Provozní řád Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha pro práci s geneticky modifikovanými organismy (GMO) v uzavřeném prostoru

Transkript

1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 1/19 Provozní řád Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha pro práci s geneticky modifikovanými organismy (GMO) v uzavřeném prostoru a) Identifikační údaje uživatele podle 6, odst. 1, písm a) a b) zákona. Název organizace: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Veřejná VŠ. Sídlo a identifikační číslo uživatele: Technická 3-5, Praha 6, PSČ , IČO: , karel.melzoch@vscht.cz Rektor: Prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. b) Identifikační údaje vlastníka budovy nebo pozemku Vlastník je totožný s uživatelem. c) Jméno, příjmení, trvalý pobyt, tel. číslo, fax a adresa elektronické pošty odborného poradce prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc., tel.: , Fax: , demnerok@vscht.cz, domácí adresa: Nušlova 2277/19, Praha 5 d) Kategorie rizika nakládání s geneticky modifikovaným organismem, které smí být na pracovišti prováděno Kategorie rizika I a II. e) Odpovědná osoba za provoz pracoviště: prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc., tel.: , Fax: , demnerok@vscht.cz f) Charakter, účel, popis technických prvků, zajišťujících uzavření prostoru, pokud se jedná o uzavřené nakládání Jednotlivé laboratoře jsou uzavřeny dveřmi bez kliky (s koulí), přístup je omezen na pracovníky a studenty ÚBM. Kultivační místnosti a mrazicí boxy, chladová místnost a autoklávovna jsou trvale uzamčeny. Klíče mají ti pracovníci ústavu ze seznamu v bodu h), kteří dané prostory využívají. Evidence klíčů je vedena klíčovým režimem ústavu. Podlahy v laboratořích jsou resistentní vůči agresivním chemickým látkám a mají protismykovou úpravu, laboratorní stoly jsou pokryty dřevotřískovou deskou s vrstvou laminátu, u kterého výrobce WESTAG + GETALIT AG zaručuje odolnost vůči oděru a kyselinám (atest k dispozici u pí. Pazderové, lab. č.v04), některé laboratoře jsou vybaveny lepivými rohožemi. Pro likvidaci všech materiálů, používaných v laboratořích se statutem nakládání s GMO se užívají tlakové parní sterilátory, které jsou umístěny v místnosti č.250 a BY12. g) Seznam a popis závazných pracovních postupů, užívaných na pracovišti Na pracovišti se provádí vědecko-výzkumná a pedagogická práce. Základní přístupy spočívají v konstrukci plasmidových vektorů (nesoucích retrovirové inserty, geny pro strukturní proteiny, osmotin, caleosin, biodegradační geny, geny pro vazbu těžkých kovů, geny pro galaktosidasa, nukleasy a geny pro rostlinné fosfolipasy D) pro transformaci organismů. Dále se na pracovišti provádí transformace rostlinných buněk bakteriemi A. tumefaciens, která nesou plasmidové vektory a detekce přítomnosti transgenů v transgenních rostlinách, detekci projevu transgenů v transgenních rostlinách a řadě dalších činností, souvisejících s využitím

2 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 2/19 transgenních rostlin k řešení vědeckých problémů. Jedná se tedy o využití mnoha typů převážně nových a průběžně vyvíjených konstruktů DNA, obsahujících různé transgeny k transformaci rostlin. V souvislosti s problematikou degradací jsou na pracovišti prováděny různé testy na určení toxicity a genotoxicity látek. Pro primární screening genotoxicity se používá Amesův test využívající mikroorganismus Salmonella typhimurium His-. Test genotoxicity je založen na stanovení počtu revertantů vznikajících v souvislosti s přítomností mutagenu. K dispozici je několik kmenů Salmonella typhimurium His-, lišících se dalšími mutacemi (delece, inzerce, posunové mutace) histidinového operonu, které odpovídají působení určitých látek. Seznam závazných pracovních postupů: metody kultivace a nakládání s vektorovými bakteriemi metody transformace bakterií, kvasinek, rostlin metody kultivace a nakládání s geneticky modifikovanými bakteriemi, kvasinkami, rostlinami, metody izolace nukleových kyselin a plasmidů z transgenních organismů metody detekce transgenů a stanovení jejich exprese v bakteriích, kvasinkách, rostlinách postupy dekontaminace pracovních ploch a nástrojů po ukončení práce postupy inaktivace geneticky modifikovaných bakterií, rostlin, kvasinek postupy stanovení genotoxicity Amesovým testem postupy detekce estrogenní aktivity způsoby nakládání s odpady Výše uvedený základní seznam lze rozšířit o isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílenou mutagenezi, o vnášení specifických transgenů do mikrobiální a rostlinné DNA klasickou transformací nebo elektroporací, či vakuovou infiltrací, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA, stanovování a detekce exprese transgenů, Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýzy produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky, měřením enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, RT-PCR, TGGE, sekvenování, restrikční analýza. Všechny postupy užívané na pracovišti representují standardní postupy uvedené v běžných manuálech typu: Current Protocols in Molecular Biology (John Willey & Sons Inc.). Metodické postupy se obměňují podle typu materiálu a cílů pokusů a jsou stále inovovány podle nových údajů v odborné literatuře a invence vědeckých pracovníků. Každý pracovník vede podrobné laboratorní protokoly obsahující údaje o konstruktu, dárci i příjemci dle předpisu ústavu tak, aby bylo možné kdykoli rekonstruovat průběh pokusu. Nejčastěji užívané vektory: Při transformacích mikroorganismů a savčích buněk se využívají běžné komerčně dostupné plasmidy: GE Healthcare: pezz 18, puc 18/19 Clontech: pbi121, pgadt7, pgbkt7, pac, pdsred1n1, pcmvcmyc, Invitrogen: pcrii, prsetb, ppicza, ptrchis, pyes2, pegfp, pcr3.1, pcr2.1- TOPO, pcrii-topo, pcr4-topo Novagen: vektory řady pet (pet 22b, pet-16b, pet19-b), pt7blue

3 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 3/19 New Englan Biolabs: pmal-p2x, pmal-c2x, ptyb4, pduet Agilent Technologies: pbluescript II SK (+/-),pbluescrpt II KS(+/-),Uni-ZAP XR Amersham Pharmacia Biotech: puc 18/19, pezz 18,, pgex-4t-2, pgex-4t-1 Addgene: pbb131, pt2/hb Promega: pgemex, psi, pgem-t Easy, Qiagen: expresní vektory řady pqe, pep31 pgreen II binární vektor pro klonování do rostlin ( Stratagene: Lambda FIX II Stratagene: Lambda FIX II Stratagene: Uni-ZAP XR Promega ptriex-4: klonovací vektor pro expresi vnesených genů v bakteriálních, kvasinkových či živočišných buňkách, pod promotory pcmv, p10 a T7, produkt firmy Novagen, komerčně dodán firmou Merck pgemex-2: klonovací vektor pro expresi genů v bakteriálních buňkách pod kontrolou T7 promotoru, produkt firmy Promega piv1 - plasmid Impact Vector I (Plant Research International, Nizozemí), obsahuje: RbcS kazetu s promotorem i polyadenylačním signálem malé podjednotky enzymu RUBISCO z rostliny Chrysanthemum morifolium, gen pro rezistenci k ampicilinu v bakteriích pnov U.S. Patent Nos. 5,767,378 a 5,994,629 (Syngenta, Švýcarsko), rostlinný vektor, T-DNA obsahuje gen pmi pro fosfomannosaisomerasu v kazetě s promotorem CMPS a nos polyadenylačním signálem pbract209 binární vektor pro klonování do rostlin ( plexa-n, plexa-c Dualsystems Biotech pgreen 0029, 0129 binární vektor pro klonování do rostlin (Hellens et al., 2000) pk7gwf2 - binární vektor pro klonování do rostlin ( (Andreeva et al. 2009, Karimi et al. 2002) p2rgw7- expresní vektor užívaný pro transientní expresi v rostlinách ( (Andreeva et al. 2009) p2fgw7- expresní vektor užívaný pro transientní expresi v rostlinách (Andreeva et al. 2009) pdrive klonovací vektor Qiagen, Qiagen Cloning Kit Plus (No: ) pcdna3, pegfp-c1, PEGFP-N1 - Invitrogen pmaxgfp - Lonza pcmvha - Clontech ppicza-alfa Life Technologies, vektor pro expresi genů v kvasinkách psoup plasmid pro kotransformaci agrobakteriálních buněk plasmidem pgreen, tento plasmid zajišťuje replikaci plasmidu pgreen v agrobakteriálních buňkách, zdroj: Vektory určené pro klonování do rostlin: ppcv: Agrobakteriální vektory řady, plasmidy na basi Ti plasmidu bakterie Agrobacterium upravený pro klonování Konz C. a kol. (1994) pbi121 nesoucí resistenci ke kanamycinu a CAMV 35S promotor

4 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 4/19 pbiαmt -plasmid pbi121 s krátkou sekvencí genu pro lidský metalothionein pbicp -plasmid pbi121 s krátkou sekvencí genu pro CP peptid ppcvr-tx34 (rezistence k hygromycinu, p35s,určeno k inzerční mutagenezi rostlin pbinm - bakteriální gen pro rezistenci ke kanamycinu, gen pro zeleně fluoreskující protein GFP prok2 binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu (Baulcombe et al., 1986) pgreenii- nesucí pac161 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen sul1 pro rezistenci k sulfonamidu (Rosso et al., 2003) pcgn1549 (Calgene) - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen pro rezistenci ke gentamycinu (McBride, Summerfelt, 1990) phannibal (CSIRO) hairpin RNAi vektor pro tvorbu rostlinných hairpin RNAi sekvencí nesoucí gen pro rezistenci k ampicilinu (Wesley et al., 2001) part27 - binární vektor pro klonování do Agrobacteria tumefaciens nesoucí gen nptii pro rezistenci ke kanamycinu a gen pro rezistenci ke spektinomycinu (Gleave, 1992), pro něž jsou k disposici jejich kompletní sekvence včetně údajů o regulačních sekvencích a selekčních markerech ve firemních materiálech. Další nekomerční vektory p416gpd: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r, ColE1 ori, CEN6/ARS4 ori, URA3 +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995). p426gpd: E. coli-s. cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995) p416adh: E. coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r, ColE1 ori, CEN6/ARS4 ori, URA3 +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995) p426adh: E. coli-s. cerevisiae shuttle expresní vektor, Ap r +, GPD promotor S. cerevisiae, CYC1 terminator. (Mumberg a kol., 1995) pjms11: vektor umožnující v G - bakteriích jednu transpozici klonovaného elementu do genomu jako součásti mini-tn5, Ap r, Km r, R6K ori, orit, tnp (transposasa), xyle (katechol 2,3-dioxygenasa) (Panke a kol., 1998). plbb9: plasmid nesoucí lamb-153 pod kontrolou laktosového promotoru, Cm r, oriv psc101 (Cebolla et al., 1996). ptoo11: Km r, Cm r, E. coli-bacillus subtilis shuttle vektor, mer promotor a merr z transposonu Tn21 inzerovány před lucff gen z Photinus pyralis pro luminiscenční detekci Hg 2+. Reference: Virta a kol., 1995 [Virta, M., Lampinen, J., Karp, M pma_ap::bglu PRO: syntetizovaný bakteriálni plasmid s ampicilinovou rezistencí a kořenovým promotorem genu bglu získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie). ptoo21: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, ars promotor a arsr z plazmidu pi258 ze Staphylococcus aureus inzerovány před lucff gen z P. pyralis pro luminiscenční detekci ionů antimonu a arsenu. Reference: Tauriainen a kol., 1997 [Tauriainen, S., Karp, M., Chang, W., Virta, M Appl. Envirion. Microbiol. 63: ]. ptoo24: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, cad promotor a cadc z plazmidu pi258 z S. aureus inzerovány před lucff gen z P. pyralis pro luminiscenční detekci Cd 2+.

5 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 5/19 Reference: Tauriainen a kol., 1998 [Tauriainen, S., Karp, M., Chang, W., Virta, M Biosens. Bioelectron. 13: ]. ptoo31: Km r, Cm r, E. coli-b. subtilis shuttle vektor, ars promotor a arsr z plazmidu R773 z E. coli inzerovány před lucff gen z P.pyralis pro luminiscenční detekci ionů antimonu a arsenu, Reference: Tauriainen a kol., 1999 [Tauriainen, S., Virta, M, Chang, W., Karp, M Anal. Biochem. 272: ]. p416gpd-meta: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen meta z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující P- ATPasu transportující ionty těžkých kovů p416gpd-pbrt: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen pbrt z Cupriavidus metallidurans CH34 kódující transportér těžkých kovů p416gpd-mett: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen mett z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující sekvenční homolog pbrt p416gpd-meta/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen meta z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující P-ATPasu transportující ionty těžkých kovů na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) p416gpd-pbrt/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen pbrt z Cupriavidus metallidurans CH34 kódující transportér těžkých kovů na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) p416gpd-mett/egfp: Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle expresní vektor založen na p416gpd, vložen gen mett z Achromobacter xylosoxidans A8 kódující sekvenční homolog pbrt na svém 3 -konci ve fúzi s genem kódujícím EGFP (enhanced green fluorescent protein) pma_ap::bglu PRO/ATF3 H: syntetizovaný bakteriálni plasmid s ampicilinovou rezistencí a kořenovým promotorem genu bglu získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie) s vloženým genem ATF3 H pro flavonoid-3 hydroxylasu z A. thaliana. pcmvha-neo, upravený komerční vektor pcmvha (Clontech), do kterého je přidán gen resistence na neomycin pdb31 expresní vektor používaný v bakteriích (prof. M. Sylvestre, INRS, Kanada, Barriault & Sylvestre, 1999) pcrii-topo::atf3 H: bakteriálni plasmid s vloženým genem ATF3 H pro flavonoid-3 hydroxylasu z A. thaliana získán od Doc. P. Galuszky (Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav Biochemie). pg1/er(g) YipEREluc kvasinkový vektor s vloženým genem herα (lidský estrogenní receptor), ERE (estrogenní responsivní element) a Luc (luciferasa). Na pracovišti není nakládáno s izolovaným plasmidem, pouze s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae BMAEREluc/Erα obsahujícícmi tento vektor, získáno od Dr. Tomáš Cajthaml, MBÚ, AVČR, Praha. prs316luc - kvasinkový vektor s vloženým genem Luc (luciferasa). Na pracovišti není nakládáno s izolovaným plasmidem, pouze s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae BMA64/luc obsahujícícmi tento vektor, získáno od Dr. Tomáš Cajthaml, MBÚ, AVČR, Praha.

6 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 6/19 pcb302 - binární vektor, do kterého byl vložen inzert GFP-fABD2 a transformovány rostliny A. thaliana (Voight et al., 2005) pcglobin2-sb100x - vektor s vloženým genem pro transponasu Sleeping Beauty 100x. Obsahuje gen pro rezistenci k ampicilinu. Získáno od Dr. Michala Pravence, FGÚ, AV ČR, Praha. (Ro H. et al., 2004). Příjemci Bakterie: Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Pseudomonas fluorescens Pseudomonas alcaligenes Salmonella typhimurium Alcanivorax borkumensis Mycobacterium smegmatis Kvasinky: Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Geneticky modifikované houby ektomykorhizní houba Hebeloma mesophaeum ektomykorhizní houba Amanita strobiliformis Buněčné linie: buněčná linie HeLa ATCC CCL-2 buněčná linie COS1 ATCC CRL-1650 buněčná linie COS7 ATCC CRL-1651 buněčná linie CV1 ATCC CCL-70 buněčná linie Sf9 ATCC CRL-1711 Sf21 Clontech LNCaP lidské prostatické rakovinné buňky buněčná linie HaCaT CLS (cell line service), cat. no buněčná linie KU-812 DSMZ, cat. no. ACC 378 buněčná linie MEF ATCC SCRC-1040 buněčná linie HL-60 ATCC CCL-240 buněčná linie PC-3 ATCC CRL-1435 buněčná linie SY-5HY ATCC CRL-2266 buněčná linie CAPAN-2 ATCC HTB-80 buněčná linie BxPC-3 ATCC CRL-1687 buněčná linie MiaPaCa-2 ATCC CRL-1420 buněčná linie DBS-FRHL ATCC CL-160 buněčná linie LNCaP ATCC CRL-1740 buněčná linie HOS ATCC CRL-1543

7 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 7/19 buněčná linie 3T3-L1 ECACC Fao Linie potkaních hepatocytů odvozená z linie H4-11-E-C3 HepG2 ECACC buněčná linie U-2 OS ATCC HTB-96 buněčná linie PA-TU-8902 DSMZ ACC 179 buněčná linie HEK 293T DSMZ ACC 305 buněčná linie JURKAT DSMZ ACC 282 buněčná linie NIH/3T3 ATCC CRL-1658 buněčná linie U-937 ATCC CRL buněčná linie T98G ATCC CRL-1690 buněčná linie U-87 MG ATCC HTB-14 buněčná linie IMR-32 ATCC CCL-127 buněčná linie GIMEN CLS buněčná linie Kelly General Cell Collection buněčná linie MCF-7 ATCC HTB-22 buněčná linie C2C12 ATCC CRL-1772 buněčná linie L-929 ATCC CCL-1 buněčná linie RAW264.7 ATCC TIB-71 buněčná linie CHO-K1 ATCC CRL-9618 buněčná linie 3T3-L1 MBX ATCC CRL-3242 buněčná linie MDBK ATCC CCL-22 buněčná linie HDF Sigma-Aldrich N buněčná linie SKBR3 ATCC HTB-30 buněčná linie HepG2 ECACC buněčná linie HEK 293T DSMZ ACC 305 buněčná linie HEK 293 ATCC CLR-1573 buněčná linie A549 ATCC CCL-185 buněčná linie A431NS ATCC CRL-2592 buněčná linie PE/CA-PJ34 (clone C12) ECACC buněčná linie HT ATCC CRL-2260 buněčná linie CHO ECACC buněčná linie MDA-MB-231 ATCC HTB-226 tkáňové kultury odvozené z transgenních myší - model MAC-PPARg KO myši Rostliny: Huseníček Thallův (Arabidopsis thaliana) Len setý (Linum usitatissimum) Tabák (Nicotiana sp.) Kopřiva dvoudomá (Urtica dioica) Ječmen setý (Hordeum vulgare L.) h) Seznam pracovníků proškolených pro práci s GMO na pracovišti je k dispozici u odborného poradce Prof. Kateřiny Demnerové.

8 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 8/19 V rámci přípravy odborníků schopných nakládat s GMO je seznam průběžně doplňován studenty doktorského, bakalářského (bakalářské práce) a magisterského programu (diplomové práce). Přenos a převoz kultur Při přenosu kultur GMO z kultivačních místností do laboratoří je situace řešena v závislosti na objemu kultury. Malé objemy jsou přenášeny v plastikových uzavřených obalech, velké objemy v přepravkách překrytých alobalem. Podobně při přenášení kultur a materiálu z laboratoří k likvidacím autoklávováním do k tomu určeným místnostem 250 nebo BY12 jsou malé objemy, kultury na plotnách nebo použité plasty přenášeny v plastikových koších s piktogramem biohazard, větší objemy v uzavřených lahvích a baňkách jištěných v přepravce nebo vozíku označených piktogramem biohazard a překrytých folií. Přenášený a převážený rostlinný materiál je neprodyšně uzavřen v plastových nebo plechových nádobách (obalech) a označen značkou Biohazard. Pokud je materiál přepravován vozem, automobil je označen nápisem Biohazard a v autě je k disposici popis přepravovaného materiálu a obecné instrukce, jak postupovat s uzavřeným kontejnerem obsahujícím transgenní materiál (neotvírat, dopravit na ÚBM VŠCHT). Vědečtí pracovníci mají k dispozici genové mapy a sekvence insertů, s nimiž pracují a v případě úniku lze těchto znalostí využít pro monitorování případného úniku transgenu a následnou likvidaci a asanaci (viz. Příloha 3 Nakládání: Havarijní plán Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha pro práci s GMO, odstavec k) Metody pro izolaci prostor a zařízení zasažených havárií, včetně metod kontroly účinnosti izolace). Studenti v laboratořích ÚBM VŠCHT pracují pod dohledem odpovědných zaměstnanců, před nástupem do laboratoří jsou studenti nakládající s GMO proškoleni a následně pravidelně doškolováni (1x ročně). Plastikové koše, přepravky i vozíky, ve kterých jsou kultury přenášeny či převáženy, jsou od května 2015 zařazeny do systému kontrolujícího čistotu pracovních ploch pověřenými proškolenými pracovníky s četností třikrát ročně (viz. Odstavec m tohoto dokumentu), prostřednictvím těchto kontrol je monitorováno i případné neúmyslné rozlití kultur při transportu. i) Výčet a přibližné množství geneticky modifikovaného organismu nebo produktu, se kterým bude na pracovišti nakládáno Rostliny a vektorové bakterie pro jejich transformace: V případě vektorových bakterií E. coli, Agrobacterium a Mycobacterium pro modifikace se bude pracovat v různých laboratořích najednou, a to přibližně s kulturami o objemu 3 ml a 5 kulturami o objemu 1 litru. Veškeré bakteriální kultury budou okamžitě po použití buď likvidovány, nebo k dlouhodobému udržování budou zamraženy ve 40% glycerolu při - 80 o C. S dalšími druhy bakterií a kvasinkami se bude nakládat v mnohem menším množství, při dlouhodobému udržování budou zamraženy ve 40% glycerolu při -80 o C. Agarové kultury vektorových organismů jsou vedeny jen v omezené míře (do 10 ks zkumavek) a dočasně (po několik týdnů). Buňky savčích linií jsou kultivovány v tekutých mediích řádově 300 ml/měsíc, kdy 1ml obsahuje 10 5 buněk. Veškeré nepotřebné linie savčích buněk jsou okamžitě po použití buď likvidovány, nebo k dlouhodobému udržování jsou zamraženy při -80 o C. V případě rostlin budou transformovány části nebo celé rostliny (popřípadě již předpěstovaná kalusová/explantátová kultura ve stejném množství), které se transformují revitalizovanou kulturou bakterií Agrobacterium v objemu 20 ml. Po provedení transformačních experimentů jsou veškeré revitalizované kultury bakterií inaktivovány v autoklávu. Předpokládaný objem

9 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 9/19 potenciálně transgenního rostlinného materiálu vyprodukovaného za 1 rok v celkovém rozsahu představuje maximálně cca in vitro jedinců (nezávisle získaných regenerantů, z nichž pouze menší část, cca. 1/10, je transgenních. Takové pokusy (selekce) in vitro probíhají obvykle po částech (do 50 ks Petriho misek) a jen po několik týdnů. Pouze malá část rostlinného materiálu, ve kterém byla prokázána přítomnost transgenů/ jejich exprese (ostatní materiál bude inaktivován v autoklávu), bude dále udržována a klonována. Většina takto získaného materiálu (in vitro klonů) bude v rámci řešených projektů předávána spoluřešitelským pracovištím (Agritec, ÚOCHB) k další kultivaci a analýzám. Eventuální převod do zeminy a pěstování v uzavřeném režimu GMO skleníku bude po dohodě probíhat na UEB AV ČR v Praze. j) Organizační a technologické zajištění pracoviště Organizační zajištění pracoviště je dáno statutem VŚCHT Praha a strukturou Ústavu biochemie a mikrobiologie a jeho rozdělením na jednotlivé laboratoře. V laboratořích V04 a V05, kde se bude pracovat s bakteriemi a rostlinami, je umístěna elektroforesa, zdroj na elektroforesu, iluminátor, termocycler pro PCR, 2 odstředivky, flow-box- Biohazard, TGGE, analytické váhy, laboratorní třepačka, inkubační box na mikrozkumavky, spektrofotometr, luminometr, vodní lázeň, míchadlo lednice a mrazicí box. V těchto laboratořích probíhá kultivace mikrobiálních buněk, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílená mutageneze, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních a rostlinných buněk, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, sekvenování, restrikční analýza. V laboratoři V06 je laboratorní ultracentrifuga, 2 flow-boxy-biohazard, CO 2 inkubátor, fluorescenční mikroskop Olympus. Zde probíhá kultivace tkáňových buněk, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, vnášení specifických transgenů tkáňových buněk transfekcí nebo elektroporací, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA, stanovení a detekce exprese transgenů. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, sekvenování, restrikční analýza. V laboratořích 237 a 239 jsou výše uvedené přístroje (viz V04, V05). V této laboratoři probíhá kultivace mikrobiálních buněk, savčích buněčných kultur, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílenou mutagenezi, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních a rostlinných buněk klasickou transformací nebo elektroporací, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA, stanovování a detekce exprese transgenů. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, sekvenování, restrikční analýza. V laboratoři 209 probíhá kultivace mikrobiálních buněk, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílenou mutagenezi, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních a rostlinných buněk klasickou transformací nebo elektroporací, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA, stanovování a detekce exprese transgenů. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, sekvenování, restrikční analýza. V laboratoři 211, je umístěn termocycler, odstředivka, elektroforesa a zdroj na elektroforesu. V této laboratoři probíhá kultivace mikrobiálních buněk, isolace plasmidové nebo

10 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 10/19 chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílená mutageneze, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních buněk, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, ověřováním enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin PCR, restrikční analýza. V laboratoři 207, je umístěna odstředivka, analytické váhy, laboratorní třepačka, elektroforesa a zdroj na elektroforesu, genové dělo pro transformaci rostlin. V této laboratoři bude probíhat příprava kultivace mikrobiálních buněk, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, izolace totální a mrna, reversní transkripce, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílená mutageneze, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních buněk, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA a biolistické metody pro transformaci rostlin a transientní expresi v rostlinách. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, ověřováním enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin PCR, restrikční analýza. Laboratoř 233a je místnost určená zejména ke kultivaci tkáňových kultur a buněčných linií a obsahuje veškeré potřebné vybavení. V laboratoři 234 je umístěn termocycler, odstředivka, elektroforesa a zdroj na elektroforesu. V této laboratoři probíhá kultivace savčích buněk, isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílená mutageneze, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních buněk, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, ověřováním enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin PCR, restrikční analýza. V laboratoři 129b probíhá klonování do bakteriálních a kvasinkových buněk. V této místnosti je umístěn termocycler, odstředivka, elektroforesa a zdroj na elektroforesu, flow-box. Jsou zde využívány metody isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílená mutageneze, vnášení specifických transgenů do mikrobiálních buněk, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA. Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýza produktu elektroforeticky, imunodetekcí, ověřováním enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin PCR, restrikční analýza. Místnost V03 a 232c je určena pouze pro kultivaci mikroorganismů a rostlin. V03 Je vybavena dvěma klimatizovanými kultivačními boxy (teploty 37 C a 28 C) a čtyřmi skříňovými orbitálními kultivátory s řízeným teplotním režimem. Kromě těchto přístrojů je zde umístěn výrobník ledu a destilační přístroj. V 232c jsou tři orbitální inkubátory, klimatizace, prostory na kultivaci rostlin. Místnost 250 (250A) je vybavena třemi autoklávy, dvěma horkovzdušnými sterilátory, třepačkou a destilačním přístrojem, v zadní části (250A) je umístěn fytotron pro kultivaci transgenních rostlinných kultur in vitro. Chladová místnost je umístěna samostatně a je určena nejen ke skladování kultur mikroorganismů, ale i pro práci s GMO, která vyžaduje teplotu okolo o C. V chodbě BY se nachází Zkušební laboratoř Ústavu biochemie a mikrobiologie (ZL ÚBM, místnosti BY05, BY06, BY07, BY09 a BY12), která je akreditovaná ČIA (Číslo subjektu:1316.3) a laboratoř forenzní analýzy (místnost BY04). Prostory laboratoří byly nově vybudovány a splňují všechny náležitosti pro práci s GMO, tzn. obsahují jednoosé a dvouosé laboratoře, vybavené chemickými stoly, digestoří a laminárními flow-boxy (třída Biohazard II) pro sterilní práci, v místnosti BY12 se nachází tlakový parní sterilátor používaný pro likvidaci materiálů, používaných v laboratořích umístěných na chodbě BY, se statutem nakládání s GMO. Vstupní dveře do chodby BY i dveře místností BY04, BY05, BY06, BY07, BY09 a BY12 jsou osazeny z vnější strany koulí a jsou trvale uzamčeny. Dveře prostorů, které oddělují veřejné prostory od chodby s laboratořemi, jsou uzavřeny. U dveří je nainstalováno automatické uzavírání. Dveře jsou z vnější strany opatřeny koulí,

11 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 11/19 ze strany laboratoří klikou. Otevírají se jednotným, nekopírovatelným univerzálním klíčem. Klíče od jednotlivých místností jsou vydány povolaným pracovníkům ÚBM VŠCHT (viz seznam) a studentům, kteří byli proškoleni o zásadách bezpečnosti práce s GMO a kteří pracují v prostorách ÚBM na svých diplomových a disertačních pracích pod metodickým vedením školitelů. Návštěvník se po uzavřených prostorách musí pohybovat v doprovodu proškoleného pracovníka. Před vstupem do prostor vyhrazených pro uzavřené nakládání s GMO si musí obléci plášť a musí být poučen o rizicích a pravidlech práce s GMO. k) Opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu podle 5 Veškeré předměty umístěné v laboratoři mohou být v případě požáru považovány za zbavené GMO (sterilace teplem). Pro případ vynášení předmětů kontaminovaných GMO během požáru mimo pracoviště musí vedoucí laboratoře rozhodnout o jejich likvidaci. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie řídí požárním a havarijním řádem l) Povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postup sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postup dekontaminace nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů). Stávající pracovníci a PGS studenti uvedení v seznamu pro jednotlivé laboratoře byli proškoleni na provádění všech metod uvedených v odstavci g) provozního řádu. Za dodržování pracovních postupů v jednotlivých laboratořích jsou zodpovědní příslušní vedoucí laboratoří. Školení budou pravidelně opakována. Po ukončení práce v laboratoři mají pracovníci povinnost zajistit bezpečné uložení biologického materiálu s transgenní DNA, otřít pracovní plochu chemickou desinfekcí (např. 0,5-1% roztokem chlornanu sodného). Použitý materiál s GMO určený k likvidaci bude sterilován v autoklávu 50 minut při 121 o C, přetlak 0,15 MPa. Postup dekontaminace nástrojů při ukončení pracovní činnosti se řídí podle charakteru činnosti a určuje jej vedoucí laboratoře. Ochranné oděvy kontaminované geneticky modifikovanými mikroorganismy se budou prát jako infekční materiál: samostatný sběr a oddělená izolovaná přeprava. Prostory laboratoří budou dle charakteru práce ozářeny germicididní lampou (přes noc). m) Systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření Kontroly čistoty pracovních ploch budou prováděny pověřenými proškolenými pracovníky s četností třikrát ročně: stěry-sledování výskytu používaných mikroorganismů a pomocí PCR metody bude detekován příslušný transgen, dle charakteru práce v dané laboratoři. U autoklávu určeném (místnost č.250 a BY12, fy Chirana PS121) pro likvidaci GMO budou pravidelně kontrolovány předepsané parametry pro bezpečnou sterilizaci externími servisními techniky a zaprotokolovány v provozní knize přístroje. Lednice a mrazáky určené pro uchovávání GMO jsou bezpečně uzamčeny a klíče jsou k dispozici u vedoucího příslušné laboratoře. Možnost výskytu přenašečů GMO (hmyz, hlodavci) je vyloučena zajištěním laboratoří, jejichž dveře a okna jsou trvale uzamčena nebo opatřené koulí. Laboratoře jsou klimatizované, okna jsou proti vniknutí hmyzu zajištěna síťkami. Zápis v Knize kontrol o každé kontrole bude parafován vedoucím příslušné laboratoře, odborným poradcem a vedoucím příslušné katedry. n) Povinnosti pracovníků při údržbě Za instruktáž pracovníků údržby o chování v laboratoři nakládající s GMO před jejich vstupem do laboratoře jsou odpovědni jednotliví vedoucí laboratoře. Při údržbářských pracích v prostorách laboratoří budou používat pláště se značkou Biohazard, které není možno

12 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 12/19 používat mimo laboratoře pro GMO. Jsou povinni dbát pokynů vedoucího laboratoře, v jehož prostorách údržbu provádějí. o) Zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních právních předpisů Ve všech prostorách vyhrazených pro práci s GMO platí interní předpisy Pravidla bezpečnosti práce v mikrobiologických laboratořích, se kterými jsou všichni pracovníci uvedení v bodě h) seznámeni. Pracovníci mají povinnost používat v prostorách pro práci s rekombinovanou DNA plášť se značkou Biohazard, které nepoužívají mimo laboratoře. p) Způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty, zejména postupy zneškodnění GMO a způsob kontroly jejich účinnosti Mikrobiální kultury i rostliny pěstované in vitro, jsou pěstovány v uzavřených nádobách (skleněných či plastových) tak, aby nedošlo k jejich úniku do prostředí. Baňky či plastové nádoby jsou umístěny na třepačkách (v případě mikroorganismů místnost V03) nebo na plastových tácech (v případě rostlin místnost 232c). GMO nejsou cíleně uváděny do prostředí. Rostliny jsou do zeminy a květináčů převáděny a pěstovány v určeném skleníku po dohodě na UEB AV ČR. Použitý materiál s GMO (mikroorganismy, rostliny) určený k likvidaci bude sterilován v autoklávu 50 minut při 121 o C, přetlak 0,15 MPa (v k tomu určených plastových pytlích). Plochy kontaminované GMO se budou ošetřovat vhodným desinfekčním roztokem (0,5-1% chlornanem sodný, 1% ajatinem apod.). Použité skleněné laboratorní nádobí a stejně tak i plastové špičky budou po použití vypláchnuty či ponořeny do desinfekčního roztoku a poté sterilovány autoklávováním. Ostatní materiál použitý v laboratoři bude likvidován sterilací (buničitá vata, filtrační papír, gumové rukavice apod.) Účinnost sterilačních procesů bude pravidelně kontrolována detekcí příslušného transgenu pomocí PCR. q) Seznam povinných pracovních pomůcek a prostředků pracovní ochrany s uvedením činností, ke kterým musí být používány V laboratoři určené pro nakládání s GMO musí pracovníci používat ochranný plášť (opatřený značkou Biohazard), ochrannou obuv, které se nesmí používat mimo určené laboratoře. Další ochranné pomůcky - gumové rukavice po práci s GMO a elektroforese DNA budou ukládány do speciálních plastových pytlů a likvidovány tlakovou sterilizací. r) Zakázané činnosti na pracovišti V laboratořích a prostorách pro práci s GMO je zakázáno jíst, pít a kouřit. V těchto laboratořích jsou povoleny pouze činnosti vymezené provozním řádem laboratoře v bodě g). s) Zásady vedení pracovních protokolů Každá činnost s GMO je zaznamenávána do pracovních protokolů každého pracovníka s vyznačením čísel stránek, data zápisu a poznámkou o způsobu likvidace nepotřebných GMO. t) Zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků Pro každý přístroj používaný v laboratoři je zřízena jednak evidence využívání přístroje kde bude uvedeno jméno pracovníka, datum, doba využití přístroje event. podmínky využití (teplota, tlak při sterilaci, teplota, otáčky při kultivaci apod.). Dále pak bude vedena evidence oprav, kalibrací a dalších zabezpečovacích prvků a postupů. Zvláštní záznamy budou

13 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 13/19 prováděny i o sanitaci přístroje. Evidenční sešity o využívání přístroje budou k dispozici u každého přístroje, ostatní evidence budou uloženy u vedoucího laboratoře. u) Opatření k zabránění vstupu nepovolaných osob Laboratorní prostory jsou rozděleny na funkční jednotky. Do každé jednotky je možný vstup pouze jedněmi dveřmi otevíratelnými klíčem. Klíče mají pracovníci, kteří v jednotce pracují. Studenti VŠCHT mají do nich přístup pouze ve speciálních pláštích označených značkou Biohazard, které jsou nošeny pouze v těchto prostorách. Pro konsultace a jednání jsou vyhrazeny klidové pracovny. Samotná budova je elektronicky chráněna a je evidován pohyb osob. v) Datum a číslo rozhodnutí o zapsání do seznamu uživatelů Původně do seznamu uživatelů s geneticky modifikovanými organismy bylo pracoviště Ústavu biochemie a mikrobiologie VŚCHT Praha zařazeno , poté na základě opětovné žádosti , , w) Údaj o případném časovém omezení platnosti provozního řádu Tento dodatek k provoznímu řádu platí do odvolání učiněného rektorem školy. Související zákony a předpisy Zákon o ochraně veřejného zdraví a o změně některých souvisejících zákonů 258/2000 Sb, účinný od , č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, zákon č. 346/2005 Sb., kterým se mění zákon 78/2004 Sb. o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty. Poučení: Tento Provozní řád VŚCHT Praha má 14 stran. Je zakázáno z něho vyjímat nebo vytrhovat listy podle paragrafu 19, písmeno b). prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc.- odborný poradce

14 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 14/19 Provozní řád Ústavu biotechnologie VŠCHT v Praze pro práci GMO v uzavřeném prostoru a) Identifikační údaje uživatele podle 6, odst. 1, písm a) a b) zákona. Název organizace: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze (veřejná vysoká škola) b) Sídlo a identifikační číslo uživatele: Technická 5, Praha 6, PSČ , IČ: , rse@vscht.cz. Rektor: Prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., mail: karel.melzoch@vscht.cz c) Identifikační údaje vlastníka budovy nebo pozemku Vlastník je totožný s uživatelem. d) Jméno, příjmení, trvalý pobyt, tel. číslo, fax a adresa elektronické pošty odborného poradce prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc., tel.: , Fax: , demnerok@vscht.cz, domácí adresa: Nušlova 2277/19, Praha 5 e) Kategorie rizika nakládání s geneticky modifikovaným organismem, které smí být na pracovišti prováděno Kategorie rizika I f) Odpovědná osoba za provoz pracoviště: Prof. Ing. Jan Masák, CSc. vedoucí pracoviště, tel.: , fax: , jan.masak@vscht.cz, g) Charakter, účel, popis technických prvků, zajišťujících uzavření prostoru, pokud se jedná o uzavřené nakládání Laboratoře pro uzavřené nakládání s GMO je uzavřena dveřmi bez kliky (s koulí). Klíče mají ti pracovníci ústavu, kteří dané prostory využívají (viz Seznam pracovníků proškolených pro práci s GMO bod k) a studenti, kteří v laboratoři pracují (viz Seznam osob proškolených pro práci s GMO průběžně doplňovaný, uložen v místnosti 119, budova A u Dr. Ing Paulové). Evidence klíčů je vedena klíčovým režimem ústavu. Podlahy v laboratoři jsou resistentní vůči agresivním chemickým látkám a mají protismykovou úpravu, laboratorní stoly jsou pokryty deskami, které jsou odolné vůči oděru a kyselinám, stěny a strop laboratoře je natřen omyvatelnou barvou. Pro likvidaci všech materiálů používaných v laboratoři se statutem nakládání s GMO se užívají tlakové parní sterilizátory, které jsou umístěny v místnostech č. 108 a S55C. h) Seznam a popis závazných pracovních postupů, užívaných na pracovišti Na pracovišti se provádí vědecko-výzkumná a pedagogická práce. Základní přístupy spočívají v expresi insertu v hostitelských buňkách, tj. kultivaci transformovaných mikroorganismů.. Bezpečnost provozu na pracovišti je zajištěna dodržováním Provozního řádu. Uchovávání GMO GMO používané na pracovišti jsou uchovávány v uzamčeném mrazicím boxu (- 70 C) v podobě glycerolových kryokonzerv v 1,5 nebo 2 ml Eppendorfových mikrozkumavkách

15 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 15/19 v řádně označeném kontejneru. Odpovědná osoba vede evidenci uložených GMO a jejich množství. GMO mohou být vyzvednuty z mrazicího pultu pouze se souhlasem odpovědné osoby za účelem provedení naplánovaného a schváleného experimentu nebo za účelem likvidace. Kultivace GMO Kultivace probíhá v kultivačních místnostech (laboratoř 117, I01, 115, K04). Před zahájením kultivace se pracovník přesvědčí, jestli je řádně zajištěno uzavření místnosti a jestli má připraveny všechny pomůcky a přístroje potřebné pro správný průběh kultivace a případnou likvidaci havárie (viz Havarijní plán). Pro účely experimentu mohou být GMO kultivovány na pevné půdě nebo použity k naočkování tekuté půdy. Očkování probíhá vždy v laminárním boxu s využitím drátěných očkovacích kliček nebo jednorázových špiček s filtrem ve spojení s mikropipetou. Zkumavky jsou řádně a pevně uzavřeny zátkami z buničité vaty nebo kovovými vršky s pérky a kultivovány v termostatu. Erlenmeyerovy baňky nebo zkumavky s tekutými půdami očkovanými GMO jsou řádně a pevně uzavřeny zátkami z buničité vaty a kultivovány v temperovaných třepačkách v odpovídajících pevných úchytech. Frekvence kmitů je nastavena tak, aby nemohlo dojít k nasáknutí tekuté půdy s GMO do zátky. Při kultivaci v bioreaktoru je inokulum vždy sterilně převedeno z Erlenmayerovy baňky do bioreaktoru, výstupní plyny jsou vedeny přes mikrofiltr Sartorius Midisart Růst GMO a charakter kultury je monitorován mikroskopováním vitálních preparátů, resp. monitorováním turbidity vzorku na spektrofotometru nebo stanovením sušiny. Jednorázové kyvety, špičky apod. jsou vyprazdňovány do uzavíratelných kontejnerů na tekutý biologický odpad naplněných dezinfekčním prostředkem Savo a po vylití odkládány do uzavíratelných pevných PE pytlů na biologický odpad. Mikroskopická sklíčka jsou po použití vcelku ukládána do uzavřeného kontejneru naplněného po okraj 70% etanolem. Bioreaktor i s celým obsahem je po ukončení kultivace sterilován v parním sterilizátoru po dobu 60 minut při 121 O C a přetlaku 0,15 MPa. Zpracování vzorků obsahujících GMO Vzorky obsahující GMO jsou zpracovány následujícími postupy: 1) fixací 70% etanolem pro účely dalšího barvení a mikroskopování, příp. zpracování průtokovou cytometrií, nebo 2) jsou odstředěny, odstředěné buňky jsou využity ke stanovení suché hmotnosti. Bezbuněčný supernatant je použit k dalším analýzám (např. stanovení enzymové aktivity, HPLC). Zpracování vzorku, případně jeho fixace probíhá v místnosti pro kultivace. Vzorky zpracované fixací 70% etanolem nebo sušením při 105 O C po dobu 4 hodin jsou dále považovány za neškodné, neobsahující GMO. i) Seznam pracovníků proškolených na práci na pracovišti: je k dispozici v místnosti 119. V rámci přípravy odborníků schopných nakládat s GMO je seznam průběžně doplňován studenty doktorského, bakalářského (bakalářské práce) a magisterského programu (diplomové práce). j) Výčet a množství GMO Kvasinka Pichia pastoris kmeny X33 a GS115 používané pro nadprodukci rekombinantních proteinů za účelem jejich následné purifikace, zdroj: Invitrogen. Bakterie rodu Clostridium

16 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 16/19 Bakterie Clostridium pasteurianum a Clostridium beijerinckii jsou použity k expresi proteinů Spo0A nebo ALB Bakterie E.coli V průběhu nakládání se odhaduje příprava především tekutých kultur jednotlivých kmenů o celkovém objemu přibližně 5 litrů při průměrné hustotě buněk /ml. Dále bude pracováno s Petriho miskami s jednotlivými rostoucími koloniemi GMO v přibližném počtu 200 misek. Na pracovišti bude prováděna pouze kultivace GMO, nikoli jeho příprava. k) Organizační a technologické zajištění pracoviště Organizační zajištění pracoviště je dáno statutem Ústavu biotechnologie. Laboratoře pro uzavřené nakládání s GMO jsou vybaveny veškerou přístrojovou technikou potřebnou pro pracovní postupy v rámci prováděných výzkumných projektů v souladu s předpisy pro uzavřené nakládání s GMO první kategorie rizika. Betonová podlaha je kryta omyvatelným PVC. Místnost je u stropu vybavena centrálně ovládanými germicidními UV-lampami, povrchy stolů a přístrojů jsou omyvatelné. l) Opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu podle 20 Veškeré předměty umístěné v laboratoři mohou být v případě požáru považovány za zbavené GMO (sterilace teplem). Pro případ vynášení předmětů kontaminovaných GMO během požáru mimo pracoviště musí vedoucí laboratoře rozhodnout o jejich likvidaci. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie řídí požárním a havarijním řádem. m) Povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postup sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postup dekontaminace nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů). Stávající pracovníci, PGS studenti a studenti uvedení v seznamu osob (bod k) byli proškoleni na provádění všech metod k uzavřenému nakládání s GMO. Seznam proškolených osob je průběžně doplňován. Za dodržování pracovních postupů v laboratoři je zodpovědný vedoucí dané laboratoře. Školení pro uzavřené nakládání s GMO budou opakována vždy při zahájení semestru, v případě potřeby častěji. Po ukončení práce v laboratoři mají pracovníci povinnost zajistit bezpečné uložení biologického materiálu s transgenní DNA, otřít pracovní plochu chemickou desinfekcí (např. 0,5-1% roztokem chlornanu sodného). Použitý materiál s GMO určený k likvidaci je sterilován v autoklávu minimálně 50 minut při 121 o C a přetlaku 0,15 MPa. Prostory laboratoří jsou ozařovány germicididní lampou (přes noc) nejméně jednou týdně. n) Systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření Kontroly výskytu GMO jsou prováděny pololetně a vždy neodkladně při pochybnosti o účinné kontrole výskytu GMO. Z povrchů a prostředí jsou odebírány vzorky, které jsou očkovány na selektivní agar (YPD) s obsahem zeocinu, protože rezistence k zeocinu je základním selekčním markerem, odlišujícím připravované GMO od výchozích kmenů a ostatních mikroorganismů. Správné nastavení podmínek pozitivní selekce je kontrolováno paralelním očkováním referenčního kmene GMO. V případě pozitivní kultivace je identita GMO potvrzena nebo vyvrácena PCR analýzou. U parních sterilizátorů určených pro likvidaci GMO budou pravidelně kontrolovány předepsané parametry pro bezpečnou sterilizaci externími servisními techniky a zaprotokolovány v provozní knize přístroje.

17 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 17/19 o) Povinnosti pracovníků při údržbě zařízení Za instruktáž pracovníků údržby o chování v laboratoři nakládající s GMO před jejich vstupem do laboratoře je odpovědná Dr. Ing. Leona Paulová, Ing. Irena Kolouchová, Ph.D. a Ing. Ivana Křížová. Při údržbářských pracích v prostorách laboratoře určené k uzavřenému nakládání s GMO jsou pracovníci provádějící opravy nebo údržby povinni dbát pokynů vedoucího laboratoře. p) Zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních právních předpisů Pracovníci jsou při práci v uzavřených prostorách povinni dodržovat zásady osobní hygieny se zřetelem k prevenci šíření GMO a prevenci profesionální infekce. Zejména jsou povinni: Používat osobní ochranné prostředky, zejména rukavice a svrchní ochranný oděv (plášť) Dodržovat závazné pracovní postupy podle bodu o) Provozního řádu Nádoby obsahující GMO otevírat pouze v očkovacím boxu Po ukončení práce si přímo v laboratoři důkladně umýt ruce s použitím mýdla V případě potřísnění pokožky (i podezření) pokožku bezodkladně osušit buničitou vatou, ošetřit postříkáním aerosolem nebo otřít 70% etanolem, nechat působit minimálně 3 min (příp. opakovat), pak důkladně umýt mýdlem V případě vniknutí do očí důkladně vypláchnout proudem vodovodní vody (min. 10 min) při odklopených očních víčkách a vyhledat lékařské ošetření. Před vypláchnutím vyjmout případné kontaktní čočky (do laboratoře s kontaktními čočkami vstupují pracovníci na vlastní riziko). V případě vniknutí do nosu vysušit tamponem z buničité vaty a vyhledat lékařské ošetření. V případě vniknutí do úst nebo polknutí vypláchnout důkladně nejméně 3 ústa vodovodní vodou a vyhledat lékařské ošetření. Nevyvolávat zvracení. Při podezření na slabé potřísnění ochranného pláště GMO jsou povinni plášť tentýž den bezodkladně po ukončení práce (při výrazném potřísnění ihned) odložit do nádoby pro shromažďování ochranných oděvů. Pracovníci jsou dále povinni dbát obecných pravidel bezpečnosti práce a dbát na bezpečnou manipulaci s hořlavinami a elektrickými přístroji. Umístění centrálního uzávěru plynu, hasicích přístrojů, hlavního vypínače přívodu elektrické energie a hlavního uzávěru vody je uvedeno v Plánku prostor pro uzavřené nakládání s GMO Související zákony a předpisy: Zákon o ochraně veřejného zdraví a o změně některých souvisejících zákonů, 258/2000 Sb, účinný od , Směrnice MZ ČSR hlavního hygienika ČSR č.46/1978 Sb. Hygienické předpisy o hygienických požadavcích na pracovní prostředí, reg. v částce 21/1978 Sb., ve znění směrnic MZ ČSR hlavního hygienika ČSR č.66/1985 Sb., Hygienické předpisy, reg.

18 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 18/19 v částce 16/1985 Sb., a ve znění výnosu MZSV ČSR hlavního hygienika ČSR č.77/190 Sb., Hygienické předpisy reg. v částce 9/1989 Sb. q) Způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty, zejména postupy zneškodnění GMO a způsob kontroly jejich účinnosti Použitý materiál s GMO určený k likvidaci bude sterilován v autoklávu minimálně 50 minut při 121 o C a přetlaku 0,15 MPa. Plochy kontaminované GMO se budou ošetřovat vhodným desinfekčním roztokem (0,5-1% chlornanem sodným, 1%-ním ajatinem apod.). Použité skleněné laboratorní nádobí a stejně tak i plastové špičky budou po použití vypláchnuty či ponořeny do desinfekčního roztoku a poté sterilovány autoklávováním. Ostatní materiál použitý v laboratoři bude likvidován sterilací (buničitá vata, filtrační papír, gumové rukavice apod.) Účinnost sterilačních procesů bude pravidelně kontrolována pomocí očkování na selektivní půdu obsahující zeocin. Odvoz deaktivizovaného odpadu je likvidován centrálně. r) Seznam osobních ochranných pracovních prostředků a dalších pomůcek Pracovníci používají při práci s GMO k osobní ochraně vždy jednorázové rukavice (latexové nebo nitrilové) a svrchní ochranný oděv (plášť). Používané pracovní pomůcky odpovídají závazným pracovním postupům a jejich použití je popsáno v bodě o) s) Zakázané činnosti na pracovišti V laboratořích a prostorách pro práci s GMO je zakázáno jíst, pít a kouřit, vpouštět do místností laboratoře návštěvy bez souhlasu vedoucího laboratoře, vpouštět do prostor laboratoře zvířata, pěstovat v nich rostliny a provádět jakékoli další činnosti, u kterých lze předpokládat riziko rozšíření GMO mimo určený prostor manipulace. V laboratořích jsou povoleny pouze činnosti vymezené Provozním řádem laboratoře. t) Zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků Evidence o provozu zařízení je vedena v následujících knihách takto: Provozní kniha V provozní knize jsou pracovníci povinni zaznamenávat chronologicky jednotlivé experimenty s GMO s uvedením následujících údajů: data nakládání, osoba(-y) provádějící nakládání, označení experimentu, stručná charakteristika a popis experimentu, podpis vedoucího, odkaz na podrobnější záznam experimentu v laboratorní dokumentaci pracovníka, který experiment provádí, případně údaje o jakýchkoli mimořádných událostech v průběhu experimentu a o jejich řešení s podpisem vedoucího příp. odpovědné osoby. Sanitační kniha V sanitační knize je osoba pověřená sanitací povinna zaznamenávat chronologicky jednotlivé provedené sanitace s uvedením následující údajů datum sanitace, způsob a rozsah provedení sanitace (použitý desinfekční prostředek, doba působení germicidních lamp), v případě mimořádné sanitace jméno a podpis