MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2012 JANA KAŠPAROVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Toxikologické hodnocení vybraných chemických látek používaných v trofických řetězcích Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Hana Dočekalová, CSc. Vypracovala: Jana Kašparová Brno 2012

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Toxikologické hodnocení vybraných chemických látek používaných v trofických řetězcích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. V Brně dne Podpis

5 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych na tomto místě poděkovala prof. RNDr. Haně Dočekalové, CSc. a prof. RNDr. Miroslavě Beklové, CSc. za cenné rady, připomínky, poskytnutou literaturu a pomoc při zpracování bakalářské práce. Zároveň bych chtěla poděkovat svým rodičům za podporu během mého studia.

6 ABSTRAKT V teoretické části této práce je zpracovaná literární rešerše, zahrnující popis několika vybraných testů toxicity. V experimentální části práce byly stanoveny inhibiční koncentrace tří chemických látek Polyolu, cínoktanoátu a bisfenolu A používaných při výrobě plastových obalů pro potraviny za pomocí testu klíčivosti a elongačního testu toxicity prováděného s organismem Hořčice bílé. K vyhodnocení dat byla použita rovnice regrese a program Software TOXICITA 3.0. Všechny tři testované látky vykazovaly toxické účinky na testovaný druh. KLÍČOVÁ SLOVA: toxicita, Hořčice bílá, bisfenol A, polyol, cínoktanoát ABSTRACT The theoretical part of the work includes the literature overview and is focused on selected toxicity tests. In the experimental part of the work inhibitory concentrations of three chemicals: polyol, tin octanoate and bisphenol A used in the manufacture of plastic packaging for foods were studied using germination test and elongation toxicity test performed with the organism of white mustard. To evaluate the data the regression equations and Software TOXICITY 3.0 were used. All three studied substances showed toxic effects on the tested species. KEYWORDS: toxicity, White mustard, bisphenol A, polyol, tin octanoate

7 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁLNÍ PŘEHLED TOXIKOLOGIE TESTY TOXICITY ROZDĚLENÍ TESTŮ TOXICITY PODLE DOBY EXPOZICE Akutní testy Subakutní (subchronické) testy Chronické testy ROZDĚLENÍ TESTŮ EKOTOXICITY Standardní testy Alternativní testy Akvatické testy Terestrické testy TESTOVANÉ ORGANISMY Charakteristika organizmu používané k testování TEST INHIBICE RŮSTU KOŘENE HOŘČICE BÍLÉ (SINAPIS ALBA) PROBIT ANALÝZA MATERIÁL A METODIKA CHARAKTERISTIKA POUŽITÝCH LÁTEK Polyol Cínoktanoát Bisfenol A PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍHO ROZTOKU PŘÍPRAVA ROZTOKŮ TESTOVANÝCH LÁTEK Polyol Cínoktanoát Bisfenol A PROVEDENÍ JEDNOTLIVÝCH TESTŮ Polyol...28

8 4.4.2 Cínoktanoát Bisfenol A VÝSLEDKY A DISKUZE TEST KLÍČIVOSTI STANOVENÍ IC 50 PRO POLYOL STANOVENÍ IC 50 PRO CÍNOKTANOÁT STANOVENÍ IC 50 PRO BISFENOL A První koncentrační řada Druhá koncentrační řada ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ...42

9 1 ÚVOD Během procesu fotosyntézy vznikají v rostlinách z jednoduchých anorganických sloučenin vody a oxidu uhličitého za pomoci sluneční energie životně důležité organické látky, které jsou základem potravních (trofických) řetězců, kde jeden organizmus je zdrojem potravy pro druhý. Do potravních řetězců se kromě nutričních a jinak užitečných látek dostávají na všech úrovních i látky nežádoucí, které mají negativní dopad na zdraví a vývoj konzumenta. Největší pozornost je věnována člověku a potravinám, které přijímá a ty jsou přísně kontrolovány na přítomnost nežádoucích látek. U těchto látek jsou experimentálně stanovovány toxikologické charakteristiky. Jedním ze zdrojů toxických látek v potravinách mohou být obaly, při jejichž výrobě jsou používány chemikálie, které mohou následně přecházet do potravin a ohrožovat tak zdraví člověka. 9

10 2 CÍL PRÁCE 1. Zpracování literární rešerže k tématu. 2. Experimentální provedení vybraných toxikologických testů na některých chemických látkách vstupujících do potravin při výrobě nebo přicházejících do styku s potravinami a pokrmy. 3. Zhodnocení získaných výsledků a jejich interpretace. 10

11 3 LITERÁLNÍ PŘEHLED 3.1 Toxikologie Toxikologie je věda o nežádoucích účincích látek. Paracelsus, otec toxikologie, kdysi napsal: Všechno je jed, ve všem je jed. Záleží pouze na dávce. Pojem jed se tedy často používá k označení jakékoli škodlivé látky, která může vyvolat poruchu biologických rovnováh, charakteristických pro zdraví. Rozhodující pro takový děj je především dávka. (RYBIČKA, 2001) Význam znalostí toxikologie se v posledních letech stal zřejmý. Možné negativní účinky chemických sloučenin a dalších škodlivin používaných nejen v průmyslu a v zemědělství, ale i v potravinářství se dostaly do vědomí široké veřejnosti. Většině lidí je již známo, že nerespektování toxikologických poznatků vedlo k zamoření našeho životního prostředí takovými sloučeninami a v takových množstvích, že jsme vlastně obrovskou laboratoří, která nemá obdoby. Nejznámějším důsledkem bylo zkracování délky života u nás. Dnes můžeme konstatovat, že se tento trend přece jen zastavil. Je to právě díky obecnému zvýšení znalostí a na tomto základě přijatých opatření. Toxikologické charakteristiky jsou zjišťovány pomocí testů toxicity. (PROKEŠ, 2005) 3.2 Testy toxicity Toxikologických testů, tedy experimentálních metod stanovení toxického působení stresorů na přírodní organismy, bylo vypracováno značné množství a lze je rozdělit podle řady různých kritérií. Bez ohledu na to, půjde-li o jejich rozdělení podle způsobu expozice, podle trofických úrovní testovacích organismů, nebo bude-li posuzováno jiné hledisko, základní provedení testu je vždy přesně dáno. Skládá se z čtyř základních kroků: příprava testovacího organismu příprava roztoku expozice studované látky vyhodnocení. Výběr testovacího organismu je jedním ze základních kroků při testování toxicity. Testovací organismus by měl být dobrým reprezentantem příslušné skupiny organismů (např. Daphnia magna korýši). Výsledek stanovení toxicity ovlivňuje také řada 11

12 biologických faktorů, jako je velikost a stáří jedinců, pohlaví, vývojové stadium a další. Vliv má samozřejmě také kultivační médium. Příprava vzorku obnáší přípravu koncentračních řad zkoumaných látek pomocí ředícího média. S každým stanovením se zároveň provádí kontrola. Při expozici testovacího organismu zkoumané látky jsou hlavními parametry body expozice, jejichž délka závisí také na generačním bodě organismu, a dále způsob expozice. Vyhodnocením výsledků testu bývá u živočichů nejčastěji letalita, popř. imobilizace, u semen a rostlin inhibice růstu. Výsledky se uvádějí jako hodnoty LC 50 (koncentrace, která způsobí úhyn 50 % testovaných organizmů ve zvoleném časovém úseku), EC 50 (střední účinná nebo efektivní koncentrace, která způsobí úhyn či snížení růstu nebo růstové rychlosti u 50 % testovacích organismů) nebo IC 50 (inhibiční koncentrace, která způsobí 50 % inhibici růstu nebo růstové rychlosti řasové kultury nebo 50 % inhibici růstu kořene Hořčice bílé Sinapis alba ve srovnání s kontrolou ve zvoleném časovém úseku). (ŽAJGLOVÁ & KAŠPAROVÁ, 2008; HORÁK a kol., 2004) 3.3 Rozdělení testů toxicity podle doby expozice Testy toxicity lze třídit podle mnoha ukazatelů, jedním z nich je doba expozice. Dle doby expozice se rozdělují testy na akutní, subakutní a chronické. (MARŠÁLEK, 2002) Akutní testy Akutními testy se sledují účinky, které se projeví v krátké době obvykle po jednorázové nebo krátkodobé expozici. Patří mezi nejrozšířenější standardní laboratorní testy. Délka trvání testů je 24 až 96 hodin. Nejčastěji se stanovuje mortalita měřená jako LD 50 (koncentrace představující smrtelnou dávku, která způsobí smrt 50% skupiny pokusných zvířat nebo) LC 50 (smrtelná koncentrace chemické látky, která zabije 50 % z pokusných zvířat v daném čase), popř. inhibice IC 50 a udává se v mg.l -1. Podle těchto hodnot lze testovanou látku zařadit do tříd toxicity a odhadnout míru jejího škodlivého působení na organismy. 12

13 3.3.2 Subakutní (subchronické) testy Tyto testy trvají obvykle 28 až 90 dnů. Organismy jsou opakovaně, obvykle jednou denně, exponovány testované látce. Provádí se paralelní test s kontrolní skupinou, s níž musí být zacházeno stejným způsobem jako s exponovanou, kromě podávání zkoumané látky. Tímto se separují vlivy prostředí od působení dané látky. Tyto testy slouží ke studiu nejvýznamnějších toxických změn při opakované expozici dané látky a k získání hodnot NOEC (Non-observed measured concentration, koncentrace nevyvolávající viditelný efekt), a LOEC (nejnižší koncentrace s pozorovatelnými efekty) (viz. obr. 1), nemusí však odhalit následky dlouhodobého působení. Výsledky subchronických testů jsou velmi užitečné pro účelné navržení chronického testu. Obr. 1: Vztah mezi dávkou a účinkem (křivka závislosti rozsahu účinku na Chronické testy koncentraci/dávce) (MARCHAND, 2007) Při chronických testech jsou organismy exponovány v testované látce dlouhou dobu, často po celou dobu dospělého života. V daných pravidelných intervalech se testovaným organismům podává testovaná látka a v průběhu experimentu jsou sledovány jednotlivé patologické změny pomocí vhodně zvolených parametrů, které indikují škodlivý účinek. Kontrolní skupina musí být stejně početná jako skupiny exponované a musí být držena za stejných podmínek, jen s tím rozdílem, že zůstává neexponována sledované 13

14 látce. Chronické testy slouží k získání informací o dlouhodobém působení látky na živý organismus a pro určení hodnot NOEC (koncentrace nevyvolávající viditelný efekt) a LOEC (nejnižší koncentrace s pozorovatelnými efekty). (KAFKA & PUNČOCHÁŘOVÁ, 1999; HÁJKOVÁ, 2010; KOČÍ, 2009) 3.4 Rozdělení testů ekotoxicity Základní rozdělení testů ekotoxicky je na testy standardní versus alternativní a dále pak na testy pracující s roztoky tzv. akvatické versus testy kontaktní neboli terestické. (MANAHAN, 1992) Standardní testy V České republice jsou validovány standardní testy toxicity a jsou dle Vyhlášky č. 502/2004 Sb. používány pro hodnocení ekotoxicity výluhů. Výhodou těchto testů jsou jednotné metodiky a výsledky jsou dobře akceptovatelné pro regulační orgány. Tyto metody poskytují základ, který se dá v případě potřeby modifikovat. Obsahují detailní seznam použitých přístrojů, medií, modelových organismů atd. Jsou u nich plně popsány experimentální, analytické a dokumentační postupy. Nevýhodou je, že bývají často příliš specifické, mnohdy těžko aplikovatelné pro jiné situace. Často bývají používány v nevhodných situacích (výzkum, hodnocení příčiny a účinku) a nemusí být aplikovatelné do reálného prostředí. (ŠKARKOVÁ, 2010) Běžně se pro testování toxicity používají ryby, bezobratlí a řasy. V České republice jsou nejčastěji prováděny následující testy, které jsou identické s ISO či OECD normami: Akutní test toxicity na rybách (OECD 203/1992, OECD 204/1984, ISO :1996). Princip testu spočívá v hod. expozici ryb v testovaných vzorcích vody. Po stanovené době se provede odečet mortality. OECD doporučuje druhy: Dánio pruhované (Brachydanio rerio), Pstruh duhový (Salmo gairdneri), Kapr obecný (Cyprinus carpio) a řadu dalších. Stáří jednoho druhu ryb bývá identické (obvykle 7 dnů), na jeden vzorek se používá 20 jedinců. 14

15 Imobilizační případně reprodukční test na perloočkách (OECD 202/1984, ISO 6341:1996) Používá se drobný korýš Daphnia magna, který je přírodním komponentem planktonu našich vod. U testu se nesleduje mortalita (v důsledku obtížného rozeznání úhynu) ale imobilita, což je jakýsi stav strnulosti či neschopnosti pohybovat se ve svém vodním prostředí. Na stanovení jsou vhodné 24 hodin staré organismy v počtu dvaceti pro každou koncentraci, srovnává se s kontrolní skupinou, vyhodnocuje se po 24 resp. 48 hodinách. Jako referenční chemikálie slouží K 2 Cr 2 O 7, která má IC50 24-hod = 0,9-2 mg.l -1. Růstově inhibiční test na řasách (OECD 201/1984). Test je založen na měření rychlosti růstu kultury použité řasy po hodinách expozice testovaném vzorku vody. Měří se buď automatickým počítacím strojem, nebo spektrofotometricky. Snížení růstové rychlosti při porovnání s kontrolou se vyjadřuje jako inhibice. Test je jednoduchý, operativní a dostatečně citlivý. Testy na vyšších cévnatých rostlinách - test klíčivosti a růstu kořenů hořčice (OECD 208/1984). Tyto testy mají zatím určité nedostatky především v jednostrannosti provedení testu, výběru testovacího organismu, vyhodnocení i interpretaci výsledků. Pro testy toxicity se používá především Hořčice bílé (Sinapsis alba), Řeřichy seté (Lepidium sativum), Ředkvičky seté (Raphanus sativa), Salátu hlávkového (Lactura sativa) a další. Vyhodnocení probíhá obvykle (např. 72 hod. test u hořčice) měřením délky kořene (je však možno měřit i biomasu nadzemní části případně zjišťovat aktivitu řady enzymů (dehydrogenáz, fosfatáz, oxidáz, peroxidáz). (RUSEK, 2001; ZÁLEŠÁKOVÁ 2008) Alternativní testy Tyto testy mají mnoho výhod, především ekonomických. Výhodou je také široká škála testovaných organismů. Využívají klidových stádií organismů, vajíčka, atd., což znamená, že nevyžadují udržování a kultivaci matečných kultur. Nahrazují používání organismů pro testy toxicity (in vitro tkáně ryb), šetří laboratorní a kultivační prostor, 15

16 vyžadují jen malé objemy vzorků, proto se jim někdy říká miniaturizované testy. Nejpoužívanějšími alternativními testy jsou např. Rototoxkit s Vířníkem Brachionus calyciflorus, Thamnotoxkit s korýšem Thamnocephalus platyurus, Daphtoxkit s korýšem Daphnia pulex a Daphnia magna. (ŠKARKOVÁ, 2010) Akvatické testy Účinek testované látky se studuje ve vodném prostředí, jedná se buď o roztok látky ve vodě, nebo o vodní výluh, jako jsou sedimenty nebo odpady. Testy probíhají v nádobách, ve kterých jsou vodné roztoky testované látky o různých koncentracích. V každé koncentraci je umístěn určitý počet testovaných organismů, který je pro všechny koncentrace stejný. Po uplynutí doby expozice se odečte počet organismů, které vykazují reakci na účinky testované látky. Vzhledem k podmínkám testů, je vhodné testovat látky rozpustné ve vodě. Mezi testovací vodní organismy patří ryby, korýši, vodní rostliny, řasy a bakterie. (ŠKARKOVÁ, 2010; FARGAŠOVÁ 2009) Terestrické testy Testy toxicity v terestrickém uspořádání slouží k posouzení možných toxických účinků chemických látek. Testování je prováděno v nádobách naplněných umělou nebo přírodní půdou, která obsahuje známou koncentraci testované látky. Tyto testy jsou vhodné i pro hydrofóbní látky, které není možné testovat v rámci akvatických testů ekotoxicity. Pomocí terestrických testů jsou testovány látky, které přichází do kontaktu s půdními ekosystémy, používají se pro hodnocení ekotoxicity různých typů pevných odpadů a kontaminovaných zemin. Testy toxicity sedimentů řek a vodních nádrží jsou zvláštní skupinou. Tyto matrice často obsahují vysoké koncentrace rizikových kovů a organických polutantů. Organismy, které v sedimentech žijí, vážou, kumulují ve svých tělech tyto látky, které se následně dostávají do potravního řetězce. V rámci terestrických testů se využívají zejména tyto organismy: chvostoskok, roupnice, žížaly, bakterie, jednoděložné a dvouděložné rostliny. (HÁJKOVÁ, 2010) 16

17 3.5 Testované organismy Ekotoxikologické testy se provádějí formou testů akutní toxicity na čtyřech typech organismů rostlinné a živočišné říše. Jedná se o nižší rostliny (řasa Scenedesmus subspicatus), vyšší rostliny (semena Hořčice bílé Sinapis alba), bezobratlé živočichy (perloočka Daphnia magna) a obratlovce (akvarijní rybka Poecilia reticulata). Výběr organismů určuje Vyhláška 294/2005 Sb. a Vyhláška 376/2001 Sb. (KOČÍ a kol, 2001, VYHLÁŠKA č. 376/2001 Sb. a č. 294/2005 Sb.) Při testech na vyšší cévnaté rostliny (OECD 208/1984) se používá nejčastěji 5eřichy seté (Lipidium sativum), ředkvičky seté (Raphanus sativa), salátu hlávkového (Ladura sativa) a hořčíce bílé (Sinapis alba). V experimentální části bakalářské práce byl použit standardní test ekotoxicity, který je z finančního hlediska nenáročný a je velmi oblíbený a často používaný pro toxikologické a ekotoxikologické studie. Tento test byl původně vyvinut k testování toxického účinku odpadních vod na závlahy. Při této zkoušce se využívá citlivosti klíčících semen Hořčice bílé (Sinapis alb)a v počátečních stádiích vývoje rostliny na studovanou látku Charakteristika organizmu používané k testování Hořčice bílá (Sinapis alba) (viz. obr. 2a.) patří do čeledi brukvovitých, Brassicaceae. V půdě setrvává tenkým vřetenovitým kořenem. Lodyhu má vzpřímenou, roztroušeně chlupatou, až 150 cm vysokou s listy jasně zelené barvy. V dolní části jsou listy pravidelně lyrovitě peřenoklané až peřenodílné, v horní části trojklané. Květy jsou oboupohlavné čtyřčetné s chlupatými stopkami. Zpočátku jsou sestaveny v klubkaté květenství, později v protáhlé hrozny, kde jednotlivé květy kvetou odspoda. Při jarním výsevu květiny kvetou v květnu až červenci, při letním lze kvetoucí hořčice vidět až do pozdního podzimu. Plody jsou odstálé, bíle štětinaté šešule, s trojžilnými až pětižilnými chlopněmi a se smáčklým, mečovitě zahnutým zobanem, který je obvykle delší nežli samotná šešule. Kvetoucí rostliny jsou opylovány hmyzem, nejčastěji včelami, jimž poskytují pastvu v letním a podzimním období. Pěstuje se především pro semeno, ze kterého se vyrábějí doplňky jídel. Olej, kterého obsahuje semeno 24-32%, je využíván v potravinářském průmyslu i pro technické účely na výrobu mýdel, ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Patří zároveň mezi krmné 17

18 plodiny. Hořčice pochází z jihovýchodního Středomoří, kde byla pěstována starověkými civilizacemi již 2000 let před naším letopočtem. V Evropě začala být pěstována v ranném středověku. Největší plochy hořčice bílé jsou v Rusku, Indii a Číně. Semeno rostliny je na brukvovité rostliny poměrně velké, je žluté nebo bělavě žluté kulovitého tvaru. Dosahuje průměru 1,5 4 mm, hmotnost tisíce semen se pohybuje od 3 do 6,8 g. Po vyklíčení vyrůstá jednoduchý kořen s hypokotylem (viz. obr. 2b.). Později je kulovitý a bohatě rozvětvený. Rostlině se nejlépe daří na středně hlinitých nebo hlinitopísčitých půdách, dobře hnojených, s dostatkem vápníku a s neutrální až mírně alkalickou půdní reakcí. (KOČÍ a kol., 2001) [m m ] a) b) Obr. 2 a) Část stonku hořčice bílé, Sinapis alba s květem b)vyklíčené semeno s hypokotylem na konci třetího dne pokusu ve standardním živném médiu (ŽAJGLOVÁ & KAŠPAROVÁ, 2008) K testu bylo použito semeno, po vyklíčení se změřila délka kořene k hypokotylu v mm. 18

19 3.6 Test inhibice růstu kořene hořčice bílé (Sinapis alba) Principem testu je kultivace semen v Petriho miskách na filtračním papíře, který je nasycený testovaným roztokem. Současně se semena nasadí do standardně připravené zásobní vody bez přítomnosti testované látky kontrola. Celková délka testu je 72 hodin a celý test probíhá za nepřístupu světla. Na konci testu se stanovuje počet vyklíčených semen a měří se délka kořene. Z naměřených délek kořene se vypočte jejich aritmetický průměr dle rovnice 1: Rovnice 1: kde: L Li n je průměrná délka kořene ve zvolené koncentraci (mm); je průměrná délka i-tého kořene ve zvolené koncentraci (mm); je počet semen ve zvolené koncentraci. Vyhodnocení testu spočívá ve výpočtu inhibice růstu kořene pro určitou koncentraci testované látky a určení koncentrace látky, která způsobí 50% inhibici růstu kořene po 72 hodinách ve srovnání s kontrolou, výsledkem je hodnota 72hIC50. Inhibice růstu kořene se vypočte dle rovnice 2: Rovnice 2: kde: I i L c L v inhibice růstu kořene (%) v dané koncentraci, je-li I<0, jedná se o stimulaci růstu průměrná délka kořene v kontrole (cm) průměrná délka kořene v testované koncentraci (cm) Koncentrace látky, při které došlo k inhibici růstu kořene, se vyjádří v logaritmické podobě. Do grafické závislosti (viz. obr. 3) se na osu x vynese koncentrace v logaritmické hodnotě a na osu y inhibice růstu kořene vyjádřená v procentech. Závislost 19

20 mortality na koncentraci má sigmoidální charakter. Takovou závislost však nelze popsat přesnou rovnici. Je třeba získaná data určitým způsobem transformovat. Nejjednodušší je postavit proti hodnotám mortality logaritmy koncentrací a závislost vyjádřit pomocí lineární regrese. V bodě IC 50 má totiž křivka inflexní bod a v jejím okolí je její průběh přibližně lineární. Koncentrace v průsečíku přímky s křivkou odpovídá IC 50. Pokud testovaná látka působí na růst kořene stimulačně, tzn. průměrná délka kořene v testované látce je větší jak v kontrole, výpočet inhibiční koncentrace se neprovádí. (KOČÍ a kol., 2001, Dvořák 2009) Obr. 3: Vztah závislosti úhynu organismu na koncentraci (KOČÍ a kol., 2001) 3.7 Probit analýza Statistická technika, pomocí níž je vyjádřen vztah mezi odezvou a podnětem. V analýze rizika při hodnocení dopadů událostí se vypracuje pravděpodobnostní vztah mezi logaritmem velikosti dávky z události (např. následky jako je toxicita) (osa x) a odpovědí v % exponované populace (např. fatalita) (osa y). Původní typická křivka dávka - odpověď (osa x logaritmus dávky, osa y odpověď, např. fatalita) je transformována na tzv. probit funkci, což je lineární křivka dávka probit (osa x logaritmus dávky, osa y probit), kterou můžeme vyjádřit rovnicí. Probit lze pak transformovat buď pomocí grafu, nebo tabelovaných hodnot na zájmová % zasažení. (BOJANOVSKÁ, 2009) 20

21 4 MATERIÁL A METODIKA Testy toxicity uváděné v této práci byly provedeny na Chemické fakultě VUT v Brně a na ústavu Veterinární ekologie a ochrany životního prostředí VFU Brno v akreditovaných laboratořích, které splňují veškeré podmínky pro provádění testu toxicity a ekotoxicity. Chemikálie: Polyol směs polymerních alkoholů připravená na Chemické fakultě VUT v Brně Cínoktanoát čistota 99.9%, Sigma-Aldrich Bisfenol A čistot a 99,9%, Merck Zásobní roztok Použité laboratorní sklo a pomůcky: Petriho misky o průměru 140mm Odměrné baňky 50 a 100 ml Kádinky Filtrační papír Pipety Mikropipety Program na vyhodnocení: Software TOXICITA

22 4.1 Charakteristika použitých látek Polyol Směs polymerních alkoholů, která se používá pro výrobu biodegradabilních polymerů, připravená v laboratořích Chemické fakulty VUT v Brně Cínoktanoát Vlastnosti cínoktanoátu jsou shrnuty v tabulce číslo 1. Tab. 1: Vybrané fyzikálně chemické parametry cínoktanoátu. molekulový vzorec C 32 H 60 O 8 Sn molární hmotnost 691,5112 g/mol Skupenství Kapalné teplota tání ( C) < 45 C Hustota 1,25 g/cm 3 index lomu 1,489-1,495 CAS EINECS Log P OW 2,67 rozpustnost ve vodě 100 mg/l (20 C) Pak 5,09 (20 C) Cínoktanoát (Sn(Oct) 2 ) je používaný jako katalyzátor při polymeraci biokompatibilních a biodegradabilních polymerů. Je to organokov rozpustný v běžných organických rozpouštědlech a cyklických monomerech, snadno zpracovatelný a komerčně dostupný. Většina sloučenin cínu prokazuje toxicitu, což neumožňuje jejich aplikaci v biomedicíně. 22

23 Katalyzátor Sn(Oct)2 (viz. obr. 4) je silným transesterifikačním činidlem. Vzniklé kopolymery mají proto náhodnou strukturu. Za vysokých teplot ( C) a přítomnosti ROH je velmi reaktivní a polymerací poskytuje produkty s vysokou molekulovou hmotností. (NEUMANOVÁ, 2010; SMČKOVÁ, 2009) CH 3 O H 3 C O Sn O CH 3 O H 3 C Obr. 4: Vzorec cínoktanoátu (KRPOUN, 2010) Bisfenol A Vlastnosti bisfenolu A jsou shrnuty v tabulce číslo 2. Tab. 2: Vybrané fyzikálně chemické parametry bisfenolu A uvedené v bezpečnostním listu. Molární hmotnost 228,29g.mol=-1 Molekulový vzorec C 15 H 16 O 6 Skupenství Šupinky Barva Bílá Zápach Po fenolu Hodnota Ph 6,4 Bisfenol A [2,2-bis(4-hydroxyfenyl(propan] (viz. obr. 5) je organická látka připravená v roce 1891 ruským chemikem Alexandrem P. Dianinem kondenzací fenolu s acetonem (proto A za jménem). Dlouho neměl bisfenol žádné významné využití, ale s rozvojem chemie polymerů se stal důležitou surovinou pro přípravu plastů. V současné době je využíván zejména při přípravě polykarbonátových plastů, které se užívají při výrobě makrolonových desek, nádob na tekutiny, kojeneckých lahví, nosičů CD a DVD, campingových příborů, dóz na potraviny, k ošetření vnitřního povrchu konzerv apod. Laboratorní testy potvrdily, že bisfenol A se dostává do potravin, které jsou v kontaktu s polykarbonáty, a lze jej dokázat v krvi lidí, kteří takové potraviny konzumují. Bisfenol A nachází stále širší použití ve stavebnictví, elektronice, medicíně, 23

24 potravinářském průmyslu i jinde a jeho roční světová produkce se pohybuje kolem 3 milionů tun. Obr. 5: Vzorec bisfenolu A (PATOČKA, 2008) Při pokusech bylo zjištěno, že bisfenol A indukuje v buňkách slinivky nadbytečnou tvorbu inzulinu, působením na estrogenové receptory, které na svém povrchu mají buňky pankreatu. Bisfenol A tedy může vest nejen ke vzniku rakoviny prsu či prostaty ale zdá se, že by mohl být i jedním z důvodů nárůstu počtu diabetiků a rovněž lidí postižených obezitou. Bisfenol A může také přispívat k těhotenskému diabetu, čí vést i k dalším metabolickým chorobám. (MERCK; PATOČKA, 2008; ARNIKA 2009) 4.2 Příprava zásobního roztoku Do zásobní nádoby byla odměřena část zásobní redestilované vody, pak se do ní dávkovaly zásobní roztoky solí. Bylo dáno 20,5ml zásobního roztoku každé soli na 1l média. Po nadávkování solí se nádoba doplnila destilovanou vodou až po rysku. Zásobní roztoky solí pro zřeďovací vodu: Zásobní roztok č. 1 : 117,6 g CaCl 2. 2H 2 O (p. a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou. Zásobní roztok č. 2 : 49,3 g MgSO 4. 7 H 2 O (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou. Zásobní roztok č. 3 : 25,9 g NaHCO 3 se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou. Zásobní roztok č. 4 : 2,3 g KCl (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou. 24

25 V tabulce číslo 3 je uvedeno množství soli potřebné pro přípravu 100 ml zásobního roztoku. Tab. 3: Příprava zásobního roztoku Roztok Množství soli (g) na 100 ml destilované vody č. 1 1,176 č. 2 0,496 č. 3 0,259 č. 4 0,023 Tabulka č. 4 nám udává, jaká byla získaná koncentrace při odebrání určitého množství ředícího roztoku (např. odebrání 16 ml z 50 ml ředícího roztoku a zpětné doplnění zásobním roztokem na 50 ml). Tab. 4: Ředící roztok Koncentrace ředícího Množství odebraného roztoku (mg/l) ředícího roztoku (ml) 10 0,

26 4.3 Příprava roztoků testovaných látek Polyol 2,5 g polyolu bylo rozpuštěno v 10 ml zásobního roztoku. A z tohoto roztoku byla připravena koncentrační řada. Připravené koncentrace roztoků jsou uvedeny v tabulce číslo 5. Zároveň byl připraven kontrolní vzorek, který obsahoval pouze zásobní roztok bez Polyolu. Tab. 5: Příprava koncentrační řady pro Polyol Kontrolní vzorek vz. 1 vz. 2 vz. 3 vz. 4 vz. 5 Vypočtená konc. (mg/l) 0 0,204 0,612 1,224 2,040 4,080 Dávka látky do 10 ml 0 0,20 0,60 1,02 2,00 4, Cínoktanoát 1 g cínoktanoátu byl rozpuštěn v 10 ml zásobního roztoku. Připravené koncentrace roztoků jsou uvedeny v tabulce číslo 6. Zároveň byl připraven kontrolní vzorek. Tab. 6: Příprava koncentrační řady pro cínoktanoát Vypočtená konc. (mg/l) Dávka látky do 10 ml Kontrolní vz. vz. 1 vz. 2 vz. 3 vz. 4 vz. 5 vz ,0102 0,0204 0,0306 0,0510 0,1020 0, ,01 0,02 0,03 0,05 0,10 0,30 26

27 4.3.3 Bisfenol A Bisfenol A je ve vodě velmi málo rozpustný, proto byl připraven vodný výluh. K 50 g bisfenolu A byl přidán 1 litr destilované vody. Směs byla vyluhována 48 hodin a poté přefiltrována. Při prvním experimentu byla vytvořena koncentrační řada I (viz. tab 7.) Do 100 ml odměrné baňky byl napipetován 1 ml výluhu bisfenolu A a doplněn 99 ml zásobního roztoku na 100 ml. Takto byly připraveny i další koncentrace ředění. Zároveň byl také připraven kontrolní vzorek, který se skládá pouze ze zásobního roztoku. Při druhém stanovení byla namíchána koncentrační řada II (viz tab. 8). Do 50 ml odměrné baňky bylo napipetováno 5 ml látky bisfenolu A, a doplněno 45 ml zásobního roztoku na 50 ml. Tab. 7: Příprava koncentrační řady I pro bisfenol A Číslo misky Koncentrace (%) Dávka látky do 100 ml Tab. 8: Příprava koncentrační řady II pro bisfenol A Číslo misky Koncentrace (%) Dávka látky do 50 ml

28 4.4 Provedení jednotlivých testů Polyol Řádně vysušené a vyčištěné Petriho misky byly na horním víčku popsány. Každá koncentrace byla prováděna ve třech paralelních stanoveních. Do Petriho misky byl vložen filtrační papír, byla napipetována 10 ml dané koncentrace studované látky a pomocí pinzety bylo vloženo 30 ks semen Hořčice bílé. Semena se nechali klíčit po dobu 72 hodin v inkubátoru při teplotě 20 C. Po této době byla pomocí pravítka změřena délka kořínků semen hořčice a vypočítána inhibice. Byl sestaven graf závislosti koncentrace v mg.l -1 na inhibici růstu v %. Z rovnice regrese byla vypočtena IC Cínoktanoát Řádně vysušené a vyčištěné Petriho misky byly na horním víčku popsany. Každá koncentrace byla prováděna ve třech paralelních stanoveních. Do Petriho misky byl vložen filtrační papír, byla napipetována 10 ml dané koncentrace studované látky a pomocí pinzety bylo vloženo 30 ks semen Hořčice bílé. Semena se nechali klíčit po dobu 72 hodin v inkubátoru při teplotě 20 C. Po této době byla pomocí pravítka změřena délka kořínků semen hořčice a vypočítána inhibice. Byl sestaven graf závislosti koncentrace v mg.l -1 na inhibici růstu v %. Z rovnice regrese byla vypočtena IC Bisfenol A Bylo připraveno dostatečné množství Petriho misek. Řádně vysušené a vyčištěné byly na horním víčku popsány. Každá koncentrace byla prováděna ve třech paralelních stanoveních. Do spodní části misky byl vložen vystřihnutý filtrační papír, nalito 10 ml příslušné koncentraci a pinzetou bylo pokládáno 30 semen hořčice do každé misky. Do misky, která byla dána jako kontrolní vzorek, bylo nalito pouze 10 ml zásobního roztoku. Poté byly vloženy všechny misky do temné komory, kde byla teplota 20 C a semena byla ponechána 72 hodin klíčit (průběh klíčení viz. obr. 6 a 7). Po uplynutí doby byly misky vytáhnuty a byla změřena délka kořenů. U každé misky byl vypočítán průměr kořenů u všech 30ti semen hořčice. Dále byla spočítána délka kořenů u 28

29 3 paralelních stanovení u každé koncentrace včetně kontrolního vzorku. Tento výpočet byl proveden dle rovnice 1. Vyhodnocení testu spočívalo ve výpočtu inhibice růstu kořene pro určitou koncentraci, což bylo provedeno dle rovnice 2. Pomocí programu Software TOXICITA 3.0 byl sestaven graf, ve kterém se na osu x nanesla koncentrace v procentech a na osu y inhibice růstu kořene v procentech. Pomocí probitové analýzy bylo zjištěno 72hIC50. Obr. 6: Průběh testu na Sinapis alba Obr. 7: Průběh testu na Sinapis alba - po 0 hod a 24 hod po 48 hod a 72 hod 29

30 5 VÝSLEDKY A DISKUZE V této kapitole jsou uvedeny výsledky jednotlivých testovaných chemikálií. 5.1 Test klíčivosti Semena Hořčice bílé (Sinapis alba) mají okrově žlutou barvu, jejich klíčivost musí být minimálně 90 %, aby mohla být použita pro test. Semena hořčice bílé se vystaví po dobu 72 hodin ve standardně připravené ředící vodě. Klíčivost z pěti měření odpovídala hodnotě 90±5 %. 5.2 Stanovení IC 50 pro Polyol V tabulce číslo 9 je znázorněna průměrná délka kořene v dané koncentraci a dále z toho dle rovnice 2 vypočtena inhibice v procentech. Následovně byl vytvořen graf závislosti inhibice na koncentraci. Z rovnice regrese byla vypočtena IC 50 (viz obr. 8). Tab. 9: Vyhodnocení inhibice růstu kořene pro Polyol Log c ředění Průměrná délka kořene v dané koncentraci Lc, L (cm) Inhibice růstu kořene (%) v dané koncentraci -0,69 0, ,21 0, ,94 0,88 0, ,97 0,31 0, ,92 0,61 0, ,35 30

31 y = 51,09x + 43,12 80 Inhibice (%) ,8-0,6-0,4-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 log c [mg.l -1 ] Obr. 8: Graf závislosti inhibice růstu kořene na log c 50% inhibice růstu: y = 51,09x + 43,12 50 = 51,09x + 43,12 x = 0,13 c = 1,35 mg.l -1 U chemické látky Polyol byla zjištěna inhibiční koncentrace IC 50 1,35 mg.l

32 5.3 Stanovení IC 50 pro cínoktanoát V tabulce číslo 10 je znázorněna průměrná délka kořena v dané koncentraci a dále z toho dle rovnice 2 vypočtena inhibice v procentech. Následovně byl vytvořen graf závislosti inhibice na koncentraci. Z rovnice regrese byla vypočtena IC 50 (viz obr. 9). Tab. 10: Vyhodnocení inhibice růstu kořene pro cínoktanoát log c ředění Průměrná délka kořene v dané koncentraci L c, L (cm) Inhibice růstu kořene (%) v dané koncentraci -1,99 1,59 5-1,69 0,88 29,6-1,51 0,89 46,8-1,29 0,54 68,2-0,99 0,5 70,2-0,51 0,03 98,5 120 y = 61,264x + 134, Inhibice [%] Obr. 9: Graf závislosti inhibice růstu kořene na log c 0-2,5-2 -1,5-1 -0,5 0 log c [mg.l -1 ] Obr. 9: Graf závislosti inhibice růstu kořene na log c 32

33 50% inhibice růstu: y = 61,264x + 134,53 50 = 61,264x + 134,53 x = -1,37 c = 0,042 mg.l -1 U chemické látky cínoktanoát byla zjištěna inhibiční koncentrace IC 50 0,042 mg.l Stanovení IC 50 pro bisfenol A Stanovení IC 50 pro bisfenol A bylo provedeno dvakrát s dvěma různými koncentračními řadami První koncentrační řada V tabulce číslo 11 je znázorněna průměrná délka kořena v dané koncentraci a dále z toho dle rovnice 2 vypočtena inhibice v procentech. Následovně byl vytvořen pomocí programu Software TOXICITA 3.0 graf (viz obr. 10) závislosti inhibice na koncentraci se zobrazenou hodnotou IC 50 dle probitové analýzy. Tab. 11: Vyhodnocení inhibice růstu pro bisfenol A Koncentrace c(%) Délka kořene x(mm) Inhibice růstu (%) 0 42,6 1 41,3 3, ,4 2, ,2 5, ,1 26, ,2 64,32 33

34 Obr. 10: Graf závislost inhibice (%) na koncentraci (%) Druhá koncentrační řada V tabulce číslo 12 je znázorněna průměrná délka kořena v dané koncentraci a dále z toho dle rovnice 2 vypočtena inhibice v procentech. Následovně byl vytvořen pomocí programu Software TOXICITA 3.0 graf (viz obr. 11) závislosti inhibice na koncentraci a zároveň se zobrazila hodnota IC 50 dle probitové analýzy. Tab. 12: Vyhodnocení inhibice růstu pro bisfenol A Koncentrace c(%) Délka kořene x(mm) Inhibice růstu(%) 0 40, ,5 2, ,8 24, ,5 49,6 70 5,36 86,8 90 3,0 92,6 34

35 Obr. 11: Graf závislost inhibice (%) na koncentraci (%) U první koncentrační řady látky bisfenol A vykazoval inhibiční koncentraci IC 50 roztok 40,25 ml výluhu/100ml. U druhé koncentrační řady látky bisfenol A 50,18 ml výluhu/100ml. Což znamená, že při těchto koncentracích omezuje růst 50% nasazených semen hořčice bílé. Na vyhodnocení byl použit program Software TOXICITA

36 6 ZÁVĚR V předložené bakalářské práci byly shrnuty informace o vybraných toxikologických testech, které se používají ke stanovení toxicity chemických látek. Přestože uvedené testy spadají spíše do oboru ekotoxikologie, je možné použít je i pro testování látek vstupujících do potravních řetězců. Byl vybrán standardní test prováděný na organismu Hořčice bílé. Tento test patří mezi běžné testy a lze ho provádět v laboratorních podmínkách. Je oblíbený pro svoji jednoduchost, kvalitnost a přesnost. Byly testovány tři chemikálie. Všechny tři chemikálie směs alkoholů Polyol, cínoktanoát a bisfenol A se používají při výrobě polymerů, které jsou součástí některých potravinářských obalů, dóz a kojeneckých lahví. U prvních dvou studovaných látek cínoktanoátu a směsi alkoholů Polyol byly výsledky vypočteny pomocí rovnice regrese. U cínoktanoátu byla zjištěna inhibiční koncentrace 0,042 mg.l -1. U směsi alkoholů Polyol byla tato koncentrace 1,35 mg.l -1. U látky bisfenol A byla použita metoda probitové analýzy, která byla provedena dle programu Software TOXICITA 3.0. Bisfenol A je ve vodě omezeně rozpustný. Proto byl testován nikoli roztok, ale výluh. IC 50 odpovídala koncentraci 40,25 ml výluhu/100ml. U druhé koncentrační řady látky bisfenol A 50,18 ml výluhu/100ml. Výsledky ukazují na významnou toxicitu všech studovaných látek. 36

37 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ARNIKA. Budoucnost bez jedů bisfenol A nebezpečí skryté v obalech na potraviny [online] [cit ] Dostupné z < BOJANOVSKÁ, H. Probit analýza a její teoretické vlastnosti, nepubl., VUT Brno Databáze online [ ]. Dostupné z: Bezpečnostní list Bisfenolu A (Merck) Česká republika. Ministerstvo životního prostředí. Vyhláška č. 376/2001 Sb. o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů. In Sbírka zákonů, Česká republika, Česká republika. Ministerstvo životního prostředí. ZÁKON č. 294/2005 Sb., o podmínkách ukládání odpadů na skládky. In Sbírka zákonů, Česká republika, DVOŘÁK, V. Porovnání ekotoxikologických a mikrobiologických testů při hodnocení zátěží půdy, nepubl., Česká zemědělská univerzita, Praha, Databáze online [ ]. Dostupná z: FARGAŠOVÁ, A. Ekotoxikologické biotesty. 1. vyd. Bratislava: Perfekt, s. ISBN HÁJKOVÁ, T. Využití testů v ekotoxikologii, nepubl., VUT Brno, Datbáze online [ ]. Dostupné z: HORÁK, J.; LINHART, I.; KLUSOŇ, P. Úvod do toxikologie a ekologie pro chemiky. VŠCHT Praha, s, 37

38 HŘIBOVÁ, Š. Využití alternativních testů ekotoxicity pro posouzení kontaminovaných environmentálních matric, nepubl., VUT Brno, Databáze online [ ]. Dostupné z: KAFKA, Z., PUNČOCHÁŘOVÁ, J. Biotesty a jejich aplikace v analytice životního prostředí. Chemické listy, 1999, č. 93, s ISSN KOČÍ, V. a kol. Test semichronické toxicity se semeny Sinapis alba, VŠCHT Praha, 2001, učební text KOČÍ, V. Ekotoxikologie nauka o účincích toxických látek na životní prostředí. In Podzimní škola ASTRA [online]. Praha, 2003 Databáze online [ ]. Dostupné z WWW: < KOČÍ, V. Význam testů toxicity pro hodnocení vlivů látek na životní prostředí. Chemické listy, 2006, č. 100, s ISSN KOČÍ, V., MOCOVÁ, K. Ekotoxikologie pro chemiky. 1. vyd. Praha: VŠCHT, s. ISBN: KOMPRDA, T. Obecná hygiena potravin. 2. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, s. ISBN KRPOUN, K. Katalytické systémy pro polymerace cyklických esterů, nepubl., VUT Brno, Datbáze online [ ]. Dostupné z: MANAHAN, S. E. Toxicological Chemistry. 2. vyd. Boca Raton: Lewis Publishers, s. ISBN

39 MARCHAND, M. L analyse du risque chimique en milieu marin : l approche méthodologique européenne, Nantes Ceres, Databáze online [ ]. Dostupné z: MARŠÁLEK, B. Ekotoxikologické biotesty: rozdělení, přehled, použití. In Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Ústav chemie ochrany prostředí. Ekotoxikologické biotesty 1: sborník pracovní konference : Juniorcentrum, Seč u Chrudimi. Praha: Vodní zdroje Ekomonitor, s NEUMAYEROVÁ, Z. Polykaprolakto, jeho syntéza, charakterizace a degrabilita, nepubl., VUT Brno, Dababáze online [ ]. Dostupné z: PATOČKA, J. Nebezpečí plastových lahví, Databáze online [ ]. Dostupné z: PATOČKA, J. Základy toxikologie, 2005, databáze online [cit ], dostupná z PROKEŠ, J. Úvod do toxikologie. České vysoké učení technické, Praha, str. RUSEK, V. Základy toxikologie. Pardubice: Univerzita Pardubice, 2001 SMRČKOVÁ, M. Polymerace a kopolymerace E-kaprolaktonu pomocí organických a oraganokovových katalyzátorů, nepubl., VUT, Brno, Databáze online [ ]. Dostupné z: ŠKARKOVÁ P. Význam kontaktních testů ekotoxicky, nepubl., VUT Brno, Datbáze online [ ]. Dostupné z: 39

40 ZÁLEŠÁKOVÁ, L. Využití testů OECD pro stanovení ekotoxikologii odpadů, nepubl., VUT Brno, Datbáze online [ ]. Dostupné z: ŽAJGLOVÁ, H., KAŠPAROVÁ, J. Ekotoxikologické hodnocení chemických látek a přípravků, SPŠCH SOČ, Brno,

41 8 SEZNAM TABULEK Tab. 1: Vybrané fyzikálně chemické parametry cínktanoátu 22 Tab. 2: Vybrané fyzikálně chemické parametry bisfenolu A uvedené v bezpečnostním listu 23 Tab. 3: Příprava zásobního roztoku 25 Tab. 4: Ředící roztok 25 Tab. 5: Příprava koncentrační řady pro polyol 26 Tab. 6: Příprava koncentrační řady pro cínoktanoát 26 Tab. 7: Příprava koncentrační řady I pro bisfenol A 27 Tab. 8: Příprava koncentrační řady II pro bisfenol A 27 Tab. 9: Vyhodnocení inhibice růstu kořene 30 Tab. 10: Vyhodnocení inhibice růstu kořene 32 Tab. 11: Vyhodnocení inhibice růstu pro bisfenol A 33 Tab. 12: Vyhodnocení inhibice růstu pro bisfenol A 34 41

42 9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Vztah mezi dávkou a účinkem (křivka závislosti rozsahu účinku na dávce) 13 Obr. 2: a) Část stonku hořčice bílé, Sinapis alba s květem. b) Vyklíčené semeno s hypokotylem na konci třetího dne pokusu ve standardním živném médiu 18 Obr. 3: Vztah závislosti koncentrace na úhynu organismu v % 20 Obr. 4: Strukturní vzorec cínoktanoátu 23 Obr. 5: Vzorec bisfenolu A 24 Obr. 6: Průběh testu na Sinapis alba po 0 hod a 24 hod 29 Obr. 7: Průběh testu na Sinapis alba - po 48 hod a 72 hod 29 Obr. 8: Graf závislosti inhibice růstu kořene na log c 31 Obr. 9: Graf závislosti inhibice růstu kořene na log c 32 Obr. 10: Graf závislost inhibice (%) na koncentraci (%) 34 Obr. 11: Graf závislost inhibice (%) na koncentraci (%) 35 42