Volitelný předmět TEKSB: Techniky explantátových kultur

Transkript

1 Volitelný předmět TEKSB: Techniky explantátových kultur RNDr. B. Navrátilová, Ph.D. In vitro, axenická, sterilní, tkáňovákultura

2 Použitá literatura BajajY.P.S.: Somatic hybridizationin cropimprovement Callaway D. J., CallawayM. B.: Breeding OrnamentalPlants. Timber press, Oregon, 2000 George E.F.: Plant propagationby tissue culture. The technology. ExegeticsLimited, Edington, 1993 HallR. D.: PlantCell Culture Protocols.Humana Press, Totowa (NJ), 1999 Lindsey K.: PlantTissue Culture. Manual. Kluwer Academic Publishers, London, 1992 Novák F. J.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin. Academia, Praha, 1990 Ovesná J., Kučera L.: Otázky biologicko bezpečnosti GMO a mezinárodnízávazky ČR. Sborník ze semináře. VÚRV, Praha, 2004 Preťová A.: Embryogenéza vyšších rastlín v in vitro podmienkach. Veda, SAV, Bratislava, 1995 Smith R.H.: Plant Tissue Culture. Techniques and Experiments. Second Edition. Academic Press, 2000 Trigiano R.N., Gray D.J.: Plantdevelopmentand biotechnology. CRC Press, 2005

3 Historie explantátových kultur, EK 1756 Henri-LousDuhumel du Monceau tvorba hojivého kalusu buněčnáteorie H. Schleiden, T. Schwann I. Fáze : základní techniky EK II. Fáze prašníkovéa protoplastovékultury III. Fáze rozvoj genetického inženýrství a biotechnologie

4 I. fáze - historie 1902 GottliebHaberlant(něm.): totipotence buněk kultura isolovaných buněk listu (růst) x neúspěch (neznalost fytohormonů) 1904 E. Hannig: embrya ředkve 1906 Brown: embrya ječmene 1922 W. Kotte, W. J. Robbins: kultivace kořenových špiček ve sterilních podmínkách (hrách, kukuřice) 1925 F. Laibach: embryokultury v mezidruhovém křížení lnu 1934 P. White: médium (vitamíny, kvasničný extrakt), Lycopersicon, Nicotiana 1934 R. Gautheret: kalusy z kambia Acer, Ulmus, Robinia, Salix, médiums IAA 1937 P. Nobecourt: Daucus, 1. rostoucíkultura, pasážování, proliferace

5 I. fáze - historie 1941 J. Van Overbeecka kol.: embryokultury, kokosovémléko 1945 S.W.Loo: vzrostné vrcholy Asparagus 1948 ADENIN v kokosovém mléku 1955 C. Miller, F. Skooga kol.- extrakt z kvasničníhoextraktu derivát adeninu -KINETIN (cytokininy) 1961 C. Miller v endospermu kukuřice ZEATIN 1962 M -S médium (tabák) 25 x konc. Knop. roztok + vit. + cukry + regulátory 1963 G. Morel meristém rostlina (dříve i ozdravovánímeristémy) 1965 L S médium (tabák) 1968 B5 médium (sója) 1969 NN (androgenezetabák) 1965 V. Vasil, A. C. Hildebrant suspenzní kultury, buněčnékultury (tabák)

6 II. fáze - prašníkovékultury, tvorba haploidů 1963 T. Yamada a kol. - Tradescantiareflexa (haploidy) S. Guha, S.C. Maheswari -Datura, diploidizace kolchicin 1969 J. P. Nitscha kol. - Nicotiana 1973 J.P. Nitsch, Norrel mikrosporovékultury

7 II. fáze protoplastovékultury 1960 E. C. Cocking -1. enzymatická izolace protoplastů (Nicotiana) 1970 Kao, Keller, Miller sója (děleníprotoplastů) 1971 I.Takebe, G. Melchers, C. Labib-rostliny z mezofylových protoplastů tabáku 1972 P. S. Carlsona kol. somatickáhybridizace 1. mezidruhový hybrid Nicotiana 1978 G. Melchersa kol.-1. mezirodový hybrid pomato topato Solanumtuberosumx S. lycopersicum

8 III. fáze genetickéinženýrství a biotechnologie 1959 Brown Agrobacterium (půdní bakterie), tvorba nádoru Bonner- RNA polymerázy u rostlin, exprese genů 1974 Ti plasmid 1980 Ti plasmid do hostitelského geonomu Ti plasmid jako vektor cizorodé DNA 1985 využitíplasmidů E. coli pro genetickéinženýrství (Agr. je nosič pro jiné geny) 1986 inkorporace genů rezistence vůči herbicidům do zemědělských plodin rezistence vůči hmyzím škůdcům rezistence vůči virovým chorobám rezistence vůči chladu

9 Využití mikropropagace ozdravovánírostlin od viróz genová banka modifikace a zlepšenírostlin (netradiční šlechtitelské metody) in vitro opylování embryokultury, gynogeneze, androgeneze chování buňky cytologie, dělení, výživa, prim. a sek. metabolismus (suspenzní kultury) morfologie a patologie kultivovaných pletiv genetická modifikace rostlin - přenos DNA - GMO, inkorporace genů do genomu rostlin kryopreservace využitísekundárního metabolismu (alkaloidy)

10

11 Metody explantátovýchkultur Meristémové kultury Kalusové kultury Somatická embryogeneze Embryokultury Prašníkovéa mikrosporovékultury Protoplastové kultury a fúze + buněčné inženýrství (jen mitochondrie) Genetické manipulace -transformace

12 Práce s explantáty Vybavenálaboratoř sklo, plasty, chemikálie, přístroje termostat, lednice, autokláv, příprava médií) Laboratoř pro aseptickou práci -laminární box binokulárnílupa chirurgickénářadí Kultivační místnost světlo 16/8 den/noc, (lux ) teplota o C, termostaty, třepačky, inkubátory

13 Složení médií a příprava Anorganickésoli (makro a mikro) Rostlinnéregulátory Vitamíny (thiamin B1, pyridoxin B6, kys. nikotinováb3) Cukry (sacharosa, glukosa, maltosa, 2-5 %) Hexitoly (myo-inositol,manitol, sorbitol) AMK, amidy (L formy: glycin; tyrosin, arginin; glutamin, asparagin Antibiotika (endogenníkontaminace, transformace s Agrobacterium) Přirozenékomplexy (antioxidanty-kys.citronová, askorbová; kok. mléko, extrakty, kasein hydrolysat..) Zpevňující složka (tekutá- bavlna, filtr. papír x pevná-agar, agarosa, gelrit, phytagel) ph (5,5-6) Příprava média, sterilizace Kultivační nádobky

14 Složení vybraných médií Makroprvky(mmol): C, O, H, N, P, S, K, Mg, Ca Mikroprvky(µmol): Fe, B, Co, Cu, I, Mo, Mn, Zn

15 Růstové regulátory fytohormony

16 Růstové regulátory- fytohormony V nízkých koncentracích vyvolává fyziologickou, biochemickou nebo morfologickou reakci v místě vzniku nebo v místech, kam je transportován Určitý hormon může ovlivňovat více fyziologických jevů Stimulátory růst podněcují Inhibitory růst brzdící Nativní produkované rostlinami Syntetické (morforegulátory) vyrobeny průmyslově Organické sloučeniny, které po syntéze v jedné části rostliny jsou transportovány do jiné části rostliny, kde ve velmi malé koncentraci (1 mmol/l, 1 µmol/l) způsobují fyziologickou reakci

17 Základní rozdělení

18 Biosyntéza fytohormonů Schéma transportu fythormonů v rostlině

19 Růstové regulátory Cesty působeníhormonů: Proniknutído buňky a ovlivněnígenovéaktivity v jádře pomocíreceptorového systému v plasmatické membráně, ve spojenís dalšími přenašeči signálu uvnitř buňky Projevy celistvosti rostliny korelace polarita regenerace periodicita (denní, roční)

20 Auxiny Syntéza ve vzrostných vrcholech nadzemních částía mladých listech, v kambiu, v oplozeném vajíčku auxano = rostu, zvětšuji Went 1926 název auxin Izolována 1931 (IAA) Kys. β-indolyloctová z tryptofanu Kys. 4-chlorindolyloctová Kys. Β-indolylmáselná (syntetická) Kys. fenyloctová Kys. naftalenoctová -syntetická

21 Auxiny Transport- více bazipetálně Působení - mnohostranné stimulace dlouživéhorůstu buněk- plasticity b. stěny, plošný růst rychlost dělení stimulace růstu kořenů-větvení, tvorba adventivních kořenů zacelováníran při poranění apikálnídominance (brzdírůst postranních pupenů) vznik partenokarpických plodů zakořeňování řízků!! Ve vyšších koncentracích působítoxicky Seradex (IBA)

22 mění fotoperiodickou adaptaci rostlin!! Nepůsobítoxicky při vyšších koncentracích Gibereliny -GA Syntéza v mladých listech, klíčících semenech, kořenech 85 giberelinů GA v Japonsku Giberellafujikuroi(Fusariummoniliforme) Transport- všestranný lýko, xylém Působení stimulace růstu x retardanty růstu CCC, Phosphon, Paclobutrazol dlouživýrůst stonku klíčenísemen stimulace děleníbuněk (zkráceníg1 a S fáze) plasticita b. stěny zvýšení osmotického tlaku rušídormanci semen i pupenů zvětšeníogránů ( vinnáréva)

23 Vliv giberelinuna životní pochody v rostlině

24 Cytokininy Syntéza v kořenových špičkách, kořenech, nadzemní části- mladé listy Transport - rozváděny xylémem (transpiračníproud) 1955 kinetin (syntetický) Působení zrychlení buněčného cyklu podmíněno přítomnosti auxinu stimulují metabolismus rostlin (RNA, proteosyntézu) tvorba pupenů rušíapikálnídominanci zpomalení projevu stárnutí chrání membrány před degradací stimulace klíčení semen (nahrazujívliv nízkých teplot) zeatin, benzyladenin, adenin

25 Vliv cytokininů na životní pochody v rostlině

26 ABA: Kyselina abscisová-1965 Syntéza ve stárnoucích listech (z kys. mevalonové) Translokace je vyššínež u auxinů, lýkem Působení zpomaluje růstovéprocesy brzdíprodlužovacífázi navozuje dormanci (odpočinek) pupenů, semen podporuje opad listů, plodů brzdíklíčení (předčasný růst embrya v nevyzrálých semenech) ovlivňuje pohyby průduchů při stresových faktorech na rostlinu (deficit vody, zasolení, nízkéteploty,..)

27 Vliv kyseliny abscisové na životní pochody v rostlině

28 Etylén (C 2 H 4 ) Fyziologickými účinky patřímezi regulátory Syntéza všechny části rostliny, u dozrávajících plodů Transport difúzív intercelulárách Působení brzdíprodlužováníbuněk zpomalení dlouživéhorůstu stonků a kořenů urychluje opad listů, plodů stimuluje dozrávání plodů a klíčení semen stimuluje rašenípupenů indukce květů a plodů Ethrel, Flordimex- oddalujína jaře kvetení

29 Vliv etylénu na životní pochody v rostlině

30 Ostatní růstové regulátory Kys. jasmonová (JA) smrtícíhormony, Jasminumgrandiflorum ve všech orgánech urychlující účinky na stárnutí listů inhibuje růst hypokotylů, listových pochev signál při reakci na dotyk signál při reakci na patogeny signál při reakci na poranění Kys. tuberonová stimuluje zakládáníhlíz u bramboru Brassinosteroidy reprodukčníorgány (1979 brassinolid, asi 30 castasteron, typhasterol)) stimulace dlouživéhorůstu zvyšujíodolnost ke stresům (sucho, teplota)

31 Ostatní růstové regulátory Fenolické látky der. k. benzoové, skořicové, flavonoidy, antokyany, kumariny, třísloviny, lignin inhibujídlouživýrůst ovlivňují dormanci pupenů, semen, hlíz, cibulí napomáhají při infekci Agrobacterium tumefaciens Polyaminy putrescin, spermin, spermidin v meristémech stimují růst v in vitro, somatickou embryogenezi stimulace prorůstání dormantních hlíz účastníse regulace buněčného cyklu obrana rostlin vůči stresům (ochrana -stabilizace membrán) Oligosacharidy fragmenty buněčné stěny inhibice dlouživéhorůstu obrana při napadenípatogenem

32 Postup při práci in vitro Příprava rostlinného materiálu (povrchová desinfekce, narušenícelistvosti rostliny, reakce na poraněnípo izolaci) Iniciace explantátovékultury (izolace explantátu, velikost explantátu, stáří, médium, podmínky kultivace) Mikropropagace (zmnožování, pasáže, regenerace rostlin) Zakořeňováni in vitro (genotyp) Převod do nesterilních podmínek Podmínky kultivace-teplota světlo (červené nahrazuje cytokinin)

33

34 Příprava explantátu Stáříexplantátu (fyziol. stav donor. rostliny, mladšípletiva, lepší sterilizace) Roční období (kontaminace: jaro x podzim; dormance -pupeny) Velikost explantátu (čím menší explantát těžšíkultivace) Cíl Aseptická technika (= desinfekce) opláchnutí vodou (teplá, mýdlová) opláchnutí alkoholem desinfekčníprostředek (SAVO, chloramin, HgCl 2.) opláchnutí sterilnívodou

35 Explantát Kontaminace desinfekčníprostředek (alkohol, chloramin, Savo, chlorové vápno, H 2 O 2..) zdroj explantátu (pole, skleník, fytotron, trichomy,..) endogenní kontaminace (hlízy, pupeny, semena x meristém, ) Lidský faktor (nářadí,..) Médium (dostatečná sterilizace) Hmyz Antibiotika Amphotericin, Ampicilin, Chloramphenicol, Penicilin Fungicidy

36 Regenerace in vivo Fyziologická -náhrada ztracených částí rostliny (jizvy po opadu) Patologická reakce rostliny na poranění : hojení ran restituce reprodukce regenerace v užším slova smyslu

37 Regenerace in vitro Totipotence buněk 1. přímá 2. nepřímá (kalus) Faktory: vnitřní vnější genotyp vývojovéstádium rostliny růstovépodmínky mateřskérostliny složenímédia, podmínky kultivace Snížení regenerační schopnosti v in vitro: odumírání explantátů po izolaci dlouhodobá kultivace hromadění metabolitů (dlouhodobé působenícytokininů) genetickézměny (kalusové kultury, buněčnékultury)

38 Morfogeneze in vitro (regenerace) Organogeneze (vznik orgánů,!!! ne celá rostlina) list, kořen, prýt, květ, hlíza (mikrohlízka) Embryogeneze zygotická embryogeneze embryokultury (embryo ze zygoty) gametofytická embryogeneze (prezygotická) haploidi -gynogeneze -androgeneze somatická embryogeneze(postzygotická) = nepřímá (z diploidní buňky)

39 Morfogeneze in vitro (regenerace)

40 Symptomy in vitro 1. Atypická anatomie, morfologie a fyziologie -miniaturizace změna stavby listů a jejich funkce (uzavřený prostor), bez kutikuly opuchlé výhony listy bledě zelenénebo šedomodré listy průsvitného (skelnatého) vzhledu - vitrifikace listy podlouhlénebo páskovité křehké krabacenénebo zkroucenélisty (jeví se jako tmavě zelené) 2. Redukce apikálnídominance shluky výhony při mikropropagaci 3. Kořenění nadměrná produkce adventivních kořenů špatná tvorba adventivních kořenů

41 Vitrifikace vyjadřuje abnormality in vitro skelnatý syndrom výhonů, křehké Symptomy in vitro Hyperhydricita mokrý vzhled prýtů (vodou nasycených) skelnatý, průsvitný, sukulentní vzhled bez kutikuly, krátká internodia

42 Meristémové kultury Meristém (velikost): Ozdravování rostlin (0,2-0,5 mm) Mikropropagacerostlin (0,5-1,0 mm)

43 Ozdravování-eliminace patogenů Tvorba bezvirózních rostlin 1 meristém = 1 rostlina testování Ozdravování: Termoterapie (vyšší teplota) Meristémová kultura Chemoterapie (antibiotika)! Reinfekce po 2-3 letech 1952 Morela Martin u jiřin Využití: jahodník, česnek, zeleniny, květiny, okrasnérostliny

44 meristém

45 Meristémové kultury-mikropropagace Přerušení korelačních vztahů (AD,..) Izolace meristémů pod binokulární lupou Izolujeme meristém se založenými listovými primordii Výhody meristémovékultury *Geneticky stabilní (regenerované rostliny jsou identické) *Vypěstování množství rostlin stejné kvality v krátké době, nezávisle na ročním období *Nižší nároky na prostor

46 Meristémové kultury-využití - záchrana a množení ohrožených druhů (kaktusy, ) - záchranné množení cenných genotypů a linií - udržení rodičovských komponent pro tvorbu hybridních odrůd - zachycení a klonování nově nalezených mutantů při šlechtění - klonování nejlepších jedinců pro produkci elitního osiva - vegetativní množení okrasných rostlin: karafiát, gerbera, anthurie, orchideje, sanpaulie, kapradina, - množení drobného ovoce (jahodník, maliník) - množení dřevin (podnože pro školkařství) - v zelinářství (množení brambor, zelí,..) - kryoprezervace (-196 o C): jahodník, maliník, hrách, brambor, karafiát

47 Meristémové kultury-množení Schéma postupu: Celárostlina Odběr meristému Mikropropagace (velký počet rostlin) Kořenění in vitro x ex vitro Aklimatizace Celárostlina

48 Meristémové kultury - množení cytokininy auxiny

49 Mikropropagace

50 Mikropropagace, multiplikace, klonování - nejen z meristémů Schopnost regenerace, tvorba identických rostlin = přímásomatická embryogeneze Solanumtuberosum, Cucumissativus, Olea europea, Eucalyptusgrandis, Salixsp., Syringa sp., Juglansregia

51 schéma Metoda mikropropagace I. Odvození aseptickékultury (vhodný explantát, kontaminace, fenolické látky) II. Multiplikace (médium, vhodný poměr hormonů, pasáž 3-6 x) není vhodný kalus III. Přenos rostlin do substrátu (auxin v médiu)

52 Metody mikropropagace

53 Metody mikropropagace Zdroje odchylek během mikropropagace: vysoké dávky růstových regulátorů, typ regulátoru rostliny regenerujíz basálního kalusu (možnost gen. změn) Meristémové kultury Kultury prýtových segmentů Z kalusů Z embryí

54 Embryokultury- kultury embryí in vitro = kultivace zralých nebo nezralých embryí in vitro 1904 Hannig -embrya u ředkve 1925 Laibach -aplikace v mezidruhovém křížení r. Linum 1945 Randolph -zkrácení šlechtitelského cyklu u r. Iris 1970 Kasha, Kao -získání haplodů u ječmene Hordeumvulgare (zůstává) x Hordeumbulbosum (eliminace chromozómů)

55 Embryokultury- kultury embryí in vitro I. Kultura semenných embryí, tj. izolace plně vyvinutých bipolárních struktur obsahujících kořenový a stonkový systém II. Kultura proembryí, tj. izolace nezralých zárodků předcházejících diferenciaci děloh Zygotická embrya Embrya in vitro výživa z endospermu (heterotrofní) výživa z kultivačního média

56 Embryogeneze in vitro zygotická embryogeneze embryokultury (embryo ze zygoty) gametofytická embryogeneze (prezygotická) haploidní rostliny gynogeneze (vaječná buňka) androgeneze (pylové embryogeneze) somatická embryogeneze (postzygotická) = nepřímá (z diploidní buňky)

57 Embryokultury-kultury embryí in vitro Využití: 1. Překonání bariér vzdáleného křížení (aborcehybr. embryí, sterility semen) 2. Zkrácení šlechtitelského cyklu (více generacíza rok) 3. Řešeníjarovizačního stádia 4. Primární explantátpro další kultury 5. Eliminace inhibice klíčení 6. Studium minerální výživy 7. Studium metabolických vztahů mezi embryem a endospermem, embryem a dělohami 8. Získání haploidních rostlin

58 Embryokultury-kultury izolovaných vajíček, květenství in vitro (moruše) Samičí květenství semeníky izolovaná vajíčka a rostliny haploidnírostliny

59 In vitro fertilizace pyl.zrno + vaj. b. pyl. zrno + centrálníbuňka pylové zrno osmot. šok DAPI pylové zrno 1. dělení endosperm elektrofúze, PEG, mikroinjekce Allium cepa, Beta vulgaris, Brassica oleracea, Cucumis melo, Gerbera sp., Helianthus annuus, Lilium sp., Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Zea mays vaječná b. synergidy centrální b.

60 Embryokultury in vivo Embryogeneze zygotického embrya (in vivo): zygota (příprava na 1. dělení) fáze pomalého vývinu embrya po oplození fáze rychlého vývinu, růstu a diferenciace embrya fáze dozrávání embrya fáze přechodu embrya do dormance (ABA) Zygota lineárnífáze globule srdce torpédo vycházková hůl kroužek

61 Kalusové kultury Kalus = masa dělících se buněk, za určitých podmínek regenerace prýtů a kořínků Primárníexplantát kalus meristemoid orgánové primordium Směs buněk, kterénejsou uniformní, mohou se lišit velikostí, tvarem, pigmentací, metabolismem nebo počtem chromosomů

62 Kalusové kultury I. Izolace explantátu = orgánová kultura II. Dediferenciace již specializovaných buněk pletiva (ztráta funkcí a struktur, změna metabolismu) Tvorba kalusu Růstové regulátory Kultivačnípodmínky III. Regenerace rostlin z kalusu -organogeneze (postupná diferenciace prýtů a kořenů) -somatická embryogeneze nepřímá (vznik celé rostliny ze somatické buňky)

63 Kalusové kultury 1. Somaklonální variabilita mutace a nové znaky 2. Mikropropagace cibule, žen-šen.. 3. Výchozí materiál pro suspenzní kulturu (mrkev) a protoplastů 4. Materiál pro indukované mutace (záření, chemomutageny) 5. Sekundární metabolity (alkaloidy, AMK, saponiny, oleje,.složky vůní, protonádorové látky, steroidy,...)

64 Kalusové kultury-využití mutací Selekce mutantů in vitro (projev mutace): znak je stabilníi v nepřítomnosti selekčního faktoru projevíse za daných podmínek projevíse v nízkéfrekvenci exprese na úrovni regenerovaných rostlin sexuální přenos v následných generacích Selekce mutantů se zlepšenou nutričníhodnotou (více bílkovin v zrnu) Rezistence vůči zasolení(vysoký turgor v buňkách, akumulace NaCl ve vakuolách) Rezistence vůči chorobám (syntéza fytotoxinů, fytoalexinů) Sekundární metabolity Artemisia annua -artemisin(antimalarika) Digitalis lanata -digoxin(srdeční stimulanty) Papaversomniferum -codein (sedativa) Taxusbreviola -taxol(protinádorové) Vanilla planifolia -vanilín (aroma)

65 Somatická embryogeneze a suspenzní kultury Buněčná suspenze = převedeme kalus do tekutého média a provzdušňujeme (kontakt buněk a shluků buněk s médiem) auxin (2,4-D) Využití: vzniká bipolární struktura obsahující kořen a prýt umělá semena (enkapsulace som. embryí) využitísomatické variability klonové množení syntetická semena sekundární metabolismus (suspenze) kryoprezervace

66 Somatická embryogeneze a suspenzní kultury Stejná vývojová stádia jako embryogeneze in vivo: globule srdce torpédo vych. hůl kroužek rostlina 1958 Reinert, Smith u mrkve 1 g mrkve 1000 embryí

67 Vznik suspenzní kultury a umělých embryí

68 Androgeneze = prašníkové a mikrosporové kultury Androgeneze kultivace prašníků, pyl. zrn, mikrospor Gynogeneze-kultivace vajíček Haploidie spontánní= haploidní partenogeneze (gynogeneze, androgeneze) indukovaná = eliminace genomu, inkompatibilita -experimentální: fyzikálnífaktory = UV, γ-záření, X-paprsky, teplotní šoky chemickéfaktory = kolchicin,. zásahy do procesů opylenía oplození(inaktivnípyl) explantátové metody = prašníkovéa pylové kultury, kultivace semeníků a vajíček, chromosomální redukce u kalusové, buněčné a protoplastovékultury

69 Prašníkové a mikrosporové kultury Důkaz totipotencebuňky: mikrospora celá rostlina Faktory ovlivňujícípylovou embryogenezi: fyziologickástav donorovérostliny a jejígen. zvláštnosti vývojové stádium pylu předpůsobení na poupata (chlad, heat shock) metoda izolace mikrospor, pylu kultivačnípodmínky vyšší osmotická hodnota média

70 Prašníkové a mikrosporové kultury Stádium pylu Tetrády a mladé mikrospory (jádro v G1 fázi) Střednífáz, vyvinuta exina, vykuola, jádro v G1 Pozdnífáze mikrospor (jádro v S fázi nebo G2) Pylovámitóza Dvoujadernéstádium -vegetativní a generativníjádro

71 Prašníkové a mikrosporové kultury Ontogeneze pylu In vivo: Pylová mateřská buňka Meiosa Pylové tetrády Vývoj mikrospory (1. pyl. mitóza) Pylový dimorfismus In vitro vývoj embryoidu z: (vegetativní, generativní buňka) -přímá embryogeneze -nepřímá embryogeneze

72 Prašníkové a mikrosporové kultury

73 Prašníkové a mikrosporové kultury Využití haploidů (mají jen jednu sadu chromosomů) Segregace vloh na gametické úrovni homozygótnístav (čistélinie v F2 generaci) Detekce recesivních mutací (fenotypický projev) Trpasličí varieta u okrasných rostlin Dihaploidizace

74 Využití haploidů v praxi

75 Androgeneze Příklady Beta vulgaris homozygotnílinie Brassica napus nováodrůda, linie Lycopersicon nová odrůda Nicotiana- novéodrůdy Oryza -nové odrůdy Pelargonium trpasličívariety

76 Protoplastové kultury = kultivace rostlinných buněk zbavených buněčné stěny Protoplast = rostlinná buňka bez buněčné stěny, její povrch tvoří cytoplazmatická membrána, má kulovitý tvar Stupně somatické hybridizace: Izolace protoplastů Fúze protoplastů (typ) Selekce a regenerace rostlin Analýza regenerovaných rostlin

77 Protoplastové kultury-izolace 1. mechanická 2. chemická enzymy (celulasa, hemicelulasa, pektinasa, ) jednostupňová x dvoustupňová spontánní x indukovaná Faktory ovlivňujícíizolaci protoplastů: rostlinný materiál genotyp zdroj pletiva fyziologický stav donorovérostliny složeníenzymatické směsi a doba působení osmotické podmínky ( mosm) kroky v průběhu izolace protoplastů (postup)

78 Protoplastové kultury- kultivace, regenerace Médium (kapková kultura, tekutá média, mikrokomůrky,..) Požadavky na výživu Vnější podmínky kultivace Regenerace: 1. Stupeň -iniciační= syntéza buněčné stěny, iniciace buněčného dělení, vznik kolonií, mikrokalusů 2. Stupeň -diferenciační= indukce výhonů na kalusech 3. Stupeň -kořenící= indukce tvorby kořenů na výhonech oddělených z kalusů

79 Využití Protoplastové kultury- regenerace Faktory ovlivňující kultivaci a regeneraci Hustota ( počet protoplastů v 1 ml) Životnost (%) Podmínky kultivace a médium Studium syntézy buněčné stěny Studium transportu látek přes cytoplasmatickou membránu Somatická hybridizace (fúze protoplastů) Inkorporace exogenního genetického materiálu organel, cybridizace Genové transformace (cizorodá DNA z bakteriálního plasmidu)

80 Protoplastové kultury- fúze protoplastů Chemická fúze PEG PEG, NaNO 3, Ca 2 NO 3 polyvinylalkohol, dextran

81 Protoplastové kultury- fúze protoplastů Přenos jaderné a cytoplazmatické genetické informace mezi rostlinnými druhy, rody Využití: Překonání sexuální inkompatibility Přenos genů rezistence vůči virovým, houbovým chorobám Přenos cytoplazmatické samčí sterility Přenos rezistence vůči stresům (teplotním, zasolení,..) Přenos rezistence vůči hmyzím škůdcům (syntéza fytoalexinů) Přenos genů pro syntézu zásobních proteinů, vitamínů, alkaloidů

82 Protoplastové kultury- fúze protoplastů Identifikace somatických hybridů: Morfologicky (habitus, životnost pylu) Karyologicky Použití sond s DNA sekvencí (DNA-DNA hybridizace, RFLP analýzy) Biochemicky (izoenzymy, dílčí proteiny, sekundární metabolity) Plastidová, mitochondriální DNA fosfoglukomutasa

83 Protoplastové kultury- fúze protoplastů Selekce som. hybridů malatdehydrogenasa

84 Protoplastové kultury- fúze protoplastů Fúze indukovaná: elektrofúze Před fúzí Po fúzi 1 hod

85 Protoplastovékultury- mikrofúze protoplastů 1 min 15 min

86 Protoplastové kultury

87 Fúze protoplastů rodu Brassica s jinými planými druhy Arabidopsis thaliana Barbarea vulgaris Camelina sativa Capsella bursa pastoris Diplotaxis catholica Diplotaxismuralis Diplotaxis harra Eruca sativa Lesquerella fendleri Mathiola incana Moricandiaarvensis Moricandia nitens Raphanus sativus Sinapis alba Sinapis arvensis Thlaspiperfoliatum Thlaspicaerulescens Kombinace vlastnostírostlin, které by se nekřížily brambor, rajče, mrkev, tabák, citrusy, rýže, salát, kukuřice, luštěniny, trávy, obiloviny

88 Cybridizace-asymetrické hybridy cytoplasmické hybridy 1. Inaktivace nebo odstraněníjádra jednoho rodiče (X-ozáření) 2. Fuzíprotoplastu a subprotoplastu nebo mikroprotoplastu 3. Eliminace chromosomů jednoho rodiče během proliferace brambor, brasika, rajče, mrkev, tabák, citrusy, rýže CMS, tolerance k herbicidům

89 Cybridizace-asymetrické hybridy hypok. protoplasty s CMS na mitochondriích chl A mit A chl B mit B mesofyl. protoplasty CTT na chloroplastech řepka CMS = cytoplasmic CTT = cytoplasmic

90 GMO - transgenní rostliny Transgenoze vnášeníznámých jednotlivých genů do dědičného základu (poprvé 1978) Pro přenos -Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, E. coli. rajče -zvýšenátrvanlivost plodů (1994) kukuřice -odolnost k zavíječi kukuřičnému endotoxin), tolerance k herbicidu sója -tolerance k herbicidu ROUNDAP, zvýšený obsah k. olejové řepka olejná -tolerance k herbicidu ROUNDAP, zvýšený obsah k. laurové brambor -tolerance k hmyzím škůdcům (mandelinka bramborová), k PVY cukrovka -tolerance k herbicidu ROUNDAP bavlník -k hmyzím škůdcům geny toxinu z B. thuringiensis pšenice -tolerance k herbicidu, rezistence k abiotickýmstresům rýže -s dlouhým zrnem, tolerance k soli Vkládajíse i signálnínebo selekčnígeny (jsou nežádoucív odrůdě)

91 GMO - transgenní rostliny Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti Montreal (OSN program pro životníprostředíunep) platnost ČR podepsala (gmo.vscht.cz) nyní více než 100 států opatření ve státech, kterése připojík projektu vzděláníodborníků a informování veřejnosti vytvořenínovélegislativy GMO ( spolupráce při výměně zkušeností Pokusy probíhají -in vitro kulturách v uzavřeném laboratorním systému - experimenty s transgenními rostlinami v uzavřeném skleníku MZe kontrola potravin USA, Kanada, Brazílie, Argentina, Brazílie, Čína Německo, Španělsko, Rumunsko, Bulharsko

92 Perspektivy GMO rostlin Přínos snížení chemické zátěže v prostředí, pokles insekticidů Uvolnění do oběhu -testy zdravotní nezávadnosti -zápis do seznamu odrůd -označení potravin (sledovatelnost), souhlas dovážející strany GMM (bakterie, kvasinky, vláknité houby) výroba antibiotik, hormónů, enzymů GMŽ(mají nižší schopnost ve volné přírodě přežít) drápatka ( není schopna přežít) myš (produkce farmaceutických proteinů) ryby (růstový hormon kapr, losos)

93 Perspektivy GMO rostlin Geneticky modifikované organismy (GMO) zlepšenígenetické výbavy kulturních rostlin zlatárýže- pro syntézu β-karotenu, zvýšeníiontů Fe vnesenígenů pro ferritin ze sóji do rýže) jedlé vakcíny produkce antigenů, kteréjsou v těle schopnévytvářet protilátky vůči nakažlivým chorobám (transgenní banány,rýže, pšenice,..) odolnost kulturních rostlin vůči abiotickým stresům, škodlivým organismům, př. virům, houbovým patog., hmyzím škůdcům produkce olejů (řepka olejná) rychle rostoucístromy pro výrobu papíru

94 Perspektivy GMO rostlin Při hodnocenígmo se zvažuje: rizika z uvedenígmo do prostředí -poškozeníživotního prostředí -snižení biologickédiverzity -poškozenízdraví člověka a zvířat -přenos pylu -likvidace zbytků GMO užitné vlastnosti GMO -efektivita -sníženíztrát -produkce farmak (humanní inzulín pomocí E. coli) -nutriční hodnoty

95 Fytopatologie in vitro in vitro selekce = kultivace buněk se selekčním činitelem přežívajícíbuňky jsou regenerovány do rostlin resistentního fenotypu Studium interakce rostlina x patogen v kontrolovaných podmínkách Druh Patogen Typ biologického testu Cíl Coffeaarabica Colletotrichum kahawae růst houby na kalusech výběr rez. genotypů Vitis vinifera Elsinoe ampelina růst kalusu na médiu s pat. testy rezistence Lycopersiconaes. Alternaria alternata testy na izol.listech in vitro hodnocení toxicity Pinustaeda Cronartium quercuum embryokultury s houbami výběr rezist. embryí Triticum aestivum Microdochium nivale listy, semenáčky in vitro výběr rezist. kultivarů

96 Terminologický slovník Adventivníembryo -embryo vyvinutéz nepohlavních buněk Adventivníorgán -vytváří se na neobvyklém místě (z kalusu) Alginát -výtažek z řas Antiauxiny -látky protikladnéauxinu (TIBA) Apikální -vrcholový Apikální dominance -nadvláda vrcholu nad postranními větvemi (u prýtuzeslabuje větveníauxina zesiluje cytokinin, u kořenů opačně) Aplikace -použití Apoptóza -programované odumírání buňky Aseptický -stav bez přítomnosti mikroorganismů v kulturách in vitro Auxin -rostlinný hormón tvořícíse v dělivých pletivech ve vrcholech Bazální-spodní BA = BAP -cytokinin Buněčná kultura -buňky nejsou organizovány do pletiv

97 Celistvost rostlin - sladěnírostlinných částív harmonický celek Cybrid -hybrid, který vznikl fúzícytoplastus protoplastem Cytokinin -rostlinný hormón tvořícíse hlavně v kořenech Dediferenciace -opak diferenciace pletiv, buněk Diferenciace -fyziologickéa morfologickézměny vedoucí ke specializaci Dormance -odpočinek Embryo -základ rostliny uložený v semeni Embryoid-útvar strukturně a funkčně podobný embryu, nevyvíjíse z oplozenévaječné buňky, ale z buňky somatické Embryogeneze -tvorba embrya Etiolizace -růst, vytahováníve tmě, prodlouženíprýtů a zakrnění listů Etylén -rostlinný hormón Explantace -izolace části rostlinného těla Explantát -uměle odebraná, izolovaná část rostliny za účelem kultivace Giberelin -rostlinný hormón tvořícíse v kořenech, nejmladších listech, pupenech, klíčích semenech

98 Hormóny rostlinné-látky, kt. se v malých množstvích v urč. části rostliny tvořía v jiné zprostředkovávajíprocesy. Hybridníbuňka - buňka, která vznikla fúzídvou odlišných protoplastů Indukce - vyvolání Inhibice -zadržení, zabránění Inhibitor -růstový regulátor brzdícírůst In vitro -ve skle, kultivace rostlinných částíza sterilních podmínek In vivo - procesy probíhajícív organismu v řirozenýchpodmínkách Kalus -masa parenchymatických buněk tvořícíse na poraněném povrchu Klonování-nepohlavnírozmnožovánírostlin, odvozených z jednoho explantátu Korelace růstové-vzájemné růstové vztahy mezi částmi rostlinného těla Kryoprezervace-uchovávánírostl. materiálu při teplotách kapalného dusíku Kys. abscisová-(aba)-přirozená hormonální látka inhibiční povahy, v dospělých listech, vzniká z kys. mevalonové Kys. gigerelová-(ga)-přirozená hormonální látka stimulační povahy, vznikáz kys. mevalonové

99 Lanolin -tuk z ovčívlny užívaný k přípravě stimulačních past Laterálnípupen -postranní, boční pupen Macerace -separace jednotlivých buněk z pletiva, narušenístřednílamely Meristém -dělivépletivo, primární, sekundární Meristemoid -shluk mer. buněk uvnitř kalusu s možností diferenciace Morfogeneze-vývoj a diferenciace pletiv a orgánů Morforegulátory -látky regulujícírůstovéprocesy Partenogeneze -vývin vaječnébuňky v embryo bez oplození Primární kultura -od izolace do prvního pasážování Regenerace -obnova narušenécelistvosti rostlin Retardace -brzdění(zadržování růstu) Retardant -látka brzdícírůst (CCC, TIBA) Rhizogeneze-zakořeňování Senescence -stárnutí Somaklonální variabilita -rostlin regenerovaných z buněk nebo z kalusů

100 Somatický hybrid -buňka nebo rostlina, kterávznikla fúzí protoplastů Somatická hybridizace -fúze protoplastů izolovaných ze somatických buněk Somatická embryogeneze -vznik embrya z jiných buněk nežzygot Stimulace -povzbuzení Stimulátor -růstový regulátor povzbuzujícírůst Subkultura -převedení na svěží médium Totipotence-schopnost rostlinné buňky diferenciace všech pletiv i organismu Transgenóze -vnášeníjednotlivých genů do genomu