Hodnocení účinku cytostatik a inhibitorů histondeacetylázy na nádorové buňky in vitro

Transkript

1 Hodnocení účinku cytostatik a inhibitorů histondeacetylázy na nádorové buňky in vitro T.Groh 1,2, J.Hraběta 1, T.Eckschlager 1 1 Klinika dětské hematologie a onkologie, 2.LF UK a FN Motol a 2 Katedra biochemie PřF UK, Praha

2 Nádory jsou velkým problémem současných rozvinutých zemí a jejich incidence stálé přibývá a mortalita příliš neklesá- úspěch tedy je. Proto se hledají stále nové léčebné postupy. Hitem sezóny je cílená (biologická léčba) Incidence a mortalita na ZN v ČR

3 Možnosti léčby nádorů Operační pouze u lokalizovaných optimum Chemoterapie pouze chemosensitivní, mnoho nežádoucích účinků Funguje omezeně Hormonální pouze hormonálně dependentní Radioterapie pouze u lokalizovaných a radiosenzitivních Cílená (biologická) inky. Pouzradiosenzitivní. Zatím příliš nefunguje. Moc drahá.

4 Cílená léčba Cytostatika zabíjejí rychle rostoucí buňky, cílená léčba je zaměřená proti specifické struktuře nádorové buňky (nemusí být vždy specifická jen pro nádorové b.). Detekce cíle této terapie je pilířem personalizované medicíny

5 HDACi mají protinádorové a antiangiogenní účinky HDACi potencují účinky cytostatikkterých? Jaký je nejvhodnější protokol- před, spolu, po? Pokusit se určit mechanismus. HDACi

6 HDACi

7 Valproát (VPA) konvenčně používaný lék antiepileptikum stabilizér nálady nízké dávky, dobře snášen

8 Valproát (VPA) v posledních letech studován pro inhibici histondeacetyláz indukuje diferenciaci a apoptózu nádorových buněk VPA ( )

9 Cisplatina (CDDP) konvenčně používané cytostatikum kovalentně se váže na DNA inhibice replikace a trankripce vede k neopravitelným změnám a následně k apotóze buněk

10 Etoposid (ETO) konvenční cytostatikum rostlinný alkaloid derivát podophylotoxinu Podophyllum peltatum inhibitor topoisomerasy II > dvouřetězcové zlomy ->apoptóza

11 Vinkristin (VCR) konvenční cytostatikum rostlinný alkaloid váže se na dimery tubulinů -> brání tvorbě mikrotubulů dělicího vřeténka kontrolní cytostatikum neovlivňuje DNA

12 Metody Buněčné linie odvozené od vysoce rizikového NBL Testované látky: 1/ inhibitory histondeacetylázy valproáta (VPA) a trichostatina (TSA); 2/ konvenční cytostatika cisplatina, etoposid, vinkristin Detekce apoptózy cytometricky: 1/ vazba anexinuv a vstup PI; 2/ vazba značeného inhibitoru casp-3 Dvouřetěžcové zlomy- detekce ϒH2AX- specifická protilátka Buněčný cyklus- PI+ RNAza po permeabilizaci Viabilita- MTT test (kolorimetrický průkaz redukce MTT na formazan)

13 Výsledky I nalezení vhodných koncentrací valproátu, etoposidu a cisplatiny zjištění IC 50 za klasických kultivačních podmínek (normoxie, 21% O 2 ) za hypoxický kultivačních podmínek (1% O 2 ) IC 50 valproát (mm) IC 50 cisplatina (µm) IC 50 etoposid (µm) Normoxie Hypoxie Normoxie Hypoxie Normoxie Hypoxie Exp. I 1,7 1,1 10,6 16,8 1,8 3,0 Exp. II 1,6 1,4 8,5 14,9 3,1 3,7 Exp. III 1,3 1,1 4,6 9,1 2,1 3,0 průměr 1,53 1,20 7,86 13,60 2,33 3,23 směr. odch. 0,17 0,14 2,50 3,28 0,56 0,33

14 viabilita % Výsledky II viabilita % testování 48h kokultivace 1mM VPA a 20µM CDDP či 8µM ETO potenciace účinku cytostatik 0,2+1= K VPA CDDP VPA+CDDP 40 K VPA ETO VPA+ETO

15 viabilita (%) viabilita (%) viabilita (%) Výsledky III testování 48h kokultivace 40nM TSA a 20µM CDDP či 8µM ETO TSA je pan-hdac inhibitor nedochází k potenciaci Indukce apoptózy trichostatinem A (TSA) koncentrace (nm) K TSA CDDP TSA+CDDP 40 K TSA ETO TSA+ETO

16 viabilita (%) Výsledky IV aktivita caspasy-3 1mM VPA potencuje po 48h kokultivaci i téměř netoxickou koncentraci 4µM CDDP K VPA CDDP VPA+CDDP K VPA CDDP VPA+CDDP

17 IC 50 (µm) Výsledky V různé sekvence kultivací 1mM valproátu a různých koncentrací etoposidu (MTT test IC 50 ) 4 Potenciace Inhibice ETO/VPA+ETO VPA/VPA+ETO ETO/VPA 0/VPA+ETO 0/ETO VPA/ETO

18 viabilita (%) Výsledky VI sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 8µM ETO K ETO/ETO 0/VPA ETO/0 ETO/VPA VPA/0 0/ETO VPA/ETO

19 viabilita (%) Výsledky VII sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 20µM CDDP K CDDP/CCDP 0/VPA CDDP/0 CDDP/VPA VPA/0 0/CDDP VPA/CDDP

20 Výsledky VIII Kombinace CDDP, 1mM VPA, N, H, 24/48, viabilita normoxia hypoxia K C/C 0/V C/0 C/V V/0 0/C V/C

21 Výsledky IX Dvouřetězcové zlomy DNA- hodnoceno průkazem ϒH2AX, UV jako kontrola, VP-16 inhibitor topoizomerázy II ,2 + 1 = 0,9 kont. UV VPA UV+VPA VP-16 VP-16+VPA VPA potencuje jak účinek VP-16 tak částečně i UV

22 Výsledky X otestování valromidu (VPM) analog VPA, účinkuje jako antiepileptikum neinhibije HDAC nalezení vhodné koncentrace VPM ~ 1mM VPA 4mM VPM (popsáno i v literatuře) K 1mM 3 mm 5 mm 8 mm 12 mm

23 viabilita (%) Výsledky XI testování 48h kokultivace 4mM VPM a 20µM CDDP nedochází k ovlivění účinku k potenciaci nutná inhibice HDAC 90 lehce protektivní efekt! K VPM CDDP VPM+CDDP

24 Diskuze Neuroblastomová buňky jsou sensitivní vůči všem testovaným látkám (ETO, CDDP, VCR,VPA, VPM) Jako nejefektivnější kombinace kultivací valproátu a etoposidu či cisplatiny se ukazuje kokultivace buněk VPA ovlivňuje děje v buňce po vazbě cytostatik (DNA reparační mechanismy, proapoptotické signály?) Je mechanismus potenciace závislý na aktivitě HDAC (nefunguje s valpromidem, ale TSA nepotencuje)? Mechanismus potenciace je spojený s DNA cíleným poškozením (nepotencuje VCR).

25 Závěr všechny použité látky jsou konvenčně používané v klinické praxi klinicky relevantní koncentrace látek v experimentech, VPA lze dávat dlouhodobě získané výsledky mohou pomoci vytvořit efektivnější protokoly léčby (nejen) neuroblastomů. VPA potencuje účinky některých cytostatik