ZPRÁVA O PRŮBĚŽNÉM PLNĚNÍ GRANTOVÉHO PROJEKTU KAN ZA ROK 2008

Transkript

1 ZPRÁVA O PRŮBĚŽNÉM PLNĚNÍ GRANTOVÉHO PROJEKTU KAN ZA ROK 2008 Podle stanoveného časového harmonogramu grantového projektu AV KAN byly v roce 2008 řešitelským týmem (složeným z ÚJF AV ČR Řež, FZÚ AV ČR Praha, FGÚ AV ČR Praha, ÚACH AV ČR Řež a VŠCHT Praha) řešeny následující úkoly: A1: Příprava a charakterizace tenkých vrstev nanokompozitů fullerenů a přechodových kovů na vybrané substráty s cílem vytvořit dobře definované nanostruktury vhodné pro bioaplikace (viz část B2). A2: Příprava latentních stop v syntetických polymerech vytvořených bombardováním ionty s různou hmotností a energiemi. Stanovení kinematiky chemického leptání latentních stop a tvorba pórů pro jejich plnění bioaktivními látkami (část B2). B1: Příprava a charakterizace uhlíkových nanostruktur (pomocí naprašování, napařování a metodou CVD) v polymerech vhodných pro bioaplikace. B2: Hodnocení adhese, růstu, diferenciace a životaschopnosti buněk osteogenních linií na nanostrukturovaných planárních substrátech v klasických statických kultivačních systémech a nastavení optimálních kultivačních podmínek v systémech dynamických. B3: Optimalizace uspořádání mikrovlnných systémů PECVD k ověření principu depozice nankokrystalických diamantů (NCD) na velké plochy vhodných pro bioaplikace (část B2). Modifikace vrstev NCD s použitím iontové mikrosondy (v ÚJF AV CR v Reži). C1: Řízená syntéza Au substrátů s hydrofilními vrstvami vícefunkčních derivátů a příprava Au vrstev na různých substrátech vhodných pro bioaplikace (část B2). C2: Studium interakce monovrstev thiolových derivátů karboranů připravených s biomolekulami a tkáňovými kulturami (část B2). C3: Modifikace karboranových monovrstev vytvořených na Au substrátech vhodných pro bioaplikace (část B2). Pro úspěšné řešení grantového projektu bylo nutné, aby se každý spoluřešitelský tým soustředil na jemu stanovené úkoly (ÚJF - A1, A2; FgÚ - B1, B2; VŠCHT - B1, B2; FZÚ - B3; ÚACH - C1, C2, C3) a tyto úkoly řešil v těsné spolupráci s ostatními skupinami. Získané výsledky svědčí o tom, že jednotlivé týmy spoluřešitelů své úkoly splnily a že jejich vzájemná spolupráce byla bezproblémová. Zpráva v následujícím informuje o nejdůležitějších vědeckých výsledcích a hospodaření jednotlivých týmů za rok 2008 a o návrhu jejich postupu prací a financování na rok ÚJF - Ústav jaderné fyziky AV ČR Řež (Mgr. Jiří Vacík, CSc.) ÚJF - Práce plánované na rok 2008 V roce 2008 bylo podle harmonogramu grantového projektu studováno několik následujících témat: Příprava tenkých vrstev binárních kompozitů kovů a fullerenů (metodou alternativní depozice resp. kodepozice) na oxidy kovů a dalších substrátů a jejich charakterizace relevantními analytickými metodami (úkol A1). Studium procesu separace fází (kovů a fullerenů) v připravených hybridních vrstvách aktivované termálním žíháním resp. iontovým ozařováním (úkol A1). Studium přípravy a leptání latentních stop v polymerech s cílem vytvořit nanostruktury s otevřenými póry, které by bylo možné plnit bioaktivními (biotolerantními) látkami (úkol A2). Z dosažených výsledků lze konstatovat, že většina úkolů plánovaných na rok 2008 byla splněna. Byly připraveny nanostruktury na bázi fullerenů, fullerenů a kovů, pórů leptaných v polymerech aj., které byly využity pro cílené studium biotolerantních rozhraní vhodných pro implantáty v tkáňovém inženýrství. ÚJF - Výsledky dosažené v roce 2008 Ve druhém roce řešení grantového projektu byly dokončeny metodické práce na kompletaci a zprovoznění depozičních systémů (Univex a MBE - Molecular Beam Epitaxy). Oba systémy umožňují v současné době přípravu tenkých vrstev hybridních kompozitů metodou alternativní depozice resp. kodepozice kovů a fullerenů 1

2 s přísně stanovenou depoziční kinetikou. Touto metodou lze připravovat hybridní multivrstvy a mixy s různou strukturou a morfologií, kterou lze kontrolovat volbou depozičních parametrů (tj. depozičními rychlostmi jednotlivých komponent, teplotou udržovanou na substrátu při depozici, tloušťkou jednotlivých vrstev apod.). Pro postdepoziční tepelnou modifikaci hybridních vrstev byla navržena a zhotovena speciální vakuová komůrka s píckou, která umožňuje žíhání vzorků do teplot až 1000ºC (s přesností jen několika málo stupňů) jak ve vysokém vakuu tak i v inertní atmosféře. Pro modifikaci vrstev iontovými svazky (H Au) byl využíván lineární urychlovač Tandetron HV, který byl nedávno instalován v Laboratoři analytických metod ÚJF AV ČR v Řeži. Analýza strukturních a dalších parametrů připravených a modifikovaných hybridních vrstev byla prováděna standardními metodami dostupnými v ÚJF (pomocí nukleárních analytických metod RBS, RBS/Channeling, ERDA, NDP), FZÚ (Ramanovskou spektroskopií a v ÚACH (pomocí mikroskopických metod SEM, TEM a HRTEM). V následujícím jsou uvedeny nejdůležitější experimentální výsledky získané v roce a) Strukturní jevy indukované ve skelném uhlíku ozařováním ionty Co [II-1]. Skelný uhlík (GC) byl ozářen ionty Co + s dávkou a iontů/cm 2. Při nižší dávce došlo na povrchu vzorku k narušení struktury GC a k vytvoření amorfního uhlíku (a-c), při vyšší dávce navíc k vytvoření uspořádané struktury a-c. Společně s uspořádanou strukturou a-c bylo identifikováno i formování řetězců transpolyacetylenu (TPA). Z měření RBS vyplynulo, že dochází k difúzi Co do formací TPA. Značné zvrásnění povrchu GC (pozorované především při vysoké dávce ozáření) svědčí o výrazné klasterizaci uhlíku. b) Spontánní dělení tenké hybridní vrstvy Ni+C 60 připravené při pokojové teplotě [II-2]. V dalším experimentu byla studována hybridizace tenkých vrstev kompozitů Ni+C 60 deponovaných na monokrystal MgO(001) při pokojové teplotě. Pomocí metody MFM (Magnetic Force Microscopy) byl objeven systém magnetických domén, který ukázal na skrytou vnitřní separaci fází. Toto fázové rozdělení se vytvořilo v průběhu procesu depozice vrstvy a svědčí o značné termodynamické nestabilitě hybridního kompozitu. Následné termální žíhání vedlo k zásadnímu přerozdělení struktury vrstvy s tím, že soustava magnetických domén vymizela. Nanostruktura kompozitu Ni+C 60 deponovaného na MgO(001) při pokojové teplotě. Skrytá struktura magnetických domén kompozitu Ni+C 60 nalezená pomocí metody MFM. c) Hybridizace a modifikace kompozitů Ni/C 60 [V-1]. Dále byla studována hybridizace a termální evoluce binárních kompozitů Ni+C 60 deponovaných na Si(001) při pokojové teplotě. Ukázalo se, že připravené vrstvy mají nanostrukturovanou morfologii s nanočásticemi Ni obklopenými tenkou polymerizovanou vrstvou fullerenů. Distribuce obou komponent (Ni a C 60 ) byla v podpovrchové vrstvě homogenní a poměr zastoupení Ni a C 60 stabilní. Ve větších hloubkách byla však distribuce komponent nehomogenní a poměr Ni/C 60 se výrazně měnil. Termální žíhání dramaticky změnilo všechny strukturní parametry kompozitu: docházelo k postupnému úniku a rozpadu fullerenů (a přeměně jejich fragmentů na amorfní uhlík), k pomalé separaci fází a k vytváření volného prostoru uvnitř stresovaného kompozitu. 2

3 d) Samoorganizování hybridních nanočástic při kodepozici Co a C 60 [V-2, V-3, III-2, III-3]. V tomto experimentu byla studována hybridizace dalšího typu hybridních kompozitu, tj. Co-C 60. Tenké vrstvy nanostrukturovaných kompozitů Co-C 60 s vysokým obsahem Co (cca 50 at. %) byly připraveny kodepozicí atomů Co (s pomocí elektronového děla) a molekul C 60 (s pomocí Knudsenovy cely) na substráty monokrystalu safíru (α-al 2 O 3 ). Pomocí metod AFM, HRTEM, XRD a Ramanovské spektroskopie bylo zjištěno, že binární kompozity metalofullerenů Co-C 60 mají kombinovanou strukturu složenou z fcc nanokrystalů Co a z organometalických polymerizovaných řetězců Co-C 60 orientovaných příčně ve směru tloušťky deponované vrstvy. Termální žíhání nanokompozitních tenkých vrstev Co-C 60 (syntetizovaných při pokojové teplotě) způsobilo při zvýšených teplotách (> 300ºC) transformaci polymerizovaných organometalických řetězců v jednostěnné uhlíkové nanotrubičky SWNT (single-wall carbon nanotubes), které byly dopovány atomy Co. Analýza Ramanovských spekter a snímků HRTEM ukázala, že atomy Co jsou umístěny uvnitř uhlíkových nanotrubiček (ve tvaru tzv. peapodů ) mající tvar 1D šroubovice. Výsledky studia svědčí o pozoruhodném strukturním uspořádání, které se v hybridních vrstvách typu Co-C 60 (syntetizovaných při pokojové teplotě a následně žíhaných při teplotách nad 300ºC) mohou vytvořit: tj. soustavu fcc nanokrystalů Co separovaných vertikálně orientovanými uhlíkovými nanotrubičkami SWNT vnitřně dopovanými atomy Co ve tvaru tzv. peapodů. e) Efekt teploty na strukturu nanokompozitu Co+C 60 [V-3, III-3]. V dalším experimentu byl studován efekt depoziční teploty na strukturu hybridních vrstev Co-C 60. Ukázalo se, že kodepozice, provedená při pokojové teplotě substrátu, vede ke vzniku komplexů s různě orientovanými fcc nanokrystaly Co separovanými polymerizovanými řetězci Co-C 60. Bylo zjištěno, že část molekul C 60 se při depozici rozpadá. Depozice při teplotách ºC má jen okrajový efekt struktura kompozitu zůstává stejná, velikost fcc nanokrystalů Co se mění (roste) jen málo a dochází pouze ke snížení hrubosti povrchové morfologie deponované vrstvy. Procento fragmentujících molekul C 60 se však zvyšuje. Depozice při teplotách > 300ºC má však již výrazný efekt. Dochází ke snižování efektivity polymerizace komplexů Co-C 60, ke zvyšování fragmentace molekul C 60, k postupné separaci fází (tj. k separaci Co a C 60 (C)) a k růstu velikosti fcc nanokrystalů a uhlíkových allotropů (vytvořených z fragmentů C 60 ). Molekuly C 60 se v blízkosti Co nanokrystalů rozpadají se zvýšenou intenzitou a tvoří nanoostrůvky složené z uhlíkových allotropů (grafitu, amorfního uhlíku ap.). Studie poukázala na úzkou souvislost nanostruktury kompozitů Co-C 60 s depoziční teplotou zvolenou při přípravě hybridních vrstev. f) Nanostruktura vrstev fullerenů pomocí klastrů C + 60 [II-3, V-4]. Další experiment se týkal modifikace tenkých vrstev svazkem ionizovaných fullerenů. K modifikaci fulleritů (deponovaných na monokrystaly α-al 2 O 3 ) byl použit svazek klastrů C + 60 s energií 50 kev. Modifikované vrstvy byly studovány pomocí metody AFM, Ramanovskou spektroskopií a povrchovou profilometrií (Dektak). Bylo zjištěno, že nanostruktura modifikovaných vrstev je silně závislá na fluenci klastrů C Při nízkých fluencích (< iontů/cm 2 ) způsobovalo bombardování fulleritů tvorbu nanoteček (nanodots) o velikosti cca 10 nm homogenně rozmístěných na povrchu vrstev. Bombardování s vyšší fluencí (> iontů/cm 2 ) však vedlo k výraznému odprašování (sputtering) a zároveň vyhlazování povrchu fulleritů. Vedle toho však bombardování s vyšší fluencí vedlo i k vytvoření uspořádaných polymerizovaných řetězců C 60 - C 60. Tato sebeorganizace povrchové morfologie fulleritů byla způsobena šokovou vlnou generovanou v povrchové vrstvě vzorku dopadem energetických klastrů C g) Konduktometrická měření leptaných pórů [IV-1]. Fólie polyesteru Hostaphan, 6 um, byly ozářeny ionty Cu (12, resp. 22 MeV) a Au (22 MeV) s nízkou fluencí s cílem vytvořit systém latentních stop. Ozářené fólie byly poté chemicky leptány s kinematikou, která byla předmětem studia. Leptáním byly získány póry submikronových rozměrů především u folií ozářených ionty Au. Cílem studia bylo vytvořit leptané póry různých průměrů a dle možnosti i profilů, jejichž parametry by bylo možné kontrolovat. K tomu účelu byla připravena i UV ozařovací komora, kde se k ovlivnění procesu formování pórů využívá vlastností UV světla. V další etapě byla dále ověřena funkčnost připravené konduktometrické aparatury (sestávající se z měřící komůrky a konduktometru) a byly provedeny první konduktometrické studie leptaných vzorků. Na základě naměřených závislostí byly stanoveny příslušné leptací podmínky a na jejich základě bylo provedeno řízené chemické leptání. Vyleptané vzorky byly průběžně prohlíženy metodou SEM a výsledky zobrazení pórů byly srovnávány s teoretickými výpočty. V průběhu experimentu se ukázalo, že existuje významná disproporce mezi výpočtem a měřením (ukazuje se, že dolet iontů Au s energií 22 Mev je menší než předpovídá MC program SRIM). Vzniklý problém je nutné vyjasnit, proto bude předmětem studia i v další etapě studia. 3

4 Póry iontů Au (22 MeV, 5x10 8 cm -2 ) ve fólii Hostaphan (PET, 6 um) leptané 90 min v 30% KOH, při pokojové teplotě: a) čelní strana (vstup iontů), hustota pórů ~4.8x10 8 cm -2, b) zadní strana, hustota pórů ~2.7x10 8 cm -2, c) průřez. Připravené tenké vrstvy hybridních nanostruktur byly použity pro studie biokompatibility a jejich možné aplikovatelnosti v tkáňovém inženýrství. Tyto studie byly prováděny především v laboratořích FGÚ (Dr. L. Bačáková). V rámci těchto experimentů byly analyzovány tenké vrstvy kontinuálních a mikrostrukturovaných fullerenů, hybridních kompozitů a nanokrystalických diamantů z hlediska jejich biokompatibility s buňkami kostní dřeně typu MG63 [II-4, II-5, I-2, II-7, II-8, III-4, III-9]. Spolupráce týmu ÚJF byla vedena především s týmem FGÚ, kdy byly pro potřeby úkolu B2 připraveny různé typy vzorků (fulleritů a hybridních nanostruktur), na kterých byly v laboratořích FGÚ prováděny testy adheze, růstu a proliferace vybraných buněk. Tato spolupráce byla bezproblémová a bude pokračovat i v roce Další spolupráce byla se spoluřešitelským týmem ÚACH, který podle požadavků pořizoval snímky leptaných fólií metodou SEM. Cenné informace a experimentální pomoc poskytli v rámci neformální spolupráce i pracovníci FLJR SÚJV Dubna (vedení Dr. P.Yu. Apelem) a ATOMKI, Debrecen (Dr. G. Dajkó zapůjčil druhou konduktometrickou komůrku k provádění paralelních měření). Zahraniční partneři nejsou přímými účastníky grantového projektu, vzájemné kontakty jsou však velmi užitečné. ÚJF - Návrh postupu prací na rok 2009 Na rok 2009 je podle stanoveného harmonogramu projektu plánována příprava a charakterizace multikomponentních (binárních a vyšších) kompozitů na bázi fullerenů (především C 60 s vysokou čistotou) a tranzitních a vzácných kovů (případně dalších vybraných prvků) deponovaných (alternativně resp. současně) na monokrystaly oxidů kovů, alkalických kovů, případně dalších substrátů (úkol A1). Dále bude pokračováno ve studiu přípravy latentních stop (vytvořených v syntetických polymerech bombardováním ionty) a jejich leptání (optimalizace kinetiky leptání) a plněním vytvořených pórů bioaktivními látkami (úkol A2). Polymery, binární kompozity a další materiály budou dále vystaveny termálnímu žíhání a iontovému ozařování s cílem modifikovat jejich nanostrukturu tak, aby byly vhodnými substráty pro účely tkáňového inženýrství (úkoly A3 a A4). FZÚ - Fyzikální ústav AV ČR Praha (Ing. František Fendrych, Ph.D.) FZÚ - Práce plánované na rok 2008 Základním úkolem byla optimalizace uspořádání mikrovlnných PECVD systémů k ověření principu depozice NCD (scalability) na velké plochy. Tato otázka je podstatná pro budoucí možné průmyslové využití. Lze konstatovat, že obsah a harmonogram prací pro rok 2008 byl dodržen. 4

5 FZÚ - Výsledky dosažené v roce 2008 Práce na grantovém projektu byla zaměřena na technologickou oblast a výzkum materiálů. V technologické oblasti projektu probíhala velmi intenzívně práce na návrzích depozičních systémů pro přípravu nanodiamatových vrstev s možností dopování bórem a k depozicím na velké plochy. Na základě diskuzí s odborníky z Německa a spolupráce s japonsko-americkou firmou SEKI Technotron byly připraveny návrhy dvou nových depozičního systémů, které jsou v současnosti ve stadiu výroby a budou instalovány a uváděny do provozu ve dvou nově zřizovaných laboratořích FZÚ Slovanka. V oblasti výzkumu materiálů se pokračovalo ve studiu B-dopovaného nanodiamantu (B-NCD) jako nového vhodného materiálu pro růst a proliferaci buňek. Tento materiál je velice důležitý z hlediska aplikací v buněčné biologii, a to specificky pro aplikace implantátů. B-dopovaný diamant je v současné době rovněž nejpoužívanější materiál pro bioelektrochemické aplikace. Na rozdíl od nedopovaného diamantu, jehož vodivost je možné kontrolovat pomocí takzvané metody surface transfer doping a která neumožňuje zcela stabilní povrchovou vodivost, B dopovaný diamant umožňuje kontrolovanou elektrickou vodivost v rozmezí mnoha (až 12-ti) řádů. Proto z hlediska konstrukce povrchových tranzistorů, což je jedna z finálních aplikací tohoto projektu, je mnohem výhodnější používat B-dopovaný diamant než diamant nedopovaný, který je na povrchu ukončený vazbami s H či O. Z tohoto důvodu bylo v projektu pokračováno především ve studiu biokompatibility B- dopovaného diamantu. Vzorky byly připravovány v rámci spolupráce s Universitou v Hasseltu, neboť ve FZÚ není systém pro deponování B-dopovaných vrstev v současné době k dispozici. Na druhé straně je v FZÚ takovýto systém pro přípravu B-dopovaných vrstev diamantu připravován, a k tomu účelu byly dokoupeny některé komponenty. Ty byly do FZÚ dodány na konci roku 2008 a jejichž sestavení do funkčního systému je plánováno na začátek roku V rámci spolupráce s Universitou v Hasseltu v Belgii byla studována vodivost (resp. mechanismus vodivosti) v připravených B-dopovaných nanodiamantových vrstvách, a to od lehce dopovaného diamantu (který je polovodivý) až po kovově legovaný diamant. Výsledkem tohoto studia bylo dosažení měrných vodivostí v oblasti 100 mscm -1, které se přibližují vodivostem monokrystalických kovově dopovaných diamatů se stejnou koncentrací B. Optimalizace dopování je důležitá z hlediska přípravy povrchových transistorů typu ISFET. B- dopované vrstvy byly testovány rovněž pomocí Ramanovské spektroskopie a bylo provedeno studium jejich transportních vlastností při nízkých teplotách (ve spolupráci s Dr. J. J. Marešem a Dr. P. Hubíkem z FTP). Výsledky těchto prací byly prezentovány v několika zvaných přednáškách na mezinárodních konferencích [VII- 4, VII-5, VII-7, VIII-16, VIII-17, VIII-18, VIII-20, VII-21]. V rámci grantového projektu se předpokládá, že mikroelektrické součástky vytvořené na základě B- dopovaného diamantu budou využívány pro interfaceování buněčných tkáni, a to specificky při konstrukci (smart) implantátů s kontrolovatelnou elektrickou vodivostí. Tyto součástky pak mohou být významné v bioaplikacích jako mikroelektrody (nebo matrice mikroelektrod) pro buněčné systémy (zejména nervové buňky). Z tohoto důvodu byly na různě dopovaných vrstvách diamantů prováděny (ve spolupráci s FGÚ) testy růstu, proliferace a biokompatibility kostních buněk typu MG 63. Na základě této spolupráce bylo zjištěno [I-2, II-8, III-4, III-6], že B-dopovaný nanodiamant je vysoce biokompatibilní materiál, jehož biokompatibilita se příliš neliší od nedopovaného diamantu. Při porovnání vrstev stejné povrchové drsnosti bylo dále zjištěno, že biokompatibilita obou druhů materiálů je prakticky stejná. Navíc při zkouškách s buňkami MG 63 bylo zjištěno, že při růstu na B-nanodiamantech dochází ke zvýšené produkci osteokalcinu. Adhese a růst buněk byly v obou dvou případech (tj. nedopovaných či dopovaných vrstev) obdobné či i vyšší než na standardních kultivačních substrátech (polystyren a sklo). Tyto výsledky byly publikovány ve vědeckých časopisech a prezentovány na několika vědeckých konferencích (např. evropská diamantová konference v Sitges a mezinárodní Workshop SBDD 2008 v Hasseltu, Belgie, viz [VII-6, VIII-15, VIII-19]). V rámci pokračovaní základního studia biokompatibility speciálních diamantových vrstev byl studován vliv jejich povrchové terminace (terminace vazeb s O) a vliv jejich hierarchické struktury (tj. nanodrsnost vrstvy a mikrodrsnosti substrátu) na adhezi a růst buněk. Z hlediska přípravy nanostrukturovaného povrchu se dosáhl významný pokrok v cílené tvorbě nanosloupků a jiných povrchových nanostruktur. Výsledky této práce byly úspěšně prezentovány na mezinárodní konferenci Solid State Surfaces and Interfaces , a příspěvek byl zaslán do časopisu Central European Journal of Physics, [VI-7]. Následně byla na těchto strukturách realizována řada biologických experimentů (Dr. M. Kalbáčová) s předpokládanou prezentací na mezinárodních konferencích Hasselt Diamond Workshop SBDD XIV (03/2009, Hasselt Belgie, Ing. Babchenko) a 23rd International Winterschool on the Electronic Properties of Novel Materials Molecular Nanostructures, IWEPNM 2009 (03/2009, Kirchberg Rakousko, Dr. Kalbáčová). 5

6 SEM cross section view nanorods Snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu (cross section SEM image) diamantové vrstvy leptané reaktivní plasmou (reactive ion plasma). Jako maska byly při leptání použity nanočástice Ni. substrate Ve spolupráci se zahraničním partnerem (Prof. Ken Haenen, University Hasselt Belgie) byla připravena sada diamantových struktur dopovaných bórem za účelem studia vlivu koncentrace bóru na strukturu cytoskeletu buněk, případně na toxicitu daných vrstev. Daná sada vzorků pozůstává z 36 oboustranně pokrytých maloplošných vzorků (velikosti 10x10 mm 2 ) a ze 4 oboustranně pokrytých velkoplošných vzorků (velikosti 50 mm v průměru). Tyto vzorky jsou určené i pro plánované studie ELISA, které jsou v současné době ve fázi rozpracování; předpokládá se, že bio-experimenty budou realizovány v FGÚ (Dr. L. Bačáková) a charakterizace vrstev v FZÚ (Dr. A. Kromka) a ÚJF (Dr. J. Vacík). Vědecký přínos těchto studií se předpokládá v roce 2009 a V rámci spolupráce s Národní Universitou v Singaporu (NUS) byla dále studována interakce fullerenů s povrchy diamantu. Bylo dosaženo důležitého úspěchu. V experimentech se podařilo chemicky (pomocí tzv. Diels Adlrovy reakce) navázat fullereny přímo na nanodiamanotvé vrstvy. Tyto systémy jsou velice zajímavé z hlediska přípravy nových uhlíkových nanokompozitů s výraznými vlastnostmi přenosu elektrického náboje. V případě spolupráce s NUS se jednalo o první přímou chemickou vazbu mezi diamanty a fullereny. Výsledky studia budou publikovány v roce Spolupráce s ostatními spoluřešitelskými týmy, především s FGÚ a ÚJF byla tradičně velmi dobrá. V FZÚ byly navíc Dr. Z. Remešem měřeny optické vlastnosti různých vrstev připravovaných v ÚJF. Bylo pokračováno i ve vzájemných návštěvách pracovníků z FGÚ a FZÚ ke zvýšení jejich vzájemných mezioborových znalostí. Společná experimentální aktivita vedla k řadě článků v mezinárodních časopisech, k několika zvaným přednáškám na mezinárodních konferencích a k (orálním a posterovým) prezentacím výsledků. FZÚ - Návrh postupu prací na rok 2008 V roce 2009 bude v FZÚ uvedena do provozu nová aparatura MW CVD pro depozici B-dopovaných vrstev, která byla částečně financována z dalších projektů řešených na pracovišti v FZÚ. V rámci grantového projektu KAN budou aplikovány podmínky, které byly již úspěšně použity pro růst B-NCD vrstev v rámci spolupráce s Universitou v Hasseltu v Belgii. Předpokládá se, že B-dopované vrstvy připravené v FZÚ budou dosahovat stejných elektrických a optických parametrů. V roce 2009 se rovněž plánuje příprava matricových elektrod vytvořených z B-NCD pro interfaceování k buňkám. Dále je plánováno, že budou provedeny první velkoplošné depozice nanokrystalického diamantu pro implantáty pomocí nového depozičního systému používajícího lineárního mikrovlného zdroje (tento zdroj byl v původním plánu k zakoupení z prostředků projektu, ale byl nahrazen koupí systému RIE - Reactive Ion Etching pro leptání vrstev; nákup realizovala v roce 2007 skupina v FZÚ Cukrovarnická, Dr. A. Kromka). Dále, během roku 2009 se bude pokračovat v studiu 6

7 specielně upravených primárních povrchů substrátů pomocí reaktivního plazmatického leptání RIE (skupina Dr. Kromky z FZÚ Cukrovarnická) a jejich biokompatibility ve spolupráci s FGÚ (Dr. L. Bačáková). FGÚ - Fyziologický ústav AV ČR Praha (MUDr. Lucie Bačáková, CSc.) FGÚ - Práce plánované na rok 2008 V roce 2008 byly ve Fyziologickém ústavu AV ČR (ve spolupráci s dalšími pracovišti) řešeny následující úkoly: Pokračování v hodnocení adhese, růstu, diferenciace a životaschopnosti buněk osteogenních kostních linií na nanostrukturovaných planárních (2D) substrátech v klasických statických kultivačních systémech (úkol B2). Nastavení optimálních kultivačních podmínek v systémech dynamických (rotačním a průtokovém), zatím s použitím buněk na 2D substrátech (včetně vrstev uhlíkových nanočástic vázaných s kovy či různými chemickými funkčními skupinami, především s obsahem kyslíku); (úkol B2). Lze říci, že tento harmonogram pro rok 2008 byl dodržen. Byla hodnocena adhese, růst, osteogenní diferenciace, životaschopnost a některé markery imunitní aktivace lidských kostních buněk linie MG 63 na kontinuálních a mikrostrukturovaných vrstvách fullerenů C 60, na binárních kompozitech fullerenů C 60 a titanu, na kompozitech syntetických polymerů a uhlíkových nanotrubiček, a konečně na nanokrystalickém diamantu naneseném na silikonový substrát v podobě nanostrukturovaných vrstev nebo vrstev s hierarchicky organizovanou mikro- a nanostrukturou. Některé nanostrukturované vrstvy byly dopovány bórem. FGÚ - Výsledky dosažené v roce 2008 a) Interakce buněk MG 63 s kontinuálními a mikrostrukturovanými vrstvami fullerenů C 60 [I-1, I-2, II-5, II- 7, III-4, III-9, III-14]. Fullerenové vrstvy byly deponovány na mikroskopická krycí sklíčka ve vakuovém systému Univex-300 na pracovišti hlavního řešitele ÚJF AVČR. V závislosti na teplotě a době expozice byly vytvořeny vrstvy o různé tloušťce. Jak ukázala mikroskopie atomové síly (AFM), tloušťka kontinuálních vrstev byla 505 ± 43 nm nebo 1090 ± 8 nm. Kromě toho byly deposicí přes kovovou mřížku získány fullerenové vrstvy obsahující výstupky o výšce 128 ± 8 nm, 238 ± 3 nm, 326 ± 5 nm, a 1043 ± 57 nm (průměr ± S.D.). Fullereny byly přítomny i v brázdách mezi vyvýšeninami, třebaže jejich vrstva byla obvykle o 1 až 2 řády tenčí než na vyvýšeninách (tj. jejich tloušťka byla v rámci S.D.) Adhese osteoblastických buněk MG 63 na kontinuální vrstvy fullerenů, jejich růst, životaschopnost (měřená aktivitou esteráz či propustností membrány pomocí komerčně dostupných fluorescenčních kitů), tvorba fokálních adhesních plaků s obsahem β 1 integrinů, talinu a vinkulinu, beta-aktinového cytoskeletu a osteokalcinu zcela srovnatelné s odpovídajícími parametry u buněk rostoucích na standardních kultivačních materiálech, jakými je polystyrénová kultivační miska a mikroskopické krycí sklo. Tento výsledek byl do jisté míry překvapivý, neboť vrstvy fullerenů byly poměrně vysoce hydrofobní (kontaktní úhel vodní kapky kolem o ), což je obvykle neslučitelné s dobrou adhesí a růstem buněk. Navíc v odborné literatuře bývá fullerenní materiál často charakterizován jako cytotoxický. Zřejmě byla vysoká hydrofobie vrstev alespoň do jisté míry kompenzována jejich povrchovou nanostrukturou, která je považována za příznivou pro adsorpci proteinů zprostředkujících adhesi buněk ve vhodné geometrické konformaci, umožňující dosažitelnost specifických aminokyselinových sekvencí v molekulách těchto proteinů adhesními receptory buněk. Vrstvy byly navíc relativně stabilní, odolné k otěru a působení biologických tekutin či chemikálií (např. při imunofluorescenčním barvení buněk), a tak pravděpodobně nedocházelo k významnému uvolňování fullerenních molekul a k jejich průniku do buněk, což je předpokladem jejich cytotoxického působení. Rovněž mikrostrukturované vrstvy fullerenů s vyvýšeninami do 326 ± 5 nm umožňovaly homogenní nárůst buněk s populační hustotou obdobnou jako na standardních kultivačních površích. Na vrstvách s vyvýšeninami kolem 1000 nm však buňky adherovaly a rostly prakticky výhradně v brázdách mezi vyvýšeninami. Uplatnila se zřejmě souhra několika nepříznivých faktorů, jako je např. strmý sklon vyvýšenin, difuse fullerenů po úbočích vyvýšenin, která mohla buňky strhávat směrem k brázdám, a již výše zmíněná hydrofobie fullerenů. Každopádně by fullereny mohly být využity pro konstrukci povrchů pro regionálně selektivní adhesi a růst 7

8 buněk, které mají uplatněn v různých biotechnologiích, jako je tkáňové inženýrství, konstrukce biosenzorů, technika microarrays pro moderní proteomiku a genomiku. Morfologie kostních buněk MG den po vysazení na mikrostrukturované vrstvě fullerenů (o tloušťce cca 1 µm). Fullereny C 60 byly deponovány na substráty (laboratorní krycí skla) přes mřížku tak, aby se vytvořily separované ostrůvky fullerenů oddělené od sebe údolími. Proces byl proveden v depozičním systému Univex s kontrolovanou depoziční kinetikou. b) Interakce buněk MG 63 s kontinuálními a mikrostrukturovanými vrstvami binárních kompozitů fullerenů C 60 a titanu nebo niklu [I-2, II-4, III-4, III-9, III-14]. Hybridní souvislé nebo mikrostrukturované hybridní C 60 /Ti filmy byly připraveny obdobnou metodou jako čistě fullerenní filmy, a sice současnou depozicí C 60 a Ti v poměru 1:1. Pro porovnávací studie byly současně připraveny i kontinuální či mikrostrukturované vrstvy samotných fullerenů C 60 a titanu. Výška výstupků na mikrostrukturovaných vrstvách se pohybovala od ± 2.1 nm do ± 5.1 nm. Některé z mikrostrukturovaných vrstev C 60 a C 60 /Ti byly následně ozářeny ionty Au + (energie 1635 kev, dávka iontů 2x10 14 cm -2 ), a konvertovány tak na amorfní uhlík (a-c) či směs amorfního uhlíku s titanem (Ti/a-C). Podobně jako na mikrostrukturovaných vrstvách fullerenů C 60, i na mikrostrukturovaných hybridních vrstvách C 60 /Ti buňky adherovaly a rostly přednostně v brázdách mezi doménami, a to již od nejnižší výšky těchto mikrodomén. V závislosti na výšce mikrodomén a době kultivace obsahovaly brázdy mezi mikrodoménami 57 až 90 % celkového počtu buněk na daném vzorku. Avšak třetí den po nasazení na iontově ozářené vrstvy začaly být buňky distribuovány rovnoměrně po celé ploše vzorku, tj. bez ohledu na mikrodomény a brázdy mezi nimi. Bylo to pravděpodobně způsobeno tvorbou chemických funkčních skupin s obsahem kyslíku, o kterých je známo, že zvyšují atraktivitu materiálu pro adhesi buněk, zejména zvýšením jeho povrchové hydrofilie. Byly rovněž připraveny hybridní vrstvy fullerenů C 60 a niklu, ale vzhledem k cytotoxicitě a imunogenicitě Ni se tyto vrstvy hodí spíše k elektronickým a dalším technickým aplikacím než k aplikacím biologickým. Lze uzavřít, že hybridní C 60 /Ti filmy byly dobrým substrátem pro adhezi a růst MG 63 osteoblastů. Mikrostrukturované C 60 /Ti filmy by mohly být (podobně jako výše zmíněné mikrostrukturované vrstvy fullerenů) využity pro navození regionálně selektivní adheze a řízeného růstu buněk pro různé biotechnologické aplikace. c) Interakce buněk MG 63 s kompozity polymer-uhlíkové nanotrubičky [I-1, I-2, III-4, III-5, III-10, III-12, III-13]. V rámci externí spolupráce s AGH University of Science and Technology v Krakově jsme realizovali předběžnou studii ke konstrukci prostorových (3D) porézních nosičů pro buňky, kde by stěny mikropórů byly dekorovány uhlíkovými nanočásticemi. Uhlíkové nanočástice v podobně jednostěnných a mnohostěnných nanotrubiček byly přimíšeny prozatím do planárně konstruovaných podložek z polysulfonu nebo z terpolymeru polypropylenu, polytetrafluorethylenu a polyvinyldifluoridu (oba typy polymerů jsou považovány za vhodné pro aplikace v inženýrství kostní tkáně). Nanotrubičky prominovaly na povrchu polymerních matric a vytvářely jejich povrchovou nanostrukturu. Místy byly nanotrubičky seskupené do mikroagregátů, takže na povrchu polymeru byly i nerovnosti řádově v mikronech (parametr R a, tj. výška či hloubka nerovností, stoupal přibližně od 0.5 do 2 mikrometrů). Tyto nerovnosti však byly poměrně oblé a nebránily dobrému rozprostření buněk. Adhese a růst kostních buněk MG 63 na kompozitech terpolymer-nanotrubičky byly výrazně (až několikanásobně) vyšší než na nemodifikovaném terpolymeru. Na nemodifikovaném polymeru adherovaly buňky v nízkém počtu, často zůstávaly nerozprostřené, tj. kulovité, tvořily četné agregáty a jejich proliferační aktivita byla nízká. Zajímavé přitom je, že modifikované i nemodifikované vzorky terpolymeru měly obdobnou hydrofobicitu kolem 100 o. Proto lze příznivé změny v adhesi a růstu buněk přičítat změnám v povrchové topografii terpolymeru po přimíchání nanotrubiček. Jak 8

9 ukázala enzymatická imunosorbentní esej (ELISA), obsahovaly buňky na kompozitech terpolymer-nanotrubičky vyšší koncentrace talinu a vinkulinu, tj. proteinů asociovaných s adhesními receptory buněk a zúčastněnými tak v procesu buněčné adhese. Navíc buňky nejevily významnou imunitní aktivaci, měřenou koncentrací imunoglobulinové adhesní molekuly ICAM-1, která váže buňky imunitního systému. Při použití polysulfonové matrice nebylo zlepšení adhese a růstu buněk přídavkem uhlíkových nanotrubiček tak výrazné jako u terpolymeru, neboť polysulfon vzhledem ke své relativní hydrofilii podporuje již v nemodifikovaném stavu poměrně výrazně adhesi a růst buněk. d) Interakce buněk MG 63 s vrstvami nanokrystalického diamantu [I-1, I-2, II-6, II-9, V-5, III-4, III-7, III-8, III-14]. Vrstvy nanokrystalického diamantu (NCD) byly naneseny na silikonové substráty mikrovlnnou CVD metodou v elipsoidním reaktoru v FZÚ. Byly vytvořeny jednak vrstvy nanostrukturované (parametr rms kolem 8 nm), a to nanesením NCD na substrát vyleštěný na atomovou drsnost, a jednak vrstvy s hierarchicky organizovanou mikro- a nanostrukturou (rms kolem 301 nm a 8 nm, jichž bylo docíleno nanesením NCD na silikonové substráty zdrsněné broušením. Oba typy vrstev NCD představovaly výborný substrát pro adhesi, růst, udržení vysoké životaschopnosti a vyzrávání osteoblastických buněk MG 63. Buňky měly dobře vyvinuté fokální adhesní plaky, obsahovaly vyšší koncentrace talinu a vinkulinu a produkovaly i osteokalcin, tj. glykoprotein extracelulární matrix vázající vápník, který je významným markerem osteogenní diferenciace buněk. Vhodné byly zejména vrstvy nanostrukturované, do jisté míry napodobující nanoarchitekturu molekul přirozené extracelulární matrix. Adhese a růst buněk byly na nich obdobné či i vyšší než na standardních kultivačních substrátech (polystyren a sklo). Ačkoli i hierarchicky mikro- a nanostrukturované povrchy byly konstruovány podle architektonického principu přirozených tkání, poměrně špičaté submikronové vyvýšeniny často činily překážku řádnému rozprostření buněk na podložce, a proto občas bylo na těchto površích dosaženo nižších populačních hustot buněk. Tento jev byl nápadný zvláště při kultivaci bovinních cévních endotelových buněk linie CPAE, které při rozprostření na kultivační podložce mají snahu zaujmout relativně větší plochu než lidské kostní buňky MG 63. Hierarchicky organizovaná mikro- a nanostruktura by se mohla příznivěji uplatnit při konstrukci 3D porézních nosičů pro buňky, kde by stěny mikropórů byly dekorovány uhlíkovými nanočásticemi. Rovněž je možno vrstvy nanokrystalického diamantu využít pro pokrytí částí kovových kloubních nebo zubních náhrad, kterými je náhrada upevněna do kosti. Vrstvy nanokrystalického diamantu by zabránily uvolňování cytotoxických či imunogenních kovových iontů, zvýšily by atraktivitu povrchu implantátu pro osídlení kostními buňkami a urychlily tak integraci implantátu do okolní kostní tkáně. V tomto smyslu byla navázána spolupráce s firmou Beznoska s.r.o., Kladno, která je v grantovém projektu průmyslovým partnerem. e) Interakce buněk MG 63 s vrstvami nanokrystalického diamantu dopovaného bórem [I-2, II-8, III-4, III-6]. Vrstvy nanokrystalického diamantu byly naneseny na mikroskopická krycí skla mikrovlnnou metodou PECVD, oxidovány, hydrogenovány a část z nich byla dopována bórem (3,000 ppm B:C). Vzorky byly osazeny lidskými kostními buňkami linie MG 63. Sedmý den po nasazení bylo na vrstvách diamantu bez bóru i s bórem dosaženo významně vyššího počtu buněk než na nepokrytých mikroskopických krycích sklech a polystyrénových miskách. Na obou typech vrstev byly buňky dobře rozprostřeny a měly dobře vyvinuté fokální adhesní plaky s obsahem α v a β 1 integrinů, talinu a vinkulinu, a měly dobře vytvořený β-aktinový cytoskelet. Navíc se buňky na vrstvách s bórem výrazněji barvily pomocí imunofluorescence proti osteokalcinu, významnému ukazateli osteogenní diferenciace. Vrstvy nanokrystalického diamantu dopované bórem je možno využít v konstrukci biosenzorů, i pro elektrickou stimulaci buněk, o které je známo, že podporuje adhesi, růst a osteogenní diferenciaci buněk. Poznámky. a) Nastavení optimálních kultivačních podmínek v dynamických kultivačních systémech. Byly použity dva typy systémů, a sice průtokový systém firmy Provitro GmbH (dříve Oligene, Berlín, Německo), a systém rotační firmy Cellon, Lucembursko. V průtokovém systému byly sledovány jednak planární vzorky studovaných materiálů v tzv. flow chamber, kde je vzorek svou horní stranou s nanesenou vrstvou a adherovanými buňkami vystaven prtoku média a tím i určitému mechanickému namáhání. Sledován byl především endotel, který na vzorcích vlivem fyziologického laminárního proudění média ( shear stressu ) rychleji vytvářel vyzrálou konfluentní vrstvu. V tzv. perfusion chamber byla sledována kolonizace porézních a vláknitých polymerních prostorových nosičů buněk (tzv. scaffoldů ) kostními buňkami (zatím byly nosiče zhotoveny pouze z kopolymeru laktidu a glykolidu bez uhlíkových nanočástic). Ve srovnání s kultivací v klasickém statickém systému byly materiály v dynamickém systému daleko hustěji a rovnoměrněji kolonizovány kostními buňkami MG 63, a to včetně vnitřních partií materiálů (ve tvaru disk o tloušťce 1-2 mm). b) Spolupráce se spoluřešitelskými týmy. 9

10 Spolupráce s týmem hlavního řešitele i spoluřešitelskými týmy byla rychlá a pružná, což se projevilo zejména dobrou koordinací spoluautorských týmů při přípravě, revizích a korekturách relativně velkého počtu mezioborových publikací a konferenčních presentací. Významným výsledkem dobré mezitýmové spolupráce je dále to, že postgraduální studentka z FgÚ AVČR Mgr. Ľubica Grausová připravila a úspěšně obhájila disertaci pro získání titulu PhD na téma Uhlíkové nanočástice jako nadějný materiál pro inženýrství kostní tkáně, což by se neobešlo bez rychlé a koordinované přípravy různých typů nanouhlíkových materiálů všemi zúčastněnými pracovišti a rovněž umožněním stáží na uvedených pracovištích. Naopak pracovníci z Fyzikálního ústavu a VŠCHT navštěvovali FgÚ a seznámili se s technikami kultivace buněk na nově vyvíjených materiálech a korelace biologických výsledků a fyzikálně-chemickými vlastnostmi materiálů, což výrazně přispívá k vývoji materiálů aplikovatelných v medicíně, zejména k implantaci do lidského organismu. FGÚ - Návrh postupu prací na rok 2009 Na rok 2009 je plánováno vypracování optimálních technik přípravy primokultur kostních buněk z kostí potkana (úkol B2). Vybrané výsledky interakce buňka-materiál budou ověřeny v primokulturách či nízce pasážovaných kulturách získaných z dlouhých kostí či lebek novorozených potkanů, přičemž budou použity statické i dynamické kultivační systémy. ÚACH - Ústav anorganické chemie AV ČR Řež (Mgr. Tomáš Baše, PhD.) ÚACH - Práce plánované na rok 2008 Na rok 2008 bylo podle harmonogramu grantového projektu plánováno pokračování studia modifikace Au a Ag nanokrystalků a jejich makroskopických vrstev. Z anorganických úkolů byla plánována optimalizace přípravy derivátu 1,2-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10. Dále byly plánovány modifikace Au vrstev karboránthiolovými molekulami a následné studium růstu buněk na těchto vrstvách ve spolupráci s FGÚ. Lze konstatovat, že harmonogram plánu činnosti na rok 2008 byl dodržen a hlavní stanovené cíle byly splněny. ÚACH - Výsledky dosažené v roce 2008 V rámci řešení dílčích úkolů grantového projektu byla dokončena optimalizace přípravy derivátu 1,2-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10, který byl následně použit pro modifikaci planárních vrstev Au. Cílem byl test růstu vybraných buněk na kovových (Au) površích, které byly modifikovány připravenými karboránthiolovými deriváty. Pro porovnání byly analýzy provedeny jak na Au tak i Ag substrátech. Tato fáze výzkumu zahrnovala i studium stability deponovaných karboránthiolových derivátů, což je důležitý aspekt pro jejich potenciální použití v Ti implantátech (modifikovaných vrstvou Au). V dalším experimentu byly modifikované molekulární vrstvy Ag vystaveny parám sulfanu. Tím byla testována jejich integrita (stabilita) vůči korozím vlivům. Tato studie ukázala, jaká je ochota vrstev Ag k substitucím karboránthiolvých derivátů na jejich povrchu - karboranthiolové deriváty se vážou k povrchu zlata jako thioláty, které významně ovlivňují vlastnosti studovaného rozhraní (inteface) kov-vnější prostředí [II-20, VII-11, VII-12]. V experimentech, které byly prováděny v roce 2008, představovalo toto rozhraní systém kov - biologický systém [VII-13, VII-14]. Biologické aspekty této práce jsou popsány jiné části zprávy (viz FGÚ). V této části lze popsat charakter a chování karboránthiolových derivátů, ovlivňujících stabilitu rozhraní. Stabilita povrchu kovu a vliv karboránthiolů jako surfaktantů je nejlépe vidět na studii, při které jsme vystavili modifikované stříbrné filmy korodující atmosféře a studovali jsme resistenci molekulární vrstvy vůči korozi. Můžeme konstatovat, že tento model poskytl výsledky, které byly ve shodě s nezávisle získanými závěry biologické studie růstu buněk na površích. 10

11 Syntetizované Au destičky o rozměrech µm a tloušťky 300 nm. V rámci chemických úprav kovových povrchů pro biologické implantánty bylo provedeno porovnání organickými thiolových derivátů s karboranthiolovými. Mnohem větší stabilitu obecně vykazovali karboránthioly. Stříbrné filmy v prostředí sulfanu mají tendenci korodovat a vytvářet vrstvu sulfidu stříbrného. Rychlost koroze pak ukazuje na náchylnost libovolné monovrstvy k substituci sulfanem popř. jinými thiolovými deriváty. Tyto studie mají význam z pohledu základního výzkumu, pojednávají totiž o stabilitě molekulární bariéry v potenciálních aplikacích. Nicméně výsledky mají význam i z pohledu aplikovatelnosti výzkumu. Hovoří totiž o stabilitě kovových povrchů při jejich dlouhodobé exposici atmosféře. Z důvodu provedení experimentů v rozumném časovém horizontu (řádově týdny) byla simulována atmosféra se zvýšeným obsahem korodujících látek, zejména sulfánu. Ze studovaných organických sloučenin se jednalo o tři alkanethioly (1- butanethiol, 1-octanethiol, 1-dodecanethiol), u kterých byl pozorován vliv délky řetězce na stabilizaci kovového povrchu, resp. blokování povrchu proti korozi sulfánem. Dále byly vybrány dva aromatické deriváty (1,2- benzenedithiol a merkaptophenol), u kterých byl pozorován vliv jedné a dvou thiolových (-SH) skupin vázajících organickou molekulu ke stříbrnému povrchu. Studiem těchto derivátů bylo zjištěny zejména dva faktory, které přispívají ke stabilitě stříbrného povrchu. Prvním je hydrofóbní charakter povrchu a druhým je jednoduše tloušťka molekulární bariéry. V souladu se zmíněnými závěry byla nejlepší ochrana stříbrných povrchů poskytnuta z organických derivatů 1-dodekánthiolem. Ochrana stříbrného povrchu byla studována pomocí reflexní UV-Vis spektroskopie. Tato technika nám umožnila studovat pokles reflektivity, který přímo souvisí se schopností surfaktantů zabránit korozi stříbrných filmů sulfánem. Bylo ukázáno, že karboránthiolové deriváty stabilizují povrch Ag mnohem efektivněji než libovolné organické deriváty. Toto vypovídá o větší stabilitě vazeb B-Ag-S než jsou C-Ag-S tvořené většinou organických derivátů. V souladu s tímto závěrem vykazoval zejména derivát 9,12-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10 značnou stabilitu, která se také projevovala v experimentech s růstem buněk. Další technika, kterou jsme použili pro studium stability těchto látek na površích, byla X-ray fotoelektronová spektroskopie (XPS). Tato metoda potvrdila pozorované efekty explicitně na změřených hodnotách vazebných energií, zejména pak na spektrech S 2p elektronů. Výsledky biologických testů také ukazují na netoxický charakter modifikací. Vybrané deriváty naopak mohou podporovat růst buněk. Toto bude předmětem dalšího studia. V roce 2008 byly započaty kvantově chemické výpočty na objasnění způsobu vazby karboranthiolů k povrchu zlatých a stříbrných (111) povrchů. Tyto teoretické experimenty (vzhledem ke značné výpočetní náročnosti) v současné chvíli stále probíhají. Jejich dokončení předpokládáme v polovině roku Výsledky by měly objasnit pozorovaný rozdíl stabilit zejména dvou karboránthiolových izomerů: 1,2-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10 (1) a 1,2-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10 (2). Oba deriváty byly předmětem studia i v předchozím roce 2007, ve kterém byly výpočetně zjištěny hodnoty jejich dipól momentů a bylo analyzováno rozložení náboje na jednotlivých atomech obou klastrů. Pozorované hodnoty byly diskutovány v souvislosti s hodnotami vazebných energií S 2p elektronů SH skupin připojených ke klastru v pozicích 1,2 nebo 9 a 12. Pozorované hodnoty odpovídaly také trendům v hodnotách pk příslušných SH skupin. Podrobnější informace viz reference [II-20, VIII-32] a závěrečná zpráva z předchozího roku. 11

12 V roce 2008 byly dále připraveny tři druhy zlatých povrchů: napařením, elektrolyticky a nanesením suspenze zlatých kuliček. Všechny tři způsoby nanesení zlata poskytují povrchy s různou korugací. Povrchy byly charakterizovány pomocí AFM. V současné době probíhá studie růstu buněk na těchto typech povrchů. Spolupráce spoluřešitelských pracovišť FGÚ a ÚACH Jak již bylo zmíněno, jsou (kromě vrstev uhlíkových nanočástic, zejména nanodiamantů) dalšími perspektivními materiály pro pokryv implantátů do organismu pacienta i pro konstrukci biosenzorů tenké vrstvy zlata, zejména vrstvy nanostrukturované a funkcionalizované dalšími bioaktivními molekulami. Proto jsme v naší studii [II-19, III-26, VII-15] nanesli tenké vrstvy zlata na experimentální podložky představované sklem a modifikovali je následujícími čtyřmi různými deriváty karboranthiolů,: 1-(HS)-1,2-C 2 B 10 H 11 (A), 1,2-(HS) 2-1,2- C 2 B 10 H 10 (B), 9,12-(HS) 2-1,2-C 2 B 10 H 10 (C) a 1,12-(HS) 2-1,12-C 2 B 10 H 10 (D). Zjistili jsme, že za 3 dny po nasazení byly počty cévních hladkých svalových buněk na vzorcích s deriváty B, C a D významně vyšší než na čistých zlatých vrstvách. Naproti tomu povrch s derivátem C obsahoval významně nižší počet buněk. Příčina zřejmě spočívala v tom, že u derivátu C byly buňkám exponovány skupiny CH, které byly kyselejší než BH skupiny exponované na derivátech A či B. U derivátu D byly SH skupiny umístěny v orientaci para, což by mohlo usnadnit uchycení karboranthiolu na povrchu zlata a jeho současnou funkcionalizaci dalšími bioaktivními skupinami nebo molekulami za účelem dalšího zvýšení atraktivity materiálu pro osídlení buňkami. ÚACH - Návrh postupu prací na rok 2009 Na rok 2009 je plánováno (v souladu s harmonogramem) provést další cílené modifikace Au a Ag povrchů, které by byly vhodné pro růst a proliferaci buněk. Vzhledem k zjištění, že karboranthiolové deriváty jsou na Au a Ag površích výrazně stabilní, byly na rok 2009 stanoveny dva důležité úkoly: 1) Test karboranthiolových derivátů odvozených od systému 1,2-C 2 B 8 H 10 a sendvičového dikarbolidového komplexu. Předpokládá se, že tyto dva systémy umožní prozkoumat nejvýhodnější geometrii vicinálních dithiolů pro stabilní modifikace povrchů. V prvním zmíněném případě se jedná o systém s menší symetrií než představuje dosud studovaný komplex C 2 B 10 H 12, v druhém případě se jedná o deriváty s větší vzdáleností SH skupin od sebe. Koordinace ke kovovým povrchům může být tímto geometrickým aspektem ovlivněna. Dosud byl studován jen systém odvozený od běžného klastru C 2 B 10 H 12, se kterým budou další výsledky srovnávány. 2) Příprava a charakterizace Au povrchů s definovanou hrubostí vhodnou pro růst buněk. Práce s Au povrchy o různé morfologii byly již započaty a v roce 2009 budou pokračovat. VŠCHT - Vysoká škola chemicko-technologická Praha (Prof. Ing. Václav Švorčík, DrSc.) VŠCHT - Práce plánované na rok 2008 V roce 2008 byla na VŠCHT (ve spolupráci s dalšími pracovišti) studována (v souladu s harmonogramem grantového projektu) následující témata: Nanostruktury vytvořené ozářením nízkoenergetickými ionty (úkol A4) (i) příprava uspořádaných nanostruktur na povrchu polymerů (ii) a jejich aplikace pro studium adheze a proliferace buněk Nanostruktury polymerů a uhlíku pro tkáňové inženýrství (úkol B1) (i) příprava bioaktivních nanostruktur na povrchu (naprašování, napařování, CVD) (ii) studium adheze C nanostruktur na polymerním substrátu (iii) studium adheze a proliferace buněk hladkého svalstva a keratinocytů Nanostruktury karboranových mono-vrstev (úkol C2). Roubování kovových nanočástic na modifikovaný polymer s cílem (i) zvýšit adhezi kovových nanovrstev pro elektroniku (ii) zvýšit adhezi a proliferaci buněk pro tkáňové inženýrství 12

13 Lze konstatovat, že harmonogram činnosti na rok 2008 byl dodržen a hlavní cíle splněny. VŠCHT - Výsledky dosažené v roce 2008 Výsledky experimentálních prací provedených ve spoluřešitelském týmu VŠCHT byly prezentovány v mezinárodních (impaktovaných) časopisech [II-11, II-12, II-13, II-16, VI-2 VI-6], ve sbornících národních a mezinárodních konferencí [III-16 III-25], v přednáškách národních konferencí [VII-9, VII-10] a staly se podkladem pro řadu diplomových a bakalářských prací [XI-1, XI-2, XII-1 XII-3]. Členové týmu se dále podíleli jako i spoluautoři na výsledcích prezentovaných v dalších výstupech [I-1, I-2, II-4, II-5, II-7, II-10, II- 16, V-8, VI-1, VII-2]. a) Depozice uhlíkové nanovrstvy na polymerní substrát [III-18, VI-2]. Uhlíkové nanovrstvy byly připraveny pomocí metody carbon flash evaporation. Jako substrát byly použity polymery (PET, PTFE). Byla studována závislost deponované tloušťky na vzdálenosti substrátu od zdroje depozice. Chemické složení C-vrstvy bylo studováno spektroskopickými metodami (FTIR, Raman, XPS, RBS, ERDA). V uhlíkové vrstvě byla sledována koncentrace radikálů v závislosti na době od konce napařování. Byla sledována sheet resistance připravené vrstvy včetně její povrchová morfologie a drsnost (AFM). Dále byly nanoindentačními měřeními studovány tvrdost, modul elasticity a scratch test vrstev. Bylo ukázáno, že tloušťka C-vrstvy klesá se vzdáleností substrátu od filamentu. Carbon flash evaporation neprobíhá z hlediska závislosti vzdálenost vs. tloušťka jako klasické napařování. Kromě dominantního C jsou v povrchové vrstvě přítomny i kyslíkaté skupiny. V celé deponované vrstvě byl detekován H a amorfní uhlík (a-c). Radikály se v C-vrstvě nacházejí ve formě singletu, jejich koncentrace klesá s dobou od depozice. Po depozici dochází k dramatickému poklesu sheet resistance a povrchové snášivosti (contact angle) v porovnání s původními polymery. Deponovaný C způsobí na povrchu PTFE dramatické změny povrchové morfologie a drsnosti. Deponovaná uhlíková vrstva má vyšší tvrdost a modul elasticity než původní polymery. Napařená vrstva uhlíku má semikrystalický charakter. b) Roubování Au nanočástic na polymer modifikovaný v plasmě [II-11, III-23, V-6, V-7, VI-5, VI-6]. Polyethylen (PE) byl modifikován v Ar plasmě. Aktivovaný povrch byl roubován z methanolu 1,2- ethandithiolem. Následně byly vzorky roubovány koloidním roztokem Au-nanočástic. Poté byla na povrch naprášena 50 nm tlustá vrstva Au. Vlastnosti modifikovaného PE byly studovány AFM, EPR, RBS a nanoindentací. Bylo ukázáno, že modifikace v plasmě způsobuje štěpení polymerních řetězců, tvorbou volných radikálů a dvojných vazeb. Au nanočástice jsou roubovány především na volné radikály. Přítomnost Au a S v povrchové vrstvě byla prokázána pomocí RBS. Expozice polymeru v plasmě i následné roubování Au nanočástic výrazně ovlivňuje povrchovou morfologii i drsnost vzorků. Nanoindentační měření ukázala, že naroubované Au částice zvýší adhezi následně naprášené Au nanovrstvy. c) Interakce Au nanočástic naroubovanými na polymer s buňkami [III-20]. Polyethylen (PE) byl modifikován v Ar plasmě. Aktivovaný povrch byl roubován z koloidním roztokem Au-nanočástic v citrátu. Vlastnosti modifikovaného PE byly studovány metodami AFM, EPR a RBS. Bylo ukázáno, že modifikace v plasmě způsobuje štěpení polymerních řetězců, tvorbou volných radikálů a dvojných vazeb. Au nanočástice jsou roubovány především na volné radikály. Přítomnost Au a v povrchové vrstvě byla prokázána pomocí RBS a XPS. Expozice polymeru v plasmě i následné roubování Au nanočástic výrazně ovlivňuje povrchovou morfologii i drsnost vzorků. Poté byla na povrch vzorků metodou in vitro sledována adheze a proliferace buněk hladkého svalstva. Bylo prokázáno, že Au nanočástice zvyšují adhezi a proliferaci buněk pravděpodobně díky mírnému zvýšení elektrické vodivosti, smáčivosti a změně povrchové morfologie PE po roubování Au nanočástic. d) Příprava orientovaných PMMA vrstev [II-12, II-16, VI-4]. Metodou spin-coating byly připraveny mikronové a submikronové vrstvy PMMA. Byla studována možnost orientovat polymerní dipóly v elektrickém poli v oblasti teploty skelného přechodu (T g ) a teploty tečení (T f ) PMMA s cílem zvýšit jeho indexu lomu (n) po ochlazení vrstvy pod T g. Povrchová morfologie byla studována AFM, kontaktní úhel byl sledován goniometricky, tloušťka filmů byla měřena na profilometru, refractive index na refraktometeru. Změna indexu lomu při orientaci PMMA vrstvy v elektrickém poli závisí na teplotě a intenzitě elektrického pole. Nejvyšší změna n byla naměřena při 11 kv cm -1. Změna kontaktního úhlu (wettability) na povrchu orientované PMMA vrstvy jednoznačně potvrzuje orientaci dipólů v elektrickém poli. Orientace vrstev způsobí mírnou změnu jejich morfologie a mírný nárůst povrchové drsnost pouze v jednom směru působení pole. Změna barvy u orientovaných vrstev nezávisí na směru elektrického pole. 13

14 Byla studována modifikace polymeru s cílem připravit struktury pro aplikace v optoelektronice. Struktury byly připraveny z PMMA při zvýšené teplotě a současném působení elektrického pole. K formování struktur docházelo jenom v místech lokální expozice elektrickým polem nebo lokálního ohřátí vrstvy expozicí laserem. Geometrii a velikost připravených struktur lze ovlivnit aplikovaným napětím, uspořádáním elektrod a tloušťkou výchozí vrstvy polymeru. Tímto postupem byl připraven a charakterizován kanálkový vlnovod. d) Příprava orientovaných PMMA vrstev [II-12, II-16, VI-4]. Metodou spin-coating byly připraveny mikronové a submikronové vrstvy PMMA. Byla studována možnost orientovat polymerní dipóly v elektrickém poli v oblasti teploty skelného přechodu (T g ) a teploty tečení (T f ) PMMA s cílem zvýšit jeho indexu lomu (n) po ochlazení vrstvy pod T g. Povrchová morfologie byla studována AFM, kontaktní úhel byl sledován goniometricky, tloušťka filmů byla měřena na profilometru, refractive index na refraktometeru. Změna indexu lomu při orientaci PMMA vrstvy v elektrickém poli závisí na teplotě a intenzitě elektrického pole. Nejvyšší změna n byla naměřena při 11 kv cm -1. Změna kontaktního úhlu (wettability) na povrchu orientované PMMA vrstvy jednoznačně potvrzuje orientaci dipólů v elektrickém poli. Orientace vrstev způsobí mírnou změnu jejich morfologie a mírný nárůst povrchové drsnost pouze v jednom směru působení pole. Změna barvy u orientovaných vrstev nezávisí na směru elektrického pole. Byla studována modifikace polymeru s cílem připravit struktury pro aplikace v optoelektronice. Struktury byly připraveny z PMMA při zvýšené teplotě a současném působení elektrického pole. K formování struktur docházelo jenom v místech lokální expozice elektrickým polem nebo lokálního ohřátí vrstvy expozicí laserem. Geometrii a velikost připravených struktur lze ovlivnit aplikovaným napětím, uspořádáním elektrod a tloušťkou výchozí vrstvy polymeru. Tímto postupem byl připraven a charakterizován kanálkový vlnovod. HDPE HDPE/plasma HDPE/plasma/Au Adheze buněk hladkého svalstva na PE, na PE po modifikaci v Ar plasmě a PE, který byl exponován v plasmě a následně roubován Au nanočásticemi. e) Depozice kovových nanovrstev na polymerní substrát [II-14]. Au nanovrstvy byly naprášeny na (PTFE) a (PET) substráty. Byl studován vliv doby naprašování na tloušťku deponované vrstvy (AAS, FIB a SEM) povrchovou morfologii a drsnost (AFM) Au vrstvy. Byla sledována elektrická resistance (Ohmova a van der Pauw metoda) a koncentrace a pohyblivost volných nosičů náboje (Van der Pauw metoda) v Au vrstvě na polymerním substrátu. Podle očekávání tloušťka Au vrstvy u 14

15 obou polymerů závisí na době depozice. Po delší době depozice byla na drsnějším PTFE stanovena větší tloušťka Au. Tloušťka spojité vrstvy Au na polymeru stanovena metodou AAS byla potvrzena i metodou FIB. Po depozici Au vrstvy na PET vzrůstá drsnost a mírně se mění i morfologie, na rozdíl od PTFE. U souvislých Au vrstev na obou polymerech byla stanovena stejná koncentrace volných nosičů a na drsnějším PTFE jejich nižší pohyblivost. Z toho vyplývá (a výsledky měření resistance to potvrdily), že vrstva naprášená na PTFE má vyšší resistanci než vrstva deponovaná na PET. SEM foto Au vrstvy naprášené na PET po dobu 500 s. Řez byl proveden metodou FIB (focused ion beam). f) Modifikace polymerů v plasmě [II-13, II-16, III-19 III-24]. Byla studována modifikace vybraných polymerů Ar plasmou. Sledovány byly změny chemického složení v povrchové vrstvě metodami FTIR, XPS a RBS. Povrchová morfologie a drsnost byla studována metodou AFM. Gravimetrickými měřeními byla stanovena tloušťka ablatované vrstvy a studována rozpustnost modifikované povrchové vrstvy polymeru. Modifikace iniciovaná plazmatem způsobuje ablaci polymerů a nárůst koncentrace funkčních skupin obsahujících kyslík v povrchové vrstvě polymeru (několik desítek nm). Koncentrace kyslíku závisí na stárnutí vzorku po expozici. Důsledkem modifikace je i rozpustnost tenké povrchové vrstvy ve vodě. VŠCHT - Návrh postupu prací na rok 2009 V roce 2009 bude především pokračováno v přípravě uspořádaných povrchových morfologií polymerů a dalších substrátů po jejich ozáření ionty (úkol A4) a ve sledování vlivu povrchových vlastností připravených nanostruktur na adhezi a proliferaci buněk hladkého svalstva a kožních buněk (úkol B1). VÝSLEDKY EXPERIMENTÁLNÍCH AKTIVIT ŘEŠITELSKÉHO TÝMU V ROCE 2008 I. Zvané kapitoly v knihách 1. L. Bačáková, V. Švorčík: Cell colonization control by physical and chemical modification of materials, In: Cell Growth Processes: New Research (Ed. Daiki Kimura), Nova Science Publishers, Inc., pp 5-56, ISBN L. Bacakova, L. Grausova, M. Vandrovcova, J. Vacik, A. Frazcek, S. Blazewicz, A. Kromka, B. Rezek, M. Vanecek, M. Nesladek, V. Svorcik, V. Vorlicek, M. Kopecek, Carbon nanoparticles as substrates for cell adhesion and growth, In: Nanoparticles: New Research, pp. 1-71, Editor: Simone Luca Lombardi, 2008 Nova Science Publishers, Inc. ISBN