Interakce buněk s materiály pro tkáňové inženýrství Lucie Bačáková

Transkript

1 Interakce buněk s materiály pro tkáňové inženýrství Lucie Bačáková Fyziologický ústav Akademie věd České republiky Vídeňská Praha 4-Krč lucy@biomed.cas.cz

2 Tkáňové inženýrství Interdisciplinární obor, který využívá principy technických a biologických vědních oborů pro vývoj biologické náhrady, která obnoví, zachová nebo zlepší funkci tkáně či celého orgánu (Langer and Vacanti: Science 260: , 1993) Nově konstruovaná tkáňová náhrada se skládá z: nosiče buněk buněčné složky Jako nosiče buněk lze využít: biologické molekuly (proteiny extracelulární matrix, např. kolagen, elastin, fibronektin, laminin, fibrin, kyselina hyaluronová) umělý materiál (syntetické polymery, materiály na bázi uhlíku, kovy a jejich slitiny, keramika). Biomateriál= materiál vstupující do interakce s biologickým prostředím

3 Materiálová složka hybridních bioarteficiálních tkáňových náhrad Materiál musí být biokompatibilní (tj. tolerován buňkami, bez cytotoxického, mutagenního a imunogenního působení, s vhodnými mechanickými vlastnostmi atd.) Bioinertní: nepodporující adhesi buněk (kloubní plochy, nitrooční čočky, současně užívané cévní protézy) Bioaktivní (biomimetické, biospecifické, bioanalogní): Napodobují vlastnosti molekul extracelulární matrix (ECM), růstové faktory, hormony, enzymy; Navozují specifické a regulovatelné chování buněk Umělý materiál je analogem ECM, který přivádí buňku na rozcestí:

4 Molekulární mechanismus buněčné adheze ke konvenčnímu umělému materiálu Buňka Umělý materiál (syntetický polymer, sklo, kov, keramika, uhlíkový materiál, kompozit) Adsorbované molekuly extracelulární matrix: Fibronektin, kolagen, laminin vitronektin, Ze séra kultivačního média či z tělních tekutin Syntetizovány i buňkami, přítomny na jejich membráně

5 Buňky se vážou ke specifickým místům adsorbovaných molekul ECM (tj. k určitým sekvencím aminokyselin či k cukerným ligandům) Buňka Adhesní receptory: Integrinové neintegrinové Bačáková L., Švorčík V.: Cell colonization control by physical and chemical modification of materials, In: Cell Growth Processes: New Research (Ed. Daiki Kimura), Nova Science Publishers, Inc., Hauppauge, New York, pp 5-56, 2008; přehledný článek Sekvence typické pro určité proteiny: RGD.. vitronektin, fibronektin REDV.fibronektin DGEA.kolagen YIGSR, IKVAV. laminin VAPG.elastin Sekvence preferované určitým adhezním receptorem: RGD, KQAGDV..integrin a v b 3 REDV. integrin a 4 b 1 DGEA.integrin a 2 b 1 YIGSR, IKVAV. a 6 b 1, a 7 b 1 KRSR neintegrinový adhezní receptor (heparan sulfát) Adsorbované proteiny Umělý materiál Sekvence preferované určitým buněčným typem: KQAGDV; VAPG. hladké svalové buňky REDV. endotelové buňky YIGSR, IKVAV.neurony KRSR.osteoblasty

6 Stavba integrinového receptoru Horton M.A.: Int. J. Biochem. Cell Biol. 29: , 1997

7 Po navázání ligandu: Adhezní receptory se shromažďují ve specifických nano- a mikrodoménách na buněčné membráně, jsou to fokální adhezní plaky (fokální adheze): V placích receptory komunikují: Strukturální molekuly (paxillin, talin, vinculin) Signální molekuly (fokální adhezní kináza) Aktinový cytoskelet (spojený s enzymy, buněčnými organelami a jádrem): Takto se signál z extracelulárního prostředí, představovaného umělým materiálem, dostane k buněčnému genomu, a ovlivní expresi genů (která je manifestována proteosyntézou), a tím chování buňky

8 Regulace adsorpce proteinů a buněčné adheze Fyzikálně-chemické vlastnosti povrchu materiálu: Přítomnost určitých chemických funkčních skupin (-OH, -NH 2 ) Povrchová energie, polarita, smáčivost Morfologie povrchu (drsnost, topografie; velikost, tvar a vzdálenost nerovností; význam nanodrsnosti) Mechanické vlastnosti povrchu materiálu (tuhost, flexibilita) Elektrické vlastnosti materiálu (náboj, vodivost) Tyto vlastnosti ovlivňují typ, množství a geometrickou konformaci adsorbovaných molekul ECM, jejich flexibilitu a možnost reorganizace, a tím dosažitelnost ligandů v těchto molekulách adhezními receptory buněk

9 Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (I) Hydrofobní povrch (nemodifikované syntetické polymery, některé uhlíkové materiály) Kontaktní úhel vodní kapky Hydrofilní povrch (mírně) Polární skupiny na materiálu, např. kyslíkové Bacakova L, Filova E, Parizek M, Ruml T, Svorcik V: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. A review. Biotechnology Advances, 29: , 2011 IF=9,3 Proteiny: rigidní, denaturované, přednostní adsorpce albuminu (neadhesivní pro buňky) Proteiny: flexibilní, fyziologická konformace, přednostní adsorpce proteinů zprostředkujících adhesi buněk (vitronektin, fibronektin)

10 Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (II) Talin Polyetylén o vysoké hustotě (HDPE) Nemodifikovaný Ar + plasma, PEG Cévní hladké svalové buňky Absorbance (Pristine PE=100%) ELISA (na mg proteinu) Pristine Paxillin, a-actinin 1E+13 3E+13 1E kev O + ions/cm 2 3E+14 1E+15 Alfa-aktin Kontaktní úhel : 100 Kontaktní úhel: 60 M. Parizek, N. Kasalkova, L. Bacakova, P. Slepicka, V. Lisa, M. Blazkova, V. Svorcik: Int. J. Mol. Sci. 10: , 2009 Absorbance (Pristine PE=100%) Pristine a-actin, SM1,2-myosins, calponin 1E+13 3E+13 1E kev O + ions/cm 2 3E+14 Průměr S.E.M. (4-6 pokusů), nepárový Studentův t-test, : p<0.05 : p<0.01 1E+15

11 Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (III) Extrémně hydrofilní povrch Mírně hydrofilní povrch Bacakova L, Filova E, Kubies D, Machova L, Proks V, Malinova V, Lisa V, Rypacek F: J Mater Sci Mater Med. 18: , 2007 Imunofluorescence vinkulinu Hladké svalové buňky aorty potkana, 3. den po nasazení Kopolymer PDLLA-PEO s vysoce hydrofilním a mobilním povrchem (kontaktní úhel < 30 ) Čistý PDLLA bez PEO (kontaktní úhel ~70 )

12 Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (IV) Silně hydrofilní materiál Přiměřeně hydrofilní materiál (A 145 PBS/DLA/PEG) (LB-AP 154 PET/DLA) 1. den 5. den Materiály pokryty fibrinovou sítí s fibronektinem a kolagenem (ÚMCH AVČR)

13 Rigidita a deformabilita adhesního substrátu buněk Polyakrylamidový gel + kovalentně vázaný kolagen Tvrdý gel, E = 40 kpa Měkký gel, E = 1 kpa Engler A., Bacakova L., Newman C., Hategan A., Griffin M., Discher D.: Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys. J. 86: , GFP-paxillin Hladké svalové buňky aorty potkana, linie A7r5, transfektované konstruktem DNA kódujícím GFPpaxillin nebo GFPaktin

14 Drsnost a topografie povrchu materiálu Makrodrsnost : 100 μm a více Nerovnosti příliš velké pro detekci buňkami Průměr buněk v suspenzi cca 20 μm Buňka se rozprostírá přes desítky μm Mechanické ukotvení implantátu Mikrodrsnost : μm: duální účinek: Menší adhezní plocha buňky, pomalejší proliferace Obvykle vyšší úroveň diferenciace buněk Submikronová drsnost : 100 nm 1 μm: Duální účinek s převahou pozitivního účinku na kolonizaci Nanodrsnost : méně než 100 nm: Příznivá pro adhezi, růst a diferenciaci buněk

15 Vliv mikrodrsnosti na adhezi buněk Kompozity s uhlíkovou matricí vyztuženou uhlíkovými vlákny, kostní buňky linie MG 63 Nemodifikovaný CFRC (R a = m) Adsorbovaný fluorescenčně značeným kolagenem IV Imunofluorescence vinkulinu v buňkách MG 63 Leštěný a pokrytý pyrolytickým grafitem (R a = m) Bačáková L., Starý V., Kofroňová O., Lisá V.: J. Biomed. Mater. Res. 54: , 2001

16 Vliv nanodrsnosti na adhezi buněk Synergistický účinek se smáčivostí materiálu Molekuly ECM zprostředkující adhezi buněk jsou adsorbovány ve výhodné geometrické konformaci (blízké fyziologické) Přednostní adsorpce vitronektinu (relativně malá a lineární molekula) Nanostrukturovaný materiál Mírně hydrofilní materiál Prof. Thomas J. Webster Vitronektin je rozpoznáván přednostně osteoblasty (KRSR v doméně vázající heparin vitronektinu je vázána molekulami heparan sulfátu na plasmatické membráně osteoblastů) Bacakova L, Filova E, Parizek M, Ruml T, Svorcik V: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. A review. Biotechnology Advances, 29: , 2011 IF=9,6

17 Lidské kostní buňky MG 63 na kompozitech z terpolymeru PP/PTFE/PVDF a uhlíkových nanotrubiček Imunofluorescence b-aktinu nebo barvení propidium iodidem Kontaktní úhel vodní kapky: Terpolymer: 100 ± 3.9 SWCNT: ± 2.1 MWCNT: ± 1.4 PP/PTFE/PVDF PP/PTFE/PVDF Mikrodrsnost (R a ): Terpolymer: 0.20 ± 0.04 m SWCNT: 1.03 ± 0.52 m MWCNT: 1.08 ± 0.30 m Nanodrsnost (R a ): Terpolymer: 30 ± 4.5 nm SWCNT: 150 ± 22.5 nm MWCNT: n.a. 4% SWCNT 4% MWCNT Spolupráce s AGH Univ. of Science and Technology, Krakov, Polsko Bačáková L, Grausová L, Vacík J, Fraczek A, Blazewicz S, Kromka A, Vaněček M, Švorčík V: Diamond Relat Mater 16: , 2007

18 Syntetický analog extracelulární matrix GRGDSG PHSRN Ligandy pro adhesní receptory (např. oligopeptid GRGDSG s kooperující sekvencí PHSRN) PEO PDLLA PLLA Materiál připraven ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AVČR, Praha Polyethylen oxid (PEO): vysoce hydrofilní neumožňuje adsorpci proteinů a nekontrolovanou adhesi buněk flexibilní řetězec zajišťuje dosažitelnost ligandů adhesními receptory Poly-DL-laktid (PDLLA): kopolymerizován s PEO Poly-L-laktid (PLLA): nosný materiál nově konstruované bioarteficiální cévní náhrady

19 Adhese cévních hladkých svalových buněk na polylaktidu a PEO Imunofluorescenční barvení vinkulinu, proteinu fokálních adhesních plaků; 3. den po nasazení, médium s 10% fetálního bovinního séra PDLLA PDLLA-PEO 50 m Buněčná adhese je podobná jako na standardních kultivačních substrátech (polystyrén, sklo) Je zprostředkována adsorpcí proteinů ze séra kultivačního média (vitronektin, fibronektin) 50 m Vysoce hydrofilní a mobilní řetězce PEO nedovolují adsorpci sérových proteinů Buňky nejsou schopny adherovat, rozprostřít se a vyvinout fokální adhesní plaky

20 Adhese a růst HSB na polymerech s GRGDSG PDLLA-PEO-5% GRGDSG 3. den po nasazení, médium s 10% séra Imunofluorescence vinkulinu DT=17.5 h LI=6.8 % PDLLA-PEO-20% GRGDSG DT=11.7 h LI=21.4 % Inkorporace BrdU 50 m PDLLA-PEO-5% GRGDSG Neadhesivní kopolymer PDLLA-PEO funkcionalizován Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly (GRGDSG), tj. ligandem pro integrinové adhesní receptory na buňkách Adhese a růst byly regulovatelné koncentrací ligandu Buňky byly životaschopné, syntetizovaly DNA a proliferovaly i v bezsérovém médiu Bacakova L, Filova E, Kubies D, Machova L, Proks V, Malinova V, Lisa V, Rypacek F: J. Mater. Sci. Mater. Med. 18: , 2007

21 Cévní endotelové buňky na vrstvách PGMA-PEO s různou koncentrací ligandů pro adhezní receptory (RGD, pmol/cm 2 ) Popelka Š, Houska M, Havlíková J et al.: PEO brushes prepared by "grafting to" method as a platform for the assessment of cell receptor-ligand binding. Accepted in European Polymer Journal

22 Shrnutí a další perspektivy moderního tkáňového inženýrství Degradabilní přirozené i syntetické polymery (polyestery, chitosan, rekombinantní proteiny) Materiál s trojrozměrnou strukturou (porézní a vláknité nosiče s hierarchicky uspořádanou makro-, mikro- a nanostrukturou) S ligandy pro adhesní receptory buněk o definovaných typech, vzdálenostech, prostorovém uspořádání Regionálně selektivní adhese buněk, preferenční adhese určitých buněčných typů ke specifickým oligopeptidickým sekvencím, řízení buněčných funkcí velikostí a tvarem plochy adhese Užití kmenových buněk (kostní dřeň, krev, pupečník, tuková tkáň, kůže, satelitní buňky kosterního svalu) Dynamická kultivace buněk, jejich vhodné mechanické namáhání Uvolňování faktorů řídících růst, diferenciaci a funkci buněk z umělého materiálu Vaskularizace tkáňově inženýrských konstruktů

23 Děkuji Vám za Vaši pozornost! Lidské kmenové buňky tukové tkáně na fibrinovém gelu

24 Odd. biomateriálů a tkáňového inženýrství FgÚ AV ČR Ivana Zajanová Věra Lisá, prom. biol. RNDr. Lubica Grausová- Doc. MUDr. Lucie Staňková, PhD Bačáková, CSc Mgr. Elena Filová, PhD MUDr. Jaroslav Chlupáč Mgr. Jana Lišková, PhD Mgr. Martin Pařízek, PhD Mgr. Ivana Kopová Mgr. Lucia Straňavová Mgr. Marta Ing. Markéta Vandrovcová, Bačáková PhD Ing. Jana Havlíková Bc. Markéta Krýslová RNDr. Jana Musílková, CSc. Mgr. Katarína Novotná