Metody asistované reprodukce

Transkript

1 Metody asistované reprodukce MARIE ŘEŘUCHOVÁ ÚSTAV BIOLOGIE

2 Osnova Historie asistované reprodukce Vymezení základních pojmů Oplodnění in vivo Snížená plodnost ženy Snížená plodnost muže Vliv některých chemických látek na plodnost muže Vybrané metody asistované reprodukce Vývoj a hodnocení kvality embryí Kryokonzervace

3 Historie asistované reprodukce základem asistované reprodukce u člověka byly experimentální práce na zvířatech (posledních 135 let) 1878 snahy o oplození savčích oocytů in vitro (králičích a morčecích) 1890 první přenos savčího (králičího) embrya do dělohy (porod šesti mláďat) 1930 oplodnění králičího oocytu spermiemi z nadvarlete in vitro (pozorování rýhování vajíčka) 1944 oplození lidského oocytu in vitro a jeho vývoj do dvoubuněčných embryí

4 Počátky asistované reprodukce u člověka R.G. Edwards a P.C. Steptoe 1965 popis zrání lidských oocytů v podmínkách in vitro 1969 popis prvních stádií po oplození oocytu 1971 publikace v časopisu Nature obsahující metodiku kultivace časných lidských embryí in vitro do stádia blastocysty 1976 první výsledek klinické aplikace oplození in vitro, těhotenství však skončilo jako mimoděložní 1978 první dítě metodou IVF (In Vitro Fertilisation)

5 Louise Brown první dítě narozené po IVF Ve Velké Británii se v roce 1978 narodilo ženě s neprůchozími vejcovody za pomoci metody IVF zdravé dítě dcera Louise Brown. Dnes je ona sama již matkou, syna počala přirozenou cestou.

6 Počátky asistované reprodukce u člověka v ČR Brno je možno považovat za kolébku metod asistované reprodukce v České republice zásluhou brněnského týmu J. Tesaříka, L. Pilky a P. Trávníka se narodilo první dítě - hoch "ze zkumavky" nejen v Československu, ale i v celém tehdejším východním bloku hoch se narodil po provedení zákroku GIFT (Gamete Intra- Fallopian Transfer), jednalo se o světové prvenství 1993 CAR ve FNOL narodilo se druhé dítě počaté metodou IVF/ET - In Vitro Fertilisation a EmbryoTransfer (první dítě počaté touto metodou se narodilo v Brně roku 1984)

7 Vymezení základních pojmů normální plodnost stav, kdy žena otěhotní nejpozději do dvou let při pravidelném nechráněném pohlavním styku (některé zdroje považují za hraniční jeden rok) hraniční doba snažení se o početí potomka přirozenou cestou je závislá na mnoha faktorech např. věku partnerů sterilita v české terminologii označení pro neplodnost primární u žen, které nebyly nikdy těhotné sekundární u ženy bylo těhotenství ukončeno porodem, potratem nebo uloženo mimo dělohu, avšak následně došlo ke ztrátě plodnosti

8 infertilita stav, kdy žena může otěhotnět, ale není schopna dítě donosit těhotenství bývá ukončeno samovolným potratem nebo předčasným porodem s následným úmrtím plodu snížená plodnost u partnerů dochází k poruše některého procesu, který má přímý dopad na jejich plodnost, ta se snižuje příčiny snížené spontánní reprodukce se formálně dělí: snížená plodnost ženy snížená plodnost muže snížená plodnost obou partnerů nevysvětlitelná snížená plodnost páru

9 Oplodnění in vivo pravděpodobnost početí plodného páru při pravidelném pohlavním styku během jednoho měsíce je v průměru asi 30 %

10 Menstruační a ovulační cyklus

11 Stavba gamet OOCYT SPERMIE centriol Vajíčko má průměr 100 μm. Velikost spermie je okolo 65 μm.

12 Jaké jsou předpoklady pro oplození oocytu u zdravé spermie? schopnost kapacitace změna vlastností buněčné membrány spermie umožňující vazbu spermie na zona pellucida spuštění akrozomální reakce exocytóza akrozomu (hydrolytické enzymy) usnadní spermii proniknout glykoproteinovým obalem vajíčka a umožní spojit se s vajíčkem (tzv. fúze gamet) spuštění kortikální reakce vajíčko uvolní obsah svých kortikálních granulí, jejichž obsah pozmění zonu pellucidu

13 Co přináší embryu OOCYT 1 sada autochromozómů 1 chromozóm X mitochondrie ribozómy a další RNA cytoplazma s řadou buněčných struktur Ochrana proti polyspermii. Centriol není v oocytu obsažen!!! Přináší jej spermie. SPERMIE 1 sada autochromozómů 1 chromozóm X nebo Y centriol (schopnost dělení) aktivace (SOAF) Sperm Oocyte-Activating Factor Mitochondrie otcovského původu jsou po ubiquitinizaci aktivně ničeny.

14 Fyziologie gamet OOCYT nenese žádné zásobní látky je vyživován difúzí z okolí má velmi omezenou životnost (12 48 hodin) neprobíhá syntéza nukleových kyselin obsahuje velké množství nukleových kyselin z preovulačního období jako zdroj energie slouží zejména pyruvát SPERMIE nenese žádné zásobní látky je vyživována difúzí z okolí má omezenou životnost (2 7 dnů) neprobíhá syntéza nukleových kyselin je pohyblivá (1 až 4 mm/min = 15 až 70 μm/s) jako zdroj energie jí slouží hlavně glukóza ke správné funkci potřebuje vápníkové ionty akrosom obsahuje hyaluronidázu, akrosin, proakrosin

15 Snížená plodnost ženy Na plodnost ženy má vliv mnoho procesů, např.: koordinovaná spolupráce mezi hypotalamem, hypofýzou a vaječníky, která umožňuje dozrávání zpravidla jednoho dominantního vajíčka příprava děložní sliznice na přijmutí embrya uvolnění vajíčka z vaječníku volný průchod vajíčka vejcovodem interakce spermie a vajíčka ve vejcovodu, která vede k oplodnění vajíčka transport zygoty vejcovodem až do dělohy, během kterého dojde k rozdělení zygoty na mnohobuněčné embryo zanoření embrya do děložní sliznice a rozvoj placenty

16 Možné příčiny snížené plodnosti ženy věk ženy po dosažení 35. roku dochází u žen k výraznému poklesu plodnosti let je výskyt neplodnosti 8 % let je výskyt neplodnosti 14 % let se neplodnost vyskytuje až u 18 % snížená ovariální rezerva ovulační dysfunkce u žen v reprodukčním věku dělíme do dvou hl. skupin: deplece folikulů v ovariích hl. zrychlená folikulární atrézie dysfunkce folikulů v ovariích rezistence ke stimulaci gonadotropními hormony

17 syndrom polycystických ovarií (PCOS) endokrinopatie (postihuje 5 10 % žen ve fertilním věku) heterogenní onemocnění s širokým spektrem fenotypických manifestací ženy s diagnostikovaným PCOS mají nepravidelný menstruační cyklus (i primární či sekundární amenorea) výskyt jednoho nebo všech z následujících znaků, a to v různém stupni projevu: typický polycystický vzhled ovarií tonická hypersekrece LH (Luteinizing Hormone) v adenohypofýze ovariální nadprodukce androgenů inzulinová rezistence hypersekrece inzulinu snížená sekrece růstového hormonu obezita (u % případů)

18 onemocnění pohlavních orgánů ženy abnormality ve stavbě i funkci vaječníků, dělohy nebo děložního čípku abnormální stavba dělohy (3 6 % pacientek) neprůchodnost vejcovodů (30 40 % pacientek) endometrióza u žen je nalezena tkáň ektopického vzhledu a chování endometria mimo dělohu (kdekoliv kromě srdce a sleziny) postihuje % pacientek nejčastěji: oblast pánve, vaječníky, pánevní pobřišnice projev: silná bolest v oblasti pánve, snížená plodnost léčba: odstranění ložisek endometriózy a následné užívání léčiv (např. kombinované hormonální antikoncepce)

19 cervikální onemocnění hlen produkován v období ovulace může negativně ovlivňovat pohyb spermií směrem k oocytu např. mohou zde být protilátky proti spermiím po navázání protilátek na spermie dochází k jejich znehybnění, shlukování, usmrcení při navázání na akrosom znemožní splynutí s oocytem léčba: podávání kortikoidů chráněný pohlavní styk po několik měsíců (???) IUI IntraUterine Insemination (promyté spermie jsou vloženy přímo do dělohy)

20 Snížená plodnost muže Plodnost muže je určena schopností produkovat dostatečný počet spermií s normální motilitou, které jsou schopny průchodu z vaginy přes děložní čípek až do vejcovodu ženy spermie oplodnit vajíčko a řadou s tímto jevem spojených chemických procesů lékařské vyšetření plodnosti muže je interdisciplinární záležitost (urologie, endokrinologie, sexuologie, toxikologie, ) podíl muže na snížené plodnosti páru je % v celosvětovém měřítku je snížené plodnosti mužů věnována menší pozornost než plodnosti žen snížená plodnost mužů je úzce spjata s kvalitou spermatu (vyhodnocuje se spermiogram)

21 Spermiogram hodnoceny jsou makroskopické i mikroskopické parametry vychází z ejakulátu získaného masturbací po předchozí dvou až sedmidenní pohlavní abstinenci vzhled ejakulátu zdravý ejakulát je homogenní a šedě opaleskujícího se vzhledu (až do žluta při delší sexuální abstinenci) viskozita ejakulátu hodnocena pomocí plastové injekční stříkačky s širokým hrdlem viskózní je hodnocen vzorek spermatu, který po vypuštění ze stříkačky tvoří vlákna dlouhá 2 cm

22 pohyblivost spermií hodnocení pohyblivosti spermií se provádí minut po odběru vzorku progresivně pohyblivé (aktivní pohyb vpřed nebo ve velkých kruzích) neprogresivně pohyblivé (pohyb na místě, točení v malých kruzích apod.) nepohyblivé morfologie spermií hodnotí se 200 spermií ve dvou alikvotních vzorcích, počítá se procentuální zastoupení normálních a abnormálních forem

23 a - kulatá hlavička bez akrozomu, b - malý akrozom, c - elongovaná hlavička d - velká hlavička, e - malá hlavička, f - špendlíková hlavička, g - vakuolovaná hlavička h - amorfní hlavička, i - zdvojená hlavička, j - volná hlavička, k - amorfní krček l - zalomený krček, m - stočený bičík, n - zdvojený bičík, o - odstup bičíku mimo osu, p - vícečetné defekty, q - nezralá buňka, r - elongovaná spermatida s - proximální cytoplazmatická kapka, t - distální cytoplazmatická kapka

24 Hodnoty základních vlastností normálního spermiogramu (WHO, 2010) objem ejakulátu koncentrace spermií 1,4 1,7 ml mil./1 ml celkový počet spermií mil. ph spermatu 7,2 celková pohyblivost spermií % progresivní i neprogresivní pohyb progresivní pohyb dopředu % normální morfologie 3 4 %

25 Diagnostika dle hodnot spermiogramu normozoospermie normální ejakulát podle referenčních hodnot WHO oligozoospermie koncentrace spermií je nižší než referenční hodnoty WHO asthenospermie celková pohyblivost spermií pod 40 % azoospermie ejakulát bez přítomnosti spermií teratospermie více jak 60 % spermií je netypického tvaru oligoasthenoteratozoospermie porucha všech tří veličin lze také použít kombinaci dvou předpon

26 Jaké vlivy ovlivňují kvalitu spermatu? infekce a zánět varlat, nadvarlat, semenných cest toxiny v životním prostředí užívání léčiv (př. antihistaminika snižují objem semenné tekutiny) horečka stres nedostatek spánku těsné spodní prádlo užívání návykových látek obezita nedostatek pohybu

27 Další možné příčiny snížené plodnosti muže kryptorchizmus po narození nepřítomnost varlete v šourku (3,4 5,8 % donošených novorozenců) retinované varle - během sestupu varlete dochází k jeho náhlému zastavení anorchie - lze nalézt slepě končící spermatické cévy a chámovod v různém stupni vývoje varikokéla zmnožení žilních pletení za varletem a nad varletem zhoršená termoregulace varlete, což je důsledek opětovného návratu teplé abdominální žilní krve do skróta

28 Vliv některých chemických látek na plodnost muže POLYCHLOROVANÉ BIFENYLY běžná aditiva v barvách, lacích, hydraulických zařízeních či teplonosných médiích, náplň transformátorů,kondenzátorů v ČR komerční názvy: Delor, Hydelor, Deloterm akutní toxicita je nízká, ale chronické vystavení nízkým dávkám je VELMI NEBEZPEČNÉ mají vynikající schopnost perzistence a bioakumulace karcinogenní riziko, nepříznivě ovlivňují imunitní systém, poškozují játra a snižují plodnost odolnost vůči rozkladu a velmi špatné odbourávání z organismu!!!u savců se vylučují hlavně mlékem!!!

29 ALKOHOL ve varlatech ovlivňuje funkci Leydigových buněk, což má inhibiční účinek na tvorbu testosteronu, s klesající hladinou testosteronu klesá i množství produkovaných spermií toxický pro varlata, způsobuje jejich atrofii negativně působí na funkci jater a tím i na metabolismus vitaminu A je nezbytný pro správnou spermatogenezi již dvě piva denně jsou příčinou nižší motility spermií i zhoršené kvality morfologie, tím se snižuje schopnost oplodnit vajíčko při pravidelné konzumaci velkého množství alkoholu, dojde k poškození jater a naruší se rovnováha v tvorbě pohlavních hormonů klesá množství testosteronu a stoupá hladina estrogenů (ztráta libida, erektilní dysfunkce až impotence, neplodnost a somatická podobnost ženě)

30 KOUŘENÍ CIGARET kouření tabáku zvyšuje příjem kadmia (rostlina tabáku tento kov absorbuje) kadmium je vazebnými vlastnostmi podobné zinku může nahradit zinek v DNA polymeráze, která hraje klíčovou roli v produkci spermatu snižuje objem ejakulátu o 22 %, redukuje pohyblivost spermií, zvyšuje výskyt abnormálních forem o 17 % (deformace bičíku, nepřítomnost bičíku, atd.) pokud kouří oba partneři, pohyblivost spermií negativně ovlivňuje i přítomnost thiocyanátu ve vaginálním sekretu žen kuřaček muži, kteří vykouří více než 20 cigaret/den mají o 60 % vyšší riziko erektilní dysfunkce (nikotin způsobuje zúžení cév v pánevní oblasti i topořivých tělesech penisu) nikotin působí toxicky i na dráhu hypotalamus-hypofýzatestes

31 OLOVO vysoká hladina olova v krvi se vyskytuje u lidí, kteří kouří, pijí alkohol nebo těch, kteří se dlouhodobě vyhýbají pohybu zvýšené riziko styku s materiálem, který obsahuje olovo je typické pro některá povolání např. lakýrník, instalatér, malíř, tiskař, chemik, hasič, voják, atp. poškozuje sperma prokazatelně snižuje schopnost spermie proniknout do vajíčka nebo ho oplodnit LÉČIVA některá antibiotika snižují přechodně počet a pohyblivost spermií (zejména nitrofurany a makrolidy) kvalitu semene ovlivňují i další léky např.: sulfasalazin - používaný k léčbě průjmů ketokonazol - lék proti plísním azulfidin - léčí ulcerózní kolitidu a další: spironolakton, kolchicin, allopurinol, tetracyklin, gentamicin, neomycin, cimetidin, cyklosporin

32 Vybrané metody asistované reprodukce Není-li při výběru léčebného postupu limitním faktorem čas (v podobě věku ženy či muže) a nejedná-li se o oboustrannou poruchu (např. transportu vajíček nebo těžkou patologii spermiogeneze), pak se centra asistované reprodukce snaží postupovat od metod jednoduchých k metodám náročnějším. Při zjištěné anovulaci s nepravidelným menstruačním cyklem se začne úpravou cyklu, šetrnou indukcí ovulace antiestrogeny, malými dávkami gonadotropinů v kombinaci s časováním koncepčního optima, přes intrauterinní inseminaci až k technikám asistované reprodukce.

33 IUI IntraUterine Insemination zavedení opakovaně promytých a seminální plasmy zbavených spermií tenkým plastovým katétrem přes hrdlo děložní do dutiny děložní provádí se v případě, že spermiogram vykazuje patologické hodnoty nebo v případě negativního poskoitálního testu (vyšší neprostupnosti hlenu děložního hrdla)

34 pokud u ženy dochází k ovulaci, lze inseminaci provést v naturálním cyklu (bez hormonální stimulace) při poruchách ovulace užíváte před IUI stimulační léky (nejčastěji klomifencitrát) nebolestivý výkon, provádí se ambulantně průběh cyklu IUI: zpravidla 3. den menstruačního cyklu začátek hormonální stimulace mezi dnem cyklu ultrazvuková kontrola lékař podle reakce na stimulaci naplánuje přesné datum inseminace a čas aplikace hcg (human Chorionic Gonadotropin), které urychlí zrání folikulů a ovulaci s písemným souhlasem léčeného páru lze použít spermie anonymního dárce intrauterinní inseminace dárcovská (AID - Artificial Insemination by Donor)

35 Transfer gamet nebo zygot do vejcovodů (jedny z prvních využívaných metod AR) GIFT (Gamete Intra-Fallopian Transfer) transfer gamet do nitra vejcovodů (1982 poprvé v Brně) výhody: - jediná laparoskopie - přirozené prostředí oplození ve vejcovodu - předcházelo se možnému vyvolání traumatu děložní sliznice při transferu embrya - použití u pacientek se silnými srůsty v oblasti pánevního dna, při neprůchodnosti vejcovodů nebo v případě velmi snížené mužské plodnosti dnes používána asi v 6 % případů ZIFT (Zygote Intra-Fallopian Transfer) transfer zygoty do nitra vejcovodů dnes se používá asi u 2 % případů

36 IVF In Vitro Fertilizace 25. června 1978 se narodilo první dítě počaté pomocí IVF Louis Brown (lékaři P. Steptoe a R. Edwards) Robert Edwards obdržel v roce 2010 za rozvoj IVF a svůj přínos v oboru asistované reprodukční medicíny Nobelovu cenu metoda IVF byla vyvinuta před třiceti lety pro ženy s neprostupnými vejcovody nebo bez vejcovodů metoda je založena na principu vytvoření mnoha folikulů, z nichž lze získat více vajíček a zvýšit tak šanci na oplodnění

37 průběh cyklu IVF: jsou podávány hormony, které stimulují vaječníky stimulace je monitorována pomocí ultrazvuku a krevních testů přibližně 9-14 dnů po započetí stimulace, když vedoucí folikul dosáhne požadované velikosti, je asi hodin před odběrem vajíček pacientce podána injekce hcg (human Chorionic Gonadotropin) odběr vajíček, také zvaný OPU (ovum pick up), se provádí v celkové narkóze a trvá přibližně minut vajíčka jsou po vyjmutí z folikulů přenesena do speciálního média, do kterého jsou následně přidány spermie (promyté, zbavené seminální plasmy, koncentrace na ml) kultivace hodin kontrola vzniku prvojader embrya se většinou 2-3 dny po odběru (5-6 dnů po odběru v případě prodloužené kultivace) přenesou do dělohy ET (EmbryoTransfer)

38

39 IVM In Vitro Maturation pacientce bez stimulační léčby odeberou nezralé oocyty oocyty pak dozrávají v laboratorních podmínkách, aby byly schopné oplodnění (dozrávání hodin) indikována ženám v mladém věku, u kterých se očekává vysoký počet oocytů při diagnostice syndromu polycystických ovarií u pacientek, které při předchozí léčbě měly hyperstimulační syndrom zdravotní stav pacientky neumožňuje podávání hormonů ke stimulaci vaječníků metoda není vhodná u obézních žen se špatnou vizualizací vaječníků

40 ICSI IntraCytoplasmic Sperm Injection mikromanipulační technika, která spočívá ve vpravení spermie do středu vajíčka pomocí mikrojehly výrazný pokrok v léčbě mužské neplodnosti (vyžaduje jen jednu spermii pro každý oocyt) vhodné i při imunologickém faktoru snížené plodnosti

41 průběh ICSI: nalezené oocyty s komplexem kumulárních buněk jsou očištěny pomocí enzymu hyaluronidázy a je posouzen stupeň jejich zralosti ICSI se vždy provádí ve stádiu druhé metafáze oocytu při vpichu spermie jsou oocyty stabilizovány pomocí speciální mikropipety a jedna vybraná spermie je po imobilizaci nasáta do mikropipety a přes zonu pellucidu a oolemmu umístěna do cytoplasmy oocytu po hodinách od aplikace spermie jsou oocyty kontrolovány, zda došlo k oplození podle přítomnosti dvou prvojader a dvou pólových tělísek v perivitelinním prostoru vyhodnocení prvního rozrýhování je možné po dalších hodinách Video ICSI

42 výběr vhodné spermie: dříve hodnotili především pohyblivost spermie a její morfologie (subjektivní hodnocení) další používaná metoda je IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection) založena na výběru morfologicky nejvhodnější spermie při zvětšení až 8000x hodnotícími parametry jsou počet vakuol v hlavičce a tvar hlavičky nově uplatňovaná metoda je PICSI (Preselected IntraCytoplasmic Sperm Injection) založená na podobných principech výběru spermie k oplodnění oocytu jako in vivo v těle ženy spermie jsou umístěny na hyaluronový hydrogel vazba na hyaluronan je možná pouze u zralých spermií, jen ony mají vhodný receptor k vazbě

43

44 Vývoj a hodnocení kvality embryí zásadní otázkou, kterou se zabývá moderní embryologie, je kvalita embrya a jeho implantační potenciál v důsledku soustavného zdokonalování metod výběru oocytu a spermie pro oplození a parametrů hodnocení embryí se přenášejí kvalitnější embrya v současné době se pro transfer do dělohy vybírají obvykle jedno až dvě embrya snaha o výběr jediného tzv. top embrya k transferu (aby se výrazně omezil počet vícečetných těhotenství, která jsou s asistovanou reprodukcí úzce spojena)

45 Průběh dělení embrya v prvních pěti dnech 0. den den punkce vajíček a jejich následná fertilizace zpravidla je % získaných oocytů nezralých 1. den kultivace v klinické praxi využívají embryologové k posouzení tzv. normálního průběhu oplození oocytu dvě kritéria: přítomnosti dvou prvojader po hodinách od inseminace výskyt dvou pólových tělísek v perivitelinním prostoru avšak přítomnost druhého pólového tělíska je někdy zavádějící, protože může docházet k fragmentaci prvního polárního tělíska

46 2. den kultivace zdravé a normálně se vyvíjející dvoubuněčné embryo se dělí za vzniku čtyřbuněčného embrya (po hodinách) 3. den kultivace pravidelně se dělící embrya dosahují osmibuněčného stádia asi za hodin i embrya, která mají 3, 5, 7 obvykle velikostně odlišných blastomer (důsledek asynchronického buněčného dělení) dvoubuněčné embryo 36 hodin po oplození osmibuněčné embryo 72 hodin po oplození

47 3. až 4. den kultivace u lidských šestnácti a vícebuněčných embryí dochází k procesu kompaktace, během kterého se jednotlivé blastomery začínají měnit v celistvou masu s nerozeznatelnou buněčnou membránou morula 5. den kultivace v morule vzniká migrací vnitřních buněk tekutinou vyplněná středová dutina blastocoel, vytváří se dutý kulovitý útvar, který se označuje blastula (blastocysta) morula 96 hodin po oplození blastocysta 120 hodin po oplození

48 později dochází k hromadění tekutiny v blastocoelu, čímž se blastocysta zvětšuje, zona pellucida se napíná a ztenčuje tento expandovaný stav může přetrvávat až 24 hodin a poté následuje děj, který se označuje jako hatching neboli uvolnění embrya ze zony pellucidy přirozenému uvolnění embrya napomáhají enzymy proteázy, které produkuje samotné embryo, ale i sliznice dělohy jestliže k procesu hatchingu nedojde, neproběhne implantace a nemůže dojít ke vzniku těhotenství možnými příčinami proč nedojde k uvolnění embrya z glykoproteinového obalu, jsou tlustší zona pellucida, zvýšená hladina FSH (Follicle-Stimulating Hormone) nebo pokročilý věk ženy některá pracoviště AR (Asistované Reprodukce) proto začala využívat metody umělého narušení zony pellucidy neboli asistovaný hatching (AH)

49 Blastocysta opouští obal, který embryo po celou dobu vývoje obklopoval (zona pellucida). Tento proces se nazývá "hatching". Nyní je zárodek připraven k uhnízdění v děložní sliznici. Video dělení embrya

50 Hodnocení kvality embryí embrya určená pro ET (Embryo Transfer) jsou vybírána po 2 6 dnech kultivace při jejich výběru se využívá různých klasifikačních systémů obecnými hodnotícími parametry jsou: rychlost dělení morfologické parametry - pravidelnost blastomer stupeň fragmentace

51 rychlost nástupu prvního buněčného dělení významný ukazatel vitality embryí u tzv. early cleavage (EC) embryí proběhlo první buněčné dělení již za hodin od oplození embrya s pomalejším nástupem dělení se označují jako tzv. non-early cleavage (NEC) pokud k nástupu dělení nedojde opožděně, předpokládá se, že se jedná o embrya se sníženou životaschopností nebo chromozomální vadou faktory, které ovlivňují nástup prvního buněčného dělení, zatím nejsou přesně známy vývoj oplozeného oocytu velmi ovlivňují vnější podmínky, například způsob oplození oocytu, podmínky kultivace, ale také se předpokládá, že velký vliv mají i vnitřní podmínky, tj. stavba a metabolismus samotného oocytu nebo spermie stále více poznatků dokládá, že to, zda dojde k transformaci zygoty v embryo, je zřejmé již ve dvoubuněčném stádiu (!!! regulační faktory pro první tři buněčná dělení pocházejí z mateřské gamety!!!)

52 morfologické parametry hodnotí se celková morfologie embrya (počet, tvar a velikost blastomer) kvalita embryí bývá označena stupněm stupeň grade I představuje nejkvalitnější embrya, oproti tomu ve stupni grade IV nacházíme embrya horší kvality častým způsobem hodnocení kvality embryí je kombinace číslice, která vyjadřuje počet blastomer a písmena, jež představuje procento fragmentace embrya ( např. D 50 %) fragmentace embryí v průběhu mitotického dělení embrya se objevuje v cytoplazmě větší nebo menší počet tzv. fragmentů jde o komponenty neobsahující DNA, které jsou vyplněny cytoplazmou a ohraničeny membránou malé množství fragmentů nemá negativní dopad na životaschopnost embrya, avšak vytvoří-li se jich velké množství takto brzy, dojde k narušení dalšího vývoje embrya

53 morfologické parametry a fragmentace embryí hodnotí se celková morfologie embrya (počet, tvar a velikost blastomer) kvalita embryí bývá označena stupněm (stupeň grade I představuje nejkvalitnější embrya) fragmenty jsou komponenty neobsahující DNA, které jsou vyplněny cytoplazmou a ohraničeny membránou

54 dvoubuněčné embryo 36 hodin po oplození embryo postižené fragmentací osmibuněčné embryo 72 hodin po oplození

55 PrimoVision Systém dnes často využívaná metoda jde o neinvazivní metodu kontinuální monitorování mimotělního vývoje embrya v uzavřeném inkubátoru, který je každých 15 minut snímán na 5 sekund kamerou následuje hodnocení kvality embryí, při kterém se klade důraz na digitální záznam, který zachycuje poruchy dělení buněk, fragmentaci, obsah vakuol a jiné patologie Video Primo Vision System

56 Délka kultivace embrya a její vliv řada pracovišť přenáší embrya ve stádiu blastocysty (je předpokládána vyšší životaschopnost) přesto embryo ve fázi blastocysty nemusí být při implantaci úspěšnější než přenesené embryo v ranější fázi vývoje počet embryí, která dosáhnou během kultivace vývojového stádia blastocysty, je v porovnání s počtem oplozených oocytů výrazně nižší otázkou je, jak dalece se na tomto faktu podílí embryo samotné, nebo jak je vývoj embryí in vitro ovlivněn podmínkami kultivace podmínky in vitro fertilizace jsou stále zdokonalovány

57 embryo, které se vyvíjí v podmínkách in vivo, vstupuje do dělohy zpravidla den od oplození stádium moruly z tohoto důvodu je vhodné sledovat celkový průběh vývoje embrya a k jeho transferu přistoupit až v době, kdy je implantace do děložní sliznice pro embryo přirozená k transferu embrya se dříve přistupovalo už po 2. dni kultivace, jelikož kvalita kultivačních médií nemohla embryu poskytnout tak dokonalé podmínky k vývoji jako prostředí dělohy se zdokonalujícím se složením kultivačních médií se prodlužovala i doba kultivace embryí in vitro až na 6 dnů

58 jako nejvhodnější den k ET byl na základě mnoha výzkumů doporučen 4. den kultivace, kdy dochází k aktivaci genomu a největšímu rozvoji embrya, v tento den embryo také vykazuje největší implantační aktivitu během 5. dne kultivace je možné v podmínkách in vitro vyloučit ta embrya, u kterých nedošlo k aktivaci genomu, a tím se zvyšuje šance na úspěšný ET (avšak tento den vybraná embrya jsou déle v in vitro podmínkách, což může snížit jejich vitalitu) při kultivaci embrya do dne vývoje hovoříme o tzv. prodloužené kultivaci (lze rozpoznat embrya, která ustrnou ve svém vývoji) vedou se časté diskuse, zda je vhodnější transfer embrya 3. nebo 5. den kultivace

59 embryo transferované 3. den kultivace se dostává dříve do dělohy a 4. den, kdy aktivuje svůj vlastní genom je už v přirozeném prostředí dělohy, což může příznivěji působit na schopnost implantace do děložní sliznice transferem 5. nebo 6. den se vytváří příznivější předpoklady pro navázání kvalitní komunikace mezi trofoblastem embrya a epitelem endometria, která se projeví v procesu adheze a následnému implantaci embrya do děložní sliznice může se stát, že po prodloužené kultivaci nebude žádné embryo vhodné k transferu do dělohy (negativní dopad na psychiku léčeného páru)

60 Kryokonzervace kryokonzervace spermií proces umožňující uchovat spermie ve zmraženém stavu pro pozdější užití spermie jsou uchovávány v tekutém dusíku při -196 C provádí se pro účely darování či u páru čekajících na darované oocyty, doporučuje se: při diagnóze nádorového onemocnění (před započetím léčby) stále častěji si muži přejí zamrazit svoje spermie jen preventivně

61 vitrifikace oocytů metoda dlouhodobého uchování oocytů pomocí prudkého zchlazení buněk použití vysoce koncentrovaných roztoků kryoprotektiv (látky chránicí buňky před poškozením mrazem) v mrazícím mediu a následné prudké podchlazení buněk ( 1000 C/min) pod -150 C oocyty jsou náchylnější k fyzikálnímu nebo chemickému poškození při kryokonzervaci než embrya může dojít k poškození meiotického vřeténka nebo jejich nežádoucí aktivaci chladem doporučuje se: před zahájením onkologické léčby jiné zdravotní důvody (např. pokud ženě musí být odebrány vaječníky) ženám v plodném věku, které odkládají mateřství

62 rozdíl mezi kryokonzervací a vitrifikací během klasické kryokonzervace jsou použity nižší koncentrace roztoků kryoprotektiv a buňky jsou mraženy velmi pomalu (± 0,3 C/min) při postupu kryokonzervace se sice nevytváří krystaly vody uvnitř buněk, ale v mrazícím mediu ano, což může vést k jejich poškození při vitrifikaci je tvorbě krystalů vody v buňkách zabráněno a úspěšnost rozmražení buněk se pohybuje kolem 95 %

63 kryokonzervace embryí jsou-li k dispozici embrya, která nebyla transferována ve stimulovaném cyklu, mohou být po kryokonzervaci použita v následujících léčebných cyklech abnormální embrya mražena nebývají i přes standardizaci postupů ne všechna embrya proces zmrazení a rozmrazení přežijí v takovém stavu, aby mohla být po rozmrazení transferována zamrazená embrya mohou být uchovávána po dobu několika desítek let (v tekutém dusíku při teplotě -196 C) mezi hlavní výhody takto uchovaných embryí je, že žena již nemusí podstupovat náročnou hormonální hyperstimulaci vaječníků