ŽÁDOST PRO GENETICKY MODIFIKOVANÝ ORGANISMUS, KTERÝ JE VYŠŠÍ ROSTLINOU. Uvedení GMO do životního prostředí.

Transkript

1 ŽÁDOST PRO GENETICKY MODIFIKOVANÝ ORGANISMUS, KTERÝ JE VYŠŠÍ ROSTLINOU. [K 17 odst. 3 písm. a) zákona] Datum podání Název projektu Uvedení GMO do životního prostředí. Optimalizace purifikace peptidu LL-37 produkovaného transgenním ječmenem 2. Žadatel 2.1. Jméno nebo název anebo obchodní firma, je-li žadatel fyzická osoba oprávněná k podnikání Nevztahuje se Název nebo obchodní firma a právní forma, je-li žadatelem právnická osoba ÚSOVSKO a. s. se sídlem č.p. 33, Klopina 2.3. Státní občanství (u fyzických osob) Nevztahuje se Adresa sídla a adresa bydliště (u fyzických osob) Nevztahuje se IČO (pokud je přiděleno) Odborný poradce 4. Kontaktní osoba na pracovišti, pokud je odlišná od odborného poradce 5. Charakteristika nakládání s geneticky modifikovaným organismem 5.1. Účel uvádění do životního prostředí, jako jsou zejména agronomické účely, zkoušky hybridizace, změna schopností přežití nebo šíření nebo zjišťování účinků na cílové nebo necílové organismy Účelem uvádění do životního prostředí je studium stabilní produkce peptidu LL-37 v polních podmínkách a dále optimalizace purifikace tohoto peptidu ze zralých zrn transgenních rostlin ječmene a také klasů v mléčně voskové zralosti (tj. z nezralých zrn). Peptid LL-37 je lidský antimikrobiální peptid ze skupiny katelicidinů, který může být po optimalizaci purifikace využit v budoucnosti ve farmaceutickém či kosmetickém sektoru, ve veterinární medicíně nebo v ochraně rostlin, jelikož antimikrobiální peptidy představují efektorové molekuly, jež jsou esenciální součástí humorální složky vrozeného imunitního systému téměř všech živých organismů. Mechanismus působení antimikrobiálních peptidů je spojen s velice nízkým rizikem 1

2 vzniku rezistentních bakteriálních kmenů v porovnání s klasickými antibiotiky. Právě díky svému širokospektrálnímu účinku a minimální cytotoxicitě vůči savčím buňkám jsou tyto peptidy považovány za velice slibná léčiva nové generace, která by mohla nahradit stávající terapeutika, a to především při léčbě onemocnění způsobených multirezistentními kmeny mikroorganismů. V roce 2014 byly publikovány výsledky klinické studie, v rámci které byla povrchová aplikace peptidu LL-37 vyhodnocena jako bezpečná pro léčbu pacientů s chronickými bércovými vředy (1). V současnosti peptid LL-37 prochází klinickými testy jako imunomodulátor podporující léčbu melanomů prostřednictvím lokálních intratumorálních injekcí. V poslední době výrazně vzrostl zájem řady vědeckých skupin ve využití ječmene coby platformy pro produkci nejrůznějších komerčně uplatnitelných substancí, a to hned z několika důvodů. Jednak existuje účinná metoda genetické modifikace pomocí supervirulentního kmene Agrobacterium tumefaciens, oproti jiným obilovinám má ječmen jednoduchý diploidní genom zaručující stabilitu transgenní linie, rostliny jsou samosprašné a je tedy u nich eliminováno riziko úniku transgenu do volného prostředí, což ječmen řadí mezi bezpečné rostliny s certifikátem GRAS (Generally Recognized as Safe) uděleným FDA (Food and Drug Administration). Přes všechny výše zmiňované výhody rostlinných systémů včetně ječmene zůstává exprese AMPs problematická, neboť bývá často spojena s nízkými výtěžky či ztrátou antimikrobiální aktivity v důsledku jejich náchylnosti na proteolytickou degradaci (2). AMPs navíc mohou působit toxicky vůči hostitelské rostlině a zapříčinit tak její abnormální, nežádoucí fenotyp včetně sterility (3). Množství, stabilita a případná fytotoxicita peptidů produkovaných v rostlinách je tedy ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž patří krom výběru samotné rostlinné produkční platformy a cílového pletiva také výběr vhodných fúzních peptidických sekvencí zodpovědných za vnitrobuněčné zacílení peptidu, jeho stabilitu a biologickou aktivitu. Transgenní rostliny ječmene produkující peptid LL-37 byly připraveny na pracovišti Univerzity Palackého v Olomouci, Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení molekulární biologie (4). Jako nejlepší se jeví z hlediska množství produkce a izolace peptidu transgenní linie označené jako UBI:LL-37, bhor:ll-37 a bhor:mbp_ll-37, které se liší kontrolními sekvencemi a přítomností proteinů usnadňujících purifikaci. Tyto tři linie budou vysety na pokusném poli na farmě Mohelnice, která je součástí firmy Úsovsko a.s. Manipulace s GM materiálem na pracovišti UP Olomouc, Oddělení molekulární biologie (není součástí této žádosti), kterému bylo vydáno rozhodnutí o uzavřeném nakládání s GMO čj. 4498/ENV/13., proběhne v laboratořích v budovách H a F, 2. patro, kde v rámci výzkumu je každoročně podáváno hlášení o uzavřeném nakládání s GMO (odborný poradce Ing. Ludmila Ohnoutková, Ph.D.). Manipulace s těmito transgenními liniemi na Oddělení molekulární biologie je oprávněna na základě oznámení z 20. června 2016 čj /ENV/16. Literatura: (1) Grönberg A, Mahlapuu M, Ståhle M, Whately-Smith C, Rollman O. (2014), Wound Repair Regen.22: (2) Moncla BJ, Pryke K, Rohan LC, Graebing PW. (2011), Adv Biosci Biotechnol. 2: (3) Nadal A, Montero M, Company N, Badosa E, Messeguer J, Montesinos L, Montesinos E, Pla M. (2012), BMC Plant Biol. 12:159 2

3 (4) Holásková E., Galuszka P., Mičúchová A., Šebela M., Öz M.T., Frébort I. (2018) Molecular farming in barley: development of a novel production platform to produce human antimicrobial peptide LL-37. Biotechnol J. 6. Doba uvádění do životního prostředí 6.1. Celková doba uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí a datum jeho předpokládaného zahájení Polní pokusy jsou plánovány na deset let od roku 2019 do roku Budou zahájeny v dubnu Poslední vegetační období skončí do konce roku Plánuje žadatel uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí v některém členském státě Evropské unie nebo mimo její území? Ne, nevztahuje se. 8. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí v jiném členském státě Evropské unie? Ne, nevztahuje se. 9. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí nebo na trh mimo území Evropské unie? Ne, nevztahuje se. 10. Hodnocení rizika uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí (+) Hodnocení rizika podle 7 zákona a 5 této vyhlášky, včetně dokumentace výsledků předchozích uvádění do životního prostředí, především z hlediska různého rozsahu činnosti a různých přijímajících ekosystémů Shrnutí hodnocení rizika Ječmen je samosprašná, v přírodě neinvazivní rostlina. Sexuální kompatibilita s plevelným druhem ječmenem myším (Hordeum murinum L.), který se na našem území volně vyskytuje, je obtížná, ke křížení nedochází, nevytváří se hybridy. Evropské unii se nenacházejí žádné jiné sexuálně kompatibilní planě rostoucí příbuzné druhy ječmene. Genetická modifikace jarního ječmene genem pro peptid LL-37 nepřináší rostlinám jarního ječmene žádné selekční výhody. Transgenní rostliny produkující peptid LL-37 (T1-T3 generace) byly pěstovány v uzavřeném ve fytotronu a ve skleníku PřF CRH (Centra regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum) v Olomouci určených pro uzavřené nakládání s GMO rostlinami (na základě rozhodnutí z 19. října 2010 čj /ENV/10 a rozhodnutí 18. ledna 2013 čj. 4498/ENV/13 určeny pro pěstování GMO rostlin. Manipulace s těmito transgenními liniemi na Oddělení molekulární biologie je oprávněna na základě oznámení z 20. června 2016 čj /ENV/16). V tomto období nebyly u těchto modifikací pozorovány žádné selekční výhody ani nevýhody. Nebyla pozorována žádná interakce s kontrolními rostlinami ani s ostatními rostlinami ani jinými cílovými organismy. Modifikovaný jarní ječmen s genem pro LL-37 peptid nepředstavuje žádná rizika pro životní 3

4 prostředí, ani žádná rizika pro lidské zdraví, ani pro zdraví zvířat a necílové organismy. Naopak LL-37 inhibuje tvorbu bakteriálních biofilmů a zabraňuje i infekcím virálního (1) či houbového (2) původu. Krom antimikrobiálního účinku inhibuje peptid nádorové bujení (3), indukuje chemotaxi mastocytů (4), buněčnou apoptózu (5) či pozitivně ovlivňuje proces hojení poranění tím, že stimuluje angiogenesi a obnovu epitelu (6). Na základě doposud publikovaných výsledků byl gen pro katelicidin LL-37 či jeho variantu vnesen do tří různých rostlin, a sice do čínského zelí (Brassica rapa var. chinensis) (7), rajčete (Solanum lycopersicum) (8) a rýže (Oryza sativa L. var. Japonica cv. Dongjinbyeo) (9). Nebyl prokázán negativní vliv na růst a vývoj cílových rostlinných organismů. Literatura: (1)Currie SM, Findlay EG, McHugh BJ, Mackellar A, Man T, Macmillan D, Wang H, Fitch PM, Schwarze J, Davidson DJ. (2013), PLoS One. 8:e73659 (2) Ordonez SR, Amarullah IH, Wubbolts RW, Veldhuizen EJ, Haagsman HP. (2014), Antimicrob Agents Chemother. 58: (3) Okumura K, Itoh A, Isogai E, Hirose K, Hosokawa Y, Abiko Y, Shibata T, Hirata M, Isogai H. (2004), Cancer Lett. 30;212: (4) Niyonsaba F, Iwabuchi K, Someya A, Hirata M, Matsuda H, Ogawa H, Nagaoka I. (2002), Immunology. 106:20-6 (5) Barlow PG, Li Y, Wilkinson TS, Bowdish DM, Lau YE, Cosseau C, Haslett C, Simpson AJ, Hancock RE, Davidson DJ. (2006), J Leukoc Biol. 80: (6) Carretero M, Escámez MJ, García M, Duarte B, Holguín A, Retamosa L, Jorcano JL, Río MD, Larcher F. (2008), J Invest Dermatol. 128: (7) Jung YJ, Lee SY, Moon YS, Kang KK. (2012), Plant Biotechnol Rep. 6:39-46 (8) Jung YJ. (2013), Biotechnol. Bioprocess Eng. 18, (9) Lee IH, Jung YJ, Cho YG, Nou IS, Huq MA, Nogoy FM, Kang KK. (2017), PLoS One.12:e Hypotéza je podpořena následujícími fakty: Modifikace UBI:LL-37 Kromě peptidu LL-37, jehož neškodnost je uvedena výše, je součástí vnesené DNA také selekční gen hpt (YP_ ), který kóduje hygromycin fosfotransferasu a vykazuje rezistenci vůči antibiotiku Hygromycinu B. Tento gen je dlouhodobě používán pro selekci transformovaných buněk, pletiv jednoděložných i dvouděložných rostlin a nepředstavuje žádné riziko pro životní prostředí, zdraví lidí ani zvířat a necílové organismy. Exprese LL-37 genu je řízena kukuřičným ubikvitinovým promotorem (UBI) a Nos terminátorem. Promotorová sekvence je původem z kukuřice seté (Zea mays L.). a sekvence terminátoru nopalin syntasy, původem z Agrobacteria tumefaciens. Tyto regulační úseky se běžně používají při transgenosi rostlin a jsou považovány za bezpečné. Vnesená DNA dále obsahuje C-terminální sekvenci pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu KDEL. KDEL je tetrapeptidová signální sekvence nacházející se na C-konci bílkovin, které svou funkci mají trvale plnit v endoplazmatickém retikulu. Sekvence KDEL zajišťuje, aby se proteiny nesoucí tuto sekvenci neustále vracely z membránových organel, kam jsou v rámci sekrečního endomembránového systému unášeny. Název KDEL je odvozen od jednopísmenných zkratek čtyř aminokyselin, které jej 4

5 tvoří. Jedná se tedy o běžný signální peptid eukaryot (tj vyskytuje se u lidí, zvířat i rostlin přirozeně). Dále je vnesen N-terminální signální peptid cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (ZmCKX1sp; GenBank NM_ ; SEQ ID NO. 5), který se nachází přirozeně v kukuřici. Modifikace bhor:ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp a NOS. Jako regulační sekvence v tomto případě slouží B1 hordeinový promotor (bhor) a NOS terminátor (viz výše). bhor je endospermově specifický promotor původem z ječmene (GenBank: X ) Modifikace bhor:mbp_ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp, bhor a NOS. Dále byla vnesena sekvence kódující maltózu vázající protein (MBP) a histidinovou kotvu (6xHis). Tyto peptidy se běžně a dlouhodobě využívají pro usnadnění purifikace cílového proteinu a jsou považovány za bezpečné. Geneticky modifikovaný ječmen produkující peptid LL-37 bude pěstován za podmínek dobré pokusnické zemědělské praxe. Je navržen tak, aby byly získány velmi důležité informace o modifikovaném rostlinném materiálu za standardních agronomických podmínek. U transgenních rostlin, které byly pěstovány ve skleníku, nebyl prokázán vliv působení transgenu na fenotyp rostliny a rostliny modifikovaného ječmene nemají oproti běžným, nemodifikovaným rostlinám ječmene žádnou jinou přednost ani selekční výhodu. Při realizaci polního pokusu s peptidem LL-37 modifikací budou dodržena všechna zákonná opatření o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, které jsou stanoveny Zákonem č. 78/2004 Sb. ve znění zákona č. 346/2005 Sb. Díky opatřením, která budou aplikována při pokusném uvádění modifikovaných rostlin ječmene do prostředí (ochranné obsevy, vzdálenost od pěstovaných konvenčních odrůd ječmene, kontrola pozemku v dalším roce), bude prakticky vyloučen jakýkoliv potenciální přenos genu pylem nebo semenem. Rovněž bude zajištěno bezpečné nakládání s osivem a rostlinným materiálem (sklizeň, uskladnění, přeprava a likvidace) tak, aby žádné environmentální riziko nevzniklo. 11. Údaje o příjemci, případně, kde je to aplikovatelné, rodičovském organismu České a latinské rodové a druhové jméno organismu, s přesným určením kultivaru (odrůdy, linie, hybridu) (A) NÁZEV ČELEDI: POACEAE (GRAMINEAE) (B) ROD: HORDEUM (C) DRUH: H. VULGARE L. (D) PODDRUH: H. VULGARE L., JARNÍ FORMA (E) KULTIVAR: GOLDEN PROMISE (F) OBECNÝ NÁZEV: JARNÍ JEČMEN 5

6 12. Údaje o genetické modifikaci a geneticky modifikované vyšší rostlině České a latinské rodové a druhové jméno geneticky modifikované vyšší rostliny, s přesným určením kultivaru (odrůdy, linie, hybridu) Obiloviny, ječmen setý, (Hordeum vulgare L), jarní forma, kultivar Golden Promise Popis a charakteristika dědičných vlastností, které byly vloženy nebo změněny, včetně signálních a selekčních genů a předchozích modifikací, a popis jejich fenotypových projevů Modifikace UBI:LL-37 Bez fenotypových projevů Peptid LL-37 - u člověka byl popsán pouze jeden gen kódující protein ze skupiny katelicidinů, a sice tzv. CAMP gen (Cathelicidine AntiMicrobial Peptide). CAMP gen je lokalizován na chromozomu 3, má velikost přibližně 2 kb a obsahuje 4 exony. Produktem genu je antimikrobiální protein hcap-18, přičemž proteolytickým odštěpením jeho C- terminálního konce vzniká antimikrobiální peptid LL-37 (Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J, Bergman T, Olsson B, Salcedo R. (1996), Eur J Biochem. 238:325-32). Primární struktura LL-37 je složena z 37 aminokyselinových residuí. hpt (YP_ ), selekční gen který kóduje hygromycin fosfotransferasu a vykazuje rezistenci vůči antibiotiku Hygromycinu B. Tento gen je dlouhodobě používán pro selekci transformovaných buněk, pletiv jednoděložných i dvouděložných rostlin a nepředstavuje žádné riziko pro životní prostředí, zdraví lidí ani zvířat a necílové organismy. UBI promotor a NOS terminátor- exprese LL-37 genu je řízena kukuřičným ubikvitinovým promotorem (UBI) a Nos terminátorem. Promotorová sekvence je původem z kukuřice seté (Zea mays L.). a sekvence terminátoru nopalin syntasy, původem z Agrobacteria tumefaciens. Tyto regulační úseky se běžně používají při transgenosi rostlin a jsou považovány za bezpečné. KDEL je tetrapeptidová signální sekvence nacházející se na C-konci bílkovin, které svou funkci mají trvale plnit v endoplazmatickém retikulu. Sekvence KDEL zajišťuje, aby se proteiny nesoucí tuto sekvenci neustále vracely z membránových organel, kam jsou v rámci sekrečního endomembránového systému unášeny. Název KDEL je odvozen od jednopísmenných zkratek čtyř aminokyselin, které jej tvoří. Jedná se tedy o běžný signální peptid eukaryot (tj. vyskytuje se u lidí, zvířat i rostlin přirozeně). ZmCKX1sp - N-terminální signální peptid cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (GenBank NM_ ; SEQ ID NO. 5), který se nachází přirozeně v kukuřici. Modifikace bhor:ll-37 Bez fenotypových projevů Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp a NOS. B1 hordeinový promotor (bhor) je endospermově specifický promotor původem z ječmene 6

7 (GenBank: X ) Modifikace bhor:mbp_ll-37 Bez fenotypových projevů Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp, bhor a NOS. MBP - sekvence kódující maltózu vázající protein (pro purifikace peptidu LL-37) 6xHis - histidinová kotva (pro purifikace peptidu LL-37) Typ genetické modifikace Vnesení cizorodého dědičného materiálu Modifikace UBI:LL-37 hpt -selekční gen hpt (YP_ ) z gram-negativní bakterie Escherichia coli kmen PWD4 kódující hygromycin fosfotransferasu způsobující rezistenci vůči antibiotiku Hygromycinu B je součástí vektoru pbract209 a pbract214 Peptid LL-37 - (parciální sekvence) lidského katelicidinu osahující 37 ak (Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J, Bergman T, Olsson B, Salcedo R. (1996), Eur J Biochem. 238:325-32). Komerčně nasyntetizován firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, US) UBI promotor a NOS terminátor- promotorová sekvence je původem z kukuřice seté (Zea mays L.). a terminátor nopalin syntasy je původem z Agrobacteria tumefaciens. Součást binárního vektoru. ZmCKX1sp - N-terminální signální peptid cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (GenBank NM_ ; SEQ ID NO. 5), který se nachází přirozeně v kukuřici. Komerčně nasyntetizován firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, US) KDEL - běžný signální peptid eukaryot (tj vyskytuje se u lidí, zvířat i rostlin přirozeně) není cizorodý. Komerčně nasyntetizován firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, US) Modifikace bhor:ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp a NOS. B1 hordeinový promotor (bhor) je endospermově specifický promotor původem z ječmene (GenBank: X ) není cizorodý. Komerčně nasyntetizován firmou Mr. Gene GmbH (Regensburg, Německo) Modifikace bhor:mbp_ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp, bhor a NOS. MBP - sekvence kódující maltózu vázající protein (Komerčně nasyntetizován firmou Thermo Fisher Scientific). 7

8 6xHis - histidinová kotva (Komerčně nasyntetizován firmou Thermo Fisher Scientific) Vlastnosti a původ použitého vektoru (pokud byl vektor při genetické modifikaci použit) Údaje o každé části úseku DNA, který byl vnesen do organismu příjemce (pokud genetická modifikace zahrnuje vnesení dědičného materiálu) viz víše (body a 12.3.) Původ (české a latinské rodové a druhové jméno dárcovského organismu přesným určením kultivaru odrůdy, rasy, plemene, linie, formy, hybridu, kmene, patovaru) Modifikace UBI:LL-37 Peptid LL-37 - původ lidský (Homo sapiens), parciální sekvence 37 ak lidského katelicidinu. U LL-37 byla podrobena optimalizace kodónu pro ječmen a navržená sekvence DNA byla na zakázku syntetizována firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, USA). Součástí LL-37 byla také iniciační Kozakové sekvence, která byla navržena s přihlédnutím na preferenci jednotlivých nukleotidů vyskytujících se kolem iniciačního kodonu u ječmene, a dále signální sekvence KDEL. hpt (YP_ ), selekční gen který kóduje hygromycin fosfotransferasu z E. coli a vykazuje rezistenci vůči antibiotiku Hygromycinu B. Součást komerčních vektorů pbract209 a pbract214. UBI promotor a NOS terminátor- kukuřičný (Zea mays L.). ubikvitinový promotor (UBI) a Nos terminátor nopalin syntasy z Agrobacteria tumefaciens. Součást komerčního vektoru pbract214. ZmCKX1sp - N-terminální signální peptid cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (GenBank NM_ ; SEQ ID NO. 5), který se nachází přirozeně v kukuřici. Na zakázku syntetizováno firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, USA) Modifikace bhor:ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp. B1 hordeinový promotor (bhor) je endospermově specifický promotor původem z ječmene (Hordeum vulgare) (GenBank: X ). Sekvence promotoru pro B1 hordeinový ječmenný protein byla společně se sekvencí NOS terminátoru na zakázku syntetizována firmou Mr. Gene GmbH (Regensburg, Německo). Modifikace bhor:mbp_ll-37 Obsahuje stejně jako v předchozí modifikaci LL-37, hpt, KDEL, ZmCKX1sp, bhor a NOS. 8

9 MBP - sekvence kódující maltózu vázající protein, na zakázku syntetizováno firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, USA) 6xHis - histidinová kotva, na zakázku syntetizováno firmou Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA, USA) Funkční charakteristika Binární vektor pbract209 Modifikace bhor:ll-37 Název sekvence Velikost úseku (v párech bází) Pravá hraniční sekvence 24 Funkce Oblast pravé hraniční sekvence T-DNA, z Ti plasmidu A. tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky bhor 550 Endospermově specifický promotor původem s ječmene hpt gen Gen kódující hygromycin fosfotransferasu, která slouží pro selekci transgenních rostlin, funkční úsek Kozakové sekvence 9 Iniciační sekvence ZmCKX1sp 50 N-terminální signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1, je zodpovědný za translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum. LL Lidský antimikrobiální peptid KDEL 12 Tetrapeptidová signální sekvence nacházející se na C-konci bílkovin, které svou funkci mají trvale plnit v endoplazmatickém retikulu. NOS Nos terminátor nopalin syntasy z Agrobacteria 83 tumefaciens Rekombinační sekvence attrl 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Rekombinační sekvence attr2 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Levá hraniční sekvence 23 Oblast levé hraniční sekvence T-DNA z Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky 9

10 Binární vektor pbract209 Modifikace bhor:mbp_ll-37 Název sekvence Velikost úseku (v párech bází) Funkce Pravá hraniční sekvence 24 Oblast pravé hraniční sekvence T-DNA, z Ti plasmidu A. tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky bhor 550 Endospermově specifický promotor původem s ječmene hpt gen Gen kódující hygromycin fosfotransferasu, která slouží pro selekci transgenních rostlin, funkční úsek Kozakové sekvence 9 Iniciační sekvence ZmCKX1sp 50 N-terminální signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1, je zodpovědný za translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum. MBP xHis 18 Sekvence kódující maltózu vázající protein (pro purifikace peptidu LL-37) Histidinová kotva (pro purifikace peptidu LL-37) Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo 15 Nukleotidová sekvence rozpoznávaná enterokinasou pro odštěpení MBP a 6xHis LL Lidský antimikrobiální peptid KDEL 12 Tetrapeptidová signální sekvence nacházející se na C-konci bílkovin, které svou funkci mají trvale plnit v endoplazmatickém retikulu. NOS Nos terminátor nopalin syntasy z Agrobacteria 83 tumefaciens Rekombinační sekvence attrl 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Rekombinační sekvence attr2 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Levá hraniční sekvence 23 Oblast levé hraniční sekvence T-DNA z Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky 10

11 Binární vektor pbract214 Modifikace UBI:LL-37 Název sekvence Velikost úseku (v párech bází) Funkce Pravá hraniční sekvence 24 Oblast pravé hraniční sekvence T-DNA, z Ti plasmidu A. tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky UBI 1987 Kukuřičný (Zea mays L.). ubikvitinový promotor hpt gen Gen kódující hygromycin fosfotransferasu, která slouží pro selekci transgenních rostlin, funkční úsek Kozakové sekvence 9 Iniciační sekvence ZmCKX1sp 50 N-terminální signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1, je zodpovědný za translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum. LL Lidský antimikrobiální peptid KDEL 12 Tetrapeptidová signální sekvence nacházející se na C-konci bílkovin, které svou funkci mají trvale plnit v endoplazmatickém retikulu. NOS Nos terminátor nopalin syntasy z Agrobacteria 284 tumefaciens Rekombinační sekvence attrl 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Rekombinační sekvence attr2 21 Rozpoznávací sekvence z E. coli pro rekombinaci využívanou v technologii Gateway klonování Levá hraniční sekvence 23 Oblast levé hraniční sekvence T-DNA z Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens rozpoznávaná při přenosu DNA z bakterie do rostlinné buňky Velikost Poloha pokud byl integrován Sekvence Pokud se jedná o vynětí části dědičného materiálu (deleci), velikost a funkce vyňatého úseku Nevztahuje se Popis metody použité pro genetickou modifikaci Nezralá zrna jarního ječmene odrůdy Golden Promise dva týdny po opylení byla sterilizována. Následně byla nezralá zygotická embrya o velikosti 1,5 mm sterilně izolována a transformována pomocí Agrobacterium tumefaciens, kmenem AGL1. Pro zvýšení účinku transformace byl do kultury Agrobacteria přidán acetosyringon. Po ovlivnění byla nezralá zygotická embrya přenesena na kalus indukující médium. Transgenní rostliny byly regenerovány z embryogenních kalusů selektovaných na antibiotiku Hygromycinu B a při přenosu z in vitro kultury do zeminy byly analyzovány pomocí PCR a qpcr. Ověřena byla přítomnost genů LL- 37 a hpt a exprese hpt. U vybraných transgenních linií T0 generace selektovaných jako pozitivní pomocí PCR analýzy byl určen počet kopií insertu metodou Southern blot. Transgenní rostliny byly dopěstovány ve skleníku. 11

12 12.8. Umístění vloženého dědičného materiálu v rostlinné buňce (vložen do chromozómů, chloroplastů nebo v neintegrované formě) Počet kopií vloženého dědičného materiálu Stabilita vloženého dědičného materiálu a stabilita jeho umístění Metody stanovení uvedených údajů Údaje o expresi vloženého dědičného materiálu Údaje umožňující jednoznačnou identifikaci geneticky modifikované vyšší rostliny Chování vložených genů Jednoznačné údaje o tom, v čem se geneticky modifikovaná vyšší rostlina liší od příjemce nebo rodičovského organismu: způsob a rychlost rozmnožování šíření v prostředí schopnost přežití účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí Transgenní linie ječmene produkující lidský katelicidin LL-37, obsahují dále transgen hpt a regulační a funkční úseky úseky DNA, které jsou uvedeny a popsány v bodech a této žádosti. Vývoj a fenotyp GM rostlin je srovnatelný s kontrolními rostlinami, GM rostliny nemají žádnou selekční výhodu, změněné šíření, způsob a rychlost rozmnožování či účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí. Zrna GM rostlin produkujících LL-37 mají změněné složení zrn (lokalizace LL-37 v zrnech), tato změna nebyla podrobněji studována, jelikož není předmětem výzkumného zájmu. GM zrna budou sloužit pouze jako zdroj peptidu LL-37, který z nich bude purifikován. Zrna nebudou součástí potravinového řetězce lidí ani zvířat Fenotypová stabilita geneticky modifikované vyšší rostliny Na základě pěstování transgenního ječmene s peptidem LL-37 v uzavřeném prostředí ve fytotronu a ve skleníku určeného pro pěstování GM rostlin nebyly zjištěny změny ve fenotypu transgenních rostlin a ve výnosu (Obr. 2) Jakákoliv změna schopnosti geneticky modifikované vyšší rostliny přenášet genetický materiál na jiné organismy v důsledku genetické modifikace Přenos vloženého dědičného materiálu jarního ječmene s peptidem LL-37 na jiné organismy není v přírodě možný. Přesto však budou uplatněna opatření, která vyloučí jakýkoli přenos genetické informace při pokusném uvádění do prostředí. Aby bylo zabráněno transferu vnášených genů do životního prostředí, bude transgenní jarní 12

13 ječmen od veškerého nepokusného jarního ječmene potencionálně pěstovaného v blízkosti pokusné parcely oddělovat izolační vzdálenost 100 m. Místo vysetí transgenních rostlin bude navíc chráněno izolačním obsevem konvenčního jarního ječmene obdobné ranosti širokým 3 m. Porost bude ohraničen přenosným oplocením bránícím vstupu zvěře a označen viditelnými cedulemi s nápisem "POZOR - GMO - NEVSTUPOVAT - NEZKRMOVAT, Není určeno ke konzumaci, krmení! Zákaz předávání neoprávněným osobám!". Na konci pokusu bude všechna zbývající rostlinná hmota, včetně obsevu konvenčního jarního ječmene, zničena rozdrcením a zapravením do půdy orbou. Výskyt rostlin vzešlých z výdrolu bude kontrolován každý měsíc během následujícího roku. V případě výskytu těchto rostlin bude použit specifický herbicid Informace o každém možném škodlivém účinku geneticky modifikované vyšší rostliny na zdraví lidí způsobeném genetickou modifikací Takový účinek není předpokládán. Navíc rostliny z polních pokusů nebudou použity k produkci potravin Údaje o bezpečnosti geneticky modifikované vyšší rostliny pro zdraví zvířat, zejména s ohledem na jakékoliv škodlivé účinky způsobené genetickou modifikací, pokud má být geneticky modifikované vyšší rostliny použito jako krmivo Neplánuje se používat rostliny jako krmivo, ani zrno nebude použito jako potravina ani jako krmivo Mechanismus interakce mezi geneticky modifikovanou vyšší rostlinou a cílovým organismem, pokud cílový organismus existuje Polní experimenty s modifikovaným ječmenem nejsou zaměřeny na sledování kvality zrna ať již vzhledem k potravinářskému využití ječmene či pro využití ke zkrmení. Vzhledem k lokalizaci peptidu LL-37 v zrnu transgenního ječmene dochází ke kvalitativní i kvantitativní změně GM zrn, tato změna nebyla podrobněji studována, jelikož není předmětem výzkumného zájmu. Cílový organismus neexistuje Možné změny v interakcích geneticky modifikované vyšší rostliny s necílovými organismy plynoucí z genetické modifikace Nepředpokládáme žádný vliv na necílové organismy. Uvádění třech linií transgenního ječmene s LL-37 do životního prostředí je z tohoto hlediska bezpečné a nevyvolá žádné změny v interakcích s necílovými druhy. I přesto bude pozorován vliv transformovaných rostlin na faunu a flóru s cílem identifikace případných změn interakcí oproti běžnému stavu Možné interakce geneticky modifikované vyšší rostliny s neživými složkami životního prostředí Nejsou předpokládány žádné interakce s neživými složkami životního prostředí. Interakce s neživým prostředím jsou podle současných znalostí na úrovni nemodifikovaného jarního ječmene. 13. Pracoviště a pozemky, na kterých bude uvádění do životního prostředí probíhat (+) Havarijní plán podle přílohy č. 5 k této vyhlášce (+) Provozní řád pracoviště podle přílohy č. 4 k zákonu 13

14 (+) Kopie katastrálních map s vyznačením pozemku a přehledný plánek ve vhodném měřítku s vyznačením pokusné plochy a plodin, pěstovaných na okolních pozemcích Umístění pozemku Kraj Olomoucký Obec Mohelnice Název katastrálního území a parcelní číslo Mohelnice, p.č 2502/4 (pole), p.č (laboratoř + sklad) Identifikační číslo půdního bloku a případně dílu půdního bloku, je-li pozemek předmětem evidence využití zemědělské půdy podle jiného právního předpisu 11) Vlastník pozemku, pokud není totožný se žadatelem, a smluvní vztah mezi vlastníkem a žadatelem Velikost a využití pozemku Celková rozloha pozemku m Velikost a poloha plochy, na které mají být geneticky modifikované vyšší rostliny pěstovány (m 2 ) m Velikost (m 2 ) a způsob využití izolačního pásma kolem plochy pěstování geneticky modifikované vyšší rostliny (vyznačit v plánku) Okolo celého pokusu bude vyset ochranný izolační pás jarního ječmene široký 3 m. Vyseta bude běžně pěstovaná odrůda jarního ječmene Francin. Celková plocha všech pěstovaných GM jarních ječmenů, včetně ochranného pásu, bude maximálně m 2. Obsev bude zničen před, nebo těsně po sklizni pokusu a to tímto způsobem: rozdrcení rostlin, podmítka, po vzejití postřik totálním herbicidem a následně orba. Izolační pásmo zamezí transferu vnášených genů do jiných nepokusných rostlin jarního ječmene. Transgenní ječmen bude od veškerého nepokusného jarního ječmene oddělovat izolační vzdálenost minimálně 100 m. Využití pozemků v izolačním pásmu (pěstované plodiny) viz obrázek Využití okolních pozemků Netransgenní jarní ječmen se nebude pěstovat do vzdálenosti 100 m, viz obrázek 5, kde je zakresleno rozmístění plodin na okolních pozemcích. Využití okolních pozemků je uvedeno také v Havarijním plánu Vzdálenost pozemku od specifických území (v metrech nebo kilometrech) Posuzovaná lokalita v Úsově se nenachází na žádném chráněném území ve smyslu zákona č. 114/92 Sb. o ochraně přírody a krajiny. Nejbližším takto chráněným územím je chráněná krajinná oblast Litovelské Pomoraví, která byla zřízena vyhláškou MŽP ČR č. 464 ze dne 29. října Její západní hranice probíhá východně od areálu ve vzdálenosti přibližně 800 metrů. CHKO má rozlohu 96 km 2 a na tomto území je vyhlášeno celkem 26 maloplošných zvláště chráněných území Zvláště chráněná území 12) 14

15 Nejbližším takto chráněným územím je chráněná krajinná oblast Litovelské Pomoraví. Západní hranice CHKO Litovelské Pomoraví probíhá východně od areálu ve vzdálenosti přibližně 800 metrů Ochranná pásma vodních zdrojů Nevyskytují se v blízkém okolí Vodní toky, vodní nádrže V blízkosti pokusného pole se nachází vodní tok Újezdka potok o průměrné šířce břehové linie 4 m a hloubce cca 1.5 až 2 m (viz. Obr. 5) a bezejmenný vodní útvar (odvodňovací strouha, většinu roku zcela suchá). Pokusné pole se nevyskytuje v záplavové oblasti (viz. Obr. 5) Území obhospodařovaná v ekologickém zemědělství 13) Pozemky v ekologickém zemědělství v blízkém okolí nejsou Jiné Nejsou Způsob zabezpečení pozemku Zabezpečení pozemku proti neoprávněným osobám Proti vstupu neoprávněných osob bude pozemek opatřen čtyřmi výstražnými cedulemi, umístěnými v rozích pozemků "POZOR - GMO - NEVSTUPOVAT - NEZKRMOVAT- CHEMICKY OŠETŘENO, Není určeno ke konzumaci, krmení! Zákaz předávání neoprávněným osobám!". V případě, že to bude z pohledu organizace pokusu nutné, bude použito více cedulí tak, aby bylo vidět z jedné na druhou. Pokusná lokalita s GM jarním ječmenem bude obseta 3 m pásem porostu jarního ječmene okolo celého pokusu, a tím bude přímý přístup k pokusným plochám omezen. Pozemek s GMO ječmenem bude bezpečně oplocen pletivem. Celý areál, na kterém se pozemky nachází, je zabezpečen proti vniknutí neoprávněných osob (vstup na kartu) Zabezpečení pozemku proti zvěři Pokusná plocha s výsevem GM jarního ječmene bude bezpečně oplocena ohradovým pletivem do výšky 120 cm. Bezpečnost zajistí i obsev porostu jarního ječmene v šířce 3 m okolo celého pokusu. Pozemek s GMO ječmenem bude bezpečně oplocen pletivem. Celý areál, na kterém se pozemky nachází, je zabezpečen proti vniknutí Zabezpečení pozemku proti splachu Na rovinatém terénu pokusného pozemku nepředpokládáme riziko splachu. Pokusné pole se nevyskytuje v záplavové oblasti (viz Havarijní plán) Popis ekosystému v místě pozemku Typ půdy Hnědozem (hnědozem modální slabě oglejená) Vodní režim včetně zavlažování Vodní režim přirozený, žádné zavlažování v místě pokusu není Klimatické podmínky 15

16 Město Úsov leží v nadmořské výšce 280 m v klimatické oblasti T 2 teplá, mírně suchá s mírnou zimou. Průměrná roční teplota je 8,5 0 C. Ve vegetačním období je prům. teplota 14,0 0 C. Průměrný roční úhrn srážek v této oblasti je 650 mm, z toho ve vegetačním období (IV. - IX.) mm, a mimo něj údaj(faktor) hodnota Průměrná roční teplota vzduchu C: 7,5 Průměrná roční teplota vzduchu ve vegetačním období o C: 14,0 Počet dní ledových za rok: 40 Průměrné datum prvního mrazového dne: Počet mrazových dní za rok: 110 Průměrné datum posledního mrazového dne: 1.5 Počet dní se sněhovou pokrývkou za rok: 50 Počet dní v roce se srážkami nad 10,0 mm: 17,5 První den se sněhovou pokrývkou: Poslední den se sněhovou pokrývkou: Flóra včetně zemědělských plodin Běžné polní plevele - merlíky, lebedy, pcháče, svízel, laskavec, rdesna, svlačce, pýr plazivý, ježatka kuří noha a další. Pozemek se nyní nevyužívá k produkčnímu pěstování plodin Fauna včetně hospodářských a migrujících zvířat Na lokalitě předpokládat z entomologického hlediska výskyt běžných druhů, vázaných na pěstované plodiny a zemědělsky využívanou půdu (jedná se především o mšice, třásněnky, ploštice) Přítomnost planých nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních rostlin na pozemku a v jeho okolí Relevantní údaje týkající se předchozích případů uvádění do životního prostředí stejné geneticky modifikované vyšší rostliny, pokud existují, zejména ve vztahu k možným vlivům na zdraví lidí a zvířat, životní prostředí a biologickou rozmanitost Nevztahuje se. 14. Popis nakládání s geneticky modifikovanou vyšší rostlinou 15. Opatření na ochranu zdraví lidí, zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti a nakládání s odpadem Vzdálenost plochy pěstování geneticky modifikovaných vyšších rostlin od planých nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních druhů rostlin Opatření pro snížení nebo zabránění úletu pylu nebo semen, jsou-li použita 16

17 15.3. Popis metod pro úpravu pozemku po skončení pokusu Monitoring Plán monitoringu: Předpoklady pro zhodnocení rizika Všeobecná pozorování Žádný rozdíl v morfologických aspektech rostlin Žádný rozdíl v agronomickém chování Popis pozorování Pozorování vlastností rostlin ve srovnání s vlastnostmi geneticky nemodifikovaného jarního ječmene Pozorování jednotlivých fází vývoje porostu, ve srovnání s kontrolními plochami Frekvence pozorování Alespoň jednou za čtyři týdny během vegetačního období Podle potřeby během vegetačního období a alespoň jednou za čtyři týdny během období pokusu Žádný rozdíl v rozšiřování zrn do životního prostředí Sledování výskytu rostlin z výdrolu zrna Monitoring specifických rizik Žádný vliv na životní prostředí zapříčiněný interakcemi s necílovými organismy Žádné škodlivé vlivy na lidské zdraví Pozorování, zda nedochází k nepřiměřenému uvolňování semen z klasu Monitoring výdrolu Vizuální pozorování fauny a flory na pokusné ploše pro identifikaci jakýchkoliv změn oproti běžnému stavu Bude nahlášen jakýkoliv výskyt zdravotního problému u člověka, který byl v kontaktu s GM ječmenem Během zralosti zrna: alespoň jednou během týdne Alespoň jednou za měsíc během roku následujícím po ukončení pokusu Alespoň jednou za dva týdny během období pokusu a jednou za dva měsíce v roce následujícím po zničení pokusů Případné hlášení je třeba podat v době od setby do sklizně 17

18 Monitoring v případě havárie V případě havárie, kdy dojde k úniku GM rostlinného materiálu, bude na místo havárie pohlíženo stejně jako na pokusnou plochu. Na tomto místě a v jeho nejbližším okolí bude probíhat monitoring ve stejném rozsahu jako na pokusné ploše, včetně ročního pozorování v následném roce Žádný vliv na životní prostředí zapříčiněný interakcemi s necílovými organismy Žádné škodlivé vlivy na lidské zdraví Sledování výskytu rostlin z výdrolu zrna Vizuální pozorování fauny a flory na pokusné ploše pro identifikaci jakýchkoliv změn oproti běžnému stavu Bude nahlášen jakýkoliv výskyt zdravotního problému u člověka, který byl v kontaktu s GM ječmenem Monitoring výdrolu Alespoň jednou za dva týdny během období pokusu a jednou za dva měsíce v roce následujícím po zničení pokusů Případné hlášení je třeba podat v době od setby do sklizně Alespoň jednou za měsíc během roku následujícím po ukončení pokusu Metody zjišťování přítomnosti geneticky modifikované vyšší rostliny a monitorování jejích účinků na ekosystém Ověření přítomnosti transgenů bude prováděno molekulárními metodami, viz bod Během pokusu budou plochy z agronomických a pokusných důvodů pravidelně navštěvovány a to alespoň jednou za čtrnáct dní. Tyto kontroly umožní, aby byl monitorován vývoj rostlin a bylo zabráněno rozšiřování GM rostlinného materiálu. Pozorování budou probíhat tak, jak je popsáno v Plánu monitoringu v bodu 5.4. Po skončení pokusu bude pokusná plocha navštěvována každý měsíc během celého následujícího roku za účelem monitoringu výdrolu. Pokud by nějaký výdrol byl nalezen, byl by ještě před metáním odstraněn ručně nebo aplikací totálního herbicidu. V zájmu usnadnění kontroly případného výdrolu nebude následující rok na daném poli pěstována komerčně žádná obilovina Specificita metod identifikace geneticky modifikované vyšší rostliny a odlišení geneticky modifikované rostliny od dárcovského organismu, příjemce, případně rodičovského organismu, citlivost a spolehlivost těchto metod Fenotyp rostlin bude pravidelně pozorován. Techniky popisu genotypu (prokázání specifických sekvencí v rostlinném genomu) - transformované rostliny jarního ječmene lze spolehlivě identifikovat pomocí PCR, viz bod Metodiky detekce byly vyvinuty a ověřeny na pracovišti PřF UP v Olomouci Techniky (metody) detekce přenosu vloženého dědičného materiálu na další organismy Transformované rostliny jarního ječmene lze spolehlivě identifikovat pomocí PCR, viz bod Přenos vloženého dědičného materiálu jarního ječmene 18

19 s peptidem LL-37 na jiné organismy není v přírodě možný. Přesto však budou uplatněna a dodržena veškerá opatření, která stanovuje zákon 78/2004 Sb., ve znění zákona č. 346/2005 Sb. Tato opatření vylučují jakýkoli přenos genu při pokusném uvádění do prostředí. Aby bylo zabráněno transferu vnášených genů do jiných nepokusných rostlin jarního ječmene, bude pozemek určený pro GM jarní ječmen od veškerého nepokusného jarního ječmene oddělovat izolační vzdálenost 100 m. Místo pokusu bude navíc chráněno izolačním obsevem konvenčního jarního ječmene obdobné ranosti širokým 3 m. Porost bude ohraničen přenosným oplocením bránícím vstupu zvěře a označen viditelnými cedulemi s nápisem "POZOR - GMO - NEVSTUPOVAT - NEZKRMOVAT- CHEMICKY OŠETŘENO. Není určeno ke konzumaci, krmení! Zákaz předávání neoprávněným osobám! ". Na konci pokusu bude všechna zbývající rostlinná hmota, včetně obsevu konvenčního jarního ječmene, zničena rozdrcením a zapravením do půdy orbou Plocha, na které bude monitoring prováděn Monitoring bude probíhat dle plánu monitoringu, viz bod 15.4, na místě pokusu a v jeho nejbližším okolí. Pokus uvádění GM jarního ječmene LL-37 bude probíhat na pozemku ve vlastnictví firmy Úsovsko a.s., ÚSOVSKA AGRO s.r.o. katastrální území Mohelnice, parcela 2502/4. Monitoring bude také prováděn na místě případné havárie a v jeho nejbližším okolí Doba trvání monitoringu Monitoring bude probíhat dle Plánu monitoringu, viz bod 5.4 Plán monitoringu, každý rok během pokusů (od setí do ukončení pokusů) a poté během jednoho roku od ukončení pokusu Četnost monitoringu Viz. bod Nakládání s odpady včetně likvidace geneticky modifikovaných, vyšších rostlin Odpad z geneticky modifikovaných rostlin vyprodukovaných z pokusu (všechny vegetativní části rostlin) bude na konci pokusu zničen rozdrcením a zapravením do půdy střední orbou. Izolační obsev konvenčního jarního ječmene způsobem rovněž zničen. Sklizený transgenní ječmen se nedostane do potravinového ani do krmivového řetězce. Likvidace vzorků určených pro analýzy bude probíhat v laboratoři GMO na pracovišti PřF UP Olomouc, Šlechtitelů 27, budova H, 2. podlaží (laboratoř 2.39). Likvidace vzorků bude provedena autoklávováním, jak je uvedeno v provozním řádu daného pracoviště Shrnutí ochranných opatření Všechna ochranná opatření jsou v souladu se zákonem č.78/2004 Sb. ve znění zákona č. 346/2005 Sb. Přeprava GM rostlinného materiálu bude zajištěna odborně způsobilými a proškolenými pracovníky. Transgenní zrna a vzorky budou přemísťovány mezi laboratoří GMO PřF UP Olomouc, budova H, Šlechtitelů 27, Olomouc a místem realizace polních pokusů a skladem firmou Úsovsko a.s., ÚSOVSKO AGRO s.r.o. Přeprava 19

20 vzorků bude zajišťována tak, aby během přepravy nevznikla žádná rizika. GM materiál bude řádně označen, umístěn ve dvojitých plastových boxech. Převážející bude mít dále s sebou havarijní plán v ČJ a lopatku, smetáček a autoklávovatelný pytel pro případ havárie. Odebrané vzorky a zrno GM rostlinného materiálu budou řádně označeny tak, aby nemohlo dojít k jejich záměně a při převozu zabezpečeny proti úniku do prostředí. Aby bylo zabráněno transferu vnášených genů do životního prostředí, bude modifikovaný jarní ječmen s peptidem LL-37 od veškerého nepokusného jarního ječmene oddělovat izolační vzdálenost 100 m 2. Místo pokusu bude navíc chráněno izolačním obsevem konvenčního jarního ječmene obdobné ranosti širokým 3 m. Porost bude ohraničen oplocením bránícím vstupu zvěře a označen viditelnými cedulemi s nápisem "POZOR - GMO - NEVSTUPOVAT - NEZKRMOVAT- CHEMICKY OŠETŘENO. Není určeno ke konzumaci, krmení! Zákaz předávání neoprávněným osobám!". Plán monitoringu bude realizován během pokusů a po jejich skončení, jak je uvedeno viz plán monitoringu. Monitoring bude probíhat na pokusném pozemku a v jeho nejbližším okolí. Monitoring bude také prováděn na místě případné havárie a v jeho nejbližším okolí. Na konci pokusu bude všechna zbývající rostlinná hmota, včetně obsevu konvenčního jarního ječmene, zničena rozdrcením a zapravením do půdy orbou. Následující rok nebude na pokusné ploše pěstován žádný komerční jarní ječmen. 16. Shrnutí informací o plánovaných polních pokusech prováděných za účelem získání nových údajů o vlivu uvádění geneticky modifikované vyšší rostliny do životního prostředí na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí Účelem uvádění transgenního jarního ječmene s peptidem LL-37 na pracovišti Úsovsko a.s., ÚSOVSKO AGRO s.r.o., katastrální území Mohelnice, obec Klopina napěstování dostatečného množství ječmene pro následnou optimalizaci purifikace peptidu LL-37 z nezralých nebo zralých zrn (sklizeň zralého zrna a klasu v mléčně voskové zralosti). Purifikace peptidu LL-37 bude provedena v PřF UP v Olomouci, Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení molekulární biologie. Jarní ječmen s peptidem LL-37 je dosud pěstovaný v uzavřeném prostředí GMO ve fytotronu a ve skleníku PřF UP v Olomouci (rozhodnutí z 19. října 2010 čj /ENV/10 a rozhodnutí z 18. ledna 2013 čj. 4498/ENV/13). Polní pokusy jsou naplánovány na deset let, do konce prosince

21 HAVARIJNÍ PLÁN PRO UVÁDĚNÍ DO ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ 1. Uživatel (osoba oprávněná k nakládání s GMO) 1.1. Jméno nebo název anebo obchodní firma, je-li uživatelem fyzická osoba oprávněná k podnikání Nevztahuje se Název nebo obchodní firma a právní forma, je-li uživatelem právnická osoba ÚSOVSKO a. s Adresa sídla ÚSOVSKO a. s. Klopina č.p. 33, Klopina 1.4. IČO (pokud je přiděleno) Pracoviště a pozemky 2.1. Adresa pracoviště Adresa pole a skladu: Úsovsko a.s., ÚSOVSKO AGRO s.r.o., farma Mohelnice, PSČ , bez č.p., konec ulice Družstevní u výpadovky na obec Moravičany 3. Popis havárie, která může vzniknout Za havárii je možno považovat neúmyslný únik (rozsypání) GM rostlinného materiálu mimo vymezené prostory např. špatnou manipulací. Únik může vzniknout i při přepravě mezi firmou Úsovsko a.s., ÚSOVSKO AGRO s.r.o., farma Mohelnice a UP Olomouc, Oddělení molekulární biologie (při dopravní nehodě). K úniku zrn může dojít dále úmyslným poškozením nebo odcizením GM materiálu a během požáru, kdy při hašení může dojít k vyplavení zrna. 4. Přehled možných následků havárie na zdraví lidí, zvířata, životní prostředí a biologickou rozmanitost, včetně způsobů zjišťování těchto následků a účinné ochrany před nimi Možné následky havárie na zdraví lidí, zvířat a na životní prostředí nejsou známy, avšak riziko projevu nežádoucích účinků spojené z výše uvedenými možnostmi úniku, je stejné jako v případě havárie netransformovaného ječmene. V případě havárie bude na místo havárie pohlíženo stejně jako na pokusnou plochu a v tomto místě a nejbližším okolí bude probíhat monitoring ve stejném rozsahu, jako na pokusné ploše, viz Plán monitoringu. Případné rostliny vzešlé s výdrolu v následujícím roce je možno regulovat mechanicky nebo chemicky vhodným herbicidem. Vzhledem k charakteru plodiny je riziko samovolného rozšiřování zanedbatelné, jelikož se jedná o jarní, jednoletou, samosprašnou rostlinu. 5. Metody detekce přítomnosti geneticky modifikovaných organismů 6. Postup v případě havárie 21

22 6.1. Metody a postupy použitelné k likvidaci geneticky modifikovaných organismů a k dekontaminaci zasažených pozemků Pro případ havárie, je k dispozici lopatka/lopata a smetáček, kterými bude uniklý GM materiál přemístěn do autoklávovatelného pytle (Biohazard), jehož obsah se zlikviduje autoklávováním v laboratoři GMO na pracovišti Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, Šlechtitelů 27, Oddělení molekulární biologie, budova H, II. Podlaží, laboratoř 2.39 a to na základě rozhodnutí o uzavřeném nakládání s GMO z 18. ledna 2013 čj. 4498/ENV/13. V případě, že k úniku dojde v okolí pokusného pole nebo skladu, bude autoklávovatelný pytel s GM materiálem nejdříve přechodně uložen do skladu pro GM zrna a poté převezen (za dodržení pravidel pro přepravu GMO) do Olomouce, kde bude opět na pracovišti Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, Šlechtitelů 27, Oddělení molekulární biologie, budova H, II. Podlaží, v laboratoři 2.39 zlikvidován autoklávováním Postupy na ochranu zdraví lidí, zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti v případě nežádoucího ovlivnění vzniklou havárií; popřípadě metody na zneškodnění nebo sanaci rostlin a zvířat, které se nacházely v oblasti v době havárie, v souladu s jinými právními předpisy 19) V případě havárie, ani při běžné manipulaci s GM ječmenem s LL-37, nepředstavuje tento ječmen žádné riziko pro zdraví lidí, zvířat a životní prostředí. Negativní účinky na zdraví člověka, zvířat a necílových organismů nejsou známy a nepředpokládají se. Vnesený peptid LL-37 je lidského původu a ostatní části expresní kazety jsou v genovém inženýrství běžně používány. Vložené geny také nevedou ke konkurenční výhodě GM ječmene (podrobně uvedeny v Žádosti pro uvedení GMO do ŽP v bodech 12.2.,12.3. a 12.5). Pravděpodobnost, že se tento jarní ječmen rozšíří mimo pokusnou plochu, je zanedbatelná. Rostliny vzešlé z výdrolu na podzim jsou citlivé na mráz a v našich podmínkách přezimují jen ojediněle. Případné rostliny vzešlé z výdrolu v následujícím roce (viz Plán monitoringu), je možno regulovat mechanicky nebo chemicky vhodným 22