Univerzita Karlova v Praze. 3. lékařská fakulta. Autoreferát disertační práce. Martina Langová

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze 3. lékařská fakulta Autoreferát disertační práce Mutagenní a antimutagenní účinky látek zevního prostředí Martina Langová Praha 2008

2 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: Doc. RNDr. P. Pikálek, CSc. Školicí pracoviště: Ústav obecné biologie a genetiky KBO, 3. LF UK Ruská 87, Praha 10 Autor: MUDr. Martina Langová Školitel: MUDr. Pavel Vodička, CSc. Oponenti: Autoreferát byl rozeslán dne:... Obhajoba se koná dne:. v. hod. kde..... S disertací je možno se seznámit na děkanátě 3. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze 2

3 Obsah : Souhrn...4 Úvod...6 Cíle...6 Metody...7 Výsledky...8 Diskuse...8 Závěr...9 Literatura...10 Publikace

4 1. Souhrn Předmětem práce je testování antimutagenních účinků chemicky definovaných přírodních látek : diallylsulfid (DAS), kyselina ellagová (EA), resveratrol (RES) a fenetyl isothiokyanát (PEITC) na experimentálních modelech, které byly ovlivněny vybranými mutageny: aflatoxin B1 (AFB1), 2-amino-3-methylimidazo/4,5,- f/chinolin (IQ) a N-nitroso-N metylurea (MNU). AFB1 a IQ jsou nepřímé mutageny a vyžadují metabolickou aktivaci k tomu, aby se projevil jejich genotoxický efekt. Oproti tomu třetí použitý karcinogen MNU metabolickou aktivaci nevyžaduje. Testováni protektivních látek přírodního původu bylo provedeno na prokaryotním modelu (Amesův test, kmeny Salmonella typhimurium TA98, TA100) a eukaryotním modelu ( mikronukleus test a kometový test na myším modelu). V Amesově testu byl pozorován výraznější vliv všech testovaných látek na snížení genotoxického efektu nepřímých mutagenů AFB 1 a IQ než na mutagenitu přímého mutagenu MNU nebo AFB 1. V experimentech na obou kmenech Salmonella typhimurium byla prokázáná dávkově závislá inhibice mutagenní aktivity IQ and AFB 1 vlivem účinků EA a DAS i RES, ale mutagenita přímo působícího mutagenu MNU byla snížena vlivem EA a DAS pouze v malé míře. Mutagenní účinky MNU byly sníženy i vlivem PEITC, ale některé vyšší koncentrace PEITC již snižovaly životaschopnost indikátorových kmenů. Také RES měl mnohem výraznější inhibiční účinek vůči mutagenitě nepřímých mutagenů AFB 1 a IQ v porovnání s přímo působísím mutagenem MNU. V testech in vivo byl prokázán signifikantní antimutagenní (antiklastogenní) účinek kyseliny elagové, resveratrolu, dialylsulfidu a fenetyl isothiokyanátu aplikovaných ve třech opakovaných dávkách před jednorázovou aplikací mutagenu. Antiklastogenní účinek se projevil u přímých i nepřímých mutagenů výrazným snížením počtu mikrojader u skupin laboratorních zvířat, kterým byly podány protektivní látky. Působení resveratrolu bylo také sledováno metodou comet assay (kometový test), která detekuje jednovláknové zlomy DNA. RES byl použit v kombinaci s nepřímým mutagenem IQ, kdy byl prokázán pozitivní efekt na snížení množství zlomů DNA v buňkách jater a kostní dřeně a v kombinaci s přímým mutagenem MNU, kdy se efekt projevil pouze u kostní dřeně, ale u jaterních buněk byl účinek minimální. 4

5 Summary In the present study were used reference mutagens which effects mutagenic activity in prokaryotic and eukaryotic testing systems. Aflatoxin B 1 (AFB 1 ) is one of the most thoroughly studied and the well known mycotoxin with carcinogenic activity. 2-Amino-3- methylimidazol[4,5-f] quinoline (IQ) in isolated form has been used as another reference mutagen. These compounds are indirect acting genotoxins, i.e. need metabolic activation to exert genotoxic effect. As a third reference mutagen in the present study there has been chosen N-nitroso-N-methylurea (MNU) which is direct acting carcinogenic N-nitroso compound. The aim of the study was to investigate antimutagenic effects of ellagic acide (EA), resveratrol (RES), diallyl sulfide (DAS) and phenetyl isothiocyanate (PEITC) on the mutagenicity of the mutagens. The Ames test with Salmonella typhimurium TA98 and TA100 strains was used for the evaluation of antimutagenic effect of EA, RES, DAS and PEITC in vitro. In experiments on Salmonella typhimurium a dose dependent inhibition of the mutagenic activity of IQ and AFB 1 by EA and DAS has been demonstrated. Mutagenicity of the direct mutagen MNU was reduced by EA and DAS to a very small degree only. RES reveals much stronger effect on mutagenicity of indirect mutagens AFB 1 and IQ in comparison with the effect on mutagenicity of direct mutagen MNU. Mutagenic effect of MNU was reduced only by the concentration 30 g PEITC per plate but in the dose 300ug per plate PEITC reduced viability of the indicator cells. The micronucleus test is a method designated for the detection of substances with a clastogenic effect, i.e. a capacity to induce breakages of chromosomes. Significant induction of micronucleated erythrocytes by the mutagens was found in bone marrow. Decrease of mutagenicity all three mutagens AFB 1, IQ and MNU by EA, RES, DAS and PEITC was detected in micronucleus test. DNA damage was evaluated as single-strand breaks. The induction of single strand DNA breaks by mutagens in bone marrow and liver essentially corresponds to the induction of micronuclei. The protection of RES against IQ toxicity assessed by using comet assay in the bone marrow of laboratory mice was effective in liver and bone marrow cells. The protection of RES against MNU genotoxicity only in the bone marrow was effective. Liver genotoxicity induced by MNU was not modified by RES pretreatment. 5

6 2. Úvod Souvislost mezi složením stravy člověka a jeho zdravím je nepochybná.v centru zájmu je pochopení a hlavně ovlivnění procesu aterogeze a onkogeneze, protože kardioavaskulární a onkologická onemocnění patří mezi nejčastější příčiny úmrtí ve vyspělých zemích. Nutrice může souviset jak s iniciací a progresí karcinogeneze, tak s jejím potlačením. K negativním environmentálním faktorům patří především chemické karcinogeny, které z velké části vznikají jednak vlivem lidské činnosti, jednak v rámci endogenních procesů (Guernich, 2000). Kromě karcinogenních látek antropogenního charakteru existuje i velká skupina přirozených karcinogenů. Na druhé straně se ve většině druhů ovoce a zeleniny se vyskytuje řada látek, které vykazují protektivní účinky (Aggarval et al., 2006). Jsou to mimo klasické vitamíny především: thiolové látky jako dialyl sulfid, flavonoidy a isoflavony, inositol hexafosfát, isothiokyanáty, kurkumin, saponiny, kapsaicin, rostlinné polyfenoly jako resveratrol, kyselina elagová, genistein a mnohé další (Zhang et al., 2008). 3. Cíl práce Cílem práce je posoudit antimutagenní účinek uvedených látek rostlinného původu po ovlivnění testovaných organizmů modelovými chemickými látkami mutagenní povahy a s různými mechanizmy účinku. Výsledků bude možno využít pro studium prevence genotoxických účinků cizorodých látek v potravních řetězcích. Byly sledovány čtyři bioaktivní látky rostlinného původu, vyskytující se v obvyklé potravě člověka, použité ve formě chemicky definovaných sloučenin: kyselina elagová (EA), resveratrol (RES), dialylsulfid (DAS) a fenetyl isothiokyanát (PEITC). Jejich účinek byl testován na inhibici mutagenní aktivity testovaných karcinogenních látek: aflatoxinu B 1 (AFB 1 ), 2-amino-3-methylimidazo[4,5,] chinolinu (IQ) a N-nitroso-Nmethylurey (MNU). Testované látky byly vybrány tak, aby reprezentovaly obvyklé složky lidské potravy, které by se tak mohly podílet na snížení rizika účinků vybraných modelových mutagenů vyskytujících se jako kontaminanty v potravinách a u kterých nelze počítat s tím, že by se podařilo této kontaminaci zcela zabránit. 6

7 3. Metody Antimutagenní účinky byly sledovány jak metodou in vitro ( Amesův test), tak metodou in vivo (mikronukleus test a kometový test). Amesův test mutagenních účinků chemických látek na prokaryotním modelu, histidin-auxotrofní mutantě Salmonella typhimurium, byl proveden podle Maron a Ames (1983). Bakterie mají arteficielně porušený gen pro biosyntézu histidinu a proto vyžadují pro svůj růst jeho externí přívod. K testování byly použity indikátorové kmeny Salmonella typhimurium TA98 a TA100. Působením testovaného mutagenu dochází ke zpětné mutaci, která se fenotypově projeví návratem schopnosti tvorby histidinu s následným růstem na základním mediu. Pro detekci účinků nepřímých mutagenů se test provádí v přítomnosti savčích jaterních mikrozomálních enzymů (metabolická aktivace pomocí S9 frakce jaterního homogenátu), Kombinace dvou kmenů TA98 a TA100 (tato kombinace je v běžné praxi nejpoužívanější) je schopna detekovat 83% mutagenních látek (Bonneau et al., 1991). Mikronukleus test je založen na sledování počtu mikrojader v těchto pokusech v polychromatofilních erytrocytech kostní dřeně. Mikrojádra vznikají v důsledku chromozomálních zlomů a jsou tvořena fragmentem chromozomu (popř. celým chromozomem nezačleněným do nově vytvořeného jádra, pokud došlo k poruše funkce dělicího vřeténka). Nejvýhodnější pro zjišťování frekvence mikrojader jsou polychromatofilní erytrocyty, které se dají identifikovat podle reziduální RNA. Po expozici mutagenní látkou se počet mikrojader v těchto buňkách zvyšuje a je mírou genotoxicity testované látky. Mikronukleus test byl prováděn metodou podle Schmida (1975). Single cell gel electrophoresis (SCGE), častěji používaným názvem je comet assay nebo kometový test je metoda určená k analýze DNA zlomů v jádrech buněk a je prakticky použitelná u všech eukaryotních buněčných populací, ze kterých může být získána suspenze jednotlivých buněk. Metoda umožňuje detekci jednořetězcových zlomů DNA v jednotlivých buňkách. Poškození DNA, které se manifestuje jako zlom, může být projeven genotoxických vlivů nebo může být přechodným jevem vznikajícím v důsledku oprav DNA. Detekce poškození DNA pomocí metody comet assay představuje tedy aktuální stav buňky. Metoda byla prováděna podle Collinse (1997). 7

8 4. Výsledky V Amesově testu byl pozorován výraznější vliv všech testovaných látek na snížení genotoxického efektu nepřímých mutagenů AFB 1 a IQ než na mutagenitu přímého mutagenu MNU nebo AFB 1. V experimentech na obou kmenech Salmonella typhimurium byla prokázáná dávkově závislá inhibice mutagenní aktivity IQ and AFB 1 vlivem účinků EA a DAS i RES Mutagenita přímo působícího mutagenu MNU byla snížena vlivem EA a DAS pouze v malé míře. Také RES měl mnohem výraznější inhibiční účinek vůči mutagenitě nepřímých mutagenů AFB 1 a IQ v porovnání s přímo působísím mutagenem MNU. Mutagenní účinky MNU byly sníženy při koncentraci 30 g PEITC na misku, ale koncentrace PEITC 300 g na misku již snižovala životaschopnost indikátorových kmenů. V mikronukleus testu byly ověřeny dávky mutagenů, indukujících u myší signifikantní zvýšení počtu mikrojader oproti kontrole (AFB 1 1 mg/kg, IQ 20 mg/kg a MNU 50 mg/kg). Tyto dávky byly dále použity ke stanovení antimutagenní aktivity sledovaných látek (Bárta et al., 1990). V testech in vivo byl prokázán signifikantní antimutagenní (antiklastogenní) účinek kyseliny elagové, resveratrolu, dialylsulfidu a fenetyl isothiokyanátu aplikovaných ve třech opakovaných dávkách před jednorázovou aplikací mutagenu. Působení resveratrolu bylo také sledováno metodou comet assay v kombinaci s nepřímým mutagenem IQ, kdy byl prokázán pozitivní efekt na snížení množství zlomů DNA v buňkách jater a kostní dřeně a v kombinaci s přímým mutagenem MNU, kdy se efekt projevil pouze u kostní dřeně, ale u jaterních buněk byl účinek minimální. 5. Diskuse Tato práce se zaměřila na sledování mutagenních a antimutagenních účinků látek, které se v prostředí člověka respektive jeho potravě přirozeně vyskytují. Zkoumané genotoxické látky se většinou vyskytují v potravě v nízkých dávkách, ale při pravidelné expozici představují zátěž organismu a z hlediska nutričně toxikologických procesů i zvýšené riziko vzniku nádorových onemocnění. Riziko karcinogeneze je snižováno ochrannými procesy probíhajícími v organismu zejména antioxidací, detoxikací, snižováním metabolické aktivace karcinogenních látek, reparací DNA, apoptózou a obrannými 8

9 schopnostmi imunitního systému (Go et al., 2003). Tyto přirozené procesy mohou být podpořeny antimutagenními a antikarcinogenními látkami přírodního původu a tak může být konzumovaná potrava významným zdrojem ochranných faktorů. Pokud se jedná o mechanismus účinků protektivních látek lze u všech předpokládat kombinaci více procesů. Velmi pravděpodobné, u některých látek již i prokázané, je ovlivnění metabolické aktivace mutagenů cestou detoxikačních enzymů, případně i ovlivnění přímé- neenzymatické. Uvedené látky mohou ovlivňovat ochranné mechanismy na různých úrovních. Například resveratrol indukuje apoptózu zvýšením exprese p53, vyvolává zastavení buněčného cyklu v G1 fázi a na rozhraní G1/S fáze indukcí exprese inhibitorů CDK, redukuje zánětlivý proces inhibicí produkce prostaglandinů a snížením aktivity cyclooxygenázy (Shankar et al. 2007). 6. Závěry V pokusech na prokaryotním i eukaryotním modelu byly pokázány antimutagenní účinky všech testovanýchh látek Vzhledem k prokázaným antimutagenním účinkům vůči testovaným mutagenům, lze kyselinu elagovou, resveratrol, dialylsulfid a fenetyl isothiokyanát považovat za možné doplňky stravy nebo za významné složky tzv. funkčních potravin, které spolu s vhodným složením stravy, mohou významně přispět k prevenci nádorových onemocnění a dalších chorob, které jsou etiologicky podmíněny genotoxickými vlivy. Pokrok v oblasti poznání procesu karcinogeneze na buněčné a molekulární úrovni otevřel slibnou strategii prevence nádorů chemoprevenci, která může účinně přispět k redukci incidence lidských zhoubných nádorů případně podpořit jejich léčbu (Bode and Dong, 2004). Složení potravy se tedy může stát efektivní strategií v prevenci různých onemocnění především nádorových a kardiovaskulárních. Je tendence jednotlivé účinné látky izolovat a poskytovat je jako potravinové doplňky v prevenci a podpůrné léčbě civilizačních chorob, ale často zůstává nedořešena otázka dávkování a vzájemných interakcí. 9

10 Literatura Aggarwal, B.B., Shishodia, S., Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer. Biochem-Pharmacol. 71(10), 2006, Bárta,I., Adámková M., Petr,T., Bártová J.:Dose and time dependence of chromosomal aberration yields of bone marrow cells in male Chinese hamsters after a single i.p. injection of aflatoxin B1. Mutation Res., 244, (1990), Bode, A.M., Dong, Z., Targeting signal transduction pathways by chemopreventive agents. Mutat. Res., 555, (2004), Bonneau, D.: Optimum association of tester strain for maximum detection of mutagenic compounds in the Ames test. Mutation Res., 252, (1991), Collins A.R., Dobson,V.L., Dušinská M., Kennedy, G., Štětina, R., The comet assay: what can really tell us? Mutation Res., 375, (1997), Go, V.L.W., Butrum, R.R., Wong D.A., Diet nutritin and cancer prevention : the postgenomic era. J.Nutrition, 133, (2003), Guengerich, F.P., Metabolism of chemical carcinogens. Carcinogenesis, 21, (2000), Maron, D.M., Ames, B.N., Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res., 113, (1983) Shankar, S., Singh, G., Srivastava, R.K., Chemoprevention by resveratrol: molecular mechanisms and therapeutic potential. Front Biosci. 12,(2007), Schmid, W., The micronucleus test. Mutat. Res., 31 (1975) Zhang, Y., Seeram, N.P., Lee, R., Feng, L., Heber, D., Isolation and identification of strawberry phenolics with antioxidant and human cancer cell antiproliferative properties. J. Agric. Food. Chem., 56(3),(2008),

11 Publikace s IF 1. Šmerák, P., Polívková, Z., Šestáková H., Štětina, R., Bárta, I., Langová, M., Turek, B., Bártová, J.:Antimutagenic Effect of Curcumin and its Effect on the Immune Response in Mice. Czech J. Food Sci., 24(2), (2006), IF: 0,39 2. Polívková, Z., Langová, M., Šmerák, P., Bártová, J., Bárta, I.: Antimutagenic Effect of Genistein. Czech J. Food Sci., 24(3), (2006), IF: 0,39 3. Bárta, I., Šmerák, P., Polívková, Z., Šestáková H., Langová, M., Turek, B., Bártová, J.: Current Trends and Perspectives in Nutrition and Cancer Prevention. Neoplasma, 53,(2006), IF: 1,21 4. Langová, M., Polívková, Z., Šmerák, P., Bártová, J., Bárta, I.:Antimutagenic Effect ofresveratrol. Czech J. Food Sci., 23, (2005), IF: 0,39 5. Langová, M., Polívková, Z., Šestáková H., Šmerák, P., Bártová, J., Bárta, I.: Antimutagenic Effect of Diallyl Sulfide. Czech J. Food Sci. ( v redakci) Abstrakta: Bárta I., Šmerák P., Štetina R., Turek B., Šestáková H., Polívková Z., Langová M.: Mutagenní, antimutagenní a imunitní aktivity látek rostlinného původu. Sborník 24. pracovních dnů České a slovenské společnosti pro mutagenezu zevním prostředím, Československé biologické společnosti, Brno Abstrakta IDVZP, Brno2001, str Bárta I., Šmerák P., Polívková Z., Bártová J., Langová M., Turek B.: Comparison of mutagenicity of selected natural chemical compounds in different tests of mutagenicity Abstracts of Federatione Iataliana Scienze della Vita. Riva del Garda, FISV 2001, s Conference of Federatione Iataliana Scienze della Vita, 21-25th September 2001 Bárta I., Šmerák P., Turek B., Šestáková H., Polívková Z., Bártová J., Langová M.: Uplatnění mutagenní a imunomodulační aktivity látek rostlinného původu na procesu karcinogeneze Výživa a zdraví 2001, Teplice, OHS 2001, s Konference: Výživa a zdraví 2001, Teplice

12 Bárta,I., Šmerák,P., Šestáková,H., Polívková,Z., Turek,B., Bártová,J., Langová,M.: Antimutagenní účinek kyseliny ellagové a její efekt na imunitní reakci u myší. Sborník 25. pracovních dnů České a Slovenské společnosti pro mutagenezu zevním prostředím a Československé biologické společnosti. Brno, IDPVZ Štětina R., Bárta,I., Šmerák,P., Šestáková,H., Polívková,Z., Langová M,. Bártová,J.: THE INTRODUCTION OF DNA BREAKS IN LYMPHOCYTES AND LIVER CELLS OF MICE AND CHINESE HAMSTERS TREATED WITH MS OR MNU. A COMPARISON WITH THE INTRODUCTION OF MICRONUCLEI 32 Environmental Meeting of Mutagen Society, sborník str. 151, Varšava září 2002 BÁRTA, I., ŠMERÁK, P., ŠESTÁKOVÁ, H., POLÍVKOVÁ, Z.,TUREK, B., BÁRTOVÁ, J., LANGOVÁ,M., ANDĚL, M.: Antimutagenní účinek kyseliny elagové a resveratrolu a jejich efekt na imunitní reakci u myší. Sborník konference Výživa a zdraví BÁRTA, I., ŠMERÁK, P., ŠESTÁKOVÁ, H., POLÍVKOVÁ, Z.,TUREK, B., BÁRTOVÁ, J., LANGOVÁ,M., ANDĚL, M.: Paralelní testování antimutagenní a imunomodulační aktivity látek přírodního původu v pravenci karcinogeneze. Jesenné pracovné dni České a Slovenské spoločnosti mutagenézy vonkajším prostredím, Československá biologická spoločnostˇ - Genetická toxikológia a prevencia rakoviny, Oktobra 2003, ÚEO SAV Bratislava. Sborník abstrakt BÁRTA, I., ŠMERÁK, P., ŠTĚTINA R., ŠESTÁKOVÁ, H., B., BÁRTOVÁ, J., POLÍVKOVÁ, Z.,TUREK, LANGOVÁ,M.: Interakce a chemoprotekce genotoxických účinků mykotoxinů. Sborník 26. pracovních dnů České a Slovenské společnosti pro mutagenezu zevním prostředím a Československé biologické společnosti. Brno, IDPVZ