Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 1/74 Příloha 1

Transkript

1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 1/74 Hodnocení rizika spojeného s uzavřeným nakládáním s geneticky modifikovanými mikroorganismy (GMM), BUNĚČNÝMI LINIEMI (BL) a s geneticky modifikovanými rostlinami (GMVR) na VŠCHT Praha Účel hodnocení: Hodnocení rizika je vypracováno pro geneticky modifikované mikroorganizmy (GMM) a vyšší rostliny (GMVR) pro potřeby Oznámení o uzavřeném nakládání s GMO v první a druhé kategorii rizika na pracovišti VŠCHT Praha, Technická 3-5, , Praha 6 v rámci vědeckých a výzkumných aktivit a kontrolní činnosti při stanovení přítomnosti a identifikace GMO. Uživatel: Ústav biochemie a mikrobiologie (ÚBM), VŠCHT Praha Ústav biotechnologie (ÚBT), VŠCHT Praha Kontaktní osoba: prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. Prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Doc. Ing. Pavel Kotrba, PhD. Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D. Ing. Leona Paulová, Ph.D. Ing. Irena Kolouchová, Ph.D. Ing. Ivana Křížová Východiska: Účelem hodnocení rizika prováděného podle zákona č. 78/2004 Sb. je identifikovat a vyhodnotit možné negativní působení navrhovaného nakládání s geneticky modifikovaným organismem nebo produktem na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost. Při hodnocení rizika musí být brány v úvahu všechny potenciální škodlivé účinky, bez ohledu na pravděpodobnost, se kterou mohou nastat, a porovnávány se škodlivými účinky nakládání s příjemcem, popřípadě rodičovským organismem nebo příbuznými organismy. Na pracovišti ÚBM VŠCHT Praha (Technická 3, Praha 6) je v současné době či blízké budoucnosti, pro vědecké a výzkumné potřeby a pro vývoj nových postupů detekce a identifikace GMO, nakládáno s geneticky modifikovanými bakteriemi a kvasinkami, buněčnými liniemi a s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami.

2 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 2/74 Hodnocení rizika geneticky modifikovaných bakterií Escherichia coli charakterizace recipientního organismu : Prokaryonta, Gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinka Čeleď : Enterobacteriaceae (Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, ) Přirozený výskyt: Jedná se o typického představitele střevní mikroflóry obratlovců, kde je užitečným komenzálem. Za určitých okolností může být nebezpečným patogenem, který může zachvátit apendix, žlučník, močové cesty i dutinu břišní. Některé biotypy E. coli mohou způsobovat závažná onemocnění člověka a zvířat. Může způsobovat akutní i chronické zánětlivé procesy Riziko podmíněné příjemcem: Používá se jen jako základní modelový mikroorganismus pro mikrobiologickou část práce v genovém inženýrství, nemá příjemce. Přímé účinky: Na ÚBM VŠCHT Praha jsou využívány kmeny, u kterých jsou patogenní vlivy na člověka minimalizovány. Předpokládá se, že pracovníci budou s E. coli nakládat v určených laboratořích a ve flow boxech, podle provozních řádu a veškeré kontaminace budou likvidovány použitím chloraminu nebo jiných antibakteriálních desinfekčních činidel. Kromě kmene E.coli BL21 jsou všechny zařazeny do kategorie rizika I. Jedná se především o tyto kmeny: určené pro experimentální práci pro oblast molekulární biologie klonování genů: bakteriální kmeny Escherichia coli DH5 : genotyp: supe44 lacu 169( 80lacZ M15) hsd R17 reca1 enda1 gyra96 thi-1 rela1, citace: Hanahan: J Mol Biol 166: 557 (1983), HB101: genotyp F - -proa)62 leub6 glnv44 ara- -mrr) rpsl20 (Str r ) xyl-5 mtl-1 reca13, JM109: genotyp: F trad36 proa + B + laci q (lacz)m15 / e14 - (McrA - ) (lac-proab) enda1, BL21(DE3): genotyp: hsds gal ( c I ts857 ind1 Sam7 nin5 lacuv5-t7 gene1), Top10: Life Technologies, genotyp F- mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) f80laczdm15 DlacX74 deor reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl (StrR) enda1 nupg, XL1-Blue: genotyp: supe44 hsd R17 reca1 enda1 gyra46 thi rela1 lac - F [proab + laci q lacz Tn10(tet r )], Stratagene, XL-1MRF Blue: genotyp: (mcra)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac [F proab laciqzdm15 Tn10 (Tet r )], pop6510 (lamb supe thr leu tonb thi lacy1 reca dex5 meta) (Boulain a kol., 1986), TG1 -proab) F [trad36 proab + laci q kol., 1989), CC118 -leu) arad -1 rpse rpob argb arge(am) BL21-Gold(DE3) LacZ- genotyp: E.coli BF- ompt hsds(rb-mb-)dcm+tetr BL21(AI) - F ompt gal dcm lon hsdsb(rb- mb-) arab::t7rnap-teta, JM109(DE3): genotyp: (Nal R ), hsdr17, mcra, rela1, supe, sbcbc, thi- - (DE3),

3 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 3/74 S17-I - 294recA (Simon, 1984), M15 prep4 Qiagen: Nal s, Str s, Rif s, Thi -, Lac -, Ara +, Gal +, Mtl, F -, RecA +, Uvr +, Lon +, SG13009 prep4 Qiagen: K 12 derivát, Nal 8, Str 8, Rif -, Th, Lac, Ara, Gal, Mtl, F, RecA, Uvr, Lon, Qiagen EZ, kompetentní buňky, Genotyp: F, Tn10(Tc ), lacl q, lacz enda1, hsdr17, lac, glnv44, thi-1, gyra96, rela1. Zdroj: Qiagen Cloning Kit Plus (No: ), podrobný popis: Qiagen PCR Cloning Handbook, Tyto buňky budou používány pro manipulaci s vektory (klonovacími, expresními a binárními) s konstrukty běžných rostlinných genů ve fúzi s reportérovými geny (GFP, RFP, mcherry) a markerovými geny (npti, AmpR), K12 PQ37 - Sfi::mud/a plac/cts, lac U169, mat+, uvra, gale, PhoC, rfa,f-, thr, leu, his, pyrd, thi, trp::muc+, sr13000::tn 10, rpob), zdroj: Doc. Malachová, Přírodovědná fakulta, Ostravská univerzita, ČR. Funkce: indukce SOS odpovědi v důsledku poškození genetické informace geneticky modifikovaného kmene Escherichia coli K-12. SOS odpověď je kontrolována dvěma regulačními proteiny rex a a lex A. Jejich hlavní funkcí je kaskádovitá regulace SOS genů, které jsou odpovědné za syntézu DNA-opravných enzymů a inhibitorů buněčného cyklu. Výše uvedený geneticky modifikovaný kmen nese operon sfi A::lac Z, vzniklý následnou fúzí a delecí v normální lac oblasti, takže aktivita indikačního enzymu β-galaktosidázy je přímo závislá na transkripci sfi A genu. Pro zvýšení citlivosti celého systému byla metodami genetického inženýrství vytvořena excizní deficience a lipopolysacharidová deficience, která umožňuje lepší difuzi látek do buňky. Kmen je rezistentní k ampicilinu využíváno pro detekci kmene pomocí PCR. (Quillardet a Hofnung, 1993; Quillardet et al.,1982), K12 SK1036: dam-4 strain, genotyp: F - mtl-1 xyl-7 argh1 his-4 ilvd188 lacms286 ϕ80diilacbk1 mete46 thi spc R tsx-3 su - dam-4 (ara-14 leub6 fhua31 lacy1 tsx78 glnv44 galk2 galt22 mcra dcm-6 hisg4 rfbd1 R(zgb210::Tn10) Tet S enda1 rspl136 (Str R ) dam13::tn9 (Cam R ) xyla-5 mtl-1 thi-1 mcrb1 hsdr2, NEB). Funkce: Kompetentní buňky E. coli K12 postrádající methyltransferasu, jsou vhodné pro transformace bez Dam a Dcm metylace. Kmen je rezistentní k spectinomycinu (spc). (NEB: chloramfenikol (cam), streptomycin (str) a nitrofurantoin (nit). BAA-525: genotyp: F- dam-13::tn9 dcm-6 hsdm hsdr zjj-202::tn10 recf143 galk2 galt22 ara-14 lacy1 xyl-5 leub6 thi-1 tona31 rpsl136 hisg4 tsx-78 mtl-1 glnv44. Funkce: Tento kmen je používán pro izolaci nemetylované DNA pro transformaci do Streptomyces nebo jakéhokoliv jiného organismu, který má restrikční systém senzitivní na metylace. SOLR: genotyp: e14 - (McrA - ) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171 sbcc recb recj uvrc umuc::tn5 (Kan r ) lac gyra96 rela1 thi- R [F proab laci q ZΔM15] Su -, zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktů č a č (revidované vydání C.01) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, XL1-Blue MRA - Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 gyra96 rela1 lac, zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktu č (revidované vydání A) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, XL1-Blue MRA (P2): genotyp: XL1-Blue MRA (P2 lysogen), zdroj a reference: Stratagene, Stratagene Instruction Manual produktu č (revidované vydání A) koupeno se soupravou, potřeba pro její použití, GG48: genotyp: ΔzitB::cat znta::npt mutant divokého kmene W3110, zdroj: prof. Christopher Rensing, Univ. of Arizona, Arizona, USA, popis kmene: kmen s inaktivovanými transportéry ZitB a ZntA pro export iontů těžkých kovů; fenotyp:

4 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 4/74 hypersensitivní k Cd 2+, Pb 2+ a Zn 2+, reference: Grass a kol., 2001 [Grass G., Fan B., Rosen B.P., Franke S., Nies D.H., Rensing C.: J. Bacteriol. 183, (2001)] Tuner(DE3), Roseta2(DE3), Rosetta-gami2(DE3), Zdroj: Merck, genotyp: Tuner(DE3) - F- ompt hsds B (r B - m B -) gal dcm lacy1 (DE3) placi (Cam R ), Roseta2(DE3) - F- ompt hsds B (r B - m B -) gal dcm (DE3) prare2 (Cam R ), Rosetta-gami2(DE3) - d(ara-leu) 7697 dlacx74 dphoa PvuII phor arad139 ahpc gale galk rpsl F (lac + laci q pro) gor522" Tn10 trxb prare2 (Cam R, Str R, Tet R ), DH11S (Life Technologies) genotyp: mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Δ(lac-proAB) Δ(rec1398) deor rpsl srl-thi-f proab + laci q ZΔM15, NEB 5-alpha: Genotyp: fhua2δ(argf-lacz)u169 phoa glnv44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17, citace: komerční kmen dodávaný firmou NEB (New Englands Biolabs), SHuffle Express: NEW England Biolabs, genotyp: kmen B, laci q, endonukleasa I a proteasa deficientní (Lon a OmpT), formace disulfidových můstků v cytoplasmě (disufide bond isomerase DsbC), spec resistence, SHuffle T7 Express: NEW England Biolabs, genotyp: kmen K12, laci q, endonukleasa I a proteasa deficientní (Lon a OmpT), T7 RNA polymerase, formace disulfidových můstků v cytoplasmě (disufide bond isomerase DsbC), spec resistence, nonspecific endonuclease I (enda1). S těmito kmeny se na pracovišti pracuje více než 15 let a nebyly zaznamenány žádné přímé negativní vlivy na osoby, které s nimi pracovaly. Nepředpokládá se, že při nakládání s E. coli uvedených kmenů v plánovaném rozsahu nesoucích plasmidovou rekombinantní DNA, dojde k poškození zdraví člověka. Riziko podmíněné vnesenými geny: Hodnocení rizika vychází z níže uvedených předpokladů: a) veškeré vnesené geny jsou součástí plasmidové DNA, která je schopna replikace v E coli, podle typu použitého vektoru je možný přenos konjugací do jiných bakterií, b) vektory (plasmid) ani inserty a jejich kombinace neobsahují aktivně transkribované sekvence jejichž produkty mohou způsobovat onemocnění člověka, zvířat nebo rostlin. V případě genů strukturních proteinů retrovirů M-PMV (Mason-Pfizerův opičí retrovirus) a HIV-1 (virus lidské imunodeficience typu 1). Jedná se o tyto strukturní proteiny: CA kapsidový protein, CANC kapsidový a nukleokapsidový (NC) protein, umístěné ve fúzi, MACANC matrixový protein (MA) ve fúzi s CANC, p12canc protein p12 ve fúzi s CANC, PSMACANC protein CANC modifikovaný doménou zodpovědnou za interakce proteinu s prostatickými buňkami. Uvedené geny a jejich modifikace jsou použity pro přípravu mutantů, tj. pro zavedení jednobodové mutace (změna jedné aminokyseliny). Tyto změny jsou prováděny pro studium zajímavých fenotypů a změn transportu nebo efektivity oligomerizace, pričemž nedochazí k vzniku nebezpečných nebo neznamých proteinů. Jelikož ve všech případech jsou do vektorů vnášeny pouze geny kódující strukturní proteiny virové schránky, které ani samy o sobě nejsou nijak nebezpečné, toxické, či infekční, nepředstavuje nakládání s organismy nesoucími tyto geny žádné riziko. c) bph C gen pro 2,3-dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasu enzym štěpící dihydroxybifenyly a dihydroxychlorbifenyly, isolován v INRS, Quebec, Kanada v laboratoři prof. M. Sylvestra, geny bph AEFGB zodpovídající za tvorbu dihydrodiolů z bifenylů nebo chlorbifenylů, isolovány a klonovány v INRS, Quebec, v laboratoři prof. M. Sylvestra (Masse,R et al., 1984). Gen pro bphd hydrolasu štěpící produkt genu bphc.

5 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 5/74 d) gen pro alfa-l-fukosidasu. Tento enzym katalyzuje hydrolytické štěpení alfa-l-fukosidů. e) geny pro obsahující chladově aktivní glykosidasy galaktosidasu) (White et al, 2000). f) geny todc1 a todc2 z Pseudomonas putida F1 utilizující toluen. g) CUP (HisCUP) gen pro metalotionein isolovaný ze Saccharomyces cerevisiae. h) Gen lamb-153 kódující přirozený protein vnější membrány E. coli K12 v němž bylo v místě kodonu 153 vytvořeno cílové místo BamHI (Boulain a kol., 1986). Protein LamB lamb-153 slouží jako vektor pro expozici peptidů a proteinů na povrchu E. coli. i) insert merr kódující protein MerR a promotor genů mer pochází ze sekvence transposonu E. coli Tn21, kde představují elementy specificky regulující transkripci genů spojených s resistencí k Hg 2+, která je běžně rozšířená u G - a G + bakterií (Silver a Phungle, 2005). Gen merr a jeho homology jsou v přírodě poměrně rozšířené (Silver a Phunge, 2005) a není pravděpodobné, že by jejich studium používanými nástroji přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. Žádný takový případ nebyl ani popsán v literatuře. Získány byly v PCR a jejich výskyt lze detekovat pomocí PCR. j) insert -HMT1A savčího metalothioneinu peptidu schopného přirozeně vyvazovat ionty těžkých kovů v cytoplasmě (Vasak, 2006). Metallothioneiny s vysokou homologii k HMT1A disponují takřka všechny eukaryotní organismy (Vasak, 2006) není pravděpodobné, že by studium HMT1A nebo jeho domény -HMT1A používanými nástroji přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. Žádný takový případ nebyl pro metalothioneiny ani popsán v literatuře. V E. coli je součásstí vektorů, které nejsou určeny k expresi transgenu v tomto hostiteli. Získány byly v PCR a jejich výskyt lze detekovat pomocí PCR. k) syntetické oligonukleotidy CHSK, HHTC, HEFGH a MDQTH kódují aminokyselinové sekvence krátkých peptidů, pro které byla na základě kvantově chemických výpočtů předpovězena schopnost vytvářet stabilní koordinační sféry iontů tranzitních kovů (Kožíšek a kol., 2008). Syntetické oligonuleotidy (tandemní repetice) HP až HP3 kódují peptid, každý obsahující motiv GHHPHG, který je vazebným místem pro ionty těžkých kovů (Vinopal a kol., 2007). Syntetický oligonuleotid CP kóduje peptid obsahující motiv CGCPCGC, který je vazebným místem pro ionty těžkých kovů (Kotrba a kol., 1999). l) gen npt pro nopalinfosfotransferasu (kanamycinová resistence) pochází z komerčního plasmidu pet 16b, kde slouží jako selekční marker. Tento gen lze stejně jako geny zodpovědné za resistence k dalším antibiotikům (bla ampicilin, cat chloramfenikol) sloužící jako selekční marker pro izolaci transformantů detekovat podle fenotypového projevu nebo specificky pomocí PCR. m) geny mettdyrabc získané z přirozeného konjugativního plasmidu pa81 (přístupové č. sekvencev EBI AJ515144) půdní bakterie Achromobacter xylosoxidans A8 (Jenčová a kol., 2004). Geny pochází 14 kb KpnI-EcoRI fragmentu a kódují potencionální determinanty bakteriální rezistence k těžkým kovům. Na základě poznatků o mechanismech bakteriální rezistence k iontům těžkých kovů (Silver a Phunge, 2005) a homologií primárních struktur produktů genů met lze jednotlivých genům a jejich produktům přiřadit následující potencionální funkce: mett (MetT) - transmembránovým transportním protein pro ionty kovů; metd (MetD) transportér (rodina CDF) exportující ion kovu z cytoplasmy, mety (MetY) pravděpodobná steroldesaturasa, metr (MetR) - transkripční aktivátor/represor z rodiny MerR, MetA - ortolog P1-ATPas transportujících ionty přechodných kovů, metb (MetB( membránový periplazmatický lipoprotein (komponenta MetA) a metc (MetC( - signální pro-lipoprotein (MetB) peptidasa. Ortology genů met jsou v přírodě poměrně rozšířené (Silver a Phunge, 2005) a není pravděpodobné,

6 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 6/74 že by jejich studium používanými nástroji přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. Jednotlivé inzerty genů met lze detekovat s využitím PCR s genově specifickými primery. n) modcanc - gen kódující modifikovaný strukturní obálkový protein Mason-Pfizerova opičího viru. Modifikace je uskutečněna pomocí velmi krátkých oligopeptidů. o) CANCZif - gen kódující modifikovaný strukturní obálkový protein Mason-Pfizerova opičího viru. Modifikace je uskutečněna pomocí krátkých sekvencí vázajících nukleové kyseliny. p) CANCTramtrac - gen kódující modifikovaný strukturní obálkový protein Mason- Pfizerova opičího viru. Modifikace je uskutečněna pomocí krátkých sekvencí vázajících nukleové kyseliny. q) GEN: gag Přístupový kód v nukleotidové databasi NCBI: NC_ Zdrojový organismus: RSV Funkce a potenciální riziko: Tento gen kóduje strukturní polyproteinový prekurzor Gag. Gen gag kóduje následující strukturní proteiny: MA, p10, CA a NC. Celý gag nebo jeho zkráceniny byly vloženy do expresních vektorů pro bakteriální, kvasinkové a savčí buňky. Akceptorové organismy obsahující vektory s vloženým genem gag nebo jeho zkráceninami nepředstavují žádné biologické riziko. s) GEN: gag Přístupový kód v nukleotidové databasi NCBI: AF Zdrojový organismus: M-PMV Funkce a potenciální riziko: Tento gen kóduje strukturní polyproteinový prekurzor Gag. Gen gag kóduje následující strukturní proteiny: MA, pp18/24, p12, CA, NC a p4. Celý gag nebo jeho zkráceniny (p12, p12canc, CANC, pp18/24) byly vloženy do expresních vektorů pro bakteriální, kvasinkové a savčí buňky. Akceptorové organismy obsahující vektory s vloženým genem gag nebo jeho zkráceninami nepředstavují biologické riziko. t) GEN: gag Přístupový kód v nukleotidové databasi NCBI: NC_ Zdrojový organismus: HIV-1 Funkce a potenciální riziko: Tento gen kóduje strukturní polyproteinový prekurzor Gag. Gen gag kóduje následující strukturní proteiny: MA, CA, NC a p6. Celý gag nebo jeho zkráceniny byly vloženy do expresních vektorů pro bakteriální, kvasinkové a savčí buňky. Jelikož se jedná pouze o strukturní proteiny viru, akceptorové organismy obsahující vektory s vloženým genem gag nebo jeho zkráceninami nepředstavují žádné biologické riziko. u) Geny a sekvence DNA z ektomykorhizních (EM) hub: RaZBP1 (Leonhardt a kol., 2014) z R. atropurpurea (holubinka červenonachová), kódující peptid podobný metallothioneinům (MT) s významnou strukturní podobnost MT sinic, jako je SmtA ze Synechococcus elongatus. MT jsou skupinou peptidů schopných přirozeně vyvazovat ionty těžkých kovů v cytoplasmě a disponují jimi všechny eukaryotní organismy a některá prokaryota (Vasak, 2006). RaACE1 a RaACE2 kodují ortology transkripčních regulátorů ACE1 a jeho homologů, které se v houbách účastní regulace transkripce genů souvisejících s biologií Cu a udržením redoxní rovnováhy v cytoplasmě (zejména genů pro metalothioneiny, transportéry Cu a nekteré oxidoreduktasy; Álvarez et al. 2009, Rutherford a Bird 2004; Beaudoin and Labbé 2001). Není pravděpodobné, že by studium proteinů R. atropurpurea (druh běžně se vyskytující v ČR) používanými nástroji přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. Žádný takový případ nebyl pro ortology ani popsán v literatuře. Jednotlivé cdna a genomové fragmenty v plasmidech lze detekovat s využitím PCR s genově specifickými primery.

7 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 7/74 Následující rekombinantní geny (cdna příp. genomové fragmenty EM hub) vnesené do E. coli jsou součástí vektorů, které nejsou určeny k expresi transgenu v tomto hostiteli (popis transgenů je uveden pro hostitele S. cerevisiae). AsMT1a, AsMT1b, AsMT1c, AsMT2, AsMT3, HmMT1, HmMT2 a HmMT3, RaMT1. RaMT2, RaZBP2, RaZBP3, RaCDF1-4, RaZIP1/2/34, AsCTR1-4, AsAP-1, AsTLP, RaZAP1. Není pravděpodobné, že by manipulace s těmito sekvencemi v E. coli v uzavřeném nakládání přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. v) Gen aldc pochází z Acetobacter aceti ssp. xylinum (Yamano a kol. 1994) a kóduje enzym α-acetolaktát dekarboxylasu, která je široce rozšířená ve fermentujících bakteriích kde se konverzí acetolaktátu na acetoin podílí na kontrole intracelulárního ph. Je vysoce nepravděpodobné, že by práce s aldc z bezpečné potravinářské bakterie používanými postupy představovala ekologické nebo zdravotní riziko. V E. coli je součástí vektorů, které nejsou určeny k expresi transgenu v tomto hostiteli. w) Syntetický oligonukleotid QPF kóduje peptid o 20 aminokyselinách (QQPFPQQPFPQQPFPQQPFP) navržený tak, aby poskytoval atomy pro vazbu látek povahy polyfenolů prostřednictvím vodíkových můstků. U tohoto uměle vytvořeného inzertu není pravděpodobné, že by přinášel zdravotní nebo ekologické nebezpečí. Lze detekovat prostřednictvím PCR, při které je sekvence insertu použita jako jeden z primerů a druhý primer je derivován ze sekvence vektoru. V E. coli je součástí vektoru, který není určeny k expresi transgenu v tomto hostiteli. x) Gen: glykoproteinu GP Přístupový kód v nukleotidové databasi GenBank: U Zdrojový organismus: Zaire Ebola virus Funkce a potenciální riziko: strukturní protein obalu rozpoznávající buněčný receptor a umožňující návázání kapsidy viru. Do bakteriálních buněk a savčích tkáňových kultur bude vnášena isolovaná, replikačně defektní část genomu. Plasmid bude obsahovat dsdna. Jelikož se jedná pouze o strukturní protein viru, akceptorové organismy obsahující vektory s vloženým genem GP nepředstavují žádné biologické riziko. y) Geny SERCA kódují lidskou sarko-/endoplasmatickou retikulární Ca 2+ ATPasu (SERCA), což je ATPasa P-typu přítomná v lidském sarkoplasmatickém a endoplasmatickém retikulu. Lidské SERCA jsou kódovány třemi různými geny (SERCA1, gen ATP2A1, ID 487; SERCA2, gen ATP2A2, ID 488; SERCA3, gen ATP2A3, ID 489). Tyto tři geny dávají vzniknout řadě isoforem proteinů SERCA, které jsou exprimovány tkáňově specificky, s výjimkou isoformy SERCA2b, která je konstitutivně exprimována ve všech tkáních. Není pravděpodobné, že by manipulace s těmito sekvencemi v E. coli v uzavřeném nakládání přinášelo zdravotní nebo ekologická nebezpečí. z) Lidské mrna nebo jejich fragmenty AKIP1, NFkB, VEGF, p53. aa) Clostridium pasteurianum kmen NRRL B-598, používan pro produkci organických kyselin a rozpouštědel, je přírodním izolátem získaným z veřejné sbírky mikroorganismů. Pro genetickou modifikaci byly použity geny kódující expresi proteinů ALB , ALB , ALB , gen kódující expresi regulačního proteinu sporulace Spo0A a gen kódující protein sporového pláště CotJC. Geny byly izolovány z Clostridium pasteurianum NRRL B-598 pomocí PCR reakce. bb) Bakterie Lactobacillus plantarum. Používaný vektor bude obsahovat gen kódující katalasu a určité fragmenty tohoto genu. cc) Bakterie Pyrococcus furiosus. Používané vektory budou obsahovat gen kódující DNA polymerasu.

8 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 8/74 dd) Rousův sarkoma virus (RSV) (isolované, replikačně defektní části genomu strukturní proteiny obalu, připraven na odd. virové a buněčné genetiky Ústavu molekulární genetiky AVČR, v laboratoři RNDr. Jiřího Hejnara, CSc. Jedná se o ptačí retrovirus, který není patogenní pro savce). ee) Virus horečky Dengue. Původ: RNA virus Čeled: Flaviviridae, rod: Flavivirus Genom viru Denge je tvořen jednořetězcovou RNA molekulou, kódující tři strukturní a sedm nestrukturních proteinů. Používané vektory budou obsahovat pouze geny kódující strukturní proteiny a jejich fragmenty, zejména kapsidový protein C. Fragmenty o této velikosti nemohou v žádném případě vytvářet jakékoli infekční částice, nejsou tedy infekční, patogenní ani toxické. ff) Virus XMRV (xenotropic murine leukemia virus-related retrovirus). Původ: Virus XMRV je nově objevený lidský gamaretrovirus a je spojován s některými onemocněními jako rakovina prostaty a únavový syndrom (Lombardie et al. (2009), Urisman et al. (2006). Jeho role jako původce těchto onemocnění však stále nebyla prokázána. Používané vektory budou obsahovat fragmenty genomu viru XMRV tj. strukturní proteiny Gag a enzymatické a další proteiny Pol o velikosti maximálně 1000 párů bází. Fragmenty o této velikosti nemohou v žádném případě vytvářet jakékoli infekční částice, nejsou tedy infekční ani patogenní. Ve všech případech vlákádí částí živočišných retrovirů se jedná pouze o části genomu kódující strukturní proteiny a enzymy. Nejsou používány geny kódující regulační sekvence. S některými geny se na pracovišti pracuje více než 15 let, s jinými se pracovalo a pracuje na jiných pracovištích a nebyly zaznamenány žádné přímé negativní vlivy na osoby, které s nimi pracovaly. Nepředpokládá se, že při nakládání s uvedenými geny dojde k poškození zdraví člověka. Komerční vektory: GE Healthcare: pezz 18, puc 18/19 Clontech: pbi121, pgadt7, pgbkt7, pac, pdsred1n1, pcmvcmyc, pcmv- HA expresní vektor pro proteiny s hemaglutininovou značkou (HA) na N-konci v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Obsahuje gen pro ampicilinovou rezistenci v bakteriích. Invitrogen: pcrii, prsetb, ppicza, ptrchis, pyes2, pegfp, pcr3.1, pcr2.1-topo, pcrii-topo, pcr4-topo, pcdna3 (vektor pro expresi genů v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Obsahuje gen pro kanamycinovou a ampicilinovou rezistenci v bakteriích a pro savčí buňky obsahuje neomycinovou rezistenci.), pegfp-c1 (expresní vektor pro proteiny ve fúzi s GFP na C-konci v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Obsahuje gen pro kanamycinovou rezistenci v bakteriích a a pro savčí buňky obsahuje neomycinovou rezistenci), PEGFP-N1 (expresní vektor pro proteiny ve fúzi s GFP na N-konci. v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Obsahuje gen pro kanamycinovou rezistenci v bakteriích a pro savčí buňky obsahuje neomycinovou rezistenci), pcdna3.1+ (vektor pro expresi genů v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Vektor obsahuje gen pro ampicilinovou rezistenci pro expresi v baktriích a T7 promotor pro expresi v savčích buňkách), pcdna6.2 N-GFP (vektor pro expresi genů v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Je to expresní vektor pro proteiny ve fúzi s GFP na N-konci a obsahuje gen pro ampicilinovou rezistenci pro expresi v bakteriích).

9 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 9/74 Novagen: vektory řady pet (pet 22b, pet-16b, pet19-b), pt7blue New Englan Biolabs: pmal-p2x, pmal-c2x, ptyb4, pduet Agilent Technologies: pbluescript II SK (+/-), pbluescript II KS(+/-),Uni-ZAP XR, Lambda FIX II, Amersham Pharmacia Biotech: pgex-4t-2, pgex-4t-1 Addgene: pbb131, pt2/hb (vektor pro stabilní expresi genů v savčích buňkách. Obsahuje gen pro ampicilinovou rezistenci v bakteriích), pse100, ptek-4s-0x Promega: pgemex, psi, pgem-t Easy, pgemex-2: klonovací vektor pro expresi genů v bakteriálních buňkách pod kontrolou T7 promotoru Qiagen: expresní vektory řady pqe (pqe30, pqe31, pqe32, pqe40), pep31, pdrive klonovací vektor Qiagen, Qiagen Cloning Kit Plus (No: ). Lonza: pmaxgfp vektor pro expresi GFP v savčích buňkách pod kontrolou promotoru CMV. Obsahuje gen pro kanamycinovou rezistenci v bakteriích. Life Technologies: ppicza-alfa vektor pro expresi genů v kvasinkách. Vectorbuilder: pet(exp) (vektor pro expresi v bakteriálních buňkách E. coli BL21(DE3) pod kontrolou T7 promotoru a indukovatelného Lac promotoru). pgreen II binární vektor pro klonování do rostlin ( ptriex-4: klonovací vektor pro expresi vnesených genů v bakteriálních, kvasinkových či živočišných buňkách, pod promotory pcmv, p10 a T7, produkt firmy Novagen, komerčně dodán firmou Merck. piv1 - plasmid Impact Vector I (Plant Research International, Nizozemí), obsahuje: RbcS kazetu s promotorem i polyadenylačním signálem malé podjednotky enzymu RUBISCO z rostliny Chrysanthemum morifolium, gen pro rezistenci k ampicilinu v bakteriích. pnov U.S. Patent Nos. 5,767,378 a 5,994,629 (Syngenta, Švýcarsko), rostlinný vektor, T-DNA obsahuje gen pmi pro fosfomannosaisomerasu v kazetě s promotorem CMPS a nos polyadenylačním signálem. pbract209 binární vektor pro klonování do rostlin ( plexa-n, plexa-c Dualsystems Biotech. pgreen 0029, 0129 binární vektor pro klonování do rostlin (Hellens et al., 2000). pk7gwf2 - binární vektor pro klonování do rostlin ( (Andreeva et al. 2009, Karimi et al. 2002). p2rgw7- expresní vektor užívaný pro transientní expresi v rostlinách ( (Andreeva et al. 2009). psoup plasmid pro kotransformaci agrobakteriálních buněk plasmidem pgreen, tento plasmid zajišťuje replikaci plasmidu pgreen v agrobakteriálních buňkách, zdroj: pcb302 - binární vektor, do kterého byl vložen inzert GFP-fABD2 a transformovány rostliny A. thaliana (Voight et al., 2005). pgadt7-rec Vector vektor ze soupravy Matchmaker Gold (Clontech; kat. č ) pro inzerce GAL4 AD/cDNA homologní rekombinací do S. cerevisiae Y1HGold. pabai Vector - kontrolní vektor soupravy Matchmaker Gold (Clontech; kat. č ). pgadt7 AD Vector vektor ze soupravy Matchmaker Gold (Clontech; kat. č ) pro expresi cdna v S. cerevisiae Y1HGold.yEP368 - plasmid získaný ze sbírky ATCC, katalogové číslo ATCC 37736, E. coli-s. cerevisiae shuttle vektor pro tvorbu fúzí promotorových oblastí jako specifických inzertů s reporterovým genem lacz, obsaženým ve vektoru. Vektor je určený pro evaluaci aktivity promotorů

10 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 10/74 stanovením aktivity β-galaktosidasy exprimované v transformantech S. cerevisiae. Dále pro obsahuje gen pro β-laktamasu ampicilinová rezistence, exprese v bakteriích, LEU2 ze S. cerevisiae selekce v S. cerevisiae leu2 a počátky replikace plasmidů pmb1 bakteriální a 2μ kvasničný. [reference k původu a využití: Myers A.M., Tzagoloff A., Kinney D.M., Lusty C.J.: Gene 45: ]. Bližší údaje o využívaných komerčních vektorech a insertech pro mikroorganismy uvádí Tabulka 1 a Tabulka 5 v Oznámení o uzavřeném nakládání s GMO v první a druhé kategorii rizika na pracovišti VŠCHT Praha. Do vektoru pegfp-ci není vložen žádný insert, tento vektor slouží pouze jako reportérový nosič (produkce fluorescenčního proteinu - GFP) a tedy nepředstavuje žádné riziko, navíc v bakteriích není ani gen pro GFP exprimován. Vektor puc je pouze nosičová molekula, nebo byl použit pro produkci fluorescenčního proteinu GFP a tedy z hlediska GMO nepředstavuje jeho vpravení do bakterií žádné riziko. Nekomerční vektory ppcv: Agrobakteriální vektory řady, plasmidy na basi Ti plasmidu bakterie Agrobacterium upravený pro klonování Konz C. a kol. (1994). p416gpd: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r, ColE1 ori, CEN6/ARS4 ori, URA3 +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995). p426gpd: E. coli-s. cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995). p425hgpd E. coli-s. cerevisiae shuttle vektor na bázi p426-gpd (Mumberg a kol., 1995) s náhradou genu URA3 (selekční marker) za gen LEU2 vektoru yep368 (připraven na VŠCHT Praha). Výsledný vektor Ap r +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. p1v5-ag E. coli-s. cerevisiae shuttle vektor na bázi p416-gpd (Mumberg a kol., 1995) se syntetickou sekvencí smfα (jako HindIII-BamHI fragment) a V5 (jako BamHI-EcoRI fragment) a fragmentem kódujícím C- terminální doménu proteinu Sag1 (jako EcoRI- XhoI fragment). (Vinopal a kol., 2007) p416adh: E. coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r, ColE1 ori, CEN6/ARS4 ori, URA3 +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. Reference: Mumberg a kol., p426adh: E. coli-s. cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r URA3 +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. Reference: Mumberg a kol., pjms11: vektor umožnující v G - bakteriích jednu transpozici klonovaného elementu do genomu jako součásti mini-tn5, Ap r, Km r, R6K ori, orit, tnp (transposasa), xyle (katechol 2,3-dioxygenasa) Reference: Panke a kol., plbb9: plasmid nesoucí lamb-153 pod kontrolou laktosového promotoru, Cm r, oriv psc101 Reference: Cebolla et al., ptoo11: Km r, Cm r, E. coli-bacillus subtilis shuttle vektor, mer promotor a merr z transposonu Tn21 inzerovány před lucff gen z Photinus pyralis pro luminiscenční detekci Hg 2+. Reference: Virta a kol., pma_ap::bglu PRO: syntetizovaný bakteriálni plasmid s ampicilinovou rezistencí a kořenovým promotorem genu bglu získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie).

11 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 11/74 ptoo21: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, ars promotor a arsr z plazmidu pi258 ze Staphylococcus aureus inzerovány před lucff gen z P. pyralis pro luminiscenční detekci ionů antimonu a arsenu. Reference: Tauriainen a kol., ptoo24: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, cad promotor a cadc z plazmidu pi258 z S. aureus inzerovány před lucff gen z P. pyralis pro luminiscenční detekci Cd 2+. Reference: Tauriainen a kol., ptoo31: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, ars promotor a arsr z plazmidu R773 z E. coli inzerovány před lucff gen z P.pyralis pro luminiscenční detekci ionů antimonu a arsenu, Reference: Tauriainen a kol., pma_ap::bglu PRO/ATF3 H: syntetizovaný bakteriálni plasmid s ampicilinovou rezistencí a kořenovým promotorem genu bglu získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie) s vloženým genem ATF3 H pro flavonoid-3 -hydroxylasu z A. thaliana. pbi121 nesoucí resistenci ke kanamycinu a CAMV 35S promotor. ppcv- rezistence k hygromycinu, p35s,určeno k inzerční mutagenezi rostlin. pbinm - bakteriální gen pro rezistenci ke kanamycinu, gen pro zeleně fluoreskující protein GFP. prok2 binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu (Baulcombe et al., 1986). pac161 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen sul1 pro rezistenci k sulfonamidu (Rosso et al., 2003). pcgn1549 (Calgene) - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen pro rezistenci ke gentamycinu (McBride, Summerfelt, 1990). phannibal (CSIRO) hairpin RNAi vektor pro tvorbu rostlinných hairpin RNAi sekvencí nesoucí gen pro rezistenci k ampicilinu (Wesley et al., 2001). part27 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu a gen pro rezistenci ke spektinomycinu (Gleave, 1992), pro něž jsou k disposici jejich kompletní sekvence včetně údajů o regulačních sekvencích a selekčních markerech ve firemních materiálech. phg/psilbaγ vector system: sestává z vektorů phg a psilbaγ [reference k struktuře, původu a využití: Kemppainen M.J. Pardo A.G.: Microbial Biotechnology (2010) 3: ]. Ze specifických sekvencí obsahuje vektor psilbaγ promotor genu glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenasy (gpdii) z Agaricus bisporus, intron genu pro nitrát reduktasu z Laccaria bicolor mezi dvěmi polyklonovacími místy určenými pro vnesení transgenu a rezistenci vůči ampicilinu pro selekci v E. coli.. Vektor phg obsahuje mezi hraničními sekvencemi z T-DNA gen pro hygromycinovou rezistenci pod kontrolou promotoru gpdii a kanamycinovou rezistenci pro selekci v E. coli. Vektory poskytl prof. Alejandro G. Pardo z Laboratorio de Micología Molecular, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina. psrk21 plasmid o velikosti 5835 bps, obsahuje lacz, per, rep a Km R úseky. Zdroj: Ing. Miroslav Pátek, CSc., AVČR, v.v.i. pzlr4 plasmid obsahující trag::lacz, trar úseky, geny resistence k gentamicinu a carbenicillinu, zdroj: ATCC. Plasmidy pry111 a prem byly získány od Nabila Haddad v rámci spolupráce s ONIRIS Nantes, Francie. Plasmid pry111 obsahuje gen rezistence k chloramfenikolu; je to malý plasnid, který umožňuje transformaci E. coli i bakterií druhu Campylobacter. Plasmid prem obsahuje GFP. pgal-gfp/pnbt29 dar od Dr. Marine Froissard, Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles. Reference: Froissard M, Belgareh- Touze N, Buisson N, Desimone M, Frommer WB & Haguenauer-Tsapis R (2006)

12 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 12/74 Heterologous expression of a plant uracil transporter in yeast: improvement of plasma membrane targeting in mutants of the Rsp5p ubiquitin protein ligase. Biotechnol J 1, pcj313 dar od Dr. Bruno André, Laboratoire de Physiologie Moléculaire de la Cellule, rue des Pr. Jeener et Brachet 12, Université Libre de Bruxelles. Dosud nepublikováno. Schéma řady modulárních plasmidů pmtl80000 bylo převzato z Heap et al. (2009) a Použité plasmidy nejsou schopny způsobit vznik patogenního mikroorganismu nebo produkce nebezpečného metabolitu transformovaným organismem a nepředstavují tedy žádné riziko pro člověka, zvířata či rostliny. Vektory obsahují geny způsobující rezistenci vůči antibiotikům pro pozitivní selekci transformantů. pmtl83253 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku erythromycinu a nukleotidovou sekvenci konstitutivního ferredoxinového promotoru, za který však není klonován žádný insert. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. pmtl82254 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku erythromycinu. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli a gen pro rezistenci k antibiotiku chloramfenikolu. pmtl82251 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku erythromycinu. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. pmtl84251 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku erythromycinu. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. pmtl85251 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku erythromycinu. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. pmtl83353 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku spectinomycinu a nukleotidovou sekvenci konstitutivního ferredoxinového promotoru, za který však není klonován žádný insert. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. pmtl84422 je kyadlový plasmidový vektor, který byl poskytnut na základě písemné dohody institucí University of Nottingham. Plasmidový vektor nese počátek replikace pro bakterie rodu Clostridium, gen pro rezistenci vůči antibiotiku tetracyklinu a nukleotidovou sekvenci konstitutivního promotoru P thl, za který však není klonován žádný insert. Vektor dále obsahuje replikační počátek pro jeho replikaci v bakterii Escherichia coli. Vektorem pro vnesení genu RNA polymerasy do tkáňových buněk pro expresi genů pod T7 promotorem bude komerčně dostupný Vaccinia virus.

13 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 13/74 pcmvha-neo, upravený komerční vektor pcmvha (Clontech), do kterého je přidán gen resistence na neomycin. pdb31 expresní vektor používaný v bakteriích (prof. M. Sylvestre, INRS, Kanada, Barriault & Sylvestre, 1999). pcrii-topo::atf3 H: bakteriálni plasmid s vloženým genem ATF3 H pro flavonoid-3 hydroxylasu z A. thaliana získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie). pg1/er(g) YipEREluc kvasinkový vektor s vloženým genem herα (lidský estrogenní receptor), ERE (estrogenní responsivní element) a Luc (luciferasa). Na pracovišti není nakládáno s izolovaným plasmidem, pouze s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae BMAEREluc/Erα obsahujícícmi tento vektor, získáno od Dr. Tomáš Cajthaml, MBÚ, AVČR, Praha. prs316luc - kvasinkový vektor s vloženým genem Luc (luciferasa). Na pracovišti není nakládáno s izolovaným plasmidem, pouze s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae BMA64/luc obsahujícícmi tento vektor, získáno od Dr. Tomáš Cajthaml, MBÚ, AVČR, Praha. pbract214::bphc/his rostlinný vektor založen na komerčním vektoru pbract214 (Gateway), který obsahuje bakteriální gen bphc pod ubiquitinovým promotorem (ubi). Selekční gen je hpt (gen pro hygromycinfosfotransferasu) řízený CaMV 35S promotorem. Bude dodáno Dr. Ohnoutková, PřF UP v Olomouci, reference: Lišková, pbi-destn upravený komerční vektor pbi121 nesoucí resistenci ke kanamycinu a CaMV 35S promotor obsahující gen pro acyl-coaδ11-desaturasu (Pdesat-Tn Delta(11)Z) (Nesnerova et al., 2004). pcglobin2-sb100x - vektor s vloženým genem pro transponasu Sleeping Beauty 100x. Obsahuje gen pro rezistenci k ampicilinu. Získáno od Dr. Michala Pravence, FGÚ, AV ČR, Praha. (Ro H. et al., 2004). Používané plasmidy založené na uvedených vektorech pezz-hp3: plasmid pezz 18 obsahující oligonukleotid ZZHP3 [plus řetězec] (CC GGG CAT CAT CCA CAC GGT CAT CAC CCA CAT GGT CAT CAT CCA CAC GGT TA, vložen jako XmaI-Hind III fragment, [plus řetězec]), kódující peptid o sekvenci: GHHPHGHHPHGHHPHG pro vazbu iontů těžkých kovů. Expresní vektor pro E. coli. pbicp: plasmid pbi121 do jehož unikátního Bam HI místa je vložen jako Bgl I-Bam HI fragment syntetický oligonukleotid o sekvenci [plus řetězec] ggatctatgggctgcggttgtccatgcggttgtggcg kódujícího peptid CP o sekvenci MGCGCPCGCG. Určen pro produkci CP peptidu jako vazebného místa pro kovy ve fúzi s -glukuronidasou plasmidu pbi121 v rostlinách. Hostitel zde E. coli TG1 a A. tumefaciens LBA : plasmid pbi121 do jehož unikátního Bam HI místa je jako Bgl I-Bam HI fragment DNA vložen -HMT1A sekvence v GenBank T27991). Zdroj -HMT1A: plasmid HAWAU68 (ATCC -HMT1A jako vazebného místa pro kovy ve fúzi s -glukuronidasou plasmidu pbi121 v rostlinách. Hostitel zde E. coli TG1 a A. tumefaciens LBA pbimerr: plasmid pbi121 ve -glukuronidasu vyštěpen pomocí Xba I a Sac I a zaměněn za gen merr kódujícího MerR protein jako specifické vazebné místo

14 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 14/74 pro Hg 2+. Určen pro produkci MerR jako vazebného místa pro Hg 2+ v rostlinách. Hostitel zde E. coli TG1 a A. tumefaciens LBA pmer-km: pet-22b s vloženým Xho I-Not I fragmentem DNA nesoucím gen pro transkripční regulátor merr a odpovídající promotorovou sekvenci Pmer kontrolující expresi genu npt (projev: rezistence ke kanamycinu) vloženého jako NcoI-HindIII fragment. Určen pro expresi npt pod kontrolou merr-pmer v E. coli. plbhp: plasmid plbb9 obsahující oligonukleotid HP [plus řetězec] (GATCCAAGCTGGTCATCATCCACACGGTGCT, vložen jako BamHI-BglII fragment, [plus řetězec]), kódující peptid o sekvenci: AGHHPHGA pro vazbu iontů těžkých kovů. Expresní vektor pro E. coli. plbhp2: plasmid plbhp obsahující druhý oligonukleotid HP [plus řetězec] (GATCCAAGCTGGTCATCATCCACACGGTGCT, vložen jako BamHI-BglII fragment, [plus řetězec]), kódující peptid o sekvenci: AGHHPHGA pro vazbu iontů těžkých kovů. Expresní vektor pro E. coli. plbcp: plasmid plbb9 obsahující oligonukleotid CP [plus řetězec] (GATCCAGCAGGCTGCGGTTGTCCATGCGGTTGTGGCGCT, vložen jako BamHI-BglII fragment, [plus řetězec]), kódující peptid o sekvenci: AGCGCPCGCGA pro vazbu iontů těžkých kovů. Expresní vektor pro E. coli. plbhpcp: plasmid plbhp obsahující oligonukleotid CP shodně jako plasmid plbcp. Expresní vektor pro E. coli. p416gpd- p416gpd, vložen gen meta z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující P- ATPasu transportující ionty těžkých meta: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na kovů p416gpd-pbrt: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen pbrt z Cupriavidus metallidurans CH34 kódující transportér těžkých kovů p416gpd-mett: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen mett z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující sekvenční homolog pbrt p416gpd-meta/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen meta z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující P- ATPasu transportující ionty těžkých kovů na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) p416gpd-pbrt/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen pbrt z Cupriavidus metallidurans CH34 kódující transportér těžkých kovů na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) p416gpd-mett/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen mett z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující sekvenční homolog pbrt na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) V plasmidech je klonována: (1) bakteriální DNA (se selektovatelnými geny pro rezistenci k neo-, hygro-, phleo-, ampicilin-, tetracyklin, rifampicin, streptomycinu nebo kanamycinu. Druhou skupinu tvoří reporterové geny pro β-glukuronidasu (gus), luciferasu (luc) a zeleně fluoreskující protein (gfp)-viz dále. Není znám přímý účinek těchto genů na člověka, je možný jejich přenos do jiných bakterií, se kterými budou v kontaktu. Přenos by mohl navodit odolnost příjemců k antibiotikům. Pokud nedojde k havárii, taková interakce se nepředpokládá.

15 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 15/74 Nakládání se provádí v rozsahu, kdy se předpokládá možnost likvidace bakteriální kultury, která unikne z uzavřené nádoby. (2) DNA hub původ Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Amanita strobiliformis, Hebeloma mesophaeum a Russula atropurpurea Nepředpokládá se negativní vliv na člověka při úniku GMM mimo uzavřený prostor. (3) rostlinná DNA - DNA pochází z druhů, které se pokládají za bezpečné z hlediska ochrany zdraví člověka a vyskytují se běžně v životním prostředí: Nepředpokládá se klonování genů, jejichž produkty jsou toxické. Nepředpokládá se negativní vliv na člověka při úniku GMM mimo uzavřený prostor vlivem vneseného transgenu. (4) živočišná DNA. Transgen pro zeleně fluoreskující protein (GFP) pochází z genomu medusy Aequorea victoria, gen pro luciferasu ze světlušky Photinus pyralis. (Luc). S genem se široce pracuje v laboratořích genového inženýrství a nepředpokládá se negativní vliv na biodiverzitu, přírodní prostředí, zdraví lidí nebo zvířat. (5) do vektorů odvozených od pet, ptriex či pgemex jsou vnášeny geny kódující pouze strukturní proteiny retrovirů M-PMV (Mason-Pfizerův opičí retrovirus), HIV-1 (virus lidské imunodeficience typu 1) či RSV (Rousova ptačího sarkomu) či jejich části a jejich modifikace. Jedná se o tyto strukturní proteiny: Gag - strukturní retrovirový polyprotein, CA kapsidový protein, CANC kapsidový a nukleokapsidový (NC) protein, umístěné ve fúzi, MACANC matrixový protein (MA) ve fúzi s CANC, p12canc protein p12 ve fúzi s CANC, PSMACANC a MODCANC proteiny CANC modifikované doménami zodpovědnými za interakce proteinu s příslušnými cílovými buňkami, CANCZif a CANCTramtrac - proteiny CANC modifikované krátkými doménami zodpovědnými za interakce proteinu s nukleovými kyselinami. Jelikož ve všech případech jsou do vektorů vnášeny pouze geny kódující strukturní proteiny virové schránky, které ani samy o sobě nejsou nijak nebezpečné, toxické, či infekční, nepředstavuje nakládání s organismy nesoucími tyto geny žádné riziko. (6) Na Ústavu biotechnologie je do vektorů vkládán syntetický gen pro vepřový trypsinogen. Pro uvedený gen ani jeho fragmenty nebyly popsány a nelze předpokládat žádné škodlivé působení na zdraví člověka, zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost. Inserty jsou získávány restrikčním štěpením DNA dárců. Inserty neobsahují žádné části, jejichž funkce není známa. Sekvence obsažené v insertu se přímo nepodílejí na patogenních vlastnostech dárcovského organismu. Vnesení insertu do vektoru bude prováděno ligací DNA. Závěr: Vzhledem k výše uvedeným faktům jsou experimenty hodnoceny jako prvá (I) a druhá kategorie rizika (II).

16 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 16/74 Agrobacterium sp. Charakterizace recipientního organismu: Prokaryota, Gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinka, nesporulující Čeleď: Agrobacterium Vyskytuje se v přírodě (půdní bakterie), infikuje řadu rostlinných druhů na poraněných místech indukuje proliferaci útvarů podobných tumorům. Kmeny: A. tumefaciens: LBA 4404, C58CI, GV3101, LBA9402 a EHA105 A. rhizogenes: 15834, 8196, A4, HR1, TR7, TR101. Obsahující plasmidy s rekombinantní DNA slouží k transformacím rostlin. Přehled hlavních vektorových plasmidů v bakteriích Agrobacterium tumefaciens pbi121 (bakteriální gen pro rezistenci ke kanamycinu pbinm (bakteriální gen pro rezistenci ke kanamycinu, signální gen pro zeleně fluoreskující protein GFP) mgfp4-er, dále novější mgfp5 až mgfp8 (sekvence pro mgfp a bakteriální gen pro rezistenci ke kanamycinu) pgreenii vektor pro transformaci rostlin s resistencí ke kanamycinu, promotorem CAMV 35S pqe31 vektor nesoucí geny bph operonu, resistenci k ampicilinu ppcv gen pro resistenci k ampicilinu, nesoucí GUS, nebo LUC psoup pomocný vektor pro replikaci pgreen ppcv: Agrobakteriální vektory řady, plasmidy na basi Ti plasmidu bakterie Agrobacterium upravený pro klonování Konz C. a kol. (1994) prok2 nese resistenci ke kanamycinu pac161 nese resistenci k sulfonamidu prok2 binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu (Baulcombe et al., 1986) pac161 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen sul1 pro rezistenci k sulfonamidu (Rosso et al., 2003) pcgn1549 (Calgene) - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen pro rezistenci ke gentamycinu (McBride, Summerfelt, 1990) phannibal (CSIRO) hairpin RNAi vektor pro tvorbu rostlinných hairpin RNAi sekvencí nesoucí gen pro rezistenci k ampicilinu (Wesley et al., 2001) part27 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu a gen pro rezistenci ke spektinomycinu (Gleave, 1992) pnov2819, pbract209 phg/psilbaγ vector system: sestává z vektorů psilbaγ a binárního vektoru phg pro konstruci T-DNA s hairpin ihprna nebo konstitutivné expresi transgenu v houbách transformovaných prostřednictvím A. tumefaciens (Kemppainen a Pardo, 2010). Hodnocení možných škodlivých účinků nakládání s geneticky modifikovaným organismem ve spojení s příjemcem Riziko podmíněné recipientním organismem: