Role kyslíku při výrobě bílých vín

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Role kyslíku při výrobě bílých vín Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Ing. Božena Průšová Vypracovala: Claudia Sapanelová Lednice 2017

2

3

4 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto práci: Role kyslíku při výrobě bílých vín vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 Autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity o tom, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne:. Podpis

5 Poděkování Tímto bych ráda poděkovala Ing. Boženě Průšové za odborné vedení práce. Mé poděkování patří rovněž firmě Vinicola za poskytnutí zázemí a materiálu potřebného pro realizaci praktické části mé práce.

6 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Kyslík a jeho význam v procesu výroby vína Kyslík jako chemický prvek Kontakt s kyslíkem Účinky kyslíku Oxidace Technologie řízeného dodání kyslíku v průběhu výroby vína Management kyslíku v jednotlivých fázích výroby vína Předfermentační operace Mošt Alkoholová fermentace (alkoholové kvašení) Zrání vína METODIKA EXPERIMENTÁLNÍ ČÁSTI Výroba vína a mikrooxidace Aromatický profil pomocí GC analýzy Senzorická analýza VÝSLEDKY Aromatický profil Senzorická analýza DISKUSE Aromatický profil Senzorická analýza ZÁVĚR SOUHRN A RESUMÉ SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHY

7 1. Úvod Kyslík sehrává významnou úlohu v technologii výroby vína. Je aktivním účastníkem mnoha důležitých biochemických a mikrobiologických procesů a jedním z hlavních faktorů odpovídajících za oxidaci moštů i vín. Svým působením tak velmi významně ovlivňuje látkové složení a kvalitu vína. Proto je třeba tyto děje dobře znát, chápat mechanizmy jejich fungování a na základě toho je moci vhodně regulovat. V technologii výroby bílých vín je role kyslíku vnímána převážně jako negativní. Známá jsou rizika spojená s jeho působením. Jedná se zejména o hnědnutí barvy a ztráty ovocného aroma, mnohdy stěžejní vlastnosti. Mošty a vína bílých odrůd jsou k oxidaci přirozeně citlivější, a tudíž i rizika s ní spojená větší. Tato skutečnost je dána množstvím a složením jejich fenolických látek. Principiálně je tak věnována velká pozornost ochraně hroznů, moštu a vína, vůči nežádoucí oxidaci v průběhu celého procesu výroby, množství přijatého kyslíku musí být stále důsledně kontrolováno. Riziko oxidace je největší v počátečních fázích výroby, tj. při sklizni, transportu a následném zpracování hroznů, kdy je managementu kyslíku potřeba věnovat velkou pozornost. Jedná se zpravidla o maximální omezení nekontrolovaného styku kyslíku se zpracovávanou surovinou a tlumení jeho účinků pomocí příslušných ochranných opatření. Během alkoholového kvašení či zrání může být naopak dodání určitého množství kyslíku velmi žádoucí. Kyslík je pro správný průběh kvašení nezbytný, podílí se při tvorbě počátečních růstových živin kvasinek a umožňuje tím jejich množení a správné fungování. Správné dávkování kyslíku pak významně přispívá také ke zlepšení organoleptických vlastností výsledného vína. Kyslík a práce s ním se stává neopomenutelnou součástí moderní vinařské praxe. Výroba bílých probíhá převážně v reduktivních podmínkách. Za dodržení správných postupů lze za vhodných podmínek připravovat bílá vína také oxidativní technologií, přičemž bývá vhodné využití technologií řízené oxidace, respektive hyperoxidace moštu a mikrooxidace ve fázích alkoholového kvašení a zrání vína. V tomto ohledu pak hrají roli především vlastnosti daného média, odrůda a typ vína. 7

8 2. Cíl práce Cílem práce je popsat a zhodnotit roli kyslíku při výrobě bílých vín. Provést rešerši dostupných literárních zdrojů zabývajících se danou problematikou a na základě získaných informací teoreticky popsat obecné účinky a management kyslíku ve všech fázích výroby vína, současně přitom nastínit současný vývoj vinařství v této oblasti. V rámci experimentální části práce následně analyticky porovnat mikrooxidované a nemikrooxidované víno. Výsledky zpracovat, diskutovat a zhodnotit vliv kyslíku dodaného do vína touto formou, respektive potvrdit nebo vyvrátit hypotézu předpokládající pozitivních účinků. 8

9 3. Literární přehled 3.1 Kyslík a jeho význam v procesu výroby vína Kyslík jako chemický prvek Kyslík (chemická značka O, latinsky Oxygenium) je důležitý biogenní chemický prvek plynného skupenství, bezbarvý, bez chuti či zápachu. Je nezbytný pro existenci většiny živých organismů. V atmosféře se volně vyskytuje jako dvouatomová (O2 dikyslík) nebo tříatomová (O3 ozón) molekula. Je velmi reaktivní a tvoří součást mnohých významných sloučenin (Greenwood and Earnshaw, 1993; Hampel, 1968). - Anorganických: uhličitany (CO3) II, křemičitany (SiO3) II, sírany (SO4) II, dusičnany (NO3), fosforečnany (PO4) III a voda (H2O). - Organických: alkoholy, fenoly, estery, peroxidy, aldehydy, karboxylové kyseliny a další. Ve většině sloučenin je v podobě dvouatomové molekuly (-2). Tvořit může také látky jako např. peroxidy (-1) či superoxidy (-1/2) (Greenwood and Earnshaw, 1993) Kontakt s kyslíkem Kyslík tvoří okolo 21% vzduchu. Hrozny, mošt a víno tak přichází do styku s kyslíkem v průběhu celého procesu výroby. Koncentrace kyslíku ve vzduchu je vždy větší než v moštu či víně uvnitř příslušné nádoby, a má tedy sklon se v rámci nich rozpouštět. Při dodržení veškerých zásad a maximálním omezení kontaktu kyslíku se zpracovávanou surovinou dochází k rozpouštění, byť minimálního řádově několika mg/l, množství kyslíku (Du Toit et al., 2006; Pavloušek, 2010) Účinky kyslíku Kyslík může vytvářet víno, ale také víno rozbít. již slovy Pasteura bychom mohli vyjádřit nezastupitelnou úlohu kyslíku v procesu výroby vína. Kyslík svým působením významně ovlivňuje látkové složení a kvalitu moštu a vína. Jeho působením dochází k oxidaci fenolických a aromatických látek daného média, čímž významně ovlivňuje organoleptické vlastnosti budoucího vína. Zásadní je rovněž pro růst a vývoj 9

10 mikroorganismů kvasinek a bakterií a tím také charakter procesů spojených s jejich činností. V těchto účincích se kyslík může projevit jak pozitivně, tak velmi negativně. Management kyslíku a způsob provedení jednotlivých technologických operací, od sklizně až po lahvování vína, pak musí z této skutečnosti vycházet. Množství přijatelného kyslíku určuje tzv. antioxidační kapacita daného média, tj. obsah látek schopných s kyslíkem reagovat a tvořit sloučeniny (Du Toit et al., 2006; Pavloušek, 2010; Reynolds, 2010b). Více o účincích kyslíku a jeho managementu v průběhu jednotlivých fází výroby bude popsáno v příslušných kapitolách Oxidace Fenolické látky hlavní substráty oxidace Hlavními spotřebiteli kyslíku moštů i vín jsou fenolické látky, resp. polyfenoly. Odpovídají za spotřebu cca 60% přijatého kyslíku. Jsou přítomny v hroznech a jejich obsah je dán danou odrůdou, ročníkem a stanovištěm. Kromě jímavosti kyslíku významně ovlivňují barvu, chuť (hořkost, trpkost), celkovou strukturu, případně průběh stárnutí vína. Oxidací jsou transformovány na chinony. Dochází ke změně jejich struktury, a tedy i zmíněných vlastností a to jak směrem pozitivním, tak negativním (Blaauw, 2009; Pavloušek, 2010; Steidl, 2002). Můžeme je rozdělit na: A) Neflavonoidy: fenolové kyseliny benzoová, skořicová a jejich hydroxylové deriváty B) Flavonoidy: flavonoly, flavanoly, antokyany, třísloviny Případně mohou být do vína dodané pocházet ze dřeva nebo formou enologických preparátů. Jedná se v tomto případě o třísloviny, tzv. hydrolyzovatelné taniny a elagiotaniny (Du Toit et al., 2006; Michlovský, 2014a) Fenolické látky bílých vín Při šetrném zpracování hroznů se obsah fenolických látek v bílém víně pohybuje v koncentracích od 50 do mg/l, zvyšuje se případným naležením rmutu, případně poškozením bobulí ještě před jejich zpracováním (Michlovský, 2014a; Steidl, 2002). 10

11 Mošty a vína bílých odrůd jsou charakteristické obsahem zejména neflavonoidních fenolických látek, jejich koncentrace se obvykle pohybuje mezi 1 a 10 mg/l (Reynolds, 2010a; Michlovský, 2014a). Především se pak jedná o deriváty hydroxyskořicových kyselin kyselinu kávovou, p-kumarovou a ferulovou. Nacházejí se převážně v dužině bobulí, odkud se poté dostávají do moštu. Co se týče množství a oxido-redukčních vlastností, je dominantní kyselina kávová, zbylé dvě jsou proti ní zastoupeny množstvím méně než pětinovým. Jsou to látky původně bezbarvé, až vlivem oxidace získávají žluté, případně hnědé, zbarvení. V hroznech se vyskytují nejčastěji v tzv. depsidech cca 75% veškerých fenolových kyselin, tj. ve formě vnitřních esterů kyseliny vinné kyselina trans-kaftarová a p-kumaroyl vinná. Jedná se o látky vysoce oxidovatelné, odpovědné za nežádoucí hnědnutí moštů bílých vín. Nejvíce zastoupeným je depsid kyseliny kávové, tj. kyselina kaftarová (Du Toit et al., 2006; Kumšta; 2007; Riberau-Gayon et al., 2006b; WSU, 2015). Flavonidní látky se v bílých vínech vyskytují obvykle jen stopově. Mohli bychom uvést katechin (flavan-3-ol) tvořící kondenzované katechinové třísloviny (taniny) a quercetin (flavanol) představitel žlutých pigmentů, původem ze slupek bobulí. V koncentraci 1 až 100 mg/l (dle dané technologie) pak mohou být zastoupeny třísloviny (Michlovský, 2014a; Riberau-Gayon et al., 2006b). Neflavonoidní fenolické látky mají jednodušší strukturu než látky flavonoidní, a proto jsou snadněji oxidovatelné. Stěžejní je kyselina kaftarová, z pohledu chemického látka označovaná jako katechol ortho-difenol, jenž má své fenolické funkční skupiny vedle sebe a je tak snadno oxidovatelná. Ostatní hydroxyskořicové kyseliny tuto strukturu nemají a nejsou tedy v procesu oxidace příliš významné, odpovídají primárně za vznik těkavých fenolů vinylfenolů lékárenské tóny (Kumšta, 2007; Reynolds, 2010a,b). Obr. 2 - Kyselina kávová (chempoint, 2012) Obr. 1 - Kyselina kaftarová (WSU, 2015) 11

12 Vzhledem ke kyselému prostředí moštu i vína nemohou oxidační reakce mezi kyslíkem a fenolickými látkami probíhat přímo, nezbytná je přítomnost katalyzátorů, konkrétně oxidačních enzymů či přechodných iontů kovů. Katalyzátory se liší jak mechanizmem svého působení, tak charakterem vzniknuvších reakcí (Kumšta, 2007). Obr. 3 - Oxidační reakce fenolických látek (Blaauw, 2009) Mechanizmus oxidace moštu enzymatická oxidace Oxidace hroznového moštu spočívá především v enzymatické oxidaci fenolických látek, přičemž se uplatňují dvě oxidázy o-polyfenoloxidáza tyrozináza (tzv. PPO) u moštů ze zdravých hroznů a p-polyfenoloxidáza lakáza v moštech z hroznů napadených šedou Botrytis cynerea (Dubernet and Ribereau-Gayon, 1973, 1974 in Riberau-Gayon et al., 2006a; Kumšta, 2007). V principu při oxidaci dochází k odštěpení vodíkových iontů polyfenolů, primárně tedy hydroxyskořicových kyselin, resp. kyseliny kaftarové a postupnému vzniku chinonů, látek červenohnědého zbarvení odpovědných za tzv. hnědnutí moštu (Kumšta, 2007; Reynolds, 2010b). Tyrozináza realizuje přenos vodíkových atomů ze struktury katecholu kyseliny kaftarové za vzniku jejího o-chinonu a vody. Vzniklý chinon se může následně vázat na glutation, je-li přítomen, a tvořit tak kyselinu S-glutationyl-2-kaftarovou, zvanou GRP (Cheynier et al., 1986 in Riberau-Gayon et al., 2006a), neboli tzv. hroznový reakční produkt - sloučeninu stabilní vůči oxidaci bránící pokračování oxidačních reakcí a tím následnému hnědnutí či ztrátám odrůdového aroma. Tento efekt je však platný pouze u moštu ze zdravých hroznů, v moštech z botrytických hroznů může být GRP naopak substrátem enzymu lakázy (Reynolds, 2010b). Poměr kyseliny kaftarové a glutationu závisí na odrůdě a pěstitelských podmínkách (Michlovský, 2014b). 12

13 Dále mohou chinony tvořit sloučeniny s dalšími polyfenoly nebo kyselinou askorbovou. Tyto reakce nepůsobí akumulaci chinonů ani změnu barvy. Zdvojená oxidace pak regeneruje kyselinu kaftarovou. Zdvojená oxidace je možná také ve spojení chinonu s flavonoidy a s GRP, vznikají pak chinony flavonoidů a chinony GRP. Chinon se pak opět váže s glutationem a dává vzniku kyselině di-s-glutationylkaftarové, tzv. GRP2. Chinony kyseliny kaftarové se mohou dále pojit s o- difenoly, kondenzují taktéž chinony flavonoidů, výsledkem je pak vznik intenzivně zbarvených a nerozpustných produktů způsobujících hnědnutí moštu (Du Toit et al., 2006; Kumšta, 2007; Riberau-Gayon et al., 2006a). Oxidační reakce prostřednictvím PPO jsou poměrně jednoduché a velmi rychlé. Eventuální průběh oxidačních reakcí závisí na koncentraci polyfenolů, glutationu, kyseliny askorbové a oxidačních enzymů, daných především odrůdou, vyzrálostí či zdravotním stavem hroznů a také podmínkami vyhovujícími tomuto procesu. Příznivě pro průběh oxidačních reakcí v moštu působí vyšší teplota a ph moštu. Aktivitu PPO lze poměrně snadno ovlivnit teplotou a aplikací chemických ochranných prostředků, tj. především oxidu siřičitého (Kumšta, 2007; Riberau-Gayon et al., 2006a). Lakáza je schopna katalyzovat oxidaci mnohem většího množství substrátů, včetně zmíněného GRP. Působí okamžitě po zpracování hroznů a následně trvá podstatně déle. Při delším kontaktu s kyslíkem dochází působením lakázy ke vzniku melaninů hnědých nerozpustných látek. Výsledkem je pak hnědý, tzv. oxidázní, zákal projevující se především u mladých vín (Michlovský; 2014a). Lakáza disponuje také větší rezistencí k SO2 a chemická ochrana napadených hroznů je tak značně obtížná (Kumšta, 2007) Mechanizmus oxidace vína chemická oxidace Ve víně probíhá zejména chemická oxidace fenolických látek, enzymatická může být již pouze doznívající. Chemická oxidace probíhá tzv. radikálovým mechanismem a v porovnání s oxidací enzymatickou je podstatně pomalejší, složitější a pro bílá vína případně mnohem závažnější (Kumšta 2007; Reynolds, 2010b). Jak bylo již zmíněno, kyslík jako takový není v prostředí vína ve svém základním stavu příliš reaktivní a množství přítomných látek schopných s ním přímo reagovat je tudíž omezené. Oxidační aktivita kyslíku se zvyšuje v přítomnosti katalytických iontů kovů a to zejména Fe2+, eventuálně Cu. Jejich prostřednictvím je kyslík redukován do podoby velmi reaktivních superoxidových radikálů, které následně reagují s přítomnými 13

14 fenolickými látkami (zejm. kaftarovou kyselinou) za vzniku příslušných chinonů. Jako vedlejší produkt vzniká současně peroxid vodíků nejreaktivnější forma kyslíku, který posléze reaguje s etanolem a v přítomnosti železnatých iontů tak dává vzniku acetaldehydu (aldehydu kyseliny octové), významnému produktu oxidace a dalšího superoxidového radikálu. Acetaldehyd může být následně oxidován, nejčastěji činností octových bakterií, až na kyselinu octovou. Kromě etanolu peroxid vodíků velmi aktivně reaguje i s ostatními organickými látkami. V suchých bílých vínech tj. s glycerolem nebo organickými kyselinami, v těch sladších pak také s cukry (Kumšta, 2007; Reynolds, 2010b; Riberau-Gayon et al., 2006b). Chování kyseliny kaftarové, resp. jejího o-chinonu, je i přesto, co se týče účinků oxidace, pro víno spíše přínosem. Její schopností je deaktivovat superoxidové radikály, čímž zabraňuje jejich následné reakci s látkami jako terpeny, estery mastných kyselin či estery vyšších alkoholů, tj. hlavními primárními (odrůdovými) a sekundárními (kvašením) buketními látkami vína (Kumšta, 2007). Podstatný je také průběh kondenzačních (resp. polymerizačních) reakcí. Pro bílá vína jsou to reakce převážně negativního charakteru. Oxidované fenoly (chinony) se slučují s dalšími přítomnými fenolickými látkami za vzniku hnědých produktů nebo s thioly za ztráty jejich typického aromatického projevu. Výjimku tvoří déle zrající klasická velká bílá vína připravovaná v režimu limitované oxidace, kdy dochází k tvorbě norisoprenoidů, významných složek jejich buketu (Du Toit et. al., 2006; Kumšta, 2007). Procesu hnědnutí barvy napomáhá také oxidace kyseliny vinné a její přeměna na kyselinu glyoxylovou či přítomnost acetaldehydu (Du Toit et. al., 2006). Z dříve uvedeného vyplývá, že čím větší koncentrace iontů Fe2+ či Cu+, čím větší, tím větší citlivost vína k oxidaci. Pro tento efekt je vhodné zamezit kontaktu vína se špatně chráněnými kovovými předměty, v případě mědi je rizikové použití fungicidních postřikových látek či přípravků k odstranění sirky. Odstranění kovů je možné modrým čiřením, tj. metodou ne příliš oblíbenou (Kumšta, 2007). 14

15 Mikrobiální oxidace V moštu i víně může za vhodných podmínek (kontaminované hrozny, vysoké teploty, zvýšený přístup kyslíku) vznikat také oxidace mikrobiální, velmi negativní, co se kvality budoucího vína týče. Významnými účastníky těchto procesů jsou zejména octové bakterie, případně kontaminační kvasinky např. z rodu Brettanomyces. Ke svému množení tyto mikroorganismy vyžadují přítomnost kyslíku. Jsou-li tedy přítomny, tak je to právě kyslík, jenž výrazně zvyšuje riziko rozvoje jejich populací (Pavloušek, 2010; Riberau-Gayon et al., 2006a) Technologie řízeného dodání kyslíku v průběhu výroby vína V technologii výroby vína existují tři možné postupy řízeného dodání kyslíku: hyperoxidace, mikrooxidace, makrooxidace. 1. Hyperoxidace moštu Hyperoxidace představuje záměrné dodání většího nadměrného množství kyslíku do vylisovaného moštu a oxidace přítomných nestabilních fenolických látek ještě před zahájením alkoholového kvašení. K vývoji této technologie vedl rozvoj mechanické sklizně hroznů spojené s bezprostředním drcením hroznů a následně delším kontaktem moštu s výlisky, tj. praktik zvyšujících obsah fenolických látek v moštu (Schneider, 1998). Využití je častější při zpracování moštů bílých odrůd, kdy je využívána jakožto protektivní opatření proti hnědnutí vína vlivem pozdější oxidace (Riberau-Gayon et al., 2006a; Schneider, 1998). Dodání kyslíku formou hyperoxidace může být zajištěno různými způsoby, a to klasickým přečerpáním moštu z nádoby do nádoby, případně z lisu do nádoby nebo může být dodán (jako plynný O2 nebo vzduch) pomocí příslušného zařízení sestávajícího z kyslíkové bomby a difuzéru (Schneider, 1998). 2. Mikrooxidace moštu a vína Mikrooxidace je technologií řízeného dodání kyslíku o malých přesných dávkách v přesně stanoveném čase. Jedná se o metodu relativně novou (r uvedení prvního komerčního zařízení na trh, nicméně pro své účinky mezi vinaři již velmi rozšířenou (Hornsey, 2007; Parish et al., 2000). Její využití je vhodné při výrobě jak červených, 15

16 tak bílých vín., kdy je využívána především k zajištění optimálního průběhu alkoholového kvašení a vývoje aromatické kvality vína (Pavloušek, 2009). Zahájení mikrooxidace je, dle potřeby, možné během kvašení moštu nebo zrání vína. Zaváděna je zejména pro své účinky stran organoleptické kvality vína. Výsledkem takových změn je vyšší intenzita a stabilita barvy i aroma, v chuti je pak víno hladší, jemnější, plnější, s lepší integrací tříslovin. Klesá riziko rozvoje nežádoucích reduktivních či rostlinných tónů. Mikrooxidované víno je rovněž stabilnější vůči pozdější nežádoucí oxidaci (Parish et al., 2000; Reynolds, 2010b; Singleton, 1987). Metoda vychází z dob minulých, kdy kvašení i zrání vína probíhalo z pravidla v dřevěných sudech, přičemž byla zajištěna přirozená mikrooxidace prostřednictvím mikropórů ve dřevě. Víno připravované v nerezových tancích přichází, bez jeho záměrného dodání, do styku jen s velmi malým množstvím kyslíku. Využitím této technologie lze podmínky mikrooxidace v sudu velmi efektivně simulovat i v uzavřených tancích. Představuje tak jednodušší a cenově méně nákladný způsob vinifikace v těchto podmínkách, navíc s možností vhodné regulace dodaného kyslíku dle dané technologie výroby a aktuálních podmínek (Blaauw, 2009; Parish et al., 2000; Pavloušek, 2009; Reynolds, 2010b). Mikrooxidační zařízení umožňuje nastavit dodání kyslíku o přesně stanovených dávkách v přesně zvoleném čase. Kyslík je rozváděn sítí tenkých plastikových (gumových) trubiček a do vína či moštu je rozptýlen ve formě malých bublinek pomocí nerezového nebo keramického rozprašovače. Stěžejní je, aby byl všechen kyslík řádně rozpuštěn a bylo tak zabráněno jeho hromadění ve víně. K tomu nedochází, jsou-li dodržena příslušná opatření (Reynolds, 2010b). Opatření pro optimální průběh mikrooxidace: 1) Vhodná dávka Pro určení správné dávky kyslíku je vhodné stanovit oxidační kapacitu média, tj. především obsah fenolickým látek. Množství celkově dodaného kyslíku by mělo být vždy menší, nežli je víno schopno spotřebovat v reakcích, jenž by nevedly k negativním změnám. Roli sehrává také turbidita vína, vína s větším množstvím kalových částic mohou spotřebovat kyslíku více. Stanovení přesných optimálních dávek pak závisí rovněž na termínu aplikace a množství kyslíku přijatého v rámci předchozích operací (Du Toit et al., 20O6; Reynolds, 2010b). 16

17 Co se týče rozvoje nežádoucích mikroorganismů, bylo značné riziko zjištěno při dávce 7,5 mg/l kyslíku (Pavloušek, 2010). Velmi důležitá je také rovnoměrná distribuce stanovených dávek. Jednorázové dodání většího množství kyslíku je kontraproduktivní, vede k oxidaci a může víno výrazně poškodit. Stejně tak případné změny v dávkování by měly probíhat pomalu. (Steidl, 2002) 2) Délka tanku Délka tanku by měla být minimálně 2,2 m. V nižších, resp. kratších tancích bublinky kyslíku pouze procházejí vínem a řádně se se nerozpouští. Důležité je také, aby byl tank stále kompletně doplňován, to kvůli hromadění kyslíku v prostoru nad hladinou vína a možnému rozvoji octových bakterií (Reynolds, 2010b). 3) Teplota Z pohledu efektivity mikrooxidace působí teploty jak příliš nízké, tak příliš vysoké nepříznivě na rozpustnost kyslíku. Ideálně by se měla teplota pohybovat kolem 18 C (Reynolds, 2010b). 4) Obsah SO2 Vysoký obsah SO2 (silný antioxidant) znesnadňuje polymerizaci fenolických látek, příliš malé množství by však mohlo vést k rozvoji nežádoucích bakterií. Vhodný je obsah kolem 20 mg/l volného SO2, přičemž nutno vést v patrnosti hodnotu ph vyšší účinek molekulární síry při nižším ph. Tato hodnota je udržována při dávce 4 mg/l/měsíc kyslíku do vína, což odpovídá navýšení obsahu volné SO2 každý měsíc zhruba o 5-10 mg/l SO2. Předpokladem je využití zdravých hroznů. Toto množství volného SO2 je dostatečné k prevenci růstu bakterií Brettanomyces, přičemž nebrání požadovaným účinkům mikrooxidace. Při výskytu těchto bakterií je lépe mikrooxidaci neaplikovat a navýšit obsah volného SO2 na 40 mg/l, případně i jinak zakročit filtrace apod. (Du Toit et al., 2005; Reynolds, 2010b). 17

18 5) Senzorické hodnocení V průběhu mikrooxidace je velmi důležité pravidelné senzorické hodnocení. Je třeba sledovat očekávaný vývoj organoleptických vlastností a eliminovat případný výskyt projevů oxidativního charakteru, hrozí např. vznik nadměrného množství acetaldehydu, jenž je provázeno nepříjemnými aromatickými tóny. Pozornost je třeba věnovat rovněž zvýšení obsahu těkavých kyselin vlivem octových bakterií nebo těkavých fenolů (zejm. červená vína) kvasinkami Brettanomyces (Pavloušek, 2010; Reynolds, 2010b). 3. Makrooxidace vína Dodání kyslíku formou makrooxidace nalézá své uplatnění ve výrobě červených vín, kde je využíváno v době alkoholového kvašení především jako podpora růstu kvasinek, tak jak je tomu při mikrooxidaci kvasícího moštu bílých vín. Prospěšně působí také pro stabilizaci barvy, změny struktury taninů a odstranění nežádoucích aromatických tónů. Dávky kyslíku jsou však vyšší (proto název makrooxidace) a to 5-8 mg/l/den, tj ml/l celkově dodaného O2 (Pavloušek, 2010; Steidl, 2002). 3.2 Management kyslíku v jednotlivých fázích výroby vína Předfermentační operace V technologii výroby bílých vín sklizeň a předfermentační operace odpovídají až z 80 % za kvalitu budoucího vína. Způsob a kvalita jejich provedení jsou jedny z hlavních faktorů, jenž určují jeho budoucí senzorické vlastnosti. K managementu kyslíku je v těchto počátečních fázích, zvláště není-li surovina ještě nijak chráněna, přistupovat velmi zodpovědně. Oxidace je v těchto fázích většinou nežádoucí (Pavloušek, 2010; Riberau-Gayon et al., 2006a). 1. Sklizeň a doprava hroznů do místa zpracování Hrozny bílých odrůd jsou z důvodu nižšího obsahu antioxidačních látek k oxidaci přirozeně citlivější, nežli je tomu u odrůd modrých. Narušením celistvosti bobulí mechanicky, případně vlivem hniloby, probíhá extrakce v nich obsažených látek, tj. budoucích substrátů oxidace, do moštu. Enzymatická oxidace tak může započít již při 18

19 sklizni a následném transportu hroznů do místa zpracování (Corona, 2010; Reynolds, 2010a; Riberau-Gayon et al., 2006a). Počínaje sklizní, ruční či mechanickou, je důležitá především šetrná manipulace a snaha o minimální poškození bobulí. Tím je omezen styk šťávy v nich obsažené s kyslíkem a minimalizováno riziko oxidace. Teplota při sklizni by se měla ideálně pohybovat okolo 2O C (Riberau-Gayon et al., 2006a; Michlovský, 2014b). Při transportu sklizených hroznů je důležité použití vhodných nádob, tzn. takové velikosti, aby nedošlo k rozmačkání bobulí, vhodná je v tomto ohledu také malá násypná výška. V neposlední řadě je pak žádoucí co nejrychlejší přeprava sklizeného materiálu do místa zpracování (Riberau-Gayon et al., 2006a; Steidl, 2002). 2. Příjem hroznů Během příjmu hroznů a jejich dalšího zpracování je důležité zajistit rychlé a maximálně šetrné nakládání, využití vhodných zařízení čerpadel, hadic s dostatečně velkým průměrem, pásových dopravníků apod. Zpracovávaný materiál by měl být, zvlášť není-li ještě nijak chráněn, stále co nejméně vystaven působení kyslíku. Vhodné je využití samospádu, je-li to možné, kdy jsou hrozny dopravovány jen svou vlastní hmotností (Riberau-Gayon et al., 2006a; Steidl, 2002). Hrozny je pak žádoucí až nezbytné chránit vůči oxidaci pomocí patřičných opatření. Zvlášť jedná-li se o hrozny nějakým způsobem porušené, případně o odrůdu s vyšším obsahem fenolických látek. Hrozny sklizené mechanicky musí být takto chráněny vždy (Riberau-Gayon et al., 2006a). Mohou být chráněny pomocí SO2. Dojde tak k útlumu aktivních oxidačních enzymů a vyvázání vzdušného kyslíku, je bráněno nežádoucímu hnědnutí. Jedná se o nejjednodušší a nejefektivnější metodu ochrany proti oxidaci. Negativním dopadem je však extrakce fenolických sloučenin ze slupek hroznů. Lepším způsobem ochrany je v této fázi tekutý oxid uhličitý, tzv. suchý led. Jeho dodáním dochází k vytlačení kyslíku. Má inertní funkci, sublimuje a tvoří ochrannou vrstvu plynného CO2 (2 kg suchého ledu vytvoří 1m 3 plynného CO2). Suchý led se pokládá přímo ve vrstvách na hrozny. Dalším pozitivním aspektem je ochlazení rmutu, tlumí činnost endogenních enzymů, navíc působí bakteriostaticky, podporuje ovocné charakteristiky vína a nemá žádný negativní vliv na vyšší rozpustnost kyslíku v moštu. Dávka CO2 by měla být min 2 g/l, následně dávky SO2 mohou být v takovém případě sníženy, případně síření zcela vynecháno, je tak sníženo riziko zvýšeného obsahu síry ve víně. Snížení teploty tímto způsobem je možné 19

20 již na sklízecím stroji a během transportu do místa zpracování, pozitivně se projeví také na kvalitě samotoku v pneumatickém lisu (Michlovský, 2014b; Riberau-Gayon et al., 2006a; Steidl, 2002). 3. Zisk moštu odstopkování, drcení, lisování Cílem těchto operací je zisk co nejčistšího moštu při dodržení veškerých zásad správného zpracování hroznů pro výrobu bílých vín. Ideální mošt připravený k fermentaci je mošt o turbiditě do 200 NTU (Riberau-Gayon et al., 2006a). Oxidované a oxidovatelné fenolické částice původem ze slupek, semen a stopek hroznů mohou mít negativní vliv, co se týče barvy a ovocného odrůdového aroma budoucího vína, případně působit vznik hořkosti a nežádoucích bylinných tónů. Šetrným zpracováním hroznů a lisováním lze zajistit obsah těchto látek v množství pod 200 mg/l moštu. Žádoucí je pak zisk co největšího objemu takového moštu při co nejnižších tlacích lisování vyšším tlakem se zvyšuje i množství oxidovatelných látek. I zde by měla být zajištěna teplota do 20 C (Riberau-Gayon et al., 2006a). Získaný mošt je žádoucí co nejrychleji zajistit z dosahu vzduchu a co nejrychleji zakvasit. Po podrcení a vylisování hroznů může rychlost spotřeby kyslíku překročit i 2 mg/l za minutu (ve víně je pak standardně v rozmezí 1 až 2 mg/l za den). Vhodné je využití zařízení pro scezování moštu, je-li k dispozici. Mošt pak neprotéká přes lis a je tak méně vystaven oxidaci (Michlovský, 2014b; Riberau-Gayon et al., 2006a). Lisovat je možno ihned po podrcení hroznů nebo může předcházet krátká macerace na slupkách. Naležením rmutu se významně zvýší množství polyfenolů v moštu, doba macerace by se tedy měla pohybovat maximálně v intervalu od 12 do 20 h. I zde je důležité omezit kontakt se vzduchem, teplota C, práce v inertní atmosféře při transportu hroznů do tanku, ochrana chlazením pomocí CO2 (0,8 kg CO2 k ochlazení 120 kg odstopkovaných hroznů při 1 C) (Riberau-Gayon et al., 2006a). K lisování je vhodné využití pneumatických lisů (Riberau-Gayon et al., 2006a). Lisování probíhá za nízkých tlaků běžně v rozmezí 0,01-0,18 MPa s možnou regulací dle charakteru dané suroviny. Konstrukce těchto lisů nabízí řešení lisovacích košů polouzavřených nebo uzavřených. Vzhledem k možnému riziku oxidace lisovaného produktu i vytékajícího moštu je vhodnější lisování v reduktivních podmínkách, tzn. volit lisy s uzavřenými koši, v nichž probíhá celý proces odděleně od okolního prostředí, tedy i bez přístupu vzduchu. Vnitřní prostor koše může být navíc vyplněn inertním plynem 20

21 (např. CO2) bránícím oxidaci. Získaný mošt je světlejšího zbarvení, nehnědne, obsahuje více primárních aromatických látek (Burg a Zemánek, 2014). Při lisování je možné využít technologických postupů kryoextrakce či suprextrakce, tj. lisování celých hroznů ochlazených pod 0 C. Tento způsob rovněž omezuje průběh oxidace, přičemž navíc podporuje uvolňování žádoucích ovocných aromatických látek (Riberau-Gayon et al., 2006a) Mošt Management kyslíku v moštu Po zisku moštu panují odlišné názory, co se managementu kyslíku týče. Existují dvě teorie 2 možné způsoby, jak s kyslíkem v této fázi nakládat: 1) Reduktivní technologie U většiny vinařů stále převažuje snaha o maximální ochranu moštu vůči působení kyslíku, resp. oxidaci, za využití SO2, případně dalších ochranných opatření. Tato teorie je založena na empirických poznatcích potřebě moštů většiny bílých odrůd zachovat si svou nazelenalou barvu umožňující posléze vzniku bílých vín s typickým ovocným aroma (Riberau-Gayon et al., 2006a). 2) Záměrné dodání kyslíku Jiní enologové zastávají odlišný názor. Mošt je-li příliš chráněn vůči působení kyslíku, dává předpoklad vzniku vína, jenž bude v budoucnu k oxidaci mnohem citlivější. Při této teorii stojí technologie hyperoxidace (Kumšta, 2007; Riberau-Gayon et al., 2006a). Jako první se proti nutnému síření bílých moštů před alkoholovou fermentací postavil v roce 1977 Muller-Späth. Jeho výzkum prokázal pozitivní účinek dodání kyslíku do nesířeného moštu před jeho odkalením a to v podobě lepší stability barvy vína, aniž by však dal vzniku chuťových vad oxidativního charakteru (Cheynier et al., 1991; Riberau-Gayon et al., 2006a; Schneider, 1989). Hyperoxidace byla s úspěchem aplikována také pro odbarvení a zlepšení kvality po druhém lisování u moštů odrůd Pinot Noir a Pinot Mounier v Champagne (Blank and Valade, 1989 in Riberau-Gayon et al., 2006). 21

22 Ochrana moštu proti oxidací 1) Oxid siřičitý Ochrana pomocí oxidu siřičitého účinně chrání mošt díky své antioxidační a antioxidázové aktivitě. Oxid siřičitý inhibuje aktivitu enzymu tyrozinázy a zabraňuje tím vzniku chinonů. Optimální obsah volného SO2 v moštu činí přibližně mg/l. Důležitou podmínkou je dodání potřebného množství SO2 jednou homogenní dávkou, nikoli postupně a po menších dávkách. Nižší dávkou je vznik oxidačních jevů pouze oddalován a v důsledku je spotřeba kyslíku větší nežli u moštu nesířeného. Pochází-li mošt ze zdravých hroznů, pak jsou aplikací této ochrany enzymatické oxidační jevy zcela zastaveny. Působí současně antimikrobiálně, tj. tlumí rozvoj bakterií a divokých kvasinek (Riberau-Gayon, 2016a; Steidl, 2002). Nevýhodou je zde extrakce fenolických sloučenin ze slupek hroznů (Riberau- Gayon et al., 2016a). Využití SO2 při prevenci oxidace moštu tedy může být předmětem diskuze. Mírná oxidace fenolických látek v tomto stádiu nemusí pro budoucí kvalitu vína představovat závažnější problém a dávkování SO2 by tak mělo směřovat především k zabránění oxidace mikrobiální. Oxidovaná kaftarová kyselina je v průběhu kvašení regenerována redukční schopností kvasinek (reakce s glutathionem produkovaným kvasinkami) a získává tím své antioxidační schopnosti zpět (Kumšta, 2007). 2) Kyselina askorbová Dalším možným způsobem ochrany moštu proti oxidaci je dodání kyseliny askorbové, tj. využití její antioxidační aktivity. Potřebná dávka činí 10 mg/hl. Askorbová kyselina nepůsobí nežádoucí extrakci fenolických sloučenin, avšak není schopna inhibice oxidáz, jako je tomu v případě oxidu siřičitého. Redukuje chinony, ale stejně jako malé dávky SO2 hnědnutí oddaluje a nezmenšuje spotřebu kyslíku. Takto chráněné hrozny a mošt je i nadále nutno udržovat v co nejmenším styku se vzduchem. Pro zajištění jejího správného účinku je využívána v kombinaci s SO2 (Riberau-Gayon et al., 2016a). 22

23 3) Ochlazení moštu Ochrana moštu ochlazením je velmi účinnou metodou ke zpomalení oxidačních reakcí. Rychlost spotřeby kyslíku je 3x větší při 30 C nežli při 12 C (Dubernet and Ribereau-Gayon, 1974 in Ribereau-Gayon et al., 2006a). Nepůsobí nežádoucí extrakci fenolických látek, jako je tomu při použití SO2, a tím umožňuje například delší dobu macerace (Corona, 2010). Jak bylo zmíněno, může být tohoto ochranného prostředku využito již při práci s hrozny. Využíváno je tekutého CO2 a manipulace v inertní atmosféře (Riberau-Gayon et al., 2016a). 4) Zahřátí moštu Aktivita enzymů prudce klesá při tzv. denaturační teplotě. Rychlým zahřátím moštu na 60 C (na několik minut) co nejdříve po jeho vylisování je teoreticky možné zničení aktivity oxidáz. Polyfenoloxidáza je z 99% neaktivní po 10 minutách zahřívání na 70 C. Tento způsob ovšem není v praxi příliš využíván (Kumšta, 2007; Riberau-Gayon et al., 2016a). 5) Odkalení Odkalením lze účinně omezit oxidační procesy v moštu, jenž jsou spojeny s přítomností kalových částic. Slouží k odstranění produktů oxidace, především oxidovaných kondenzovaných forem flavonoidů, ještě před zahájením alkoholového kvašení. Výsledkem je zisk čistého moštu a následně vína bez nežádoucích oxidativních tónů. Není však ochranou proti hnědnutí. Oxidační aktivita tyrozinázy je stále dostatečná. Doporučeno je snížení množství kalů na max. 0,6% objemu (Riberau-Gayon et al., 2016a) Hyperoxidace moštu Smysl dodání většího množství kyslíku v předfermentační fázi spočívá v odstranění nestabilních, tj. snadno oxidovatelných fenolických sloučenin, v případě bílých moštů tj. hlavně chinonů hydroxyskořicových kyselin jakožto prekurzorů hnědnutí moštu. Oxidací jsou tyto látky vysráženy a následně mohou být snadno odstraněny pomocí běžných odkalovacích operací. Takto ošetřený mošt pak snižuje citlivost vína vůči pozdější oxidaci, resp. hnědnutí (Lagarde and Fargeton, 2014; Schneider 1998). 23

24 Oxidací fenolických látek dochází ke zhnědnutí moštu, to je však během následné alkoholové fermentace zcela odstraněno. Oxidovaná kyselina kaftarová reaguje s glutathionem produkovaným kvasinkami za vzniku GRP. Dojde tak k regeneraci oxidovaných fenolických látek včetně jejich antioxidačních schopností. I z hnědého oxidovaného moštu, tak lze vyrobit stabilní mladé víno (Kumšta, 2007; Schneider, 1998). Účinnost hyperoxidace z pohledu stabilizace barvy závisí na konkrétní dané odrůdě (Cheynier et al., 1991). Odrůdově závislé je rovněž její působení stran aroma vína a při rozhodování o vhodném využití této metody je nutno vést to v patrnosti. Negativní účinek spočívá v tomto ohledu ve snížení intensity primárních, tj. odrůdových aromatických látek. Postihuje tak například aroma odrůdy Sauvignonu blanc a jemu příbuzných, po aromatické stránce podobných odrůd (Dubourdieu and Lavigne, 1990 in Riberau-Gayon, 2006a). Tento jev souvisí s obsahem thiolu 4-metyl-4-merkaptopentanonu odpovědného za citlivost aroma této odrůdy k oxidaci a jehož koncentrace klesá tím víc, čím míň je mošt chráněn vůči oxidaci (Riberau-Gayon et al., 2006a). Hyperoxidace je tudíž vhodná pro výrobu neutrálních bílých vín, jejichž buket je formován až během alkoholového kvašení či zrání a dřívější oxidace je naopak podporou jeho vzniku (Kumšta, 2007; Lagarde and Fargeton, 2014). Přínosem tohoto technologického postupu je také možnost vynechání ochrany SO2, jenž by svými antioxidačními vlastnostmi bránil účinkům kyslíku, a tedy dosažení požadovaných výsledků (Schneider 1998) Alkoholová fermentace (alkoholové kvašení) Alkoholová fermentace, respektive kvašení je přirozeným a nejvýznamnějším procesem nastanuvším v získaném moštu. Činností mikroorganismů kvasinek probíhá přeměna přítomných cukrů (monosacharidů d-glukózy a d-fruktózy) na alkohol (etanol, resp. etylalkohol) za vzniku oxidu uhličitého a mnohých vedlejších produktů, jakožto i látek významných pro vývoj organoleptických vlastností vína. Jeho správné řízení je tak pro kvalitu budoucího vína velmi zásadní (Hornsey, 2007; Steidl, 2002). 24

25 Kvasinky Kvasinky, tj. mikroorganismy uskutečňující proces alkoholového kvašení jsou jednobuněčné houby původem z vnějších částí bobulí, kde v místech jejich kontaktu se šťávou (při stopce, v prasklinách) dochází k jejich množení. Pocházet mohou také z půdy ve vinici, významným zdrojem infekce je pak lis a další zařízení používané během předfermentačních operací. Rozmnožování kvasinek probíhá nepohlavně pučením. Jejich generační doba se pak pohybuje v řádu několika hodin (Steidl, 2002). Během alkoholového kvašení vína se uplatňuje především rod Sacharomyces a jeho druhy, z nichž nedůležitější je Sacharomyces cerevisiae. Kvasinka Sacharomyces cerevisiae je elipsoidního tvaru o velikosti 5-10 µm (velký průměr) a 1-7 µm (malý průměr). Tělo buněk je tvořeno velmi pevnou buněčnou stěnou tvořenou polysacharidy (manany, glukany) obklopující vnitřní prostředí buňky cytoplasmu se systémem membrán a buněčnými organelami. Látkové složení těla kvasinky tvoří voda 2-5%, bílkoviny 42-46%, sacharidy 30-37%, nukleové kyseliny 6-8%, tuky 4-5% a minerály 7-8% (Hornsey, 2007; Hutkins, 2006). Obr. 4 - Tělo pučící kvasinky (Hornsey, 2007) Dle způsobu zisku energie potřebné k jejich růstu jsou kvasinky heterotrofní chemoorganotrofové, tj. organismy jenž získávají energii rozkladem organických sloučenin. Co se týče potřeby kyslíku, jsou kvasinky organismy fakultativně anaerobní, tj. pro svůj optimální růst a vývoj vyžadují určité množství kyslíku, dokáží však růst a množit se i bez něj (Hutkins, 2006; Riberau-Gayon et al., 2006a). Kvasinky metabolizují sacharidy obsažené v moštu. Jako takové jsou schopny transformace cukrů prostřednictvím dvou rozdílných metabolických procesů, 25

26 alkoholovou fermentací za anaerobních podmínek a dýcháním (prostřednictvím Krebsova cyklu a dýchacího řetězce) v podmínkách aerobních. Schopnost úplné oxidace glukózy kvasinkami Sacharomyces cerevisiae však záleží na tom, v jaké koncentraci se v daném médiu vyskytuje. Je-li obsah cukru vyšší než 9 g/l (v moštu běžně okolo g/l cukru), prodýchání glukózy pak není možné. Glukóza v moštu je tak během kvašení transformována prakticky jen metabolismem alkoholové fermentace. Tento jev je nazýván jako tzv. Crabtree-Efekt (Riberau-Gayon et al., 2006a). V době alkoholového kvašení se kvasinky stávají dominantními spotřebiteli kyslíku. Během fermentace je tím zajištěna dostatečná ochrana vůči oxidaci (Hornsey, 2007; Reynolds, 2010b) Význam kyslíku v procesu alkoholového kvašení Kyslík je během alkoholového kvašení, společně s dusíkem, důležitou potřebou kvasinek během podílející se na jeho správném průběhu a úspěšném dokončení (Riberau- Gayon et al., 2006a). Kvasný proces jako takový, tj. přeměna cukru na alkohol, je dějem anaeorobním. Pro optimální růst a množení kvasinek je však přítomnost určitého množství kyslíku základním předpokladem. Alkoholové kvašení se tak stává dějem fakultativně anaerobním (Hutkins, 2006; Reynolds, 2010b). Dříve nebyl kyslíku během alkoholového kvašení přikládán příliš velký význam, Pasteur o něm hovořil jako o životě beze vzduchu. Kvašení probíhalo v dřevěných sudech, kde byl zajištěn přirozený kontakt kvasícího moštu s kyslíkem a tak mohlo zdárně proběhnout bez jakéhokoli záměrného dodání. Po zavedení, dnes již převládajícího, kvašení bílých vín v uzavřených nerezových tancích, tj. v anaerobních podmínkách, byl prokázán jeho značný vliv v tomto procesu (Riberau-Gayon et al., 2006a). Kvašení bílých vín v uzavřených nerezových tancích umožňuje velmi dobrou kontrolu přijatého kyslíku, přesné dávkování a správné načasování jeho eventuálního dodání. Současně jsou minimalizována možná rizika, tj. především rozvoj nežádoucích bakterií. Kvašení bílých vín za stálého přístupu kyslíku není doporučováno. Dodání kyslíku může být realizováno přečerpáním kvasícího moštu nebo prostřednictvím provzdušňovacího zařízení. První způsob je vhodný pouze v případě moštu původem ze zdravých hroznů, v opačném případě je lépe jej omezit z důvodu zvýšeného rizika vzniku nežádoucích organismů (např. octových bakterií). Dle množství dodaného kyslíku pak 26

27 můžeme hovořit o zcela anaerobních (kyslík není dodáván), semi-anaerobních či omezeně aerobních podmínkách kvašení (Blaauw, 2009; Riberau-Gayon et al., 2006a). Průběh fermentace je třeba neustále sledovat a v případě potřeby regulovat, přičemž je práce s kyslíkem velmi dobrým prostředkem. Alkoholová fermentace bílých vín by neměla trvat déle než 12 dní, ideálně kolem 10 dní. Dodáním kyslíku můžeme proces významně urychlit, nutno však počítat se zvýšenou potřebou výživy dusíkem, vyšší teplotou, případně produkcí aromaticky nepříjemných sirných sloučenin a acetaldehydu v důsledku intenzivní činnosti kvasinek (Moreno-Aribas and Polo, 2009; Riberau-Gayon et al., 2006a) Kyslík během jednotlivých fází alkoholového kvašení Pro iniciaci alkoholového kvašení je potřeba řádově 10 milionů buněk kvasinek na 1 ml (ve vylisovaném moštu přítomno cca buněk/ml). Při inokulaci kvasinkami u bílých vín častější, je takový počet zajištěn. Prezence určitého množství kyslíku je tak důležitá zejména v případě iniciace spontánním kvašením, kdy je nezbytným prostředkem pro namnožení kvasinek do potřebného množství. Během operací a nezbytných manipulací ještě před započetím kvašení je však toto množství obvykle zajištěno a nemusí být nikterak záměrně dodáván. Dodání kyslíku v úplném začátku kvašení navíc podporuje rozvoj také ne-sacharomycetních kvasinek, což vždy nemusí být žádoucí (Hornsey, 2007; Pavloušek, 2010; Steidl, 2002). Podle počtu buněk kvasinek bychom mohli celý proces alkoholového kvašení rozdělit do 4 hlavních fází (mendelu, 2013) : 1) Lag fáze Latentní neboli tzv. lag fáze je krátkou, několika hodinovou, adaptační fází kvasinek, při níž se po iniciaci kvašení přizpůsobují náročným podmínkám moštu, nedochází nyní ještě k jejich množení. Až po jejím uběhnutí začíná docházet k buněčnému dělení (pučení) a kvasinky se začínají množit (Hornsey, 2007; Moreno-Aribas and Polo, 2009). 27

28 2) Exponenciální růstová fáze Exponenciální růstová fáze, též nazývaná jako hlavní růstová fáze, začíná cca ve 2. dnem po iniciaci kvašení. V jejím průběhu růst a množení kvasinek dosahuje svého vrcholu. Populace naroste až o buněk/ml. Současně tedy dochází také k maximální produkci etanolu, CO2 a dalších vedlejších produktů kvašení (Moreno- Aribas and Polo, 2009; Pavloušek, 2010). Tato významná fáze kvasného procesu trvá po dobu 3-6 dní (Moreno-Aribas and Polo, 2009). Na jejím konci bývá často žádoucí dodání určitého množství kyslíku. Nezbytné je při kvašení moštu o nízké turbiditě a vysokém obsahu cukru, tj. v případě obtížnějších podmínek pro kvašení. Kyslík v této fázi podporuje syntézu nenasycených mastných kyselin, lipidů a sterolů nezbytných součástí buněčných membrán kvasinek Sacharomyces cerevisiae a umožňuje tím jejich optimální růst. Zvyšuje jejich membránovou stabilitu, čímž přispívá větší odolnosti vůči vlivům okolního prostředí výkyvům teplot, chemickému složení kvasícího moštu, nižšímu obsahu výživy či pozdější vyšší koncentraci alkoholu. Kvasinky následně lépe přežívají během jejich stacionární fáze. Nedochází k jejich rychlému odumírání a tím vzniku nežádoucích reduktivních tónů. Zlepšuje se rovněž propustnost jejich buněčných membrán a průnik glukózy do buňky, kde je následně metabolizována. Výsledkem je urychlení a zkvalitnění procesu fermentace. Dodání kyslíku v době intenzivního množení kvasinek může zajistit až 2x rychlejší průběh fermentace, tj. téměř nebo zcela odpovídající rychlosti při kvašení za stálého přístupu vzduchu, stejných hodnot dosahuje i množství prokvašeného cukru a vzniklého alkoholu (Du Toit et al., 2006; Hornsey, 2007; Riberau- Gayon et al., 2006a). V této fázi dochází rovněž k intenzivní produkci řady sloučenin (metabolitů kvasinek, sekundárních produktů fermentace) činných při utváření organoleptického charakteru vína. Výsledkem působení kvasinek je pak vznik pestré škály esterů, vyšších alkoholů, volatilních mastných kyselin, karbonylových (nejvýznamnější acetaldehyd) či sirných volatilních sloučenin. Vzniká tzv. sekundární či chceme-li kvasný buket aromatické látky ethylestery mastných kyselin a acetáty vyšších alkoholů obohacující mladé víno o příjemné ovocné a květinové tóny. Přínosem může být také vyšší obsah samotných vyšších mastných kyselin, jenž mají antibakteriální vlastnosti. Následně je v hotovém víně možné jisté snížení dávek SO2, příznivé pro delší uchování některých sladkých bílých vín (Michlovský, 2014a; Moreno-Aribas and Polo, 2009; Steidl, 2002). 28

29 3) Stacionární fáze Stacionární fáze je nejdéle trvající fází kvašení, kdy činností kvasinek nadále probíhá přeměna cukrů na alkohol za vzniku vedlejších produktů. V této fázi již může kvašení probíhat i v anaerobních podmínkách. Kvasinky nerostou, a tudíž už v těchto pokročilejších fázích fermentace z dodaného kyslíku neprofitují (Moreno-Aribas and Polo, 2009; Riberau-Gayon et al., 2006a). 4) Fáze odumírání kvasinek Fáze odumírání kvasinek nastává vyčerpáním zkvasitelného substrátu a vyšším obsahem alkoholu, jenž je pro kvasinky toxický (Pavloušek, 2010; Riberau-Gayon et al., 2006a). Obr. 5 - Růstová křivka kvasinek (mendelu, 2013) Na skutečnost, že pro daný efekt je termín dodání kyslíku velmi zásadní, poukázal již Ribérau-Gayon (r. 1951) ve svém experimentu, jímž prokázal rozdíl mezi fermentací probíhající bez záměrného dodání kyslíku a fermentací během níž byl kyslík dodáván. Stejné závěry pak potvrzují i další výzkumy z let pozdějších Sablayorolles&Barre r. 1986, Fleet r Zároveň se výzkumy shodují i na množství potřebného kyslíku pro kvasinky řádově kolem 10 mg/l (Riberau-Gayon et al., 2006a). V minulosti panovaly jisté obavy z možných ztrát ovocného odrůdového aroma, a kvašení tak probíhalo v čistě anaerobních podmínkách. Nyní je však známo, že 29

30 aromatické látky odpovědné za toto aroma mohou být oxidací ovlivněny během předfermentačních operací, případně po odkalení po skončení fermentace. Dodání kyslíku v první polovině fermentace nemá na toto aroma vliv. Redukční síla kvasinek oxidaci účinně brání. Možné je lehké oslabení kvasného aroma. Riziko pomalého a váznoucího kvašení spojeného se striktně anaerobními podmínkami je však závažnější nežli minimální ztráty tohoto přechodného aroma. Naopak dodání určitého množství kyslíku účinně brání vzniku nepříjemných redukčních aromatických tónů (Riberau- Gayon et al., 2006a) Mikrooxidace v průběhu alkoholového kvašení Během výroby bílých vín, vzhledem k technologii výroby (kvašení v uzavřených tancích, předfermentační zpracování hroznů), bývá přínosné zahájit mikrooxidaci již v počátku alkoholového kvašení (Pavloušek, 2010). Kyslík dodaný v této fázi působí jako podpora růstu kvasinek, z čehož vychází i přesný termín její aplikace. Mikrooxidace je zaváděna přibližně v první třetině kvašení, tj. ke konci exponenciální růstové fáze kvasinek cca 5 dní po inokulaci moštu kvasinkami. Pro kýžený efekt byla ke konci této fáze zjištěna optimální dávka celkově dodaného kyslíku 5 mg/l. Jednotlivé dávky pak tedy mohou činit 2 mg/l/48 hodin (Du Toit et al., 2006) Zrání vína Po ukončení alkoholové fermentace jsou nádoby, v nichž kvašení probíhalo, opatrně doplněny a následně je postupováno podle toho, zda je či není žádoucí malolaktická fermentace (Riberau-Gayon et al., 2006a). Následuje proces zrání vína trvající po různou, velmi významný z pohledu látkového složení, potažmo organoleptických vlastností výsledného vína, přičemž je kyslík aktivním činitelem. Jeho působení může být pro víno velmi přínosné, ale stejně tak negativní. Rozhodujícím je složení daného mladého vína (oxido-redukční potenciál, aromatické látky) a jeho požadovaný výsledný styl. Tomu je pak nutno přizpůsobit i management kyslíku. Cílem je neomezit mocná plná vína v jejich rozvoji, ale zároveň zamezit předčasným ztrátám buketu příjemných lehkých vín přílišnou aerací (Michlovský, 2014b; Pavloušek, 2010; Reynolds, 2010b; Riberau-Gayon et al., 2006b). 30

31 Účinky kyslíku Doba po skončení alkoholové, případně malolaktické, fermentace je pro většinu bílých vín značně riziková. Víno v tomto období nabízí velmi vhodné podmínky k rozvoji nežádoucích oxidačních procesů. Působení kyslíku vede snadno k oxidativnímu charakteru vína a to zejména po stránce kvality aroma a barvy. Existuje rovněž značné riziko rozvoje nežádoucích mikroorganismů (Du Toit et al., 2006; Pavloušek, 2010). 1. Aroma Vývoj vína po stránce aromatické je jedním z hlavních účinků působení kyslíku v průběhu výroby vína a období zrání vína je v tomto velice významné. V bílých vínech jde po většinou o změny negativního charakteru (Pavloušek, 2010; Reynolds, 2010b). V následující tabulce jsou pak uvedeny sloučeniny, jenž byly stanoveny v oxidovaném bílém víně, jejich koncentrace a senzorické projevy v rámci vína. Tab. 1 - Senzorické dopady oxidace bílých vín (Du Toit et al., 2006) Sloučenina Senzorický projev Koncentrace (μg/l) furfural dřevnaté tóny, vařená zelenina 90,2 τ-2 nonenal vařená zelenina, dřevnaté tóny 62,6 eugenol vařená zelenina, dřevnaté tóny 6,2 5-M-furfural dřevnaté tóny 40,5 benzaldehyd vařená zelenina, dřevnaté tóny 165 hexenal pichlavý 62,3 fenylacetát medový methional krmivo pro zvířata TDN petrolej 90 vitispiran kafr, eukalyptus 360 Vlivem oxidace může poměrně snadno docházet také ke vzniku nadměrného množství acetaldehydu. Ten se tvoří již během alkoholového kvašení a ve víně následně vzniká oxidací etanolu. Projevuje se v podobě charakteristických pachů po jablkách či zvětralosti. Takto se projevuje, je-li v přebytku nad volným SO2, dodáním SO2 do stavu jeho mírné převahy lze tento efekt účinně eliminovat acetaldehyd se transformuje na siřičitý aldehyd, jenž nemá žádnou z těchto vlastností (Hornsey, 2007; Michlovský, 2014a; Reynolds, 2010b). Nepříznivým dopadem oxidace jsou i možné ztráty ovocného a květinového aroma vína. Kyslík během zrání vína inter-reaguje s látkami odpovědnými právě za tento, často velmi žádoucí, druh aroma. Ve vínech muškátových odrůd dochází k transformaci 31

32 terpenů na jejich méně aromatické oxidy. U Sauvignononu blanc a příbuzných odrůd se jedná o přeměny aromatických sirných sloučenin vonných thiolů (tóny grapefruitu, černého rybízu, mučenky) na sloučeniny odrůdově méně typického charakteru (Kumšta, 2007; Michlovský, 2014a,b; Reynolds, 2010a,b). 2. Barva Působením kyslíku dochází ve víně k chemické oxidaci fenolických látek, přičemž může být nápomocným také již zmiňovaný acetaldehyd (Du Toit et al., 2006). Barva vína pak bývá ovlivněna v její intenzitě a odstínu. Výsledkem je nahnědlá vyšší barva, hnědé vločky, hnědnutí povrchu vína srovnatelného s černým čajem. Možný je také vznik oxidačních zákalů hnědého, železitého ( olovnatá barva vína), bílého (bílá nebo našedlá barva koloidní povahy) (Michlovský, 2014a; Steidl, 2002). 3. Mikrobiologická rizika Víno po vykvašení obsahuje stále dostatečné množství živin pro růst mikroorganismů a v kombinaci s kyslíkem tudíž představuje vhodné prostředí k jejich rozvoji. Závažným postihem je potom zejména tzv. octovatění vína. Činností octových bakterií dochází ke zvýšení obsahu těkavých kyselin projevujících se kyselým pachem po octu a ostře kyselou chutí (Pavloušek, 2010; Steidl, 2002) Ochrana vína před nežádoucí oxidací Pro omezení nežádoucí oxidace ve víně je základem minimalizace nekontrolovaného styku vína s kyslíkem. K omezení rizik spojených s mikrobiální oxidací také důsledná hygiena provozu a ukončené alkoholové, případně jablečno-mléčné kvašení (Michlovský, 2014b; Pavloušek, 2010). Reaktivita kyslíku rozpuštěného ve víně stoupá s teplotou (Rankine and Pacock, 1970 in Farkaš, 1988). Žádoucí je proto teplota do C (Du Toit et al., 2006). Základním protektivním opatřením chemické ochrany je aplikace SO2. Oxid siřičitý, jakožto silný antioxidant, brání oxidaci jiných sloučenin včetně etanolu a acetaldehydu. Hlavní antioxidační účinek spočívá v zabránění rychlé reakce oxidovatelných látek s H2O2. Vzniká H2S a ten, je-li obsažen v nízkých koncentracích, nezpůsobuje žádné nežádoucí aromatické projevy. Acetaldehyd s oxidem siřičitým tvoří siřičitý aldehyd, nevykazující žádné nežádoucí účinky. Simultánně působí 32

33 antimikrobiálně a brání tak rozvoji mikrobiální oxidace. Hladina volné SO2 ve víně je obvykle udržována v koncentraci kolem 30 mg/l. Pro styl moderních mladých vín vyznačujících se svým svěžím ovocným aroma, kdy je žádoucí zachování primárních a sekundárních aromatických látek, je třeba vyšších dávek. Naopak při výrobě velkých bílých vín, kdy vlivem kyslíku dochází k vývoji jejich buketu během delšího zrání je optimální dávky snížit (Du Toit et al., 2005; Kumšta, 2007; Reynolds, 2010b). Aplikace kyseliny askorbové je komplikovanější. Samotná dává vzniku H202 a může tak být spíše prooxidantem nežli antioxidantem. Vhodná je pouze v kombinaci s SO2 a pouze u mladých vín určených k rychlé spotřebě, uzavřených inertní (šroubovací) zátkou. V případě vín déle zrajících, zrajících v lahvi opatřených korkovým uzávěrem, se její užití příliš nedoporučuje (Du Toit et al., 2006; Kumšta, 2007). Novým prostředkem ochrany vína, jenž může být do vína dodáván, schváleným OIV (International Organization of Vine and Wine) v roce 2015, je glutathion (GSH redukovaná forma). Dodáván je před lahvováním vína, a to v dávkách maximálně 20 mg/l. Účinný je především pro uchování aroma vína, míra účinnosti však závisí na složení, tj. obsahu ostatních antioxidantů vína (Antoce et al., 2016). Možná je také ochrana pomocí inertních plynů, jimiž mohou být vyplněny nádoby ještě před jejich naplněním vínem. Při transportu z tanku do tanku pak mohou být naplněny hadice a dna tanků oxidem uhličitým, což brání styku s kyslíkem v původní nádobě (Du Toit et al., 2006) Způsoby zrání Principiálně záleží volba způsobu, tedy v jakých podmínkách bude víno zrát, na daném typu vína a jeho očekávané kvalitě. Rozhodujícími jsou ale rovněž možnosti (materiálové, finanční) konkrétního vinařského provozu. Zrání bílých vín probíhá především v reduktivních podmínkách, tj. v uzavřených nerezových tancích, jenž zajišťují dobrou kontrolu přijatého kyslíku a prostředí limitující výskyt po většinou nežádoucích oxidačních jevů (Blaauw, 2009; Michlovský, 2014b; Riberau-Gayon et al., 2006a). Zrání v podmínkách mikrooxidace, tedy za stálého přístupu vzduchu je možné, ale vhodné pro výrobu jen určitého typu vín a tj. suchých bílých vín se schopností rozvoje svých organoleptických vlastností během delšího zrání a následného ležení v lahvi. Taková vína tedy mohou zrát i v dřevěných sudech. Kyslík přispívá k rozvoji jejich aroma 33

34 v podobě tzv. terciálního buketu (Riberau-Gayon et al., 2006). Typicky se jedná o vína burgundských odrůd jako je Chardonnay, Rulandské bílé, Rulandské šedé, dále např. Veltlínské zelené, Ryzlink vlašský, Neuburské či Sylvánské zelené (Michlovský, 2014b). Z pohledu technologického se však jedná o velmi pracnou a časově náročnou metodu, navíc značně finančně nákladnou, a tedy vhodnou zejména pro produkci dražších, prémiových vín. Díky dnes dostupným prostředkům (technologie řízené mikrooxidace, dřevěné hobliny a jiné alternativy dubových sudů) lze zajistit takové prostředí i v nerezových tancích. Výroba je méně náročná a kvalitativní parametry hotového vína téměř srovnatelné s vínem zrajícím v sudu (Parish et al., 2000; Riberau- Gayon et al., 2006a) Ležení vína na kvasnicích účinky, rizika Oxido-redukční děje ve zrajícím víně jsou často spojeny také s přítomností kvasničných kalů. Kvasinky jsou i po odumření schopny intenzivně spotřebovávat kyslík a zrající víno je tak dobře chráněno vůči oxidaci (Reynolds, 2010b; Riberau-Gayon et al., 2006a). Během zrání dochází k autolýze odumřelých těl kvasinek a přechodu látek z jejich těl do vína. Tyto látky pozitivně působí při utváření organoleptických vlastností vína. Jmenovat bychom mohli např. vznik esterů mastných kyselin a vyšších alkoholů, tj. látky tvořící příjemné ovocné tóny ve víně. Manoproteiny z buněčných stěn napomáhají stabilizaci kyseliny vinné a zabraňují oxidaci ovocných vůní. Vlivem kyslíku probíhá oxidace membránových lipidů kvasinek, vznik lipidových peroxidů a dalších produktů formujících chuťové vlastnosti (plnost, kulatost ) vína. Pozitivním aspektem je také možnost snížení potřebné dávky SO2 (Moreno-Aribas and Polo, 2009; Reynolds, 2010b; Štefková, 2011). Působením kvasinek však vznikají také sloučeniny jako H2S, methanthiol (methymerkaptan) či ethanthiol (ethylmetrkaptan). Tyto látky se ve vyšších koncentracích projevují nepříjemnými, tak zvanými redukčními tóny, tj. pachy po zkažených vejcích, zelí, česneku, cibuli apod. V tomto ohledu působí kyslík během zrání velmi prospěšně (Michlovský, 2014a; Riberau-Gayon et al., 2006a). Objeví-li se tyto tóny, lze je dodáním kyslíku, tj. oxidací odpovědných sirných sloučenin, účinně eliminovat (Reynolds, 2010b). 34

35 Mikrooxidace v průběhu zrání vína Druhým vhodným termínem pro dávkování kyslíku prostřednictvím této technologie je období zrání vína. Umožňuje ponechání vína zrajícího v uzavřených tancích na jemných či středních kalech, čímž pozitivně přispívá vývoji jeho organoleptických vlastností. Víno je hladší, jemnější, plnější, bez projevů redukčních aromatických tónů (Parish et al., 2000; Pavloušek, 2010; Riberau-Gayon et al., 2006). Mikrooxidace je obvykle zaváděna začátkem zrání, po ukončení případné jablečnomléčné fermentace, případně před jejím zahájením. Zahájení mikrooxidace v době před jablečno-mléčnou fermentací, případně při neukončené alkoholové fermentaci je však velmi rizikové, co se týče rozvoje nežádoucích mikroorganismů, jimž jsou tímto poskytovány příznivé podmínky působení kyslíku v kombinaci s vyšším obsahem zbytkového cukru (Parish et al., 2000; Pavloušek, 2010). Dávkování je stanovováno na základě původního způsobu zrání v těchto podmínkách, tj. v sudu. Během zrání vína v dřevěných sudech přichází víno přirozeně do styku s kyslíkem v množství cca 40 mg/l /rok, což odpovídá přibližně 3-4 mg/l/měsíc kyslíku. Při mikrooxidaci vína zrajícího v uzavřených tancích je doporučenou dávkou 4-5 mg/l/měsíc při teplotě 15 C. Přesná dávka se však často liší v závislosti na konkrétním víně, teplotě a přesném termínu zahájení mikrooxidačního procesu (Blaauw, 2009; Du Toit et al., 2006; Ribéreau-Gayon et al., 2006a). 35

36 4. Metodika experimentální části Cílem experimentální části práce bude zhodnotit, to jest potvrdit nebo vyvrátit hypotézu předpokládající pozitivní účinky metody mikrooxidace na kvalitu bílého vína. Hodnoceny budou organoleptické vlastnosti hotového vína a to prostřednictvím stanovení aromatického profilu a senzorickou analýzou. Vyhodnocení bude poté spočívat v porovnání vína mikrooxidovaného a vína vyrobeného ze stejného moštu, při jehož výrobě nebylo této metody využito a jenž tak bude sloužit jako kontrola. 4.1 Výroba vína a mikrooxidace Na experiment byly vybrány dvě odrůdy vína, a to Rulandské bílé a Rulandské šedé. Po vylisování a odkalení, byl získaný mošt každé odrůdy rozdělen na dvě části, přičemž jedna část moštu byla mikrooxidována a druhá byla vyrobena klasickým postupem, tedy sloužila jako kontrola. Celý proces mikrooxidace a výroby vína probíhal ve výrobním zázemí firmy Vinicola se sídlem v Břeclavi. První program mikrooxidace byl u každé odrůdy zahájen na konci první třetiny kvasného procesu v délce 48 hodin. Dávka kyslíku byla 2 mg/l/48 hodin při teplotě C. V průběhu kvasného procesu byly každý den odebírány vzorky. Druhý program mikrooxidace byl zahájen ve fázi zrání vína, a to po první stáčce z hrubých kalů, po dobu cca 6 měsíců. Dávka kyslíku byla 4-5 mg/l/měsíc při teplotě 15 C. V průběhu zrání vína se vzorky neodebíraly, odebrány byly až vzorky hotového vína po ukončení celého procesu výroby. V tabulce jsou uvedeny základní parametry moštu po odkalení, ještě před jeho rozdělením a zahájením mikrooxidace. Obsah cukru v moštu byl měřen refraktometricky, tj. na základě indexu lomu světla. Hodnota ph moštu byla stanovena pomocí kombinované skleněné elektrody SenTix 21. Obsah titrovatelných kyselin a asimilovatelného dusíku byl stanoven pomocí odměrné analýzy, tedy titrací. Obsah veškerých titrovatelných kyselin byl stanoven alkalimetricky za pomoci automatického titrátoru TitroLine easy, a to titrací 10 ml vzorku odměrným roztokem 0,1M NaOH do bodu ekvivalence ph 8 měřeným skleněnou elektrodou. Z odečtené spotřeby NaOH se vypočítal obsah titrovatelných kyselin, vyjádřených v ekvivalentech kyseliny vinné. Do ztitrovaného roztoku se přidalo 5 ml roztoku formaldehydu a pokračovalo se v titraci 36

37 odměrným roztokem NaOH znovu do ph 8. Z odečtené spotřeby NaOH se vypočítal obsah asimilovatelného dusíku (tj. volných aminokyselin a amonných iontů) (Balík, 2011). X 1 = a f 0,75 [g l -1 ] X 1 - obsah veškerých titrovatelných kyselin v g l -1 a - spotřeba roztoku NaOH v ml f - faktor roztoku NaOH X 2 =( a-blank) f 140 [mg.l -1 ] X 2 - množství dusíku v mg N l -1 a - spotřeba roztoku NaOH v ml f - faktor roztoku NaOH Tab. 2 - Základní parametry moštu Rulandské šedé Rulandské bílé Datum Cukr [ NM] ph Titrovatelné kyseliny [g/l] Asimilovatelný dusík [mg/l] ,5 3,4 7,4 245, ,4 2,8 10,0 339, Aromatický profil pomocí GC analýzy Aromatický profil porovnávaných vín byl stanoven metodou plynové chromatografie. Princip metody spočívá v rozdělení složek mezi dvě fáze mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou). V plynové chromatografii je mobilní fází plyn, tzv. nosný plyn. Fáze stacionární je umístěna v chromatografické koloně. Stacionární fáze u náplňových kolon může být pevná látka (aktivní uhlí, silikagel, oxid hlinitý, polymerní sorbenty apod.) či vysokovroucí kapalina nanesená v tenké vrstvě na pevném, inertním nosiči. U kapilárních kolon je stacionární fáze nanesena v tenké vrstvě přímo na upravenou vnitřní stěnu kapiláry. Princip separace látek plynovou chromatografií je následující. Kolonou se stacionární fází prochází stále nosný plyn. Vzorek je vnesen (nastříknut) do vyhřívaného bloku - nástřikové komory (injektoru), kde se odpaří a ve formě par je unášen nosným plynem do kolony. Složky se separují v koloně na základě odlišné schopnosti poutat se na stacionární fázi. Každá složka vzorku postupuje kolonou svou vlastní rychlostí závislou na distribuční konstantě složky KD = cs/cm, kde cs a cm jsou rovnovážné koncentrace složky ve stacionární a v mobilní fázi. Látky postupně vycházejí z kolony v pořadí rostoucích hodnot distribučních konstant a vstupují do detektoru. Detektor 37

38 indikuje okamžitou koncentraci separovaných látek v nosném plynu. Signál detektoru je vhodně upraven a plynule se registruje. Výsledkem je grafický záznam závislosti signálu detektoru na čase nazývaná jako chromatogram. Popsaná chromatografická technika se označuje jako eluční. Dojde-li na chromatografické koloně k rozdělení - separaci všech n-sloţek analyzovaného vzorku, obsahuje chromatogram n-elučních křivek - píků těchto složek. Dle polohy píku pak lze vyslovit předpoklad o identitě látky. Plocha píku je úměrná množství látky ve vzorku (Krofta a kolektiv, 1997). Koncentrace jednotlivých volatilních sloučenin pak byly stanoveny dosud nepublikovanou metodou extrakce methyl t-butyletherem. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetovalo 20 ml vzorku vína, 50 µl roztoku-2-nonanolu, sloužícího jako vnitřní standard, o koncentraci 400 mg/l. Poté bylo přidáno 1,5 ml extrakčního rozpouštědla MTBE s přídavkem 1% cyklohexanu. Po důkladném protřepání a oddělení fází byla vrchní vrstva i s podílem vzniklé emulze odebrána do mikrozkumavky, odstředěna čirá organická fáze vysušena bezvodým síranem hořečnatým. Takto upravený extrakt byl pak použit ke GC-analýze. Instrumentace: Shimadzu GC 17A Autosampler: AOC 5000 Detektor: QP 5050A Software: GC Solution Podmínky separace: Kolona: DB WAX 30m x 0,25 mm; 0,25µm stacionární fáze (polyethylenglykol) Objem nástřiku vzorku: 1 µl split poměr 1:5 Průtok nosného plynu He: 1 ml/min (lineární rychlost plynu 36 cm/s) Teplota nástřikového prostoru: 180 C Počáteční teplota kolonového prostoru 45 C se udržuje 3,5 minuty, poté následuje gradient teploty: Do 75 C o 6 C/min Do 126 C o 3 C/min Do 190 C o 4 C/min Do 250 C o 5 C/min, konečná teplota se udržuje následných 6,5 min. Celková délka analýzy je 60 minut. Detektor pracuje ve SCAN modu s intervalem 0,25 s v rozmezí Napětí detektoru 1,5 kv. 38

39 Jednotlivé látky byly identifikovány na základě MS spektra a retenčního času. Kvantifikace byla následně provedena porovnáním plochy píku vzorku a vnějšího standardu s korekcí na vnitřní standard. 4.3 Senzorická analýza U hotového vína byla provedena senzorická zkouška za účasti 9 profesionálních degustátorů s použitím stobodového systému mezinárodní unie enologů dle rezoluce OIV (mezinárodní organizace pro révu a víno) pro hodnocení vín z roku Osvědčení degustátorů bylo dle evropských a českých norem ČSN, ISO a DIN. Výsledky byly zaznamenány do 100 bodové tabulky k hodnocení vín a následně jejich průměrné hodnoty zaneseny do sloupcových grafů. 39

40 5. Výsledky 5.1 Aromatický profil Stanovením aromatického profilu každého z testovaných vzorků vín byla zjištěna přítomnost volatilních sloučenin. Byly stanoveny vyšší alkoholy, mastné kyseliny, estery (ethylacetát, ethylaestery mastných kyselin, acetáty vyšších alkoholů) a další látky. Z tabulky výsledků je zřejmé, že u obou testovaných odrůd byl v mikrooxidovaných vzorcích (Mox) stanoven vyšší celkový obsah volatilních sloučenin než v nemikrooxidovaných (NeMox) a také vyšší obsah esterů, mastných kyselin, vyšších alkoholů, polyalkoholu, 2,3-butandiolu, ethyllaktátu, methionolu a acetoinu, menší byla naopak koncentrace 1,1-diethoxyethanu. Mikrooxidované víno odrůdy Rulandské šedé (RŠ) obsahovalo vyšší koncentrace veškerých přítomných esterů vyšších alkoholů, Ruladnské bílé (RB) obsahovalo méně isoamylacetátu a 2-phenylethylacetátu. Tab. 3 - Stanovené volatilní sloučeniny a jejich koncentrace v rámci jednotlivých vzorků Stanovená látka jednotka vzorek RŠ Mox RŠ NeMox RB Mox RB NeMox Isoamylalkohol mg/l 185,6 140,3 182,9 133,4 Isobutylalkohol mg/l 28,1 21,4 18,3 10,9 2-Phenylethanol mg/l 5,8 4,6 6,9 5,4 1-Propanol mg/l 19,7 12,9 16, Butanol μg/l Hexanol μg/l ,3-Butandiol mg/l 1071,4 656,6 968,6 634,5 Máselná kys. mg/l 1,22 0,93 1,59 1,26 Isomáselná kys. mg/l 1,9 1,5 1,7 1,23 Isovalerová kys. mg/l 0,29 0,22 0,33 0,27 2-Methylbutanová kys. mg/l 0,23 0,17 0,16 0,12 Hexanová kys. mg/l 4,23 3,66 4,14 3,46 Oktanová kys. mg/l 4,24 3,74 4,92 4,67 Dekanová kys. mg/l 1,61 1,5 1,86 1,79 Dodekanová kys. μg/l Ethyl acetát mg/l 35,7 28,1 33,6 35,8 Ethyl butyrát μg/l Ethyl hexanoát μg/l Ethyl oktanoát μg/l Ethyl dekanoát μg/l Ethyl dodekanoát μg/l Ethyl laktát mg/l 11,24 8,93 6,98 3,93 Isoamyl acetát mg/l 4,04 3,49 5,97 6,07 2-Phenylethyl acetát μg/l Isobutyl acetát μg/l Hexyl acetát μg/l Methionol mg/l 0,87 0,71 0,64 0,41 1,1-Diethoxyethan μg/l Acetoin mg/l 2,9 2,6 1,7 1,1 40

41 5.2 Senzorická analýza V rámci senzorické analýzy byly porovnávané vzorky vín hodnoceny tak, že u obou testovaných odrůd dosahovalo mikrooxidované víno vyššího průměrného bodového hodnocení nežli víno nemikrooxidované, a to jak v celkovém hodnocení, tak v jednotlivých hodnocených parametrech. Průměrný celkový bodový zisk činil u mikrooxidovaných vín 75 (Rulandské šedé) a 82,3 (Rulandské bílé) bodů naproti jejich nemikrooxidovaným variantám, kdy tyto zisky činily 70,3 (RŠ) a 79,6 (RB) bodů. Co se týče vína odrůdy Rulandské šedé, činil bodový rozdíl zaokrouhleně 4,7 bodů ve prospěch mikrooxidované varianty, u odrůdy Rulandské bílé byl tento rozdíl 2,7 bodů. Vyhodnocení, jakožto i rozdíl mezi mikrooxidovanou a nemikrooxidovanou variantou v rámci dané odrůdy ilustruje následující graf. Graf 1 - Senzorická analýza celkové průměrné hodnocení Vysvětlivky: 1 Rulandské šedé 2 Rulandské bílé V rámci příloh práce je k dispozici také grafické vyhodnocení hodnocených parametrů. 41

42 6. Diskuse 6.1 Aromatický profil Stanovením aromatického profilu byla prokázána přítomnost široké škály významných volatilních sloučenin. Některé ze stanovených látek mohou být přítomny již v hroznech, ve větším množství však vznikají až během alkoholové fermentace jako produkty průvodních reakcí nebo jsou přímo kvasničného původu, tj. produktem metabolismu kvasinek (estery, vyšší alkoholy, mastné kyseliny). Mikrooxidované vzorky obou testovaných odrůd prokázaly vyšší celkový obsah těchto sloučenin a z velké většiny i vyšší koncentrace jednotlivých látek, případně skupin látek. Lze tak očekávat, že bude mikrooxidované víno aromaticky výraznější nežli víno nemikrooxidované. V diskusi bude dále věnována pozornost zejména esterům, látkám významně formujícím ovocné aroma vína. Právě pro tuto svou vlastnost je prezence těchto látek, a tudíž i prostředků napomáhajících jejich vzniku, v bílém víně často velmi žádoucí. Je zřejmé, jelikož jsou to látky vzniknuvší reakcí alkoholu, resp. etanolu s kyselinou, že nejintenzivněji se budou tvořit během hlavní (exponenciální) růstové fáze kvasinek, tj. tedy termínu aplikace mikrooxidace. Kvasinky, resp. jejich těla, obsahují ve svém nitru řadu látek, mimo jiné, také vyšších mastných kyselin hexanové, oktanové, dekanové či dodekanové, jenž jsou významnou součástí jejich buněčných membrán. Po jejich odumření pak ve víně tato těla zůstávají, dochází k autolýze (rozpuštění buněčných stěn) a přechodu daných látek do vína. Zmíněné mastné kyseliny poté reagují s etanolem za vzniku estrů (ethylesterů) mastných kyselin. Je známo, že působením kyslíku narůstá počet buněk kvasinek, tudíž by se s tímto nárůstem měla zvýšit také koncentrace, resp. intenzita projevu, těchto esterů ve víně. Vína s vyšším obsahem těchto látek jsou pak ve svém aroma příjemná, svěží, ovocná, můžeme v nich hledat tóny banánu, hrušky, zeleného jablka či ananasu. Většina esterů se ve víně obvykle pohybuje v koncentracích kolem hraničních hodnot prahového vnímání, a tak i malá změna jejich obsahu má vliv na aromatický charakter vína (Moreno-Aribas and Polo, 2009; Riberau-Gayon et al., 2006a; Štefková, 2011). Z přítomných esterů překročil svůj čichový práh u obou Mox vín obsah ethylhexanoátu. U těchto vín, oproti jejich NeMox variantě, bychom tak mohli nalézat tóny banánu či zeleného jablka. V mikrooxidovaném víně odrůdy Rulandské šedé se pak 42

43 nad tímto prahem, opět na rozdíl od jeho nemikrooxidované varianty, pohyboval také obsah ethyldekanoátu. Další významnou skupinou esterů vzniknuvších v důsledku působení kvasinek jsou estery vyšších alkoholů. Jedná se opět o látky, jenž dodávají vínu příjemné ovocné a květinové tóny. V tomto ohledu byla mikrooxidace přínosem zvláště u vína odrůdy Ruladské šedé. U tohoto vzorku vína byl zjištěn rovněž vyšší obsah ethylacetátu (esteru etanolu a kyseliny octové), který, je-li obsažen v nízkých koncentracích (do 70 mg/l), dodává vínu na komplexnosti a opět přispívá lehkému ovocnému aroma mladého vína. Mezi estery byl stanoven také ethyllaktát známý jako tzv. zakulacovač nebo zjemňovač chuti a ethylbutyrát, jenž vínu dodává meruňkovou vůni. Mikrooxidované víno pak obsahovalo vyšší koncentrace obou jmenovaných látek než víno nemikrooxidované, a tudíž i zde můžeme označit účinky mikrooxidace za pozitivní. Aromatické projevy jednotlivých esterů stanovených v testovaných vzorcích pak zobrazuje následující tabulka. Tab. 4 - Stanovené estery vytvořené kvasinkami a jejich aromatické projevy (Pavloušek, 2010; Michlovský, 2014) Ester Aromatický projev 1. Ethyl acetát ovocný 2. Ethyl butyrát meruňková 3. Ethyl hexanoát zelené jablko, banán 4. Ethyl oktanoát sladké mýdlo, hruška, ananas 5. Ethyl dekanoát příjemné, mýdlové tóny 6. Ethyl dodekanoát mýdlové tóny 7. Ethyl laktát jahoda, máslo (zakulacovač chuti) 8. Isoamyl acetát zralé banány 9. 2-Phenylethyl acetát květiny 10. Isobutyl acetát banán, ovoce Hexyl acetát sladký, parfém Rovněž celková koncentrace esterů, samotných mastných kyselin a vyšších alkoholů byla u mikrooxidovaných vzorků vyšší než u vzorků nemikrooxidovaných. Na základě toho lze předpokládat, že tato vína budou aromatičtější, ovocnější, jemnější s větším potenciálem dalšího rozvoje a delšího uchování si tohoto svého aroma. Výsledky provedených analýz tak potvrdily hypotézu a prokázaly účinky mikrooxidace jakožto prostředku ke zlepšení organoleptických vlastností vína, což bylo hlavním úkolem experimentu. Současně potvrdily význam termínu její aplikace, čímž se shodují s výsledky v minulosti prováděných experimentů, např. Riberau-Gayon,

44 Kdybychom měli mezi sebou porovnat i dvě testované odrůdy Rulandské šedé a Rulandské bílé, byl rozdíl v celkovém obsahu volatilních látek mezi mikrooxidovaným a nemikrooxidovaným vzorkem signifikantnější, a tudíž přínos mikrooxidace větší u první jmenované. Můžeme se domnívat, že tento rozdíl byl způsoben danou odrůdou či kvalitou původního moštu, existuje však i řada dalších aspektů, jenž mohly tuto skutečnost ovlivnit. 6.2 Senzorická analýza Senzorickou analýzou testovaných vzorků vín byly opět prokázány pozitivní účinky mikrooxidace stran organoleptické kvality vína. Mikrooxidované víno bylo v průměru lépe hodnoceno po stránce vizuální, aromatické, chuťové i co se týče celkového dojmu. Nejvýraznější rozdíl mezi mikrooxidovaným a nemikrooxidovaným vínem byl u obou hodnocených odrůd zaznamenán v harmonii aroma vína. Tato skutečnost se tak setkává s úvahu vedenou na základě stanoveného aromatického profilu. Při porovnání dvou testovaných odrůd se v rámci dané dvojice i nyní, v souvislosti s mikrooxidací, lépe projevilo mikrooxidované víno odrůdy Rulandské šedé. 44

45 5. Závěr Při produkci bílých vín jsou kyslíku stále přičítány převážně negativní účinky. Díky dostupným poznatkům a získaným zkušenostem, je však postupně tento názor relativizován. Podkladem tomu muže sloužit i tato práce. Na základě výstupů provedeného experimentu, sestávajícího ze stanovení aromatického profilu a senzorické analýzy, byl prokázán význam dodání určitého množství kyslíku v čase alkoholového kvašení a zrání vína. Mikrooxidované víno obou testovaných odrůd jevilo lepších organoleptických vlastností, nežli víno vyrobené ze stejného moštu, avšak klasickým reduktivním způsobem. Jako zvlášť přínosné lze hodnotit působení kyslíku stran tvorby esterů, zejména pak esterů mastných kyselin a vyšších alkoholů. Lze tak očekávat příjemné, svěží, ovocné víno, s tóny hrušek, jahod, tropického ovoce banán, ananas. Víno mohlo zrát v přítomnosti kvasničných kalů, aniž by došlo k rozvoji redukčních tónů. Praxe tak potvrdila teorii, na jejímž principu je aplikace metody mikrooxidace bílých vín založena Zavedení mikrooxidace, resp. mikrooxidačního zařízení tak může být zajímavým doplněním výbavy vinařského provozu, případně vhodnou méně nákladnou a časově náročnou alternativou dřevěných sudů. Nákladově se pořízení mikrooxidačního zařízení pohybuje řádově kolem Kč (Vinovation, 2001). Cena dřevěných sudů se může velmi různit, běžně se však pohybuje cca od 16 do Kč za jeden 225 l sud (BS vinařské potřeby), přičemž se dále navyšuje o další provozní náklady. Vhodné řešení tak může představovat například ponechání dřevěných sudů pro výrobu dražších prémiových vín a zbylá vína mikrooxidovat v tancích pomocí mikrooxidačního zařízení. V oblasti technologie výroby bílých vín je využití řízené mikrooxidace novým a velmi aktuálním tématem. Dosud však byla ve spojitosti s touto technologií věnována pozornost zejména výrobě červených vín. Do budoucna by proto bylo přínosné vedení dalších výzkumů zabývajících se touto problematikou. Zajímavým by mohlo být sledování dalších odrůd vhodných k vinifikaci v těchto podmínkách, případně porovnání bílého vína mikrooxidovaného přirozeně v dřevěných sudech s vínem připraveným v nerezovém tanku, mikrooxidovaným za pomoci mikrooxidačního zařízení. Tady však vyvstává otázka vlivu dřeva, co se týče výsledných senzorických vlastností. Zatímco u mikrooxidace máme možnost vyrobit víno senzoricky neutrální, u zrání v sudech je aroma téměř vždy ovlivněno aromatickými látkami dřeva. 45

46 6. Souhrn a Resumé Kyslík je významným faktorem činným během celého procesu výroby vína, je jedním z hlavních původců oxidace moštu a vína. Jeho působení má různé účinky, pozitivní či negativní, přičemž hraje významnou roli při formování organoleptických vlastností vína. V technologii výroby bílých vín je kyslík známý především pro své negativní účinky, zejména v podobě hnědnutí barvy či ztrát ovocného aroma, často jedné z klíčových vlastností. Mošty a vína bílých odrůd jsou k oxidaci přirozeně velmi citlivá. Tato skutečnost je dána především složením jejich fenolických látek, jenž představují v první řadě hydroxyskořicové kyseliny a jejich deriváty. Z tohoto důvodu probíhá výroba bílých vín převážně v reduktivních podmínkách. Je kladen značný důraz na ochranu vůči nežádoucí oxidaci, zejména v počátečních fázích výroby. Záměrné dodání kyslíku je možné, žádoucí může být zejména v průběhu alkoholového kvašení, avšak musí být vždy důsledně kontrolováno. Současné vinařství směřuje v tomto případě k využívání technologií řízeného dodání kyslíku, respektive hyperoxidace a mikrooxidace. Obsahem práce je literární rešerše přibližující danou problematiku, tj. vliv a management kyslíku ve všech fázích výroby bílých vín, přičemž současně představuje jednotlivé technologie řízeného dodání kyslíku a možnosti jejich využití. Experimentální část práce je věnována konkrétně mikrooxidaci bílých vín. Analytickým porovnáním, stanovením aromatického profilu a senzorickou analýzou, mikrooxidovaných vzorků se vzorky vyrobenými v reduktivních podmínkách potvrzuje hypotézu o příznivých účincích této metody ve vztahu k organoleptickým vlastnostem vína. Klíčová slova: kyslík, bílé víno, oxidace, hydroxyskořicové kyseliny, mikrooxidace 46

47 Oxygen is an important factor active during all winemaking process. It is one of the main agents responsible for the oxidation of must and wine. The exposure to oxygen may have different effects, positive or negative, while it plays an important role in the formation of the organoleptic qualities of wine. In white winemaking, oxygen is known particularly for its negative impacts, especially for the colour browning and the losses of the fruity aroma, often one of the key qualities. White musts and wines are naturally prone to oxidation. This is due to the composition of their phenolic compounds, which are represented primarily by hydroxycynamic acids and their derivates. For this reason the white winemaking process is realised mostly in reductive conditions. Big emphasis is put on the protection against undesirable oxidation, particularly at the begining of the process. Deliberate introduction of oxygen is possible, it may be desirable especially during the alcoholic fermentation, but it has to be always well controlled. In this case, the contemporary winemaking aims to use the techniques of controlled aeration, hyperoxidation and micro-oxygenation respectively. The thesis contains a review approaching the issue the impact and the management of oxygen in all stages of the white winemaking and present the techniques of controlled aeration and their possible utilization. The experimental part of the thesis is dedicated to the micro-oxygenation of white wines. Through the analytical comparison, aromatic profile and sensory analysis, of the micro-oxidized wine and the wine prepared in reductive conditions confirms the hypothesis regarding the positive effects of this technique in relation to the organoleptic qualities of wine. Key words: oxygen, oxidation, white wine, hydroxycynamic acids, micro-oxygenation 47

48 7. Seznam použité literatury ANTOCE, A.O., G.A. BADEA a G.A. COJOCARU. Effects of Glutathione and Ascorbic Acid Addition on the CIELab Chromatic Characteristics of Muscat Ottonel Wines. Agriculture and Agricultural Science Procedia [online]. 2016, 10, [cit ]. Dostupné z: S main.pdf?_tid=e7f2f25a-1a43-11e aacb362&acdnat= _77c69c2df01215fae1a8be4cdd5f3787 BALÍK, Josef. Vinařství: návody do laboratorních cvičení. Vyd. 3., nezměn. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, ISBN BLAAUW, D.A. Micro-oxigenation in contemporary winemaking [online]. Stellenbosch: Sauth Africa, 2009 [cit ]. Dostupné z: Diplomová práce. Cape Wine Academy. BURG, Patrik a Pavel ZEMÁNEK. Stroje a zařízení pro vinařství. Olomouc: Agriprint, ISBN CORONA, O. Wine-making with Protection of Must against Oxidation in a Warm, Semiarid Terroir. South African Journal of Enology & Viticulture [online]. 2010, 31(1), [cit ]. ISSN Dostupné z: DU TOIT, W.J., J. MARAIS J., PRETORIUS, I.S a M. DU TOIT, M.. Oxygen in Must and Wine: A review. South African Journal of Enology & Viticulture [online]. 2006, 27(1), [cit ]. ISSN Dostupné z: 48

49 DU TOIT, W.J., I.S. PRETORIUS a A. LONVAUD-FUNEL. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability andculturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and astrain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology [online]. 2005, 98, [cit ]. DOI: /j x. Dostupné z: FARKAŠ, Ján. Technology and Biochemistry of Wine. New York: Gordon and Breach Science Publishers, GREENWOOD, N. N. a Alan EARNSHAW. Chemie prvků. Přeložil František JURSÍK. Praha: Informatorium, ISBN HAMPEL, Cliford A. The encyclopedia of the chemical elements. Reinhold, ISBN HORNSEY, Ian S. The chemistry and biology of winemaking. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, c2007. ISBN HUTKINS, Robert W. Microbiology and technology of fermented foods. Ames, Iowa: Blackwell Pub., ISBN Krofta a kol., Návody pro laboratorní cvičení z Analytické chemie II. VŠCHT: Praha CHEYNIER, V., J.M. SOUQUET, A. SAMSON a M. MOUTOUNET. Hyperoxidation: influence of various oxygen supply levels on oxidation kinetics of phenolic compounds and wine quality. Vitis [online]. 1991, 30, [cit ]. Dostupné z: KUMŠTA, Michal. Hydroxyskořicové kyseliny - Část 1. Vinařský obzor. 2007, 2007(6), ISSN LAGARDE-PASCAL, Christine a Laurent FARGETON. White wine must oxygenation: set up and sensory effect. Internet journal of enology and viticulture [online]. 2014, 7(2) [cit ]. Dostupné z: 49

50 MICHLOVSKÝ, Miloš. Lexikon chemického složení vína: příručka praktického vinaře. Rakvice: Vinselekt Michlovský, 2014a. ISBN MICHLOVSKÝ, Miloš. Příprava bílých vín. Rakvice: Vinselekt Michlovský, 2014b. ISBN MORENO-ARRIBAS, M. Victoria. A M. Carmen POLO. Wine chemistry and biochemistry. New York: Springer, c2009. ISBN Parish, M., Wollan, D., Paul, R.. Micro-oxygenation a review. The Australian and New Zealander Grapeower and Winemaker, Annual Technical Issue. Sauth Australia: Wine network Pty Ltd, PARISH, M., Wollan, D., Paul, R.. Micro-oxygenation a review. The Australian and New Zealander Grapeower and Winemaker, Annual Technical Issue. Sauth Australia: Wine network Pty Ltd, 2000, PAVLOUŠEK, Pavel. Výroba vína u malovinařů. 2., aktualiz. a rozš. vyd. Praha: Grada, ISBN PAVLOUŠEK, Pavel. Využití mikrooxidace při výrobě červených vín [online]. 2009, 2009(11), [cit ]. Dostupné z: REYNOLDS, A. Managing wine quality, Volume 2. Oenology and wine quality. 1. Cambridge: Woodhead Publishing, 2010b. ISBN REYNOLDS, A. Managing wine quality, Volume 1. Viticulture and wine quality. 1. Cambridge: Woodhead Publishing, 2010a. ISBN RIBE REAU-GAYON, Pascal., Denis. DUBOURDIEU a Bernard. DONE CHE. Handbook of enology: The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. Volume 2. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, 2006b. ISBN RIBE REAU-GAYON, Pascal., Denis. DUBOURDIEU a Bernard. DONE CHE. Handbook of enology: The Microbiology of Wine and Vinifications. Volume 1. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, 2006a. ISBN

51 SCHNEIDER, V. Must Hyperoxidation: A Rewiew. American Journal of Enology and Viticulture. 1998, 49(1), ISSN SINGLETON, V.L., Oxygen with phenols and related reactions in musts, wines,and model systems:observations and practical implications. Am. J. Enol. And Vit., : p STEIDL, Robert. Sklepní hospodářství. Valtice: Národní salon vín, ISBN ŠTEFKOVÁ, Andrea. Mastné kyseliny a jejich estery ve víně. Lednice, Bakalářská práce. Mendelova Univerzita v Brně. Vedoucí práce Ing. Michal Kumšta. Webové zdroje: Dřevěné sudy. BS vinařské potřeby [online]. [cit ]. Dostupné z: Co jsou to antioxidanty. Chempoint: Vědci pro průmysl a praxi [online] [cit ]. Dostupné z: Micro-Oxygenation: MICRO-OXYGENATION ON-SITE SUPPORT PACKAGES. Vinovation, Inc: Vinovation promotional material [online] [cit ]. Dostupné z: Vinařství: Kinetika růstu kvasinek. Mendelu: Portál e-lerningových prezentací [online] [cit ]. Dostupné z: WSU Viticulture and Enology: Grape and Wine Phenolics: A Primer. Washington State University [online] [cit ]. Dostupné z: 51

52 Seznam tabulek, grafů a obrázků: Tab. 1 - Senzorické dopady oxidace bílých vín (Du Toit et al., 2006) Tab. 2 - Základní parametry moštu Tab. 3 - Stanovené volatilní sloučeniny a jejich koncentrace v rámci jednotlivých vzorků Tab. 4 - Stanovené estery vytvořené kvasinkami a jejich aromatické projevy (Pavloušek, 2010; Michlovský, 2014) Graf 1 - Senzorická analýza celkové průměrné hodnocení Graf 2 - Senzorická analýza - Rulandské šedé Graf 3 - Senzorická analýza - Rulandské bílé Chromatogram 1 - Rulandské šedé nemikrooxidované Chromatogram 2 - Rulandské šedé mikrooxidované Chromatogram 3 - Rulandské bílé nemikrooxidované Chromatogram 4 - Rulandské bílé mikrooxidované Obr. 1 - Kyselina kávová (chempoint, 2012) Obr. 2 - Kyselina kaftarová (WSU, 2015) Obr. 3 - Oxidační reakce fenolických látek (Blaauw, 2009) Obr. 4 - Tělo pučící kvasinky (Hornsey, 2007) Obr. 5 - Růstová křivka kvasinek (mendelu, 2013)

53 8. Přílohy Aromatický profil - chromatogramy Rš-nemox Chromatogram 1 - Rulandské šedé nemikrooxidované Chromatogram 2 - Rulandské šedé mikrooxidované

54 Chromatogram 3 - Rulandské bílé nemikrooxidované Chromatogram 4 - Rulandské bílé mikrooxidované