto dietách zaţírají aţ po několika dnech a obvykle začínají ţír v rozích komůrek. Proti tomu je dieta Premix připravovaná za studena a bez agaru měkká, nemá hladký rovný povrch a housenky se obvykle do druhého dne zaţírají dovnitř diety v různých místech komůrky (obrázek 4.8). Dietu Premix je moţné rychle připravit a okamţitě pouţít, coţ je velmi příznivá vlastnost při práci s polními populacemi obaleče jablečného. Obrázek 4.8: Konzistence diety Premix (vlevo) a Iv-S (vpravo) se liší. Povrch diety Premix umoţňuje okamţité vsáknutí vody, zatímco povrch Iv-S diety je hladký, pevný a voda se musí z povrchu odpařit. Housenky se na dietě premix vţírají do druhého dne na různých místech (výřez vlevo), zatímco housenky na dietě Iv-S zůstávají několik dní na povrchu a obvykle začínají ţír v rozích a u stěn komůrek. Metodu aplikace viru do diety pouţívali také Fritsch a kol. (2005), Asser-Kaiser a kol. (2007) či Eberle a kol. (2008). Při stejných termínech hodnocení stanovili Eberle a kol. (2008) střední letální koncentraci k CpGV-M na dietě Iv-S pro housenky laboratorního kmene CpS 1,9x10 3 OB/ml (7 dní) a 0,145x10 3 OB/ml (14 dní), Asser-Kaiser (2010) uvádí ve své disertační práci LC 50 1,425x10 3 OB/ml (7 dní) a 0,501x10 3 OB/ml (14 dní). Tyto výsledky korespondují s našimi výsledky zjištěnými pro dietu Guenn a Iv-S. LC 50 stanovená Asser- Kaiser (2010) po 14 dnech dokonce koresponduje i s údaji zjištěnými pro dietu Premix (LC 50 =0,581x10 3 OB/ml). 47

49 Biologické testy druhého experimentu porovnávaly mortalitu housenek při aplikaci CpGV na povrch diety. Dieta Iv-S byla vybrána jako zástupce diety s agarem, pruhou testovanou dietou byl Premix. Předpokládali jsme, ţe odlišné vlastnosti diet (obrázek 4.8) povedou k rozdílnějším LC 50 neţ u rovnoměrného zamíchání viru do diety. Suspenze CpGV aplikovaná na povrch diety Iv-S zůstávala pouze na povrchu, zatímco při aplikaci na povrch diety Premix se suspenze okamţitě vsákla a tak částice mohly proniknout i hlouběji do diety. Naše výsledky potvrdily hypotézu, ţe má při této metodě pouţitá dieta vliv na mortalitu housenek. Střední letální koncentrace stanovená pro dietu Premix byla 15,1 krát (7. den) a 8,6 krát (14. den) vyšší neţ u diety Iv-S a 95% konfidenční limity LC 50 na těchto dietách byly od sebe vzdáleny (tabulka 4.2). Sklon křivek mortality se na dietách Iv-S a Premix nelišil v ţádném z termínů hodnocení, a přestoţe byl niţší neţ při aplikaci viru do diety, nebyly mezi sklony křivek mortality stanovenými pro obě metody nalezeny průkazné rozdíly. Porovnatelnost LC 50 při pouţití těchto dvou diet a metody aplikace CpGV na povrch diety nebyla moţná. Povrchovou aplikaci CpGV pouţívali v biologických testech například Berling a kol. (2009), Lacey a kol. (2005) a Lacey a kol (2008). Všichni hodnotili mortalitu sedmý den, ovšem pouţívali různé diety a uváděli odlišné hodnoty LC 50. Lacey a kol. (2005) ve své práci nezmiňují druh diety, který pouţili, ale dietu popsali tak, ţe měla pevný povrch, který byl před aplikací housenek vysušen. V pozdější práci Lacey a kol. (2008) uvádí, ţe v pokusu pouţili umělou dietu vyrobenou firmou Southland Products Incorporated (Lake Village, AR), která se prodává jiţ připravená a před pokusem se pouze rozvaří. Tato dieta stejně jako Iv-S obsahuje agar. Berling a kol. (2009) pouţili dietu od firmy Stonefly Industries, TX, tedy dietu Premix. Mortalita v pokusech Lacey a kol. (2005) po 7 dnech (LC 50 =0,06 OB/mm 2 ) je 4,3 krát niţší neţ mortalita v našich pokusech na dietě Iv-S, avšak pozdější práce Lacey a kol. (2008) uvádí LC 50 po 7 dnech 0,236 OB/mm 2, coţ plně koresponduje s našimi výsledky stanovenými pro dietu Iv-S (LC 50 =0,257 OB/mm 2 ). Lacey a kol. nepouţívali pro biologický test purifikovaný izolát viru CpGV-M, ale jeho formulovanou podobu preparát Cyd-X (Certis, USA), a tak lze odlišné výsledky vysvětlit tím, ţe se různé šarţe biopreparátů mohou ve své účinnosti lišit (Lacey a kol, 2008; Stará, 2002). Výsledky Berling a kol. (2009) bylo třeba pro porovnání s našimi výsledky nejprve přepočítat na společné jednotky, protoţe autoři aplikovali na povrch diety koncentrační řadu viru 0, ,2 OB/mm 2, ale LC 50 neuvádějí v jednotkách OB/mm 2, ale OB/μl. Tabulka 4.3 představuje přepočet mezi jednotkami OB/mm 2 a OB/μl. V další tabulce 4.4 jsou 48

50 porovnány LC 50 a LC 90 našeho experimentu s pokusem Berling a kol. (2009). Náš experiment byl porovnán pouze s výsledky citlivého kmene obaleče jablečného (Sv) k CpGV-M původem z Francie po 7 dnech v letech 2007 a 2008 (Berling a kol., 2009). Údaje známé z publikace Údaje podle podmínek Berling a kol. (2009) našich testů Termín hodnocení mortality (dny) 7 7 Objem diety v jedné komůrce (µl) Objem aplikované suspenze CpGV (µl) 6 30 Obsah povrchu komůrky (mm 2 ) Faktor* 4,666* 4,8* Aplikovaný rozsah OB/mm 2 0, ,2 0, Aplikovaný rozsah OB/µl ,3 998 Tabulka 4.3: *faktor nebyl v publikaci uveden, ale byl vypočítán jako podíl obsahu povrchu komůrky a objemu aplikované suspenze. Hodnoceno 7. den Naše testy Berling a kol. (2009) Berling a kol. (2009) Rok testování Označení kmene obaleče jablečného CpS Sv Sv Počet housenek v testu (n) LC 50 (OB/µl) 18,65 24,00 29,22 95 CL%(OB/µl) 15,37 22,75 14,10 35,86 13,87 49,27 LC 90 (OB/µl) 130,12 275,45 377,37 95 CL% (OB/µl) 96,89 188, ,83 512,48 231,96 725,56 Sklon 1,52 1,21 1,15 Tabulka 4.4: Porovnání výsledků povrchové aplikace CpGV-M na dietu Premix s výsledky Berling a kol. (2009). Přepočítaná LC 50 z našeho testu spadá do 95% konfidenčních limitů stanovených Berling a kol. (2009) v letech 2007 i 2008 tabulka 4.4. V případě LC 90 se 95% konfidenční limity vzájemně překrývají jen s rokem 2007, protoţe sklon křivek byl v našem biolgickém testu výrazně strmější neţ uvádí Berling a kol. (2009) pro rok Závěrem experimentu s povrchovou aplikací CpGV je, ţe nelze porovnávat výsledky z diet, které mají odlišné povrchy. Povrch diet s agarem nepropouští vodu, a tak částice zůstávají na povrchu podobně jako je tomu při aplikaci v přírodě (Lacey a kol., 2002). Proto byla v kapitole 6 III pro testování účinnosti biopreparátů na bázi různých izolátů CpGV zvolena dieta Iv-S na kterou byly preparáty aplikovány povrchově. Pro testování účinnosti čistých izolátů CpGV byla pouţívána metoda míchání viru do diety, a to buď s dietou Premix 49

51 (5 Cíl II) nebo dietou Iv-S (6 Cíl III), aby bylo moţné porovnat naše data s výsledky Fritsch a kol. (2005) a Eberle (2010). Součástí porovnávání diet byl i experiment sledující vývoj obaleče jablečného. Hodnocením přirozené mortality 1. a 7. den po umístění housenek na dietu bylo zjištěno, ţe druh diety tuto mortalitu neovlivňuje. Další dvě hodnocení porovnávala hmotnost housenek L5 (po 14 dnech) a hmotnost kukel (po 21 dnech). Hmotnost samců a samic housenek resp. kukel se statisticky významě lišila, coţ potvrzuje také (Howell, 1991). Dále se statisticky lišila hmotnost samců housenek a obou pohlaví kukel na dietě Premix. Vţdy byla niţší neţ na dietách Guenn a Iv-S. Při přípravě diet Iv-S a Guenn jsou přidávány konzervační látky, které zabraňují růstu mikroorganismů. Tyto látky jsou rozpuštěny v absolutním etanolu a jsou přidávány do diet krátce po uvaření (přílohy A.2, A.3). Přestoţe se etanol v horké dietě rychle odpařuje, byl porovnán vývoj obaleče na dietách, které byly po přípravě ponechány v otevřených boxech po dobu minimálně 16 hodin (standardní doba pro biologické testy) a dietách v boxech, které byly uzavřeny víkem ihned po vychladnutí (1,5 h). Vývoj byl hodnocen na základě zastoupení L4 a L5 instarů housenek po 10 dnech od umístění housenek na dietu a bylo zjištěno, ţe zbytkový etanol měl zásadní vliv na rychlost vývoje. V případě diety Guenn byl rozdíl vývoje housenek v boxech s dietou uzavřených po 1,5 hodině a po cca 16 hodinách větší neţ u diety Iv-S, protoţe při přípravě diety Guenn se přidávají dvě komponenty rozpuštěné v etanolu (metylparaben, kyselina benzoová), zatímco do Iv-S jen metylparaben (příloha A.2, A.3). Termín pro hodnocení vývoje byl stanoven na dobu, kdy se nejvíce housenek nachází ve 4. nebo 5. instaru, který lze velmi snadno rozeznat. Steineke a kol. (2002) sledovali vývoj housenek obaleče jablečného v laboratorních podmínkách při různých teplotách (15 C 32 C). Hodnotili, za kolik dní dosáhne 50 % housenek dalšího instaru a u L5 při teplotě 26 C uvádí, ţe 50 % housenek dosáhne tohoto instaru 11. den. Vývoj při 26 C zároveň vyhodnotili jako nejrychlejší. Naše experimenty byly také prováděny při této teplotě a hodnoceny po 10 dnech, respektive jedenáctý den počítáme-li den umístění housenek na dietu. Pokud byla dieta připravena standardně, naše výsledky korespondovaly s daty uváděnými Steineke a kol. (2002). Na dietě Guenn bylo v průměru 40,3 % jedinců instaru L5, 62,3 % jedinců L5 na dietě Iv-S a 53,7 % jedinců L5 na dietě Premix. Dieta Premix byla pouţita jako referenční, protoţe se do ní etanol nepřidával. V boxech s dietou uzavřených po krátké době převaţoval instar L4 (Guenn: 6,1 % L5; Iv-S 37,5 % L5). Niţší podíl L5 na dietě Guenn proti dietě Iv-S by mohl být vysvětlen dvojnásobným objemem etanolu, který je do diety přidáván. 50

52 5 Cíl II: Biologické testy citlivosti obaleče jablečného k CpGV 5.1 Metodika Zdroje obaleče jablečného Laboratorní chovy obaleče jablečného Laboratorní chov obaleče jablečného (krymský kmen), dále CpKrym je udrţován ve VÚRV od roku Celý vývojový cyklus obaleče probíhá v klimatizované místnosti při teplotě 25±1 C a umělém osvětlení (fotoperioda 16L:8D h). Housenky jsou chovány ve skupinách (15-20 jedinců) na umělé dietě v jednorázových plastových miskách s perforovaným víčkem. Sloţení diety a její příprava jsou popsány v příloze A.1. Za dní se ze zakuklených housenek líhnou motýli. Motýli jsou pravidelně odchytáváni z misek za pomoci skleněné trubičky a poté přeneseni do chovné klícky, kde dochází k páření a kladení vajíček. V klícce je umístěna trubička s buničinou nasáklou medovým roztokem, který prodluţuje ţivot dospělců aţ o několik dní (převzato od A. Alešové, ÚOCHB AV ČR). Strop klícky kryje voskovaný papír, na který kladou samičky vajíčka. Kaţdý druhý den se papír s čerstvě nakladenými vajíčky dezinfikuje roztokem formaldehydu (3,5 %), opláchne se vodou a po oschnutí je inkubován se při teplotě 25±1 C na navlhčeném filtračním papíru v uzavřené plastové krabici. Chov kmene CpS (více podkapitola 4.1.1) slouţil jako referenční senzitivní skupina pro hodnocení citlivosti CpKrym a biologických testů citlivosti polních populací obaleče jablečného k CpGV Přírodní populace obaleče jablečného Populace obaleče jablečného byly sbírány v přírodě (jabloňové sady, aleje) několikrát za sezónu (červenec listopad). Housenky, popřípadě kukly, byly vybírány z pásů z vlnité lepenky, která byla obtočena hladkou stranou ven kolem kmene jabloní a zajištěna drátem (obrázek 5.1). Housenky byly umístěny do plastových krabiček s perforovaným víčkem, ve kterých si zalezly do připravených ruliček z vlnité lepenky. Housenky a kukly sebrané z pásů lepenky do začátku srpna byly nejprve uloţeny do klimatizovaného boxu s nastavenou teplotou 26 C a fotoperiodou 16L:8D h. Některé z housenek první generace se zakuklily a daly vzniknout 2. generaci, u které byla hodnocena citlivost k viru. Nezakuklené housenky 1. generace a housenky z pozdějších sběrů vstupují do diapauzy, proto byly umístěny do klimatizovaného boxu s teplotou 10 C na jeden aţ dva týdny a poté byla teplota sníţena minimálně na tři měsíce na 6 C. Počátkem jara byla teplota opět zvyšována (týden při teplotě 10 C, dva týdny při teplotě 16 C a poté 20 C. Při této konečné teplotě se líhnuli motýli. 51

53 Čerstvě vylíhnutí dospělci byli pravidelně odchytáváni a přenášeni do chovných klícek umístěných do klimatizovaného skleníku s přirozeným osvětelním. Kolem klícek byly rozmístěny nádoby s vodou pro zajištění vyšší relativní vlhkosti vzduchu a čerstvé větvičky a nezralá jablka pro podpoření páření a ovipozice dle Witzgall a kol. (2005). Metodika odchovu populací obaleče jablečného z přírody byla převzata z JKI, Darmstadt a publikace Fritsch a kol. (2005). Chovné klícky měly boční stěny z vinuté obvazové gázy, na kterou samičky nekladou vajíčka (osobní sdělení dr. J. Huber, Darmstadt, Německo). Strop klícky byl tvořen hladkým materiálem (parafilm nebo potravinová fólie), na který samičky mohou klást vajíčka. Příprava vajíček pro biologické testy byla obdobná jako u laboratorního kmene CpKrym, pouze vzhledem k menším snůškám vajíček byly snůšky nejprve uloţeny v chladničce (maximálně po dobu jednoho týdne) a poté inkubovány současně z více sběrů, aby bylo připraveno dostatečné mnoţství housenek pro zaloţení biologického testu. Vajíčka byla inkubována v plastových kelímcích s navlhčeným filtračním papírem v klimatizovaném boxu při teplotě 26 C. Do pěti dnů se začaly líhnout housenky, které byly pouţity pro biologické testy citlivosti přírodních populací k CpGV. Obrázek 5.1: A) pás z vlnité lepenky pro odchyt housenek L5 resp. kukel. B) Detail čerstvě odtrţeného pásu, kde byla housenka v zámotku připravená ke kuklení nebo přezimování Zdroj CpGV Mexický izolát CpGV-M (EU Standard) laskavě zapůjčil dr. J. A. Jehle (DLR Rheinpfalz, Německo). Podrobnosti ke kvantifikaci izolátu viz podkapitola Izolát byl vţdy kvantifikován na začátku sezóny a poté bylo několik mikrolitrů z ředění 1:10 zamraţeno a pouţíváno po celou sezónu k přípravě biologických testů. 52

54 5.1.3 Testování citlivosti obaleče jablečného k CpGV Pro biologické testy byla vţdy pouţita F1 generace odchovaná v laboratoři. Buďto pocházeli oba rodičové z přírody, nebo byl z přírody pouze samec, který byl pářen se samicí laboratorního kmene CpKrym. Metodika biologických testů se v závislosti na získaných poznatcích lišila mezi lety 2008 a následnými dvěma lety 2009 a V roce 2008 byly populace testovány k různým koncentracím viru, zatímco v letech 2009 a 2010 byla k testování citlivosti přírodní populace pouţita jedna diagnostická koncentrace 3x10 5 OB/ml, která do 7 dnů usmrtí všechny citlivé jedince laboratorního kmene CpKrym. Výjimkou byla pouze populace VBII, která byla v roce 2010 testována také k různým koncentracím viru. Původ a označení všech populací testovaných v letech je uveden v tabulce 5.1. V tabulce 5.2 jsou uvedeny pouţité koncentrace viru a počet testovaných jedinců. Pro biologické testy byla pouţita dieta Premix, kterou lze snadno a rychle připravit i v malém mnoţství. CpGV byl míchán do diety v průběhu přípravy (viz podkapitola 4.1.4). Laboratorní chov obaleče (CpKrym) byl testován se sedmi koncentracemi CpGV (3x10 2, 10 3, 3x10 3, 10 4, 3x10 4, 10 5, 3x10 5 OB/ml) ve třech nezávislých opakováních. Metoda pro hodnocení biologických testů 7. a 14. den po infekci je popsána v podkapitole Statistické vyhodnocení Citlivost CpKrym byla vyhodnocena za pomoci probitové analýzy (XLSTAT, 2010). Mortalita byla při vyhodnocování testů přepočtena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925). Biologický test byl proveden ve třech nezávislých opakováních. Výsledkem probitové analýzy bylo stanovení středních letálních koncentrací (LC 50 ) s 95% konfidenčními limity (pásy spolehlivosti) 7. a 14. den testu. Mortalita housenek polních populací vystavených různým koncentracím viru byla 7. a 14. den testu porovnána s mortalitou CpKrym a CpS. Housenky populací vystavené jediné koncentraci CpGV (3x10 5 OB/ml) byly povaţovány za citlivé, pokud do 7 dnů uhynuly. Housenky, které přeţily 7. den, byly povaţovány za rezistentní. Mortalita byla upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925) a u jednotlivých populací bylo vyhodnoceno zastoupení rezistentních a citlivých jedinců (%) po 7 a 14 dnech testu. Mortalita housenek pocházejících z jednotlivých snůšek vajíček od různých skupin obalečů populace VBII a z hybridního kříţení VBII xcpkrym byla v letech 2009 i 2010 hodnocena statisticky neparametrickým testem Mann-Whitney test (XLSTAT, 2010), který 53

55 porovnal průměrnou mortalitu populací VBII a VBII xcpkrym v jednotlivých letech. Poté byly porovnány výsledky mezi lety 2009 a Populace (zkratka) Kód F1 generace* Původ a ošetřování Bulhary (B) Drahoraz (D) B08 D10 Jiţní Morava n. a. Severovýchodní Čechy i. p. Praha Ruzyně Vrátnice PI08 Střední Čechy (PI) PI09 n. a. PI10 Praha Ruzyně Experimentální sad PII09 Střední Čechy (PII) PII09 xcpkrym o. p.+cpgv** Slaný (S) Tuchoraz (T) Velké Bílovice Studánky (VBI) PII10 PII10 xcpkrym S10 T10 VBI08 Střední Čechy i. p. Střední Čechy i. p. Jiţní Morava i. p. Velké Bílovice Špičáky VBII08 xcpkrym Jiţní Morava (VBII) VBII09 i. p.+cpgv** VBII09 xcpkrym VBII10 VBII10 xcpkrym Vinice u Třebnouševsi (V) V09 Severovýchodní Čechy o. p.+cpgv** Tabulka 5.1: Přehled populací, u kterých byla testována citlivost k CpGV -M v letech *kód F1 generace je sloţen z místa sběru rodičovské populace a roku testování; **CpGV pouţíván experimentálně; n. a.=neošetřovaná alej; i. p.= integrovaná produkce; o. p.=organická produkce. 54

56 Kód F1 generace* Počet testovaných jedinců** Koncentrace (OB/ml) B , 3x10 3, 10 4, 3x10 4 D x10 5 PI , 3x10 3, 10 4, 3x10 4 PI x10 5 PI x10 5 PII x10 5 PII09 xcpkrym 39 3x10 5 PII x10 5 PII10 xcpkrym 188 3x10 5 S x10 5 T x10 5 V x10 5 VBI , 3x10 4 VBII08 xcpkrym , 3x10 3, 10 4, 3x10 4 VBII x10 5 VBII09 xcpkrym 489 3x10 5 VBII x10 5 VBII , 3x10 3, 10 4, 3x10 4 VBII10 xcpkrym 431 3x10 5 Tabulka 5.2: Přehled testovaných F1 generací přírodních populací. *kód F1 generace je sloţen z místa sběru rodičovské populace a roku testování. **počet jedinců po odstranění uhynulých v den umístění housenek na dietu Původ populací testovaných v roce 2008 Pro testování citlivosti F1 generace přírodních populací obaleče jablečného byly sbírány od července do listopadu 2007 přezimující housenky rodičovské generace. Sběr probíhal na jedné lokalitě ve středních Čechách: Praha Ruzyně u vrátnice (PI) a na dvou místech jiţní Moravy u obce Bulhary (B) a ve Velkých Bílovicích Studánky (VBI). Vzorky populace PI a B pocházely z jabloní rostoucích v neošetřované aleji, avšak alej v Praze Ruzyni se nachází ve vzdálenosti asi 400 m od experimentálního sadu několik let ošetřovaného biopreparátem na bázi CpGV (Carpovirusine; Arysta Lifescience, Francie). Vzorek populace VBI pocházel z jabloňového sadu se systémem integrované ochrany nedaleko Velkých Bílovic, kde byla část plochy ošetřována CpGV (Madex; Andermatt Biocontrol, Švýcarsko), a to přibliţně 500 m od místa sběru housenek. V roce 2008 byly v sadu ve Velkých Bílovicích z plochy zvané Špičáky (VBII) sbírány housenky první generace přímo z jablek. Tato plocha či její okolí bylo po dobu delší neţ 10 let 55

57 experimentálně ošetřovano CpGV. Nedorostlé housenky z jablek byly dokrmeny na dietě Premix a ponechány ke kuklení. Vylíhlo se několik samců, kteří byli pářeni se samičkami CpKrym a jejich potomstvo (VBII08 xcpkrym ) bylo následně testováno. Ostatní housenky, které vstoupily do diapauzy, byly přidány ke sběrům z podzimu Původ populací testovaných v roce Sběr přezimujících housenek rodičovské generace z pásů vlnité lepenky probíhal v roce 2008 a 2009 na dvou místech ve středních Čechách: Praha Ruzyně-neošetřovaná alej (PI) a Praha Ruzyně-experimentální sad v organickém reţimu pěstování a několikaletou aplikací CpGV (PII). V roce 2009 byly ve středních Čechách sbírány housenky ještě na lokalitách Slaný (S) a Tuchoraz (T). Tyto sady patří do systému integrované ochrany. V letech 2008 a 2009 byly na jiţní Moravě sbírány housenky z části CpGV ošetřovaného sadu ve Velkých Bílovicích Špičáky (VBII). V severovýchodních Čechách byly housenky sbírány v roce 2008 v sadu s organickou produkcí ovoce, kde byl 4 roky experimentálně pouţíván CpGV (Vinice u Třebnouševsi-V) a v roce 2009 ze sadu se systémem integrované ochrany v Drahorazi (D). 5.2 Výsledky Citlivost laboratorního kmene CpKrym k CpGV V grafu na obrázku 5.2 je uvedena závislost mortality housenek CpKrym na CpGV ze třech nezávislých opakování biologického testu. Mortalita v kontrolách byla po sedmi dnech 1,1 % a po čtrnácti dnech 2,1 %. Mortalita se v čase významně zvýšila. LC 50 se mezi hodnocením po sedmi a čtrnácti dnech 13,7 krát sníţila, coţ bylo přibliţně dvakrát více neţ v případě výsledků mortality CpS na dietě premix (5,6 krát). Mortalita housenek CpKrym se po sedmi dnech statisticky významně lišila od mortality CpS hodnocené biologickým testem v podkapitole (obrázek 5.3). Po čtrnácti dnech byla mortalita stále statisticky významně odlišná, avšak 95% konfidenční limity CpS se jiţ dotýkaly limitů CpKrym. Sklony křivek CpS a CpKrym byly paralení. Střední letální koncentrace CpKrym stanovené po sedmi a čtrnácti dnech jsou uvedeny v tabulce 5.3. CpKrym počet housenek v testu (n) LC 50 (OB/ml x10 3 ) 95% konf. limity (OB/ml x10 3 ) Tabulka 5.3: Střední letální koncentrace (LC 50 ) laboratorního kmene CpKrym 7 a 14 dní po inokulaci virem (tři nezávislá opakování). χ 2 sklon 95% konf. limity 7 dní 12,152 10,014 14, ,54 1,85 1,57 2, dní 0,890 0,723 1, ,76 2,00 1,65 2,34 56

58 Obrázek 5.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek CpKrym na koncentraci CpGV. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích ve třech nezávislých opakování biologického testu. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech opakování testu. Obrázek 5.3: Logitová regrese závislosti mortality housenek na koncentraci CpGV. Porovnání výsledků biologického testu CpKrym s výsledky CpS (dieta Premix). Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Model a 95% konfidenční intervaly jsou výsledkem analýzy třech opakování testu. 57

59 5.2.2 Citlivost polních populací obaleče jablečného k CpGV Biologický test s koncentrační řadou viru Na kontrolních dietách bez viru byla v hodnocených termínech mortalita přírodních populací 0 %. Mortalita přírodních populací obaleče jablečného v závislosti na koncentraci CpGV byla vynesena v bodech do grafu mortality CpKrym, protoţe citlivost přírodních populací nebylo moţné z důvodu malého souboru testovaných jedinců vyhodnotit za pomoci probitové analýzy s uvedením LC 50. Jednotlivé body vyjadřující mortalitu přírodních populací PI08, B08, VBI08 leţely v blízkosti modelové křivky i 95% konfidenčních limitů stanovených pro laboratorní kmeny CpKrym a CpS v obou termínech hodnocení (obrázek 5.4). Obrázek 5.4: Logitová regrese citlivosti přírodních populací obaleče jablečného k CpGV-M v porovnání s laboratorními kmeny CpKrym a CpS. Hodnoceno 7. a 14. den po infekci. 58

60 Při hodnocení vzorku potomstva samců populace VBII kříţených s laboratorními samicemi v roce 2008 (VBII08 xcpkrym ) a čisté přírodní populace 2010 (VBII10) po sedmi dnech byly body do koncentrace 10 4 OB/ml (log c=4) poměrně blízko křivky CpKrym nebo CpS (obrázek 5.4 A), ovšem po 14 dnech uţ byly všechny body vzorku F1 generace kříţenců VBII08 xcpkrym hodnocené v létě roku 2008 zcela vzdáleny 95% pásům spolehlivosti obou citlivých laboratorních kmenů (obrázek 5.4 B). Mortalita v nejvyšší testované koncentraci 3x10 4 OB/ml (log c=4,477) nepřesáhla ani 17 % a v ostatních koncentracích se pohybovala od 16,7-36,4 %. V potomstvu populace VBII10 se vyskytovalo více citlivých jedinců, a to především v nejniţší testované koncentraci 10 3 OB/ml (log c=3), kde mortalita dosáhla 85 %. V ostatních koncentracích se mortalita pohybovala od 50 do 60 % Biologické testy s jednou diagnostickou koncentrací viru V roce 2009 byl testován vzorek čtyř přírodních populací (PI09, PII09, V09, VBII09). U dvou z těchto populací byli navíc někteří samci rodičovské generace kříţeni s laboratorními samicemi a citlivost jejich potomstva (PII09 xcpkrym, VBII09 xcpkrym ) k viru byla také testována za pouţití jedné diagnostické koncentrace. Počet jedinců, kteří byli testováni, je uveden v tabulce 5.2. Mortalita v kontrolách byla po 7 dnech do 5,5 % a po 14 dnech se u některých populací zvýšila na 10 %, protoţe došlo k neočekávanému výskytu houby s rychlým růstem (Aspergillus sp.) v dietě. Všichni testovaní jedinci PI09, PII09, PII09 xcpkrym a V09 uhynuli do 7 dnů, avšak v populacích VBII09 a VBII09 xcpkrym se celkově vyskytovalo 123 jedinců (23,6 %) a 102 jedinců (20,9 %), kteří v této vysoké koncentraci přeţili a nejevili známky infekce granulózou (obrázek 5.5 A). Po 14 dnech se počet jedinců, kteří přeţili, sníţil u VBII na 62 jedinců (12,5 %) a u VBII09 xcpkrym na 61 jedinců (14,3 %) (obrázek 5.5 B). 59

61 Obrázek 5.5: Grafické znázornění celkového podílu citlivých a rezistentních jedinců u hodnocených populací. A) po 7 dnech B) po 14 dnech v roce Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925). Podobně jako kolísal počet rezistentních a citlivých jedinců testovaných k různým koncentracím v roce 2008 (obrázek 5.4), i zde se v jednotlivých skupinách obalečů vyskytovaly různé poměry citlivých a rezistencích jedinců, a proto se také mortalita z odlišných snůšek vajíček lišila a pohybovala se od 45,5 % do 95,6 % (BVII09) a od 61,5 % do 100 % (VBII09 xcpkrym ) po sedmi dnech (obrázek 5.6 A) a od 75,6 % do 100 % (BVII09) a od 65,4 % do 100 % (VBII09 xcpkrym ) po čtrnácti dnech (obrázek 5.6 B). 60

62 Obrázek 5.6: Přehled mortality u potomstva VBII09 a VBII09 xcpkrym z různých snůšek vajíček v roce A) po 7 dnech; B) po 14 dnech při koncentraci 3x10 5 OB/ml. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925). V roce 2010 byl testován vzorek šesti přírodních populací (D10, PI10, PII10, S10, T10, VBII10). U dvou z těchto populací byli opět někteří samci rodičovské generace kříţeni s laboratorními samicemi a citlivost jejich potomstva (PII10 xcpkrym, VBII10 xcpkrym ) k viru byla také testována za pouţití jedné diagnostické koncentrace. Počet jedinců, kteří byli testováni, je uveden v tabulce 5.2. Mortalita v kontrolách byla po 7 dnech i 14 dnech do 5,6 %. Výskyt houby Aspergillus sp. v dietě byl proti roku 2009 minimální. Všichni testovaní jedinci D10, PI10, PII10, S10, T10 a PII10 xcpkrym uhynuli do 7 dnů, avšak v populacích VBII10 a VBII10 xcpkrym se opět vyskytovali jedinci se sníţenou citlivostí k viru. Celkově se v populaci VBII10 vyskytovalo 74 jedinců (34,9 %) a v populaci VBII10 xcpkrym 123 jedinců (28,5 %), kteří v této vysoké koncentraci přeţili a nejevili známky infekce granulózou (obrázek 5.7 A). Po 14 dnech se počet jedinců, kteří přeţili, sníţil u VBII na 43 jedinců (20,3 %) a 73 jedinců (16,9 %) u VBII10 xcpkrym (obrázek 5.7 B). 61

63 Obrázek 5.7: Grafické znázornění celkového podílu rezistentních jedinců u hodnocených populací po A) 7 dnech B) 14 dnech v roce Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925). V roce 2010 byli obaleči VBII10 chováni ve více klíckách (I-X) a kříţenci, kteří vznikli pářením VBII10 xcpkrym, pocházeli buďto z jednotlivých párů (pár I-II) nebo ze skupin (skupina I-II) (obrázek 5.8). Mortalita z odlišných snůšek vajíček se opět lišila. Nejniţší mortalita byla sedmý den pozorována u skupin VBII10 pocházejících z klícek II (23,8 %), VI (22,2 %) a IX (33,3 %) a u VBII10 xcpkrym skupiny II (39,9 %). Stoprocentní mortalita byla zjištěna u potomstva z klícek I, IV, VIII a páru I VBII10 xcpkrym (obrázek 5.8 A). Po čtrnácti dnech mortalita vzrostla, ale stále byla nejniţší u skupin VBII10 pocházejících z klícek II (57,1 %), VI (55,6 %) a IX (53,3 %) a u VBII10 xcpkrym skupiny II (63,3 %). Mortalita 100 % byla zjištěna navíc pouze u VBII (skupina X) (obrázek 5.8 B). 62

64 Obrázek 5.8: Přehled mortality u potomstva VBII10 z různých snůšek vajíček nakladených skupinami obalečů z odlišných klícek (I-X) a VBII10 xcpkrym z různých snůšek vajíček pocházejících od dvou párů a dvou skupin v roce A) po 7 dnech; B) po 14 dnech při koncentraci 3x10 5 OB/ml. Mortalita upravena podle mortality v kontrole (Abbott, 1925) Statistické porovnání mortality VBII a kříţenců VBII xcpkrym Mortalita potomstva různých skupin obalečů kolísala jak při testování přírodní populace VBII, tak kříţenců VBII xcpkrym. Pomocí neparametrického testu (Mann- Whitney test) byla porovna mortalita potomstva z jednotlivých snůšek VBII s mortalitou kříţenců VBII xcpkrym v letech 2009 a V roce 2009 byla porovnávána mortalita potomstva z devíti různých snůšek VBII09 s šesti snůškami kříţenců VBII09 xcpkrym. Průměrná mortalita po 7 a 14 dnech byla porovnána v krabicovém grafu (obrázek 5.9). Po sedmi dnech dosáhla průměrná mortalita 72 % (VBII09) a 80,9 % (VBII09 xcpkrym ). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,328) nebyla zamítnuta hypotéza, ţe se průměry neliší. Ani po 14 dnech se průměry 86,75 % 63

65 (VBII09) a 87,27 % (VBII09 xcpkrym ) na hladině významnosti α=0,05 (p=0,774) statisticky významně nelišly. Obrázek 5.9: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry populace VBII09 a kříţenců VBII09 xcpkrym. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota. V následujícím roce 2010 byla porovnávána mortalita potomstva z deseti různých snůšek VBII10 se čtyřmi snůškami kříţenců VBII10 xcpkrym. Průměrná mortalita po 7 a 14 dnech byla porovnána v krabicovém grafu (obrázek 5.10). Po sedmi dnech dosáhla průměrná mortalita 65,26 % (VBII10) a 74,08 % (VBII10 xcpkrym ). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,605) byla potvrzena nulová hypotéza, ţe se průměry neliší. Obrázek 5.10: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry populace VBII10 a kříţenců VBII10 xcpkrym. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota. Také po 14 dnech se průměry 80,73 % (VBII10) a 85,96 % (VBII10 xcpkrym ) na hladině významnosti α=0,05 (p=0,723) statisticky významně nelišly. 64

66 Protoţe se průměry mezi populací VBII a kříţenci VBII xcpkrym v letech 2009 a 2010 nelišily, byla data obou skupin sloučena a byl porovnán rozdíl mezi lety 2009 a 2010 po 7 a 14 dnech. Průměrná mortalita potomstva byla stanovena z 15 různých snůšek vajíček v roce 2009 a 14 snůšek vajíček v roce Průměrná mortalita byla po 7 dnech 75,59 % (2009) a 67,79 % (2010). Pomocí neparametrického testu (Mann-Whitney test) byla na hladině významnosti α=0,05 (p=0,651) potvrzena hypotéza, ţe se průměry mezi lety neliší. Průměrná mortalita byla po 14 dnech 86,96 % (2009) a 82,22 % (2010). Na hladině významnosti α=0,05 (p=0,687) se průměry mezi lety 2009 a 2010 nelišily. Obrázek 5.11: Krabicový graf porovnávající mediány a průměry mortality mezi lety 2009 a 2010 ze sloučených dat populací VBII a kříţenců VBII xcpkrym. + aritmetický průměr; medián; minimum; maximum; 25 % a 75 % kvartil; minimální/maximální hodnota. 5.3 Diskuze Aby mohla být hodnocena citlivost přírodních populací k CpGV-M, byla nejprve stanovena probitovou analýzou citlivost laboratorního kmene CpKrym. Střední letální koncentrace byla po sedmi dnech 3,76 krát vyšší, neţ LC 50 stanovená pro citlivý kmen CpS v Německu. Po 14 dnech se rozdíl sníţil a LC 50 CpKrym byla jen 1,53 krát vyšší. Niţší mortalita chovu CpKrym můţe vypovídat o odlišné citlivosti housenek k CpGV v porovnání s výsledky CpS chovu, ovšem výsledky po 14 dnech jiţ byly velmi blízké. Není snadné porovnávat výsledky z různých laboratoří, protoţe na výsledky biologického testu má vliv celá řada faktorů. Kvantifikace částic můţe být ovlivněna objektivně (druh světelného mikroskopu), ale také subjektivně (kdo částice počítá, jak dlouho vzorek před počítáním míchá na vortexu apod.). Dále mohouu mít vliv na výsledky rozdílné podmínky v klimatizovaném boxu, kde kaţdý C můţe ovlivnit délku vývoje housenek a také střední letální čas (LT 50 ) viru se s různou teplotou liší (Steineke, 2004). Také v jedné laboratoři můţe mít stejný kmen odlišnou citlivost v různých letech. Autoři Fritsch a kol. (2006) stanovili 65

67 LC 50 laboratorního kmene po 14 dnech v jednom roce 3,41x10 2 OB/ml a následující rok 8,77x10 2 OB/ml. Pro biologické testy s přírodními populacemi, kde byla pouţita koncentrační řada viru, měla význam především data získaná po 14 dnech, protoţe po sedmi dnech byla mortalita k viru citlivých jedinců v koncentracích do 10 4 OB/ml nízká podobně jako u jedinců se sníţenou citlivostí k CpGV. Teprve po čtrnácti dnech se mortalita citlivých jedinců zvýšila. 100 % mortality dosáhly housenky v koncentracích 10 4 OB/ml a 3x10 4 OB/ml, zatímco populace tvořené z části housenkami se sníţenou citlivostí k viru přeţívaly i při koncentraci 3x10 4 OB/ml. U výsledků biologického testu kříţenců VBII 08xCpKrym a populace VBII testovaných v letech 2008 a 2010 ke koncentrační řadě viru nebyla vysoká korelace mezi mortalitou a koncentrací viru, zatímco u citlivých populací a laboratorních kmenů byla tato korelace vysoká. U kříţenců VBII 08xCpKrym a populace VBII10 byl významnějším faktorem poměr citlivých a rezistentních jedinců v testované skupině, neţ koncentrace, které byli jedinci vystaveni. Fritsch a kol. (2005) a Fritsch a kol. (2006) testovali prvně populace obaleče jablečného, u kterých zcela selhala ochrana preparáty na bázi CpGV-M. V jejich případě byly populace natolik rezistentní, ţe při koncentraci 10 7 OB/ml mortalita těchto populací po šesti dnech nepřesáhla 20 %. Po 14 dnech stanovili pro tyto populace LC 50 pohybující se od 8x10 4 do 3x10 5 OB/ml, tedy zhruba 1000 krát vyšší neţ u citlivého laboratorního kmene. Testovali také jednu populaci z konvenčního sadu, kde byl CpGV pouţíván jen jako doplňující prostředek a zde našli podobně jako v našem případě vysoce nehomogenní skupinu, u které stanovili po 14 dnech LC 50 2x10 3 OB/ml, ovšem sklon proloţené křivky byl velice nízký (0,53). V našem případě nebylo dostatečné mnoţství housenek na testování vyšších koncentrací a z dat získaných z koncentrací x10 4 OB/ml nebylo moţné LC 50 stanovit. Sklon proloţené křivky u kříţenců VBII 08xCpKrym byl 0,094 a u populace VBII10 dokonce záporný (-0,370). Z důvodu malého mnoţství potomstva přírodních populací byla pro následující roky zvolena metoda hodnocení citlivosti housenek jen k jedné diagnostické koncentraci viru (3x10 5 OB/ml). Při této koncentraci uhynuly všechny housenky citlivého kmene CpKrym do 7 dnů a bylo pak snadné rozeznat rezistentní a citlivé jedince jiţ při prvním hodnocení. Asser-Kaiser a kol. (2007) pouţívali niţší diskriminační dávku 5,8x10 4 OB/ml pro rozpoznání citlivých a rezistentních jedinců po 7 dnech. Tato koncentrace usmrtila po 7 dnech % housenek CpS, ovšem testy byly prováděny na dietě Iv-S, kde byla zjištěna vyšší mortalita (4 Cíl I). Eberle a kol. (2008) hodnotili v průběhu 14 dní mortalitu všech instarů housenek CpS a CpR (nehomogenně rezistentní populace) při koncentraci 2x10 5 OB/ml izolátů CpGV- 66

68 M a CpGV-I12. Tato koncentrace CpGV-M usmrtila v průběhu 14 dní více neţ 99 % housenek CpS všech instarů a housenky přenesené na dietu v instaru L1 uhynuly do 7 dnů. Mortalita CpR při pouţití CpGV-M dosahovala po 6 dnech 25 % a po 14 dnech 51,4 %. Vycházíme-li tedy z toho, ţe citliví jedinci uhynuli do 7 dnů, potom rezistentních jedinců v populaci CpR bylo kolem 75 %, avšak dalších téměř 25 % housenek uhynulo do 14 dnů, přestoţe se jednalo o rezistentní jedince. Také námi zvolená diagnostická dávka 3x10 5 OB/ml usmrtila po 14 dnech i některé rezistentní jedince populace VBII respektive VBII xcpkrym. Rozdíl mezi mortalitou 7. a 14. den činil v roce ,1 % a v roce ,6 %. Mortalitu rezistentních jedinců lze vysvětlit tím, ţe se v izolátu CpGV-M vyskytují ve velmi nízké koncentraci také částice viru, které dokáţou usmrtit rezistentní housenky. Vzhledem k nízké dávce těchto účinných částic, které housenky v průběhu vývoje mohly přijmout, uhynuly tyto housenky aţ ve 4. či 5. instaru, avšak měly typické příznaky granulózy a také detekce viru pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) potvrdila přítomnost viru. Mortalitu rezistentních housenek ve vysokých koncentracích CpGV-M pozorovali jiţ v roce 2006 v laboratořích Andermatt Biocontrol AG a pasáţováním izolátu CpGV-M přes rezistentní housenky získali izolát, ze kterého formulovali nový biopreparát Madex Plus (Zingg a Kessler, 2007; Jehle a Schmitt, 2009). Přestoţe na dietě s diagnosticku koncentrací viru 3x10 5 OB/ml přeţili do 14 dnů samci i samice, zakuklilo se jen několik samic kříţenců VBII xcpkrym a některé samice VBII vstoupily do diapauzy. Ostatní samice a všichni samci uhynuli ve stádiu housenky. Ve vzorku populace z části sadu ve Velkých Bílovicích (VBII), kde byl preparát po více neţ deset let pouţíván, bylo nalezeno v roce ,6 % a v roce ,9 % rezistentních jedinců v potomstvu samců a samic této populace. Z těchto hodnot zjištěných po 7 dnech lze předpokládat, ţe se v současné době v populaci VBII vyskytuje od 20 % do 30 % rezistentních jedinců. Sníţení podílu rezistentních jedinců po 14 dnech na 12,5 % (2009) a 20,3 % (2010) bylo částečně ovlivněno příměsí částic viru, který dokáţe usmrtit rezistentní jedince. Mortalitu stanovenou po čtrnácti dnech můţeme porovnat s výsledky Schmitt a kol. (2008), kteří hodnotili podíl citlivých a rezistentních jedinců u populací pocházejících z 23 evropských sadů. Do hodnocení zahrnuli koncentrace 10 4 aţ 10 6 OB/ml, kdy uţ jsou po čtrnácti dnech všechny k viru citlivé housenky usmrceny. Podíl rezistentních jedinců se u 14 poulací pohyboval od 30 % do 90 %, u šesti populací se vyskytovali pouze citliví jedinci a u třech populací byl podíl rezistentních jedinců do 20 %. V této studii byla hodnocena také kříţová rezistence k několika běţným účinným látkám insekticidů, která však nebyla potvrzena. 67

69 V roce 2010 byly také dva samci VBII jednotlivě pářeni s citlivými samicemi z chovu. Podle studie Asser-Kaiser (2010) tak mohly vzniknout páry: A) Z S W x Z S Z S, kdy je mortalita potomstva 100 %; B) Z S W x Z R Z R, potomstvo je rezistentní nebo C) Z S W x Z S Z R, kdy 50 % potomstva je rezistentní. Mortalita potomstva prvního páru byla 100 %, coţ odpovídá případu A) a mortalita druhého páru byla po 7 dnech 68,8 % a po 14 dnech 87,5 %. Tato mortalita by měla odpovídat případu C), ovšem v našich testech byla mortalita v obou termínech hodnocení vyšší neţ 50 %. Proto bylo dalším cílem práce ověřit, zda je rezistence zaloţena na pohlavním chromozomu Z, jak uvádí Asser-Kaiser a kol. (2007) viz 6 Cíl III. Porovnáním průměrných mortalit čisté populace VBII a kříţenců samců VBII s laboratorními samicemi v letech 2009 a 2010 nebyl nalezen statisticky průkazný rozdíl mezi průměry (Mann-Whitney test). Průměrná mortalita se nelišila ani mezi roky 2009 a

70 6 Cíl III: Účinnost nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného 6.1 Metodika Zaloţení rezistentního kmene obaleče jablečného Homogenně rezistentní kmen obaleče jablečného (CpR-CZ) byl zaloţen z populace VBII09, která byla opakovaně kříţena s laboratorním kmenem CpKrym. Rezistentní jedinci byli získáni selekcí na dietě obsahující 3x10 3 OB/ml nebo 3x10 5 OB/ml. Odchov i selekce rezistentních jedinců probíhala v klimatizovaném boxu při 26 C a fotoperiodě 16L:8D h po dobu deseti generací. Housenky byly chovány na dietě Premix, ke kuklení housenek byly pouţity pásky z vlnité lepenky a dospělci byli chováni po skupinách v plastových krabicích vyloţených gázou. Samice kladly vajíčka na voskovaný papír umístěný pod víčkem krabice Ověření zaloţení rezistence CpR-CZ k CpGV-M K ověření zaloţení rezistence CpR-CZ byla pouţita metodika podle Asser-Kaiser (2010). Jednotlivě byli kříţeni obaleči CpS (genotypy Z S Z S, Z S W) s obaleči CpR-CZ (předpokládané genotypy Z R Z R, Z R W). Celkem byly vytvořeny tři páry Z S Z S x Z R W a tři páry Z R Z R x Z S W. Pohlaví jedinců bylo rozlišeno ve stádiu kukly podle počtu abdominálních segmentů (obrázek 2.6 B). Jednotlivé páry byly chovány v jednorázových plastových kelímcích, na jejichţ povrch kladly samice vajíčka. Potomstvo těchto párů bylo umístěno na kontrolní dietu bez viru a dietu obsahující diskriminační koncentraci izolátu CpGV-M (2009). Byla pouţita stejná dieta (Ivaldi-Sender, 1974) i koncentrace viru (5,8x10 4 OB/ml), kterou ve svých experimentech pouţívala Asser-Kaiser (2010). Pokus byl vyhodnocen po 7 dnech stanovením mortality F1 housenek. Mortalita byla opravena dle mortality v kontrole (Abbott, 1925). Po 14 dnech bylo stanoveno zastoupení samců (%) v jednotlivých variantách Zdroj obaleče jablečného Selektovaný rezistentní kmen CpR-CZ, u kterého byla testována citlivost k různým izolátům CpGV. Kontrolně byla testována také účinnost izolátů k citlivým housenkám laboratorních kmenů CpS a CpKrym Zdroj CpGV Izolát CpGV-M Mexický izolát CpGV-M (EU standard) byl vyuţíván jiţ při biologických testech (5 Cíl II) a slouţil k selekci rezistentního kmene škůdce. Izolát CpGV-M (2009) byl pouţit 69

71 v roce 2010 jako kontrola homogenity chovu rezistentního kmene CpR-CZ při biologických testech s novými izoláty CpGV Izoláty CpGV účinné proti rezistentním populacím Proti CpR-CZ byly testovány čtyři izoláty CpGV (CpGV-E2, -I08, -I12, -S), u kterých byla prokázána vysoká účinnost proti k viru rezistentním kmenům CpR a CpRR1 (Eberle, 2010), a dále izolát V015 purifikovaný z nově vyvíjeného přípravku označeného ABC V015 (Andermatt Biocontrol AG, Švýcarsko). Izoláty byly purifikovány v DLR Rheinpfalz nebo JKI Darmstadt (Německo) a před vlastním pokusem kvantifikovány viz podkapitola Formulované přípravky Preparát Madex Plus na bázi pasáţovaného izolátu CpGV-M a nově vyvíjený preparát ABC V015 na bázi izolátu CpGV-V015 laskavě poskytnula firma Andermatt Biocontrol AG (Švýcarsko). Přípravky obsahovaly 3x10 10 OB/ml Biologický test účinnosti nových izolátů CpGV proti rezistentní populaci obaleče jablečného Pro vyhodnocení účinnosti různých purifikovaných izolátů byla pouţita diskriminační koncentrace 5,8x10 4 OB/ml, kterou pouţívali Asser-Kaiser a kol. (2007) a Asser-Kaiser (2010) pro rozlišení citlivých a rezistentních jedinců nehomogenně rezistentní populace CpR. Tato koncentrace usmrtila % citlivých jedinců laboratorního kmene CpS. Testování citlivosti CpR-CZ bylo provedeno v JKI (Darmstadt) za pouţití diety připravené podle Ivaldi- Sender (1974). Pro testování účinnosti formulovaných preparátů byla pouţita metoda aplikace viru na povrch diety podle Ivaldi-Sender (1974) s jednou diskriminační koncentrací viru. Testování bylo provedeno v JKI (Darmstadt). Zvolená koncentrace 6,25 OB/mm 2 odpovídala LC 95 aţ LC 99 po 7 dnech u housenek kmene CpS v pokusu s povrchovou aplikací CpGV-M (podkapitola 4.2.2). Experimenty hodnotící citlivost CpR-CZ k purifikovaným izolátům i formulovaným preparátům byly provedeny nejméně ve třech nezávislých opakováních a součástí testu byla i kontrolní dieta bez viru. K CpGV-M citlivé kmeny CpS a CpKrym byly testovány v jednom (izoláty) nebo ve třech (přípravky) nezávislých opakováních. Mortalita housenek byla hodnocena po 7 a 14 dnech. Korekce mortality byla provedena podle mortality v kontrolách (Abbott, 1925). Účinnost izolátů byla stanovena na základě porovnání průměrných mortalit 70

72 housenek a jejich směrodatných odchylek (SD) získaných ze všech opakování biologického testu. Účinnost izolátu V015 byla navíc testována biologickým testem o šesti koncentracích (3x OB/ml) zamíchaných do diety připravené podle Ivaldi-Sender (1974) a účinnost přípravků Madex Plus a ABC V015 byla stanovena biologickým testem o šesti koncentracích (0,0208 6,2500 OB/mm 2 ) aplikovaných na povrch diety připravené dle Ivaldi-Sender (1974). Biologický test byl vyhodnocen probitovou analýzou 7. a 14. den (podkapitola 4.1.6). 6.2 Výsledky Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného Biologický test (5 Cíl II) přeţili do 14 dnů samci i samice, avšak úspěšně dokončilo vývoj pouze několik samic F1 generace populace VBII09 a kříţenců VBII 09xCpKrym. Samice F1 generace VBII09 vstoupily do diapauzy, a tak byl chov rezistentního kmene zaloţen ze samic F1 generace VBII 09xCpKrym, které se zakuklily a vylíhli se z nich dospělci. Tyto samice byly pářeny se samci kříţenců z kontrolní diety bez viru nebo se samci CpKrym. Potomstvo kontrol VBII vstoupilo do diapauzy. F2 generace nově vznikajícího chovu CpR-CZ byla selektována při niţší koncentraci viru 3x10 3 OB/ml, aby mohli dokončit vývoj heterozygotní samci (Z S Z R ). Rezistentní samci a samice generací F3 a F4 byli také selektováni převáţně při niţší koncentraci 3x10 3 OB/ml. U dalších generací probíhala selekce především při koncentraci 3x10 5 OB/ml, aby se selektoval homogenně rezistentní kmen (Z R W, Z R Z R ). Selekce rezistentního kmene obaleče jablečného probíhala rok, protoţe v průběhu selekce docházelo v některých generacích k nečekaně vysokým úhynům housenek posledního instaru, a to především v zimním období. Housenky se vyvíjely normálně, ale zakuklilo se jich jen několik a samice motýlů kladly málo, nebo ţádná vajíčka. Homogenně rezistentní kmen CpR-CZ byl získán aţ v druhé polovině roku Ověření zaloţení rezistence u CpR-CZ Všechny tři páry tvořené homogenně rezistentním samcem a citlivou samicí (Z R Z R x Z S W) nakladly dostatek oplozených vajíček. Mortalita housenek F1 umístěných na dietu s diskriminační koncentrací viru (5,8x10 4 OB/ml) byla sedmý den ve dvou případech 0 % a jednou 2,63 % (tabulka 6.1). Ze třech párů sloţených z citlivého samce a rezistentní samice (Z S Z S x Z R W) nakladl dostatek oplozených vajíček pouze jeden pár. Od druhého páru se z několika oplozených vajíček vylíhlo 8 jedinců a u třetího páru samice nekladla. Sedmý den byla mortalita potomstva prvního páru 51,16 % a druhého 25 % (tabulka 6.1). Po čtrnácti 71

73 dnech se zastoupení samců v potomstvu párů Z R Z R x Z S W pohybovalo od 46,51 %do 48,28 % a tvořilo tak přibliţně polovinu všech ţivých jedinců, zatímco v potomstvu párů Z S Z S x Z R W přeţili pouze samci (tabulka 6.1). Předpokládané genotypy rodičů CpR-CZ x CpS Z R Z R x Z S W CpS x CpR-CZ Z S Z S x Z R W Předpokládané potomstvo (F1) Z S Z R Z R W Z S Z R Z S W Počet testovaných jedinců F1 (n) 7 dní 14 dní Předpokádaná / skutečná mortalita (%)* Předpokádané / skutečné zastoupení samců (%) 47 0 / 0,00 50 / 46, / 2,63 50 / 47, / 0,00 50 / 48, / 51, / / 25, / Tabulka 6.1: Mortalita (po 7 dnech) a zastoupení samců (po 14 dnech) v potomstvu pocházejícím od jednotlivých párů sloţených z kmenů CpS a CpR-CZ při diskriminační koncentraci CpGV-M (5,8x10 4 OB/ml). *Mortalita opravena dle mortality v kontrole (Abbott, 1924) Purifikované izoláty Účinnost všech nových izolátů hodnocených po sedmi dnech byla vysoká, zatímco CpGV-M byl se stanovenou mortalitou 0,83 % zcela neúčinný (obrázek 6.1). Nejvyšší průměrná mortalita housenek CpR-CZ byla zjištěna při pouţití izolátů CpGV-E2 (97,4 %) a CpGV-I12 (99,6 %). Účinnost izolátů CpGV-I08, -S a -V015 byla v jednotlivých opakováních vysoce variabilní. U izolátů CpGV-S a -V015 byla vysoká směrodatná odchylka (SD) způsobena jedním z opakování, při kterém byla mortalita housenek velmi nízká 41,9 % (CpGV-S) a 69,8 % (CpGV-V015), zatímco v ostatních opakováních mortalita dosahovala 100 %. Izolát CpGV-I08 byl méně účinný ve všech opakováních a mortalita housenek se pohybovala od 36,7 % do 91,2 %. Proti housenkám CpS byly vysoce účinné všechny izoláty včetně CpGV-M (obrázek 6.1). Mortalita byla stanovena v jednom opakování a dosahovala 97 % %. Po 14 dnech testu byla nízká průměrná mortalita CpR-CZ zaznamenána pouze na dietě obsahující CpGV-M (10,83 %). Ostatní izoláty usmrtily do 14 dnů všechny housenky. 72

74 mortalita mortalita (%) průměrná mortalita 7d (5,8x10 4 OB/ml) CpGV-E2 CpGV-I08 CpGV-I12 CpGV-S CpGV-V015 CpGV-M I SD n CpR-CZ CpS Obrázek 6.1: Porovnání průměrné mortality housenek CpR-CZ a CpS při pouţití různých izolátů CpGV zamíchaných do diety v diskriminační koncentraci 5,8x 10 4 OB/ml. SD=výběrová směrodatná odchylka, n=počet testovaných jedinců. Mortalita upravena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925) Účinnost izolátu V015 proti CpR-CZ byla vyhodnocena také probitovou analýzou (obrázek 6.2). Střední letální koncentrace byla po 7 dnech jen 3 krát vyšší neţ LC 50 stanovená pro kmen CpS infikovaný CpGV-M (tabulka 4.1). Po 14 dnech se tento rozdíl sníţil a LC 50 byla vyšší jen 1,8 krát (tabulka 6.2). V015: CpR-CZ 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Log (OB/ml) 7 dní Lower bound (95%) Upper bound (95%) 14 dní Model Obrázek 6.2: Logitová regrese závislosti mortality housenek CpR-CZ na koncentraci CpGV-V015. Mortalita hodnocena 7 a 14 dní po infekci. Body představují mortalitu housenek v jednotlivých koncentracích biologického testu. 73

75 CpR-CZ počet housenek LC 50 95% konf. limity V015 v testu (n) (OB/ml x10 3 ) (OB/ml x10 3 χ 2 95% konf. Sklon ) limity 7 dní 3,753 2,536 5,513 75,75 1,32 1,02 1, dní 0,553 0,343 0,788 37,77 1,75 1,19 2,31 Tabulka 6.2: Střední letální koncentrace (LC 50 ) CpR-CZ 7 a 14 dní po inokulaci CpGV-V Formulované přípravky Účinnost formulovaných CpGV produktů byla ověřena ve třech nezávislých opakováních na rezistentním chovu CpR-CZ a citlivém chovu CpKrym. Účinnost všech třech přípravků byla proti housenkám CpKrym vysoká a motralita po 7 dnech dosahovala % (obrázek 6.3 A). Obrázek 6.3: Porovnání průměrné mortality housenek CpR-CZ a CpKrym při pouţití třech preparátů na bázi CpGV aplikovaných povrchově v diskriminační koncentraci 6,25 OB/mm 2. SD=výběrová směrodatná odchylka, n=počet testovaných jedinců. Mortalita upravena dle mortality v kontrolách (Abbott, 1925). Proti CpR-CZ nejlépe účinkoval nově testovaný přípravek ABC V015, který do sedmi dnů usmrtil 86-96,9 % housenek. Přípravek Madex Plus na bázi CpGV-M pasáţovaného přes rezistentní populaci způsobil mortalitu u 57,9-82,3 % housenek CpR-CZ, zatímco původní 74