ČÁST A. OZNÁMENÍ O UZAVŘENÉM NAKLÁDÁNÍ PRVNÍ A DRUHÉ KATEGORIE RIZIKA Díl 1 Všeobecné náležitosti oznámení

Transkript

1 ČÁST A OZNÁMENÍ O UZAVŘENÉM NAKLÁDÁNÍ PRVNÍ A DRUHÉ KATEGORIE RIZIKA Díl 1 Všeobecné náležitosti oznámení Datum podání: Osoba, podávající oznámení (dále oznamovatel ) (+) Výpis z obchodního rejstříku (ne starší než 3 měsíce), případně úředně ověřená kopie živnostenského listu, zřizovací nebo zakládací listiny 1.1. Jméno, popřípadě jména, a příjmení (obchodní firma), je-li oznamovatelem fyzická osoba oprávněná k podnikání: nevztahuje se 1.2. Název (obchodní firma) a právní forma, jeli oznamovatelem právnická osoba: Vysoká škola chemicko technologická v Praze 1.3. Státní občanství (u fyzických osob): nevztahuje se 1.4. Sídlo (u právnických osob), nebo místo podnikání a adresa bydliště (u fyzických osob): Technická 3-5, Praha 6, IČO: DIČ: CZ Předmět činnosti (podle zakládací listiny nebo zápisu v Obchodním rejstříku): Výuka studentů a vědecký výzkum biologie, mikrobiologie, molekulární genetiky a biochemie. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze uskutečňuje bakalářské, magisterské a doktorské studium, rozvíjí mezinárodní spolupráci včetně výuky zahraničních studentů a realizuje své úkoly v součinnosti s ostatními vědeckými a odbornými institucemi. Vykonává rovněž správu práv ke svým patentům, licencím a zlepšovacím návrhům Jméno, popřípadě jména, a příjmení osob, které tvoří statutární orgán oznamovatele, s uvedením způsobu, jímž jménem oznamovatele jednají: Jméno, příjmení, titul: prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., rektor 2. Odborný poradce (+) Výpis z evidence Rejstříku trestů ne starší než 3 měsíce (+) Doklad o dosaženém vzdělání a délce odborné praxe Jméno, popřípadě jména, příjmení, titul: Kateřina Demnerová, Prof. Ing., CSc Povolání, případně zaměstnavatel a funkce: profesor mikrobiologie, Vysoká škola chemicko technologická v Praze, Fakulta potravinářské a biochemické technologie 2.2. Vzdělání: vysokoškolské (, Praha) 2.3. Odborné kurzy: lektorka řady odborných kurzů o GMO, člen České komise pro nakládání s GMO (od1/2001), účastník mezinárodních programů GMO, člen European Network of GMO laboratories, člen komise EATF Food Testing - GMO 2.4. Dosavadní praxe: 25 let vědecké práce včetně práce s GMM 2.5. Adresa bydliště: Nušlova 2277/19, Praha Kontaktní adresa: Ústav biochemie a mikrobiologie, Praha, Technická 3, Telefon: Fax: demnerok@vscht.cz 1

2 Díl 2 DALŠÍ NÁLEŽITOSTI OZNÁMENÍ V PŘÍPADĚ OZNÁMENÍ PRO PRVNÍ a DRUHOU KATEGORII RIZIKA 1. Účel a doba trvání uzavřeného nakládání: 1.1. Účel uzavřeného nakládání povaha práce, kterou bude oznamovatel provádět (např. výzkum, výuka, laboratorní kontrola, výroba); vědecká a výzkumná činnost (vývoj a využití metod transformace rostlin) v rámci vědeckých projektů řešených na ; vysokoškolská výuka. Vědecko-pedagogičtí pracovníci, společně s dalšími pracovníky Praha a studenty jsou účastníky řady výzkumných projektů národního programu výzkumu (MŠMT, GAČR a dalších), jakož i projektů mezinárodních (např. rámcové programy EU), jejichž některé části předpokládají práci s geneticky modifikovanými organizmy (GMO). GMO jsou využívány i v rámci výuky (demonstrační účely), v rámci řešení bakalářských, magisterských a doktorandských prací mnoha specializovaných programů výuky Celková doba trvání uzavřeného nakládání a datum jeho předpokládaného zahájení: trvale, květen 2011, nové GMO zaří Hodnocení rizika zařazení do kategorie rizika: (+) Souhrnné hodnocení rizika podle 7 zákona pro uvedený druh organismu (druhy organismů): příloha č.1 Výsledek hodnocení rizika: kategorie rizika I a II 3. Pracoviště, na kterém bude nakládání probíhat: (+) Provozní řád pracoviště podle přílohy 4 zákona: příloha 2 (+) Havarijní plán podle 20 zákona: příloha 3 Doklad o udělení akreditace a projekt pokusů podle zvláštního právního předpisu v případě chovných zařízení pro živočichy: Pracovišti nejsou uděleny žádné akreditace ve výše uvedeném smyslu, se živočichy se nepracuje Adresa pracoviště: Praha, Technická 3, Charakter pracoviště: mikrobiologické a biochemické laboratoře 3.3. Popis umístění prostor pro uzavřené nakládání a technický popis jejich nejdůležitějšího zařízení: (+) Plánek areálu a umístění nejdůležitějšího zařízení příloha 5 Kontaktní osoby pro dané pracoviště Kontaktní osoba pro laboratoř V04, V03, 232c Jméno, příjmení, titul: Ing. Jitka Viktorová, Ph.D. Kontakt: tel.: jitka.viktorová@vscht.cz Kontaktní osoba pro laboratoř V05 Jméno, příjmení, titul: Ing. Petra Lovecká, Ph.D. Kontakt: tel.: loveckap@vscht.cz 2

3 Kontaktní osoba pro laboratoř 209 Jméno, příjmení, titul: Ing. Ondřej Uhlík, Ph.D. Kontakt: tel.: Kontaktní osoba pro laboratoř 250, 250A Jméno, příjmení, titul: Ing. Jitka Viktorová, Ph.D. Kontakt: tel.: Kontaktní osoba pro laboratoře V06, 239, 237, BY04 a BY05a Jméno, příjmení, titul: Prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Kontakt: tel.: tomas.ruml@vscht.cz Kontaktní osoba pro laboratoře 234 Jméno, příjmení, titul: Ing. Petra Lipovová, Ph.D. Kontakt: tel.: petra.lipovova@vscht.cz kontaktní osoba pro laboratoře 207 Jméno, příjmení, titul: Doc. Dr. Ing. Zuzana Novotná Kontakt: tel.: zuzana.novotna@vscht.cz kontaktní osoba pro laboratoř 129 b Jméno a příjmení, titul: Doc. Ing. Pavel Kotrba, Ph.D. Kontakt tel.: pavel.kotrba@vscht.cz Kontaktní osoba pro místnosti 211, 233a Jméno, příjmení, titul: RNDr. Jarmila Zídková, CSc Kontakt: tel.: jarmila.zidkova@vscht.cz Kontaktní osoba pro chodbu BY Jméno, příjmení, titul: Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D. Kontakt: tel.: kamila.zdenkova@vscht.cz Kontaktní osoba pro Ústav biotechnologie Jméno, příjmení, titul: Ing. Leona Paulová, Ph.D. Kontakt: tel.: paulovae@vscht.cz Kontaktní osoba pro místnost I01: Jméno, příjmení, titul: Ing. Irena Kolouchová, Ph.D. Kontakt: tel.: irena.kolouchova@vscht.cz 3

4 Kontaktní osoba pro místnosti A115 a K04 Jméno, příjmení, titul: Ing. Ivana Křížová. Kontakt: tel.: krizovaa@vscht.cz Nakládání s GMO I i II. kategorie rizika bude probíhat na Ústavu biochemie a mikrobiologie Praha, budova B (vlevo od hlavního schodiště) (Technická 3, Praha 6), v laboratoři č. 129b, V04, V05, V06, 233a, 234, 237, 239, 207, 209, chodba BY a chladové místnosti, 211, kultivační místnosti V03, 232c, a místnosti 250 a 250A určené pro autoklávování médií a likvidaci GMO. Nakládání s GMO I. kategorie rizika probíhá na Ústavu biotechnologie Praha, budova A (Technická 5, Praha 6), a to v laboratořích 117, 117a, 115, I01a a K04. Hlavní uzávěry médií (el. proud, plyn, voda) jsou umístěny na chodbách s inženýrskými sítěmi přimykajícími se k boční zdi laboratoří. Uzávěry médií jsou příslušně vyznačeny. V laboratořích budou pracovat odborní a vědeckopedagogičtí pracovníci Praha a podle velikosti místností i proměnlivý počet studentů bakalářského, magisterského a postgraduálního studia (4-8). Komplex prostor pro práci s GMO na ústavu ÚBM je částečně ve zcela uzavřeném režimu, v chodbě, kam nemají nepovolaní vstup povolen (V03, V04, V05, V06), laboratoře a místnosti 207, 209 a chladová místnost, 211, 233a, 232c, 234, 237, 239, 250, 250A a chodba BY se nacházejí na ostatních přilehlých chodbách a jsou uzamykatelné, uzamykatelná laboratoř 129b je v prvním patře budovy B - viz plánek pracoviště. Dveře laboratoří 117, 115, I01a a K04 pro práci s GMO na Ústavu biotechnologie jsou ze strany chodby opatřeny koulí, klíče jsou vydávány pouze proškoleným osobám proti podpisu, počet klíčů je evidován. 3.4 Posouzení prostor a zařízení pracoviště a jeho umístění podle požadavků na uzavřený prostor a ochranná opatření stanovená pro první a druhou kategorii rizika přílohou č.4 k této vyhlášce: (+) srovnávací tabulky požadavků pro danou kategorii stanovených vyhláškou a skutečného vybavení pracoviště viz příloha 4 Jedná se o laboratoře, kultivační místnosti které všeobecně vyhovují požadavkům pro nakládání v I. a II. kategorii rizika. Vstup do komplexu prostor určeného pro práci s GMO nemají nepovolaní vstup dovolen (zámek, příp. kombinace zámek-koule). Chodba s kultivační místností V03 a laboratořemi V04 av05, V06 a chodba BY je elektronicky zabezpečena proti vstupu nepovolaných osob. Posouzení prostor a zařízení laboratoří: Laboratoře č. 129b, V04, V05, V06, 233a, 234, 237, 239, 207, 209, jedná se o jednoosé a dvouosé laboratoře, vybavené dvěma až čtyřmi chemickými stoly, digestoří a laminárním flow-boxem (třída Biohazard II) pro sterilní práci, která slouží pro experimentální práci odborných a vědeckopedagogických pracovníků, jsou klimatizované (prostory není třeba větrat okny, což dále přispívá ke zvýšení bezpečnosti nakládání) a vybavena pro práci s bakteriemi, a základní molekulárně biologické metody (např. zařízení pro PCR na detekci transgenů). V těchto laboratořích bude nakládáno s geneticky modifikovanými bakteriemi E. coli, Agrobacterium, Pseudomonas. Laboratoře jsou určeny pro přípravu kultivačních médií, nakládání s vektorovými bakteriemi Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas fluorescens (subkultivace, stanovení denzity, izolace plasmidové DNA, transformace bakterií) a GM rostlinami (subkultivace in vitro kultur, transformace rostlin, 4

5 vyhodnocování transformačních experimentů, izolace NK a molekulární detekce transgenů). Vstup do laboratoře je možný jedněmi uzamykatelnými dveřmi z chodby.v prostorách laboratoří bude s nimi nakládáno experimentálně, budou zde uchovávány v inkubátorech tomu určených a označených značkou GMO. K laboratořim V04, V05 a V06 přísluší také kultivační místnosti č. V03 a 232c. Místnost V03 je vybavena policemi, výrobníkem ledu, třepačkami a ultracentrifugou. Stejně jako jiné místnosti určené pro práci s GMO je tato kultivační místnost uzamykána a přístup je omezen pouze na oprávněné osoby. Podobně místnost 232c je určena po kultivaci rostlin. Laboratoře 129b, 207, 209, 211, 237, 239 jsou jednoosé a dvouosé laboratoře, vybavené dvěma až čtyřmi chemickými stoly, digestoří, v laboratoři 207 je umístěno genové dělo pro transformaci rostlin, v laboratoři 129b je v místnosti bez oken, odděleném příčkou (prostor 129d) umístněn termostatovaný inkubátor a orbitální inkubátor. Chladová místnost bude využívána k přechovávání speciálních chemikálií a vzorků, realizaci některých biochemických postupů vyžadujících sníženou teplotu (např. izolace proteinů, DNA) a částečně k uchovávání kultur vektorových bakterií E. coli, Agrobacterium, Salmonella a Pseudomonas. Tato místnost bude trvale uzamčena a přístup do ní bude umožněn jen autorizovaným osobám. Kultivační místnosti jsou minimálně v měsíčních intervalech dezinfikovány (mytí podlahových ploch Savo, ošetření kultivačních polic). Dveře kultivačních místností jsou osazeny z vnější strany koulí a jsou trvale uzamčeny. Laboratoř 211 je jednoosá se 4. pracovními stoly vybavená centrifugou a dalším potřebným vybavením. Laboratoř 233a je místnost určená zejména ke kultivaci tkáňových kultur a buněčných linií a obsahuje veškeré potřebné vybavení. V chodbě BY se nachází Zkušební laboratoř Ústavu biochemie a mikrobiologie (ZL ÚBM, místnosti BY05b, BY06, BY07, BY09 a BY12), která je akreditovaná ČIA (Číslo subjektu:1316.3) a laboratoř forenzní analýzy (místnost BY04, BY05a). Prostory laboratoří byly nově vybudovány a splňují všechny náležitosti pro práci s GMO, tzn. obsahují jednoosé a dvouosé laboratoře, vybavené chemickými stoly, digestoří a laminárními flow-boxy (třída Biohazard II) pro sterilní práci. Vstupní dveře do chodby BY i dveře místností BY04, BY05, BY06, BY07, BY09 a BY12 jsou osazeny z vnější strany koulí a jsou trvale uzamčeny. Laboratoře jsou klimatizované (prostory není třeba větrat okny, což dále přispívá ke zvýšení bezpečnosti nakládání) a vybaveny pro práci s mikroorganismy i potravinami, a základní molekulárně biologické metody (např. zařízení pro PCR na detekci a qpcr pro kvantifikaci transgenů). Srovnávací tabulky požadavků dle vyhlášky č. 209/2004 Sb. a přijatých opatření jsou součástí Oznámení. Laboraře Ústavu biotechnologie (319) v místnosti 117 jsou umístěné v 1. poschodí budovy A (Technická 5, Praha 6) a jsou využívány jako kultivační místnosti. Betonová podlaha je kryta omyvatelnou dlažbou, stěny a strop jsou natřeny omyvatelnou barvou. Místnost je u stropu vybavena centrálně ovládanými germicidními UV-lampami, povrchy stolů a přístrojů jsou omyvatelné. Místnost je vybavena laboratorními bioreaktory o pracovním objemu do 7 l, lednicí, pultovým mrazicím boxem, laminárním očkovacím boxem, plynovými kahany, UV-VIS spektrofotometrem, temperovanou třepačkou, termostatem, odstředivkami, přístroji na PCR analýzy a dalšími laboratorními přístroji a pomůckami. Laboratoř A115 je vybavena lednicemi, mrazáky, odstředivkami, ultraodstředivkou, plynovým kahanem, spektrofotometrem, termocyklerem a dalšími běžnými laboratorními přístroji. Povrchy pracovních stolů a podlahy jsou z omyvatelných materiálů. Laboratoř K04 je vybavena lednicí, mrazákem, odstředivkami, spektrofotometrem, termocyklerem a prutokovým citometrem. Laboratoř I01 bude využívána jako kultivační místnost. Betonová podlaha je kryta protiskluzovou dlažbou, stěny a strop jsou natřeny omyvatelnou barvou. Povrchy stolů a přístrojů jsou omyvatelné. Místnost je vybavena laboratorním bioreaktorem o pracovním objemu do 2 l, lednicí, mrazicím boxem, laminárním očkovacím boxem, 5

6 plynovými kahany, UV-VIS spektrofotometrem, temperovanou třepačkou, termostatem, odstředivkami a dalšími laboratorními přístroji a pomůckami. Prostory a umístění pracoviště Ústavu biotechnologie splňují požadavky na práci s GMO v první kategorii rizika pracovní plochy, podlahy a stěny jsou omyvatelné, místnosti jsou vybaveny germicidní lampou pro přímé ozařování, ústav je vybaven tlakovým parním sterilizátorem, přístup do místností, kde probíhá nakládání s GMO je omezen jen na proškolené osoby, které používají osobní ochranné prostředky (pracovní oděv, rukavice,...), okna jsou otevírána jen při sanitaci, povrchy jsou pravidelně dezinfikovány tekutým dezinfekčním prostředkem, odpady jsou shromažďovány odděleně a likvidovány tlakovou parní sterilací, laboratoře mají své vlastní vybavení dostačující pro nakládání s GMO, mimo pracovní prostor je k dispozici odpočinková místnost a na pracovišti je k dispozici sprcha. 4. Geneticky modifikovaný organismus 4.1 Údaje o dárcovských organismech, včetně jejich původu: Donorové organismy, z nichž jsou jednotlivé geny v insertech odvozeny, jsou uvedeny v následujícím přehledu: Bakterie: Pandoraea pnomenusa (dříve Comamonas testosteroni) (bphc gen pro 2,3- dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasu enzym štěpící dihydroxybifenyly a dihydroxychlorbifenyly, isolován v INRS, Quebec, Kanada v laboratoři prof. M. Sylvestra, geny bphaefgb zodpovídající za tvorbu dihydrodiolů z bifenylů nebo chlorbifenylů, isolovány a klonovány v INRS, Quebec, v laboratoři prof. M. Sylvestra (Masse,R et al., 1984). Gen pro bphd hydrolasu štěpící produkt genu bphc. Burkholderia xenovorans LB geny bifenylového operonu získané z laboratoře prof. D. Dowlinga (Dowling et al., 1993, Mondello, 1989, Chain et al., 2006). Paenibacillus thiaminolyticus bakterie pocházející z České sbírky mikroorganismů v Brně (CCM 3599). Na našem pracovišti je v tomto kmenu vyhledáván gen pro alfa-l-fukosidasu a beta-d-galaktosidasu. Arthrobacter spp.- psychrotrofní bakterie, obsahující chladově aktivní glykosidasy (beta-galaktosidasu, beta-glukosidasu, alfa-amylasu, alfa-galaktosidasu) (White et al, 2000). Bakterie E. coli K12 gen lamb přenašeč maltosy (protein vnější membrány buněčné stěny). Používán je gen lamb-153 s BamHI místem vytvořeným v pozici kodónu 153 (Boulain a kol., 1986). Získán v plasmidu plbb9 (Cebolla a kol., 1996) z laboratoře V. de Lorenza (CSIC, Madrid, Španělsko). Achromobacter xylosoxidans A8 nepatogenní půdní bakterie, isolovaná z oblasti kontaminované PCB, Žamberk, Česká Republika (Pavlů, 1999). Z této bakterie byly použity pouze některé geny proteiny biodegradačních či transportních drah či jejich řídící sekvence. Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes - rostlinné pathogeny používané pro transformaci rostlin a rostlinných pletiv. 6

7 Salmonella typhimurium His - Dlouhodobé uchovávání při 80 o C. Obsahuje mutaci v histidinovém operonu. Kmen (zdroj Státní zdravotní ústav). E. coli transposon Tn21 mer promotor a gen merr transkripční aktivátor/represor kontrolující promotor mer genů zajišťujících resistenci k Hg 2+. Získán z laboratoře Dr. M. Virty (Dept. Biotechnology, Univ. Turku, Turku, Finsko). Pseudomonas putida F1 nepathogenní půdní bakterie utilizující toluen (Zylstra a Gibson, 1989). Pseudomonas putida KT2442 půdní bakterie; hsdr; rifampicinová rezistence (Herrero a kol., 1990). Clostridium thermocellum bakterie obsahující gen pro arabinofuranosidasu. Plasmid s tímto genem byl získán z ENSC Rennes, Francie. Clostridium pasteurianum kmen NRRL B-598, používan pro produkci organických kyselin a rozpouštědel, je přírodním izolátem získaným z veřejné sbírky mikroorganismů. Pro genetickou modifikaci byly použity geny expresi proteinů ALB , ALB , ALB , gen expresi regulačního proteinu sporulace Spo0A a gen protein sporového pláště CotJC. Geny byly izolovány z Clostridium pasteurianum NRRL B-598 pomocí PCR reakce. Acetobacter aceti ssp. xylinum IFO 3288 získaná ze sbírky Institute for Fermentation (IFO), Osaka, Japonsko (Yamano a kol. 1994). Zdroj oblasti α-acetolaktát dekarboxylasy (gen aldc, přístupové č. v GenBank S69150). Bakterie v kontaminovaném materiálu (blíže nespecifikované kmeny, jedná se o přímou izolaci metagenomu). Alcanivorax borkumensis mořská bakterie běžně se vyskytující v životním prostředí bohatém na uhlovodíky (Yakimov et al, 1998). Bakterie byla získána darem v rámci vědecké spolupráce od Dr. Sabirove. Bakterie je používána jako modelový organismus pro studium proteinů asociovaných s lipidovými tělísky. Jedná se konkrétně o geny těchto proteinů: ABO_0192, ABO_2595, ABO_1000, ABO_1581, ABO_1597, ABO_0193, ABO_0746, ABO_2153, ABO_1760, ABO_2693, ABO_2389, ABO_1510, ABO_0361, ABO_1923. Mycobacterium smegmatis kmen mc(2)155, bakterie pocházející ze sbírek ATCC (ATCC číslo ). Na našem pracovišti je v tomto kmenu vyhledáván gen pro Pup, součást proteazomálního degradačního systému. M. smegmatis patří mezi rychle rostoucí druhy mykobakterií, je nepatogenní a používá se jako obvyklý modelový organismus pro mykobakterie, (Methods in Molecular Biology vol. 101 Mycobacteria protocols, 1998, editors T. Parish and N. G. Stoker, Humana Press Inc, Totowa, NJ, ISBN ). Používaný kmen je citlivý ke kanamycinu, má kompletně osekvenovaný genom (GenBank: CP ), je snadno transformovatelný pomocí elektroporace, a proto je vhodný jako hostitelský organismus pro studium exprese a funkce jednotlivých genů. Rhodococcus erythropolis grampozitivní aerobní nepohyblivá půdní bakterie. Bakterie pochází ze sbírky Mikrobiologického ústavu Akademie věd. Rhizobium radiobacter - Druh půdních, gramnegativních, nesporulujících, pohyblivých tyčinkovitých bakterií, které jsou patogeny dvouděložných rostlin a způsobují tvorbu nádorů. Bakterie je využívána se v biotechnologickém výzkumu. Bakterie Rhizobium 7

8 radiobacter NTL4(pZLR4) ATCC BAA-2240 (Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)) pochází ze sbírky ATCC. Bakterie Lactobacillus plantarum. Používaný vektor bude obsahovat gen katalasu a určité fragmenty tohoto genu. Bakterie Pyrococcus furiosus. Používané vektory budou obsahovat gen DNA polymerasu. Kvasinky: Saccharomyces cerevisiae (i) CUP, HisCUP gen gen pro metalothionein, resp. gen pro metalothionein s polyhistidinovou kotvou a syntetické sekvence s vysokou schopností vázat těžké kovy, dostupné komerčně, nebo gen získaný z Biotechnology Center, Logan, USA HisCUP. Saccharomyces cerevisiae AH 109 (Clontech) - kmen používaný pro dvojhybridový expresní systém, jedná se o auxotrofní kmen pro adenin, leucin, tryptofan a histidin. W303 - laboratorní kmen (zdroj: Dr. H. Sychrová Fyziologický útav AV ČR). Gen sag1 -aglutinin. Velké houby: ektomykorhizní houba Amanita strobiliformis (muchomůrka šiškovitá) (Basidiomycota /Agaricomycotina/ Agaricomycetes/ Agaricomycetidae / Agaricales / Amanitaceae). Zdroj transkriptomu, cíleno na geny pro metalothioneiny a membránové transportery kovů, izolvány metalothioneinů AsMT1a, AsMT1b, AsMT1c a AsMT2. Přirozená ektomykorhizní houba rostoucí v mykorhize s listnatými stromy (Tilia, Carpinus, Corylus, Fagus, Betula sp.) (Weiss a kol., 1997; Borovička 2006). Plodnice ze sběru v Královské zahradě Pražského Hradu. ektomykorhizní houba Russula atropurpurea (Basidiomycota / Agaricomycotina / Agaricomycetes / Agaricomycetes incertae sedis / Russulales / Russulaceae). Zdroj transkriptomu, cíleno na geny pro metalothioneiny a membránové transportery kovů. Rozšířená ektomykorhizní houba rostoucí v symbióze především s dubem (Quercus) (Sarnari 1998). Plodnice získáné sběrem na kopci Vrábov u Českého Šternberka. ektomykorhizní houba Hebeloma mesophaeum (holubinka černonachová) (slzivka opásaná) (Basidiomycota /Agaricomycotina/ Agaricomycetes / Agaricomycetidae / Agaricales / Cortinariaceae). Zdroj transkriptomu, cíleno na geny pro metalothioneiny a membránové transportery kovů. rozšířená ektomykorhizní houba rostoucí v mykorhize s listnatými i jehličnatými stromy (např. Picea, Betula) (Vesterholt 2005). Plodnice získána sběrem v areálu ÚJV Řež, a.s. Živočichové: medúza Aequorea victoria obsahující gen pro GFP (green fluorescent protein) (Chalfie a Kain, 1998), na pracovišti jsou používány také mutanty genu pro GFP, a to YFP (yellow fluorescent protein), gen pro BFP (blue fluorescent protein), gen pro CFP (cyan 8

9 fluorescent protein) získány od Emory University Atlanta (laboratoř Dr. Hunter) a gen RFP (red fluorescent protein) (Chalfie a Kain, 1998). Hmyz Photinus pyralis obsahující gen pro luciferasu (Luc) Hmyz Trichoplusia ni obsahující gen pro acyl-coaδ11-desaturasu (Pdesat-Tn Delta(11)Z), získáno v plasmidu od prof. Knipple, Cornell Univ., ITHACA, NY, USA (Knipple et al., 1998), patogenita: ne; přirozený výskyt: USA; přirozený habitat: neuvádí se. Homo sapiens buněčná linie HeLa ATCC:CCL-2. Homo sapiens genu HMT1A metalothionein 1A. Zakoupena jako plasmid HAWAU68 (plasmid puc19 obsahující číslo sekvence v GenBank T27991) od American Type Culture Collection (katalogové číslo ATCC ). Hostitelský organismus: E. coli TG1. Homo sapiens jako zdroj genů pro vkládání do rostlinného materiálu, konkrétně MBD (microtubules binding domain) z MAP4 (microtubule associated protein 4) (Marc J. et al.,1998). Homo sapiens - lidská sarko-/endoplasmatická retikulární Ca 2+ ATPasa (SERCA) je ATPasa P-typu přítomná v lidském sarkoplasmatickém a endoplasmatickém retikulu. Přenosem Ca 2+ iontů z cytosolu do ER/SR udržuje koncentrační rozdíl a tím homeostasu Ca 2+ v buňkách. Lidské SERCA jsou kódovány třemi různými geny (SERCA1, gen ATP2A1, ID 487; SERCA2, gen ATP2A2, ID 488; SERCA3, gen ATP2A3, ID 489). Tyto tři geny dávají vzniknout řadě isoforem proteinů SERCA, které jsou exprimovány tkáňově specificky, s výjimkou isoformy SERCA2b, která je konstitutivně exprimována ve všech tkáních. Vektory s geny pro isoformy SERCA2a,b a SERCA3 byly získány od Dr. J. Lyttona (Universita Calgary, Kanada), gen pro fúzní SERCA2b-N-GFP od Els Larivière (Katolická Univerzita Leuven, Belgie). Homo sapiens - lidské mrna nebo jejich fragmenty AKIP1, NFkB, VEGF, p53. Mus musculus buněčná linie 3T3-L1 ze sbírky European Collection of Cell Cultures (katalogové číslo ECACC ). Zdroj transkriptomu, cíleno na geny pro vybrané adipokiny a proteiny regulující metabolismus lipidů a sacharidů. Rattus norvegicus buněčná linie Fao ze sbírky European Collection of Cell Cultures (katalogové číslo ECACC ). Zdroj transkriptomu, cíleno na geny pro vybrané adipokiny a proteiny regulující metabolismus lipidů a sacharidů. Rattus norvegicus - kmen Brown Norway - zdroj genu EndoG, mitochondriální enzym endonukleasu G. Zdroj: FGÚ AV ČR (dodána pouze játra). Prvok Trypanosoma brucei gen pro nukleasu TRYP v plasmidu popine (s ampicilinovou rezistencí) získaný z laboratoře dr. Jana Dohnálka, Biotechnologický ústav AVČR. Pichia pastoris ppiczαa-ptryp#3: Pro genetickou modifikaci nebyl přímý dárcovský organismus. Transformace příjemce probíhá syntetickým genem pro vepřový trypsinogen získaným od firmy Geneart AG (Regensburg, Germany). Seznam veškerých konstruktů využívaných či v nejbližším době plánovaných k použití na pracovišti ke genetickým modifikacím bakterií, kvasinek a rostlin je uveden níže. Další 9

10 údaje o příjemcích, vektorových konstruktech, metodách detekce GM organismů a množstvích GMO s nimiž bude nakládáno jsou uváděny odděleně pro mikroorganismy a rostliny. Předpokládá se, že v průběhu řešení projektů budou postupně rozšiřovány okruhy vektorových konstruktů používaných na pracovišti a jejich seznamy budou dále aktualizovány. Rostliny: Sasanka Discosoma sp. - gen pro RFP (red fluorescent protein) a mcherry (Shaner, N. C. et al. (2004) získáno od ÚMG, AVČR Praha. Rostlina Nicotiana tabacum cv. Samsun - modelový organismus pro studium vyšších, NtPLDp1). Rostlina Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38 přirozeně obsahující gen pro osmotin (osm) získané od Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR (ÚOCHB) a také gen NTF3 H pro flavonoid-3 -hydroxylasu. Rostlina Brassica oleracea obsahující 1). Lycopersicon esculentum (Rajče jedlé) v tomto organismu byly nalezeny geny pro endonukleasu TBN1 (AM238701) a pro bazickou peroxidasu (tpx1, GI:675546). Gen TBN1 byl získán v laboratoři RNDr. Jaroslava Matouška, CSc., České Budějovice. Gen tpx1 byl již v minulosti použit pro transformaci rostlin tabáku za účelem zvýšení účinnosti biodegradace fenolických látek (Sosa Alderete et al., 2009). Na našem pracovišti bude tento gen použit pro kotransformaci rostlin tabáku v kombinaci s dalšími genetickými determinantami (RaCd3 a pbta) pomocí agrobakteriální infiltrace. Humulus lupulus (Chmel otáčivý) - v tomto organismu byl nalezen gen pro endonukleasu HBN1. Tento gen byl získán v laboratoři RNDr. Jaroslava Matouška, CSc., České Budějovice. Rostlina Arabidopsis thaliana modelový organismus pro studium vyšších rostlin, obsahující gen pro caleosin AtCL01(At4g2640) a přirozeně také gen ATF3 H pro flavonoid-3 -hydroxylasu. Arabidopsis thaliana cv. Columbia modelový organismus pro studium vyšších rostlin, obsahující gen pro fosfolipasu D (AtPLDp1). Arabidopsis thalinana var. Columbia používané pro získávání genetického materiálu (genů TUA6, Ueda et al., 1999, Ambrose et al., 2007, Sampathkumar et al., 2011, Voigt et al., 2005, Andreeva et al. 2009, Flückiger et al., 2003). Arabidopsis thalinana upravený gen LOV - gen ilov. Fotoreverzibilní fluoreskující protein přibližně 10 kda velký, alternativa k GFP (přibližně 25 kda), je odvozen z rostlinného flavinového chromoproteinu fototropinu. Zea mays (kukuřice) využit jako donorový organismus pro promotor genu β- glukosidasy (β-glu), dodán ve vektoru pma-ap (Dr. Galuszka, PřF UP Olomouc); dále se v tomto organismu nachází gen pro osmotin stejně jako v tabáku, ovšem s jiným nukleotidovým složením. Vzorek biomasy pro odběr DNA bude odebrán z pole. 10

11 Phaseolus lunatus semena fazole bílé byla zakoupena v Top potravinách a použita pro izolaci rostlinné DNA, zdroj genu PlDef1 pro antimikrobiální peptid. Hordeum vulgaris L. VSD (vacuolar sorting determinant) z aleurainu (Aleu-GFP) pro vkládání do rostlinného materiálu (Flückiger et al., 2003). Nicotiana tabacum VSD (vacuolar sorting determinant) z z chitinasy A (Chi- GFP) pro vkládání do rostlinného materiálu (Flückiger et al., 2003). Rostlina Umbellularia californica (okoličnatka kalifornská) je stálezelený keř přirozeně se vyskytující v Severní Americe. Přirozeně obsahuje gen thioesterasu (accession number v NCBI GenBank M ). Rostlina Cuphea viscosissima (hlazenec viscosissima) rostlina, která se přirozeně vyskytuje ve Střední a Jižní Americe. Přirozeně obsahuje gen thioesterasu (accession number v NCBI GenBank JF ). Rostlina Nepenthes distillatoria (láčkovka) roste v tropických deštných lesích a na jejich okrajích, v kulturní krajině provází křoviny na mezích mezi zemědělskými kulturami a podél vodotečí. Karnivorní (masožravá) rostlina, v baňkovitých láčkách, které se tvoří na koncích listů, tráví drobné členovce. Obsahuje proteasu nepentesin 1. Plasmid s tímto genem (pet16b nep1) byl poskytnut Dr. Petrem Manem, Mikrobiologický ústav, AVČR. Tkáňové kultury: Suspenzní a kalusové kultury odvozené z těchto transgenních rostlin na našem pracovišti. Suspenzní kultury divokého typu Arabidopsis thaliana var Columbia (Axelos et al., 1992 ) transformované běžnými strukturními rostlinnými geny ve fúzi s reportérovými geny (GFP, RFP, mcherry apod.). Živočišné viry: Ve všech případech retrovirů se jedná pouze o části genomu strukturní proteiny a enzymy. Nejsou používány geny regulační sekvence ani obalové proteiny. Mason-Pfizer monkey Virus (isolované, replikačně defektní části genomu strukturní proteiny obalu, připraven na odd. mikrobiologie Univ. of Alabama, USA v laboratoři Prof. E. Huntera). Human Immunodeficiency Virus (isolované, replikačně defektní části genomu které nejsou patogenní ani jiným způsobem škodlivé strukturní proteiny obalu, připraven na odd. mikrobiologie Univ. of Alabama, USA v laboratoři Prof. E. Huntera). EBOLA virus (isolované, replikačně defektní části genomu strukturní protein obalu (GenBank: U ), plasmid obsahující dsdna byl získán z komerční firmy Sino Biological, poté předán na ÚBM od Prof. Kizka z Mendelovy univerzity). Feline Immunodeficiency Virus (isolované, replikačně defektní části genomu strukturní proteiny kapsidy, připraven v Centro de Virologia Animal, Argentina v laboratoři prof. Gonzalez Vaccinia virus ATCC VR 1354 obsahující gen pro RNA polymerasu bakteriofága T7 11

12 Rousův sarkoma virus (RSV) (isolované, replikačně defektní části genomu strukturní proteiny obalu, připraven na odd. virové a buněčné genetiky Ústavu molekulární genetiky AVČR, v laboratoři RNDr. Jiřího Hejnara, CSc. Gen gag (NC_001407) kóduje strukturní polyproteinový prekurzor Gag. Gen gag kóduje následující strukturní proteiny: MA, p10, CA a NC. Virus horečky Dengue. Původ: RNA virus Čeled: Flaviviridae, rod: Flavivirus Genom viru Denge je tvořen jednořetězcovou RNA molekulou, tři strukturní a sedm nestrukturních proteinů. Používané vektory budou obsahovat pouze geny strukturní proteiny a jejich fragmenty, zejména kapsidový protein C. Fragmenty o této velikosti nemohou v žádném případě vytvářet jakékoli infekční částice, nejsou tedy infekční, patogenní ani toxické. Virus XMRV (xenotropic murine leukemia virus-related retrovirus). Původ: Virus XMRV je nově objevený lidský gamaretrovirus a je spojován s některými onemocněními jako rakovina prostaty a únavový syndrom (Lombardie et al. Science 2009, 326, 585, Urisman et al. PLoS. Pathog. 2006, 2, 25). Jeho role jako původce těchto onemocnění však stále nebyla prokázána. Používané vektory budou obsahovat fragmenty genomu viru XMRV tj. strukturní proteiny Gag a enzymatické a další proteiny Pol o velikosti maximálně 1000 párů bází. Fragmenty o této velikosti nemohou v žádném případě vytvářet jakékoli infekční částice, nejsou tedy infekční ani patogenní. V případech retrovirů se jedná pouze o části genomu strukturní proteiny a enzymy. Nejsou používány geny regulační sekvence ani obalové proteiny. Rostlinné viry: Tombusvirus - od rostlinných virů, které infikuje krytosemenných rostlin. Tento virus obsahuje gen pro supresor RNA silencingu p19. Plasmid s tímto genem (plch44022) byl zakoupen od firmy Addgene Údaje o příjemci a rodičovském organismu, včetně jejich původu: Vzhledem k tomu, že pracovní týmy se podílí na řešení projektů NPVII (MŠMT), GAČR, Výzkumných Centrech (MŠMT), GAAVČR atd. je řada konstruktů shodných či obdobných s těmi, jež jsou využívány na dalších pracovištích: ÚMBR; JĆU, AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby, Šumperk (AGRITEC); Ústav organické chemie a biochemie AV ČR (ÚOCHB), Praha; Ústav experimentální botaniky AV ČR, Praha (ÚEB); Ústav molekulární genetiky AV ČR, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně (MZLU). Geneticky modifikované bakterie bakteriální kmeny Escherichia coli DH5: genotyp: supe44 lacu 169(80lacZ M15) hsd R17 reca1 enda1 gyra96 thi-1 rela1, citace: Hanahan: J Mol Biol 166: 557 (1983), 12

13 HB101: genotyp F - -proa)62 leub6 glnv44 ara- -mrr) rpsl20 (Str r ) xyl-5 mtl-1 reca13, JM109: genotyp: F trad36 proa + B + laci q (lacz)m15 / e14 - (McrA - ) (lac-proab) enda1, BL21(DE3): genotyp: hsds gal (c I ts857 ind1 Sam7 nin5 lacuv5-t7 gene1), Top10: Life Technologies, genotyp F- mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) f80laczdm15 DlacX74 deor reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl (StrR) enda1 nupg, XL1-Blue: genotyp: supe44 hsd R17 reca1 enda1 gyra46 thi rela1 lac - F [proab + laci q lacztn10(tet r )], Stratagene, XL-1MRF Blue: genotyp: (mcra)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 enda1 supe44 thi- 1 reca1 gyra96 rela1 lac [F proab laciqzdm15 Tn10 (Tet r )], pop6510 (lamb supe thr leu tonb thi lacy1 reca dex5 meta) (Boulain a kol., 1986), TG1 -proab) F [trad36 proab + laci q a kol., 1989), CC118 - phoa thi-1 rpse rpob argb BL21-Gold(DE3) LacZ- genotyp: E.coli BF- ompt hsds(rb-mb-)dcm+tetr, BL21(AI) - F ompt gal dcm lon hsdsb(rb- mb-) arab::t7rnap-teta, JM109(DE3): genotyp: (Nal R ), hsdr17, mcra, rela1, supe, sbcbc, thi- - (DE3), S17-I - 294recA (Simon, 1984), M15 prep4 Qiagen: Nal s, Str s, Rif s, Thi -, Lac -, Ara +, Gal +, Mtl, F -, RecA +, Uvr +, Lon +, SG13009 prep4 Qiagen: K 12 derivát, Nal 8, Str 8, Rif -, Th, Lac, Ara, Gal, Mtl, F, RecA, Uvr, Lon, Qiagen EZ, kompetentní buňky, Genotyp: F, Tn10(Tc ), lacl q enda1, hsdr17, lac, glnv44, thi-1, gyra96, rela1. Zdroj: Qiagen Cloning Kit Plus (No: ), podrobný popis: Qiagen PCR Cloning Handbook, Tyto buňky budou používány pro manipulaci s vektory (klonovacími, expresními a binárními) s konstrukty běžných rostlinných genů ve fúzi s reportérovými geny (GFP, RFP, mcherry) a markerovými geny (npti, AmpR), K12 PQ37 - Sfi::mud/a plac/cts, lac U169, mat+, uvra, gale, PhoC, rfa,f-, thr, leu, his, pyrd, thi, trp::muc+, sr13000::tn 10, rpob), zdroj: Doc. Malachová, Přírodovědná fakulta, Ostravská univerzita, ČR. Funkce: indukce SOS odpovědi v důsledku poškození genetické informace geneticky modifikovaného kmene Escherichia coli K-12. SOS odpověď je kontrolována dvěma regulačními proteiny rex a a lex A. Jejich hlavní funkcí je kaskádovitá regulace SOS genů, které jsou odpovědné za syntézu DNA-opravných enzymů a inhibitorů buněčného cyklu. Výše uvedený geneticky modifikovaný kmen nese operon sfi A::lac Z, vzniklý následnou fúzí a delecí v normální lac oblasti, takže aktivita indikačního enzymu β-galaktosidázy je přímo závislá na transkripci sfi A genu. Pro zvýšení citlivosti celého systému byla metodami genetického inženýrství vytvořena excizní deficience a lipopolysacharidová deficience, která umožňuje lepší difuzi látek do buňky. Kmen je rezistentní k ampicilinu využíváno pro detekci kmene pomocí PCR. (Quillardet a Hofnung, 1993; Quillardet et al.,1982), dam - /dcm - kompetentní buňky E. coli: genotyp: ara-14 leub6 fhua31 lacy1 tsx78 glnv44 galk2 galt22 mcra dcm-6 hisg4 rfbd1 R(zgb210::Tn10) Tet S enda1 rspl136 (Str R ) dam13::tn9 (Cam R ) xyla-5 mtl-1 thi-1 mcrb1 hsdr2, zdroj a 13

14 reference: New England Biolabs. Funkce: Kompetentní buňky E. coli K12 postrádající methyltransferasu, jsou vhodné pro transformace bez Dam a Dcm metylace. Kmen je rezistentní k chloramfenikolu (cam), streptomycinu (str) a nitrofurantoinu (nit). BAA-525: genotyp: F- dam-13::tn9 dcm-6 hsdm hsdr zjj-202::tn10 recf143 galk2 galt22 ara-14 lacy1 xyl-5 leub6 thi-1 tona31 rpsl136 hisg4 tsx-78 mtl-1 glnv44. zdroj a reference: ATCC BAA-525TM. Funkce: Tento kmen je používán pro izolaci nemetylované DNA pro transformaci do Streptomyces nebo jakéhokoliv jiného organismu, který má restrikční systém senzitivní na metylace. HST08: genotyp: F, enda1, supe44, thi-1, reca1, rela1, gyra96, phoa, Φ80d laczδ M15, Δ(lacZYA-argF) U169, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), ΔmcrA, λ, zdroj a reference: Clontech. SOLR: genotyp: e14 - (McrA - ) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171 sbcc recb recj uvrc umuc::tn5 (Kan r ) lac gyra96 rela1 thi- R [F proab laci q ZΔM15] Su -, zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktů č a č (revidované vydání C.01) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, XL1-Blue MRA - Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 gyra96 rela1 lac, zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktu č (revidované vydání A) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, XL1-Blue MRA (P2): genotyp: XL1-Blue MRA (P2 lysogen), zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktu č (revidované vydání A) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, GG48: genotyp: ΔzitB::cat znta::npt mutant divokého kmene W3110, zdroj: prof. Christopher Rensing, Univ. of Arizona, Arizona, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými transportéry ZitB a ZntA pro export iontů těžkých kovů; fenotyp: hypersensitivní k Cd 2+, Pb 2+ a Zn 2+, reference: Grass a kol., 2001 [Grass G., Fan B., Rosen B.P., Franke S., Nies D.H., Rensing C.: J. Bacteriol. 183, (2001)] Tuner(DE3), Roseta2(DE3), Rosetta-gami2(DE3), Zdroj: Merck, genotyp: Tuner(DE3) - F- ompt hsds B (r B - m B -) gal dcm lacy1 (DE3) placi (Cam R ), Roseta2(DE3) - F- ompt hsds B (r B - m B -) gal dcm (DE3) prare2 (Cam R ), Rosetta-gami2(DE3) - d(ara-leu) 7697 dlacx74 dphoa PvuII phor arad139 ahpc gale galk rpsl F (lac + laci q pro) gor522" Tn10 trxb prare2 (Cam R, Str R, Tet R ), DH11S (Life Technologies) genotyp: mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Δ(lac-proAB) Δ(rec1398) deor rpsl srl-thi-f proab + laci q ZΔM15, NEB 5-alpha: Genotyp: fhua2δ(argf-lacz)u169 phoa glnv44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17, citace: komerční kmen dodávaný firmou NEB (New Englands Biolabs), SHuffle Express: NEW England Biolabs, genotyp: kmen B, laci q, endonukleasa I a proteasa deficientní (Lon a OmpT), formace disulfidových můstků v cytoplasmě (disufide bond isomerase DsbC), spec resistence, SHuffle T7 Express: NEW England Biolabs, genotyp: kmen K12, laci q, endonukleasa I a proteasa deficientní (Lon a OmpT), T7 RNA polymerase, formace disulfidových můstků v cytoplasmě (disufide bond isomerase DsbC), spec resistence, nonspecific endonuclease I (enda1). Escherichia coli - souhrně lze říci, že všechny konstrukty budou v modifikované E.coli na volném plasmidu a budou způsobovat, že modifikovaná bakterie bude rezistentní na různá antibiotika. I když tyto vlastnosti dávají bakteriím výhodu v přežívání a množení oproti 14

15 divokému typu, jedná se o výhodu za zcela specifických podmínek. Naopak fakt, že kmeny, se kterými se bude nakládat, jsou mnohonásobně auxotrofní, způsobuje to, že modifikované bakterie se nemohou za normálních podmínek množit. Vnášené konstrukty jinak nedávají bakteriím žádné další nové vlastnosti a tyto bakterie nejsou ani patogenní ani toxické. Všechny popsané modifikace budou geneticky stabilní pouze za podmínek, že linie budou udržovány izolovaně a zabrání se jakémukoliv mísení s divokým typem či jinou linií, které by z výše popsaných důvodu vedlo k rychlé eliminaci chromozomu nesoucího modifikaci. Kmeny E. coli s rekombinantními plasmidy se nashromáždily během více než patnácti let práce v genovém inženýrství jednak jako dary kolegů z jiných laboratoří a jednak průběžnou konstrukcí nových typů rekombinovaných plasmidů přímo na ústavu. Některé rekombinované plasmidy jsou současně v bakteriích Agrobacterium tumefaciens (rhizogenes). Pseudomonas fluorescens F 113 mikroorganismus s přirozenou resistencí na rifampicin (Dowling et al., 1993). Pseudomonas alcaligenes CCM 2655 mikroorganismus sloužící pro transformaci genem lambb pro transmembránový protein. Bakteriální kmeny Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, C58CI,GV3101, LBA9402, EHA105 a AGL-1, Agrobacterium rhizogenes 15834, 8196, A4, HR1, TR7, TR101 a obsahující plasmidy s rekombinantní DNA slouží k transformacím rostlin. Bakterie Salmonella typhimurium His- (Ames et al., 1973, OECD 1984): TA98 rfa, pkm101, uvrb TA100 rfa, pkm101, uvrb TA97 rfa, uvrb YG1041 rfa, uvrb, pkm101, pyg233 YG1042 rfa, uvrb, pkm101, pyg233 se používá pro testování genotoxicity vzorků získaných ze životního prostředí a čistých chemikálií. Alcanivorax borkumensis geneticky modifikovaný deleční mutant atfa1 atfa2 spolupráce od Dr. Sabirove, v jejíž laboratoři byl připraven. Mycobacterium smegmatis kmen mc(2)155, bakterie pocházející ze sbírek ATCC (ATCC číslo ), reference: Snapper SB, et al Campylobacter jejuni bakterie pochází ze sbírky ZL ÚBM, ze sbírkových kmenů budou použity kmeny NCTC 11168, a CCM Rhodococcus erythropolis: CCM 2595 psrk21 phe plasmid obsahuje geny pro syntézu prvního enzymu degradační dráhy fenolu fenolhydroxylasy a geny rezistence vůči kanamycinu. Kmen byl získán z Mikrobiologického ústavu Akademie věd. CCM 2595 psrk21 catrabc - plasmid obsahuje geny pro syntézu druhého enzymu degradační dráhy fenolu katechol-1,2-dioxygenasy a geny rezistence vůči kanamycinu. Kmen byl získán z Mikrobiologického ústavu Akademie věd. 15

16 CCM 2595 ΔcatR - modifikace spočívá v chromosomální deleci v regulátorové části operonu genu catrabc který reguluje transkripci druhého enzymu degradační dráhy fenolu katechol-1,2-dioxygenasy. Kmen byl získán z Mikrobiologického ústavu Akademie věd. Rhizobium radiobacter NTL4(pZLR4) ATCC BAA-2240 (Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)): bioreporter používaný pro detekci signálů mezibuněčné komunikace bakterií (quorum-sensing). Vektor pzlr4 obsahuje geny rezistence ke gentamicinu a karbenicilinu. Kmen byl získán ze sbírky ATCC. Počet bakteriálních kmenů s různými plasmidy jde do stovek. Bakteriální kmeny se udržují dlouhodobě převážně ve zmrazeném stavu (v glycerolu). Různé kmeny E. coli této sbírky se průběžně používají ke konstrukci dalších rekombinovaných plasmidů a kmeny A. tumefaciens pro transgenozi rostlin. Geneticky modifikované kvasinky Pichia pastoris auxotrofní kmeny (neschopné syntetizovat určité aminokyseliny) používané pro nadprodukci rekombinantních proteinů za účelem jejich následné purifikace, Invitrogen. Pichia pastoris SMD1168H Genotyp: pep4 selekce Zeocin rezistentních vektorů, kmen bez proteasy A (Life Technologies). Pichia pastoris kmeny X33 a GS115 jsou používany pro nadprodukci rekombinantních proteinů za účelem jejich následné izolace a purifikace, zdroj: Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Saccharomyces cerevisiae kmeny pro analýzu proteinových interakcí v systému dvojitého hybrida: cdc25h, EGY 48 c, YM4271, W303: Mat a, leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 mal10, HS100-3c: Mat a AH 109. Saccharomyces cerevisiae Y1HGold (MATα, ura3-52 his3-200 ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4δ, gal80δ, met, MEL1) komerční kmen pro analýzy DNAproteinových interakcí v systému Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System (Clontech; kat. č ). DTY113: Mat, trp1-1 leu gal1 ura3-50 his cup1δ61, zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: kmen s inaktivovaným genem metalothioneinu CUP1; fenotyp: citlivý k Cu 2+, reference: Tamai a kol., 1993 [Tamai K. T., Gralla E.B., Ellerby L.M., Valentine J.S., Thiele D.J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, (1993)]. DTY168: Mat his6 leu ura3-52 ycf1::hisg, zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: kmen s inaktivovaným genem 16

17 vakulárního transporteru YCF1; fenotyp: citlivý k Cd 2+, reference: Szczypka a kol., 2000 [Szczypka M.S., Wemmie J.A., Moye-Rowley W.S., Thiele D.J.: J. Biol. Chem. 269, (1994)]. CM34: Mat, zrt1::leu2 zrt2::his3 ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52, zdroj: prof. David Eide, Univ. of Missoury-Columbia, Columbia, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými geny transporterů Zrt1 a Zrt2 pro příjem Zn 2+, reference: MacDarmid a kol., 2000 [MacDarmid C.W., Gaither L.A., Eide D.: EMBO J. 19, (2000)]. CM37: Mat a, zrt1::leu2 zrt2::his3 zrt3::npt ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52, zdroj: prof. David Eide, Univ. of Missoury-Columbia, Columbia, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými geny transporterů Zrt1 a Zrt2 pro příjem Zn 2+ a Zrt3 pro ukládání Zn 2+ ve vakuole, reference: MacDarmid a kol., 2000 [MacDarmid C.W., Gaither L.A., Eide D.: EMBO J. 19, (2000)]. CM100: Mat, can1-100oc leu2 trp1 ura3-52, zdroj: prof. David Eide, Univ. of Missoury-Columbia, Columbia, USA, popis kmene: parentální kmen pro S. cerevisiae CM34 a CM37, reference: MacDarmid a kol., 2000 [MacDarmid C.W., Gaither L.A., Eide D.: EMBO J. 19, (2000)]. DTY1 (Mat a, gal1 trp1-1 his3 ade8 CUP1 r ), zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: parentální kmen pro MPY17 a kmen ctr1δctr2δctr3δ, reference: Peňa a kol. (1998) [Peňa M.M.O., Koch K.A., Thiele D.J.: Mol. Cell. Biol. 18, (1998)]. MPY17 (Mat a, ctr1::ura3::kan r ctr3::trp1 his3 lys2-802 CUP1 r ), zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými geny membránových transportérů pro příjem Cu 2+, reference: Peňa a kol. (1998) [Peňa M.M.O., Koch K.A., Thiele D.J.: Mol. Cell. Biol. 18, (1998)]. ctr1δctr2δctr3δ (Mat a, ctr1::ura3::kan r ctr2::his3 ctr3::trp1 lys2-802 CUP1 r ), zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými geny membránových transportérů pro příjem Cu 2+ (Ctr1p a Ctr2p) a export Cu 2+ z vakuoly (Ctr2p), reference: Rees a kol. (2004) [Rees E.M., Lee J. Thiele D.J.: J. Biol. Chem. 279, (2004)]. Saccharomyces cerevisiae kmeny pro analýzu proteinových interakcí v systému dvojitého hybrida: NMY51, zdroj Dualsystems Biotech, MATa his3d200 trp1-901 leu2-3,112 ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexaop)8-lacz ade2::(lexaop)8-ade2 GAL4. CTY10-5d MAT a ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 gal4 - gal80 URA3 lexalac. CM137: Matα can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 zrc1::his3 cot1::kan R, zdroj: prof. David Eide, Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, Madison, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými geny transporterů Zrc1 a Cot1 pro transport Zn 2+ do vakuol, reference: MacDarmid a kol., 2000 [MacDarmid C.W., Gaither L.A., Eide D.: EMBO J. 19, (2000). BMA64-1A, (Baudin-Baillieu et al., 1997) [MATa ura3-52; trp1d2; leu2-3_112 his3-11 ade2-1 can1-100], Zdroj: Dr. Tomáš Cathaml, MBÚ, AVČR Praha, Popis kmene: parentální kmen pro BMAEREluc/Erα a BMA64/luc, Reference kmenů BMAEREluc/Erα a BMA64/luc: Leskinen et al.,

18 DTY59 Matα, his6, leu-, ura3-52, CUP1 R-3, acel-δ225 zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: kmen s inaktivovaným transkripčním faktorem Ace1, reference: Gralla a kol [Gralla E., Thielele D., Silar P., Valentine J.: PNAS 88: ]. DTY7 Matα, his6, leu-, ura3-52, CUP1 R-3 zdroj: prof. Denis Thiele, Duke Univ., North Carolina, USA, popis kmene: parentální kmen pro DTY59, reference: Gralla a kol [Gralla E., Thielele D., Silar P., Valentine J.: PNAS 88: ]. BY4741 ERG6-RFP (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YML008c- RedStar2::nat). Kmen obsahující heterogenní gen pro RFP protein, který je vložen jako fúzní kotva na 3 konec genu ho protein ERG6. Tento kmen byl získán jako dar od Dr. Marine Froissard, Equipe Différenciation et polarité cellulaire, Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles. Reference: Froissard M, D'andrea S, Boulard C & Chardot T (2009) Heterologous expression of AtClo1, a plant oil body protein, induces lipid accumulation in yeast. Fems Yeast Research 9, BY4741 PET10-RFP (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YKR046c-RedStar2::nat). Kmen obsahující heterogenní gen pro RFP protein, který je vložen jako fúzní kotva na 3 konec genu ho protein PET10. Tento kmen dosud nebyl publikován a byl získán jako dar od Dr. Marine Froissard, Equipe Différenciation et polarité cellulaire, Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles. Kmeny z veřejné sbírky Eroscarf ( BY4741 (Mat a; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0) [Acc. no. Y0000] (Brachman a kol [Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P and Boeke JD Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14, (1998)]) BY4741 ccc2δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YDR270w::kanMX4). Kmen s inaktivovaným genem pro transportér Ccc2 (rodina P1- ATPas), který lokalizuje v membráně golgiho útvaru pro transport Cu. [Euroscarf Acc. no. Y03629] BY4741 pmr1δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YGL167c::kanMX4). Kmen s inaktivovaným genem pro transportér Pmr1 (rodina P1- ATPas), který lokalizuje v membráně golgiho útvaru pro transport Mn a Ca. [Euroscarf Acc. no. Y04534]. BY4741 zrc1δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YMR243c::kanMX4). Kmen sensitivní vůči Zn v důsledku inaktivavace transporteru Zrc1 pro transport Zn do vakuol. [Euroscarf Acc. no. Y00829]. BY4741 yap1δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YML007w::kanMX4). Kmen s inaktivovaným genem pro Yap1, globální transkripční regulátor genů odezvy na stress (oxidativní, těžké kovy). [Euroscarf Acc. no. Y00569]. 18

19 BY4741 cot1δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YOR316c::kanMX4) [Euroscarf Acc. no. Y01613]. Kmen sensitivní vůči Zn a Co v důsledku inaktivovace transporteru Cot1 pro transport Zn a Co do vakuol. BY4741 bsd2δ (Mata; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YBR290w::kanMX4) [Euroscarf Acc. no. Y05738]. Kmen s inaktivovaným genem pro Bsb2, membránový (ER, vakuola) protein regulující cílení transpoirtérů Mn SMF1 a SMF2. Inaktivace zvyšuje citlivost vůči těžkým kovům. BY4741 zap1δ (Mata his3d1 leu2d0 met15d0 ura3d0 YJL056c::kanMX4) [Euroscarf Acc. no. Y01367]. Kmen s inaktivovaným genem pro transkripční regulátor Zap1, který se účastní aktivace genů pro membránové transportéry importéry Zn v odezvě na dostupný Zn. BY4741 msc2δ Mata his3d1 leu2d0 met15d0 ura3d0 YDR205w::kanMX4 Kmen s inaktivovaným genem pro Msc2 (rodina CDF), který jako heterodimer se Zrg17 (rodina CDF) lokalizuje v membráně ER pro import Zn. Mutace msc2δ vede v k teplotně senzitivní (37 C) inhibici růstu v důsledku chybného sbalování proteinů v ER (Ellis et al., 2005). [Euroscarf Acc. no. Y06971]. BY4741 arr1δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YPR199c::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transkripční faktor Arr1, který aktivuje transkripci genů pro rezistenci k As. Mutant je citlivý k As. [Euroscarf Acc. no. Y05614]. BY4741 arr2δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YPR200c::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro arsenát reduktázu Arr2. Mutace způsobuje citlivost kmene k As(V), zatímco citlivost k As(III) zůstává srovnatelná s parentálním kmenem. [Euroscarf Acc. no. Y05615]. BY4741 arr3δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YPR201w::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transportér Arr3. Mutace způsobuje citlivost k As(III). [Euroscarf Acc. no. Y05616]. BY4741 smf1δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YOL122c::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transportér dvojmocných a trojmocných kovů Smf1. Mutace způsobuje citlivost kmene k Cd a odolnost k Ni. [Euroscarf Acc. no. Y06272]. BY4741 pho84δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YML123c::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transportér anorganického fosfátu (Pi) Pho84. Mutace způsobuje resistenci k As a zároveň snižuje viabilitu buněk pěstovaných v médiu s nízkým obsahem P. [Euroscarf Acc. no. Y06524]. BY4741 zrg17δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YNR039c::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transportér Zn Zrg17. Mutace zrg17δ vede k inhibici růstu za podmínek nedostatku Zn a zvýšené teploty (37 C) v důsledku chybného sbalování proteinů v ER [Euroscarf Acc. no. Y05414]. BY4741 hac1δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YFL031w::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro transkripční faktor Hac1, který spouští transkripci buněčné odpovědi na stresové podmínky. Mutace způsobuje inhibici růstu za stresových podmínek. [Euroscarf Acc. no. Y05650]. BY4741 sae3δ (Mata ura3δ0 leu2δ0 his3δ1 met15δ0 YHR079c- B::kanMX4) Kmen s inaktivovaným genem pro protein Sae3, který se účastní meiózy. 19