Proč studovat biofilmy

Transkript

1 Proč studovat biofilmy

2 Definice: biofilm je komplexní seskupení mikroorganismů rostoucích na pevném podkladu. Pro biofilmy je charakteristická strukturální heterogenita, genetická diverzita, komplexní interakce uvnitř společenstva a extracelulární matrice z polymerních látek (substances) EPS.

3 Proč studovat biofilm? Bakteriální biofilmy působí vážné problémy 1. V průmyslu primárně ve vodních systémch, střižné síly nejsou schopné zastavit tuto tvorbu. 2. Problematika lidského zdraví: - rezistence k antimikrobiálním látkám - zpomalené pronikání antimikrobiálních látek - biofilmy na lékařských instrumentech.

4 Vývoj tvorby biofilmu Mikroorganismy schopné přilnout na povrch využívají nutrienty přítomné na povrchu potravin nebo technologického zařízení a začínají se množit (proliferate). Ostatní mohou za určitých podmínek vylučovat polysacharidy, které slouží jako ochrana před environmentálními stresy a následně znemožňují jejich odstranění z povrchů. Tato trojrozměrná (3-D) matrice (matrix) složená z polysacharidů, proteinů, DNA a mikroorganizmů je označovaná jako biofilm.

5 Jak se biofilm začíná tvořit? Tvorba biofilmu začíná připevněním (attachment) volně rostoucích mikroorganismů k povrchu. Tito první kolonisté se přichycují k povrchu pomocí slabých a reversibilních van der Waalsových sil. Nejsou-li kolonisté okamžitě odstranění z povrchů, mohou se vzájemně kotvit za účasti adhezivních proteinů a bičíků (pili.)

6 Biofilmy jsou přirozeným způsobem existence mikroorganismů Vybudovaná struktura biofilmu sestává z mikrobiálních buněk a EPS (extrapolymerní látky), má definovanou architekturu a skýtá optimální prostředí pro výměnu genetického materiálu mezi buňkami. Buňky také spolu komunikují pomocí quorum sensing, a tento mechanismus může také ovlivnit procesy uvnitř biofilmu, jako je jeho rozpad (detachment.)

7 EPS Složení: - polysacharidy(exopolysacharidy), proteiny, fosfolipidy, NK Exopolysacharidy: - vysokomolekulární látky, složené z monosacharidů a necukerné složky, které jsou specifické pro jednotlivé MO - N-acetyl-heparosan ( Escherichia coli) - Dextran ( Lactobacillus hilgardii) Poskytuje ochranu před antimikrobiálními látkami, UV zářením, změnou ph, osmotickým šokem a dehydratací Umožnuje zachytit živiny Zabraňuje přistupu biocidu, toxinu, težkych kovu

8

9 Bill Costerton Ředitel Centre for Biofilm Engineering, Montana State University, USA Umístil se mezi 100 nejvíce citovaných autorů v mikrobiologii. Mikroorganismy rostoucí ve formě biofilmu jsou více rezistentní k antibiotikům než planktonní buňky. Costerton, J.W., G.G.Geesey, and G.K.Cheng How bacteria stick. Sci.Am. 238: 86-95

10 Vývojová stadia tvorby biofilmu

11 Metody ke studiu biofilmů Konfokální skenovací laserová mikroskopie Mikrotitrační destičky, barvení krystal. violetí Plovoucí seskupení v kapalinách d Tvar a velikost kolonií na agarových mediích

12 Honeycomb biofilm structure of L. monocytogenes

13 Nerezové kupony. Biofilmy byly vytvořeny kmeny E. coli O157:H7 strain ATCC (A) a ATCC (B) při 22 C. Kupony (2 x 5 cm) jsou drženy pinzetou.

14 Biofilmy lze pěstovat v laboratoři s použitím levných přístrojů. Různé typy průtočných cel.

15 Využití kuponů Kupony slouží jako povrchy na které bakterie adherují. Lze je připravit na zakázku, nebo si je zhotovit. Např. nerezové kupony získáme rozřezáním plechu na vhodné rozměry. Podobně se pracuje se sklem a plasty. Povrch lze vyleštit, nebo opatřit testovanou nátěrovou látkou. Po vytvoření biofilmu je nutné jej z kuponů vhodným způsobem snést a analyzovat.

16 Testování tvorby EPS u S. aureus Kongo červeň přidaná do media

17

18 Health Risks from Microbial Growth and Biofilms in Drinking Water Distribution Systems 2002 U.S. Environmental Protection Agency Office of Ground Water and Drinking Water Standards and Risk Management Division 1200 Pennsylvania Ave., NW Washington DC tml

19 Cílem tohoto dokumentu je přehled: Mikrobů přítomných nebo spojených s biofilmy, které mohou být ohrožením zdraví uživatelů distribučního systému; Typů onemocnění u každého patogenu nebo jeho metabolického produktu ; Dráhy kterými patogeny mohou vstupovat do distribučního systému Faktory ovlivňující přežití a růst patogenů v distribučním systému; Vliv biofilmů na další zdravotní aspekty spojené s distribučním systémem; Vhodná opatření pro omezení rozvoje biofilmu; Vhodné indikátory přítomnosti biofilmu a účinnost jeho kontroly;

20 What is Quorum sensing regulation

21

22 Patogeneze Infekce plic při cystické fibróze (Pseudomonas aeruginosa) Zánět středního ucha Zánět žlučových cest (G střevní tyčinky) Periondotitida (zánět podpůrných tkání zubů) Endokarditida (zánět srdečních chlopní) Keratitida (zánět rohovky) Tvoří se na umělých implantátech, katétrech

23

24 Biofilmy na lékařských implantátech Tab. Příklady některých infekcí způsobených biofilmem asociovaným s implantátem

25 Typy biofilmů V přírodě, biofilmy existují primárně jako komplexy multidruhových společenství bakterií, ve kterých každý druh zaujímá svou ekologickou niku uvnitř biofilmu v souladu se svým metabolismem a morfologií. Povaha těchto vícedruhových biofilmů je daná aktuální přítomností druhů a jakou roli každý druh plní. Např. jeden druh může provádět anaerobní fermentace ve spodních vrstvách, ale v jiném prostředí může využívat aerobní metabolismus, v přítomnosti odlišných sousedících mikrobů.

26 Quorum-sensing

27 Biofilmy urychlují tvorbu rezistentních bakteriálních kmenů

28 Pozitiva a negativa biofilmů Přirozeně utvořené biofilmy redukují přenos tepla ve výměnících tepla a v chladících věžích, znečisťují při reversní osmose membrány, a kontaminují výrobní zařízení potravinářského průmyslu. Vícedruhové biofilmy jsou využívány průmyslově, hlavně při čištění odpadních vod, kde odstraňují organické látky a také těžké kovy. Přítomnost mnoha druhů umožňuje ošetření odpadů o různém složení a kde složení jednotlivých složek kolísá.

29 Dopad biofilmů na průmysl Biofilmy jsou z hlediska ekonomiky problematické. Tvorba biofilmů ztěžuje sterilizační procesy v potravinářském průmyslu. Mikroorganizmy v biofilmech jsou více odolné k desinfekčním látkám, detergentům užívaným k sanitaci apod. Koroze způsobená nasedáním biofilmů představuje velký problém v průmyslu a má dopady na ekonomiku.

30 Biofilmové reaktory Reaktory mohou být jednoduché jako např. batch reaktor, kontinuální míchaný reaktor (CSTR), packed bed reactor (PBR), fluidized bed reactor (FBR), airlift reaktor (ALR), upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reaktor, nebo jiná vhodná konfigurace.

31 Použití biofilmových reaktorů Produktivita těchto reaktorů převyšuje všechny ostatní typy reaktorů. Dobře dokumentovaná je produkce ethanolu, butanolu, kys. mléčné, kys. octové acid/octa, kys. jantarové a fumarové, kromě toho jsou biofilmové reaktory využívané při čištění odpadních vod. Biofilmové reaktory mají vysokou kapacitu pro využití v biotechnologii/biotransformace pro své ekonomické výhody.

32 A Bioethan biofilm airlift suspension and expanded granular sludge blanket (Biobed) reactors at Gist Brocades B Pagues CIRCOX (foreground; 140 m 3 ) and internal circulation (background; 385 m 3 ) reactors at a brewery in Brazil

33 Čištění odpadních vod Dva typy biofilmu jsou využívané : 1) Biofilmy rostoucí na nosičích jako je křída, dřevěné uhlí, pryskyřice,smůla, beton, kostní uhlí, jílové cihličky, nebo písek. Biomasa roste na povrchu všech uvedených částic, velikost částic se nárůstem biofilmu zvětšuje, až na několik mm v průměru. Hustota podpůrných částic je obvykle vyšší než v planktonicky kultivované fermentační půdě. Vzhledem k vyšší hmotnosti tyto biočástice setrvávají v dolní sekci reaktoru. 2) Biofilmy se tvoří jako výsledek tvorby vloček. Tento typ biofilmu je označován jako granulární biofilm a reaktor, kde se tyto biofilmy aplikují je nazýván granulární biofilmový reaktor. Tvorba granulí může trvat několik týdnů až několik měsíců. Buňky bakterií tvoří extracelulární polymerní látky (EPS), které pevně váží buňky k sobě a tak tvoří vločky i větší agregáty.

34 BacLight Live/Dead stain

35 Barvící techniky živých buněk v biofilmu Barvivo obsahuje dvě rozdílná fluorescentní barviva, jedno je SYTO 9 zelené-fluorescentní barvivo nukleové kyseliny, další je červené-fluorescentní barvivo nukleové kyseliny, propidium jodid. SYTO 9 zelené-fluorescentní barvivo barví jak živé tak neživé buňky penetrací přes intaktní i porušenou buněčnou membránu. Avšak, propidum jodid barví pouze buńky s poškozenou membránou, což působí snížení zelené fluorescence v neživotných buňkách. Tedy, když se buňka jeví jako červená, je mrtvá. Když se buňka jeví jako zelená, znamená to, že je živá.

36 Stages of biofilm development

37

38

39

40