Prohlášení: V Praze, Klára Zdařilová

Transkript

1

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Klára Zdařilová

3 Ráda bych na tomto místě poděkovala především své školitelce RNDr. Markétě Janatové PhD. za navržení zajímavého tématu a za cenné rady, ochotu a čas, který mi věnovala během jeho zpracování. Dále bych poděkovala svým přátelům za povzbuzení a praktické rady.

4 Abstrakt Karcinom prsu je nejčastější nádorové onemocnění u žen v České republice. Mutace ve dvou hlavních predispozičních genech, BRCA1 a BRCA2, vysvětlují rozvoj onemocnění pouze u 16 % pacientů s pozitivní rodinnou anamnézou. Gen PALB2 byl objeven v roce 2006 a řadí se mezi tumor supresorové geny. Jeho proteinový produkt hraje významnou roli v opravě dvouřetězcových zlomů DNA mechanismem homologní rekombinace. Interaguje s proteiny BRCA1, BRCA2 a RAD51, umožňuje jejich vstup do reparačního ohniska a spuštění homologní rekombinace. V závislosti na poškození DNA se také podílí na regulaci buněčného cyklu. Funkce proteinu PALB2 je tedy nezbytná pro udržení integrity genomu a při její ztrátě deaktivací genu dochází ke genomové nestabilitě, která může být základem pro rozvoj tumorogeneze. Heterozygotní mutace genu PALB2 zvyšující riziko vzniku karcinomu prsu, byly také prokázány u karcinomu pankreatu a méně často u karcinomu ovaria. Proto je tedy nadějná analýza patogenních variant genu PALB2 u BRCA1/2-negativních pacientek z rodin s mnohočetným výskytem karcinomu prsu, jejíž význam může být v naší populaci srovnatelný s významem analýzy genu BRCA2. komplex Klíčová slova: PALB2, karcinom prsu, homologní rekombinace, reparace DNA, BRCA

5 Abstract Breast cancer is the most common cancer among women in the Czech Republic. Mutations in two major predisposition genes, BRCA1 and BRCA2, account only for 16 % of familial risk of breast cancer. Gene PALB2 was discovered in 2006 as a tumor suppressor. Protein product of PALB2 plays a major role in pathway of DNA repair of double-strand breaks through the homologous recombination mechanism. PALB2 links BRCA1, BRCA2 and RAD51 and is required for their recruitment to DNA damage foci and initiate homologous recombination. In a response of DNA damage PALB2 participates on regulation of the cell cycle. Protein function of PALB2 is necessary to maintain the integrity of the genome and in case of loss this function, because of the gene inactivation, it leads to genomic instability, which may be the basis for the development of tumorogenesis. Heterozygous mutations in PALB2 increase the risk of breast cancer predisposition, these mutations has been demonstrated even in pancreatic cancer and less often in ovarian cancer. Therefore, it is important to analyze truncating mutations in the PALB2 gene in BRCA1/2-negative patients from families with a strong history of hereditary breast cancer. The frequency of PALB2 mutations may be comparable to the frequency of mutations in the BRCA2 gene in Czech hereditary breast cancer families. complex Key words: PALB2, breast cancer, homologous recombination, DNA repair, BRCA

6 Obsah 1 Úvod Geny zodpovědné za vznik rakoviny Poškození DNA Homologní rekombinace Nehomologní spojování konců (NHEJ) Gen PALB Lokalizace a struktura genu PALB Struktura proteinu PALB Funkce genu PALB2 a jeho proteinového produktu Interakce s proteinem BRCA Interakce s proteinem BRCA Interakce s proteinem RAD Interakce s proteinem MRG Interakce s proteinem KEAP Vlastní interakce přes coiled-coil motiv Regulace G2 kontrolního bodu buněčného cyklu Shrnutí funkce genu PALB Role PALB2 při vzniku různých onemocnění PALB2 a Fanconiho anémie PALB2 a karcinom prsu PALB2 a jiné druhy nádorových onemocnění Závěr Seznam zkratek Citovaná literatura... 22

7 1 Úvod Karcinom prsu je nejčastějším typem rakoviny, vyskytující se především u žen. Z % vzniká na základě náhodných somatických mutací v buňkách prsní žlázy. U 5-10 % procent žen dochází ke vzniku karcinomu na základě mutace v genech predisponujících ke vzniku hereditární formy rakoviny prsu (Pohlreich et al., 2012). Prvními objevenými geny zodpovědnými za vznik karcinomu prsu byly geny BRCA1 (Miki et al., 1994) a posléze gen BRCA2 (Wooster et al., 1995). Tyto geny jsou řazeny do rodiny tzv. vysoce penetrantních genů. Pro nosičky mutací v těchto dominantních genech je charakteristický časný nástup rakoviny prsu, popřípadě ovaria v nižším věku oproti populačnímu riziku a nezřídka se v rodinách s tímto postižením vyskytují i jiné typy nádorových onemocnění, jako jsou rakovina slinivky, prostaty, melanom atd. (Thompson et al., 2002). Přestože mutace v hlavních predispozičních genech BRCA1 a BRCA2 objasňují dohromady asi 16 % případů karcinomu prsu (Anglian Breast Cancer Study Group, 2000), stále zbývá většina rodin s výskytem onemocnění, kde jsou za vznik karcinomu zodpovědné mutace v jiných genech než BRCA1 a BRCA2. U dalších asi 4 % (Antoniou and Easton, 2006) případů onemocnění jsou za tumorogenezi dohromady zodpovědné geny jako p53, PTEN, STK11, CDH1, které jsou součástí rozsáhlejších syndromů, se zvýšeným rizikem výskytu jiných patologií jako: Li-Fraumeni syndrom, Cowdenův syndrom atd. U zbylých rodin s dědičnou formou karcinomu prsu bývá za vznik onemocnění zodpovědná buď kombinace velmi častých nízko-penetrantních alel nebo mutace středně-penetrantních genů jako ATM, CHEK2, PALB2, BRIP1 (Walsh and King, 2007) nebo RAD51C (Meindl et al., 2010). Většina genů, jež se podílejí na vzniku hereditárních forem karcinomu prsu, kóduje proteiny účastnící se v procesech důležitých pro opravy poškozené DNA, především při reparaci dvouřetězcových zlomů. Bialelické mutace v některých z těchto genů zároveň způsobují Fanconiho anémii. 2

8 2 Geny zodpovědné za vznik rakoviny Vznik rakovinného bujení může mít mnoho příčin. Podílejí se na něm jak genetické, tak negenetické faktory. Mezi zodpovědné geny řadíme ty, které mají souvislost s kontrolou buněčného dělení, nebo geny související s opravou poškozené DNA. V buňkách se vyskytují dva typy genů, jejichž aktivita nebo naopak neaktivita může vést k rozvoji rakovinného bujení (Schulz, 2007). První skupinu tvoří tumor supresorové geny, jejichž nejdůležitější funkcí je kontrola buněčného dělení, jsou tzv. antiproliferační. Tyto geny jsou recesivní a k rozvoji tumorogeneze je zapotřebí mutace v obou jejich alelách. Jedinci, kteří zdědili jednu alelu mutovanou, jsou heterozygoti, a dojde-li ke ztrátě druhé alely, dochází ke vzniku onemocnění. Tento proces se projevuje jako ztráta heterozygozity mikrosatelitových markerů (LOH loss of heterozygosity) a u těchto pacientů k výskytu rakoviny dochází častěji a v nižším věku než u zdravých jedinců. Mezi tyto geny patří retinoblastomový gen (RB), jehož hlavní úlohou je regulace přechodu mezi G1 a S fází buněčného cyklu. Při deleci RB genu není tento přechod regulován, a dochází tak k nadměrné proliferaci buněk. Dalším tumor supresorovým genem je p53, který se aktivuje při poškození DNA a aktivuje geny zodpovědné za pozastavení buněčného cyklu. Zároveň také iniciuje apoptózu, nebyla-li reparace DNA úspěšná. Dalšími geny, které jsou zodpovědné za vznik rakoviny, jsou onkogeny. Onkogeny vznikají z protoongenů, což jsou běžné geny kódující proteiny, jejichž funkce je především v regulaci buněčného růstu a diferenciaci. Dojde-li např. k bodové mutaci v protoonkogenu, zvýšení počtu protoonkogenů, translokaci do transkripčně aktivního místa nebo ke vzniku chimérického genu v důsledku chromozomální přestavby, vznikne onkogen, který několikanásobně zvýší expresi nebo aktivitu proteinu. Onkogeny se od tumor supresorových genů zásadně liší v mezialelových interakcích. Zatímco tumor supresorový gen je recesivní, onkogeny jsou dominantní a k rozvoji rakovinného onemocnění stačí pouze jedna mutovaná alela. Příkladem protoonkogenu je KRAS gen, jehož proteinový produkt spadá do rodiny ras proteinů. Tento protein je schopen vázat GTP a funguje jako buněčný spínač, jenž je 3

9 zodpovědný za aktivaci a inaktivaci buněčné signalizace vedoucí k buněčnému růstu a proliferaci. Zvláštní podskupinu tvoří geny zodpovědné za opravu poškozené DNA a geny kontrolních bodů. Poruchy reparačních mechanismů jsou totiž jedny z nejčastějších příčin karcinogeneze. Při špatné funkci některého genu účastnícího se reparace poškozené DNA se neopravená DNA hromadí v buňkách, což může vést ke špatné funkci jiných důležitých genů. S mutacemi v těchto genech jsou spojena vzácná dědičná onemocnění, jako např. některé recesivní syndromy chromozomální nestability (ataxie-teleangiektazie gen ATM, Fanconiho anémie skupina FANC genů) nebo dominantní familiární nádorové syndromy (karcinom prsu a ovaria geny BRCA1 a BRCA2). 3 Poškození DNA Na každou buňku v lidském těle připadá přibližně poškození, což znamená, že má-li zdravý jedinec buněk, v těle se odehraje kolem oprav denně (Friedberg et al in Schärer 2003). DNA je napadána radikály, a ty mohou spolu s vnějšími vlivy jako UV záření, rentgenové záření nebo chemické látky způsobovat poškození DNA. Tyto faktory vedou ke vzniku různých aberací DNA vlákna. Dvouřetězcové zlomy nejsou v buňce tak časté, přibližně 8 zlomů za den, ale zato jsou nejvíce toxické a to především pro dělící se buňky (Poumpouridou and Kropis, 2012). Při buněčném cyklu dvouřetězcový zlom separuje fragmenty DNA z centromery, což vede k její úplné ztrátě během mitózy. Navíc může docházet k rekombinaci volných konců s ostatními částmi genomu, a to ve výsledku může vést až k buněčné smrti (Schulz, 2007). Existují dva mechanismy opravy dvouřetězcových zlomů. Častější je mechanismus nehomologního spojování konců tzv. NHEJ. Tento mechanismus je ovšem velmi náchylný k chybám. Druhým velice přesným, avšak o to více pro buňku náročným, je mechanismus homologní rekombinace (HR). Mechanismus oprav spočívá v aktivaci celé řady signálních drah, které jsou spuštěny jako odpověď na genotoxický stres. Odpověď spočívá v detekci 4

10 poškození DNA, signalizaci jeho přítomnosti a spuštění opravy. Zahrnuje také aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu, vedoucí k jeho pozastavení, které je důležité pro opravy poškozené DNA, aby genetické chyby nebyly předány další generaci. 4 Homologní rekombinace Při poškození DNA je dvouřetězcový zlom nalezen MRN komplexem (trimérní komplex MRE11, RAD50 a NBS1), který se váže na DNA do těsné blízkosti zlomu. V dalším kroku se na MRN komplex naváže endonukleáza a helikáza, které zajistí sestřih 5 vlákna a vznik 3 přesahu. K 3 jednořetězcovým přesahům má vysokou afinitu replikační protein A (RPA protein), který se na ně váže a brání spárování jednořetězcového vlákna nebo vytváření sekundárních struktur. Protein BRCA2 je klíčovým proteinem pro lokalizaci a funkci proteinu rekombinázy RAD51, a to tak že navádí rekombinázu do jádra buňky, kde tato rekombináza obepíná jednořetězcovou DNA (West and Stephen, 2003). Poté RAD51 oligomerizuje a vytváří vlákno z nukleové kyseliny a proteinu na jednořetězcovám přesahu. Tento nukleoprotein je schopen najít DNA sekvence identické k sekvencím 3 přesahu na nepoškozené sesterské chromatidě. Po nalezení těchto sekvencí napadne jednovláknový 3 přesah nukleoproteinu nalezenou dvoušroubovici DNA. Dochází k invazi ramen, DNA polymeráza začne prodlužovat 3 konec vlákna a dochází ke vzniku Hollidayovy struktury a rekombinaci (Obrázek č. 1). Vzhledem k potřebě sesterské chromatidy jako templátu probíhá HR výhradně v S a G2 fázi buněčného cyklu. 5

11 Obrázek č. 1: Schematické znázornění mechanismu reparace dvouřetězcových zlomů mechanismem homologní rekombinace. Převzato z (Pastink et al. 2001). Jiným typem poškození jsou ICLs (interstrand crosslinks) způsobené chemickými látkami jako alkylačními činidly, mytomycinem C atd. K jejich opravě je také zapotřebí homologní rekombinace. ICL poškození je detekováno takzvanou ATR cestou prostřednictvím FANCM helikázy a AP24 proteinem a poté se pomocí FANCA, -G, -F, -C, -B, AP100, -E a -L proteinů vytváří FA jaderný komplex (Moldovan and D Andrea, 2009). Po sérií ubikvitinací FANC proteinů je FA jaderný komplex odstraněn a FANCD2 a FANCI doplňují proteiny homologní rekombinace. Bialelické mutace proteinů podílejících se na opravě ICLs zlomů způsobují různé formy Fanconiho anémie. Z celkového počtu 15 druhů Fanconiho anémie, je nejčastější FANCA (66 %) následováno FANCC (10 %) a FANCG (9 %). (Zhang et al., 2012) 5 Nehomologní spojování konců (NHEJ) Nehomologní spojování konců neboli NHEJ (non-homologous end joining) je další možný způsob opravy dvouřetězcových zlomů DNA. Tento proces je buňkou využíván častěji, a to 6

12 především v G1 fázi buněčného cyklu, kdy DNA ještě není replikován, a velmi obtížně by tak probíhala homologní rekombinace. Zároveň je mechanismus nehomologního spojování konců méně náročný, a to jak energeticky, tak co do počtu zúčastněných proteinů. Zjednodušeně tento proces probíhá tak, že buňka spojí neboli zliguje konce DNA vlákna. Celý mechanismus začíná rozpoznáním dvouřetězcového zlomu heterodimerním Ku proteinem, který má DNA vazebnou doménu, přes kterou se naváže na konce zlomu a přemostí mezeru. Ku protein aktivuje protein DNA-PKcs, který poté přivádí a aktivuje další důležitou součást procesu - specifickou ligázu IV v asociaci s proteinem XRCC4 zajišťující spojení konců (Obrázek č. 2). Za určitých okolností mohou být spojeny i konce nekomplementárních vláken. Obrázek č. 2: Schematické znázornění mechanismu reparace dvouřetězcových zlomů mechanismem nehomologního spojování konců (NHEJ). Převzato z (Pastink et al., 2001). 7

13 6 Gen PALB2 6.1 Lokalizace a struktura genu PALB2 PALB2 (ID#79728, OMIM#610355), celým názvem Partner And Localizer of BRCA2, náleží do rodiny FANC genů. Gen PALB2 byl objeven v roce 2006 (Xia et al., 2006) a dnes je znám jako další gen zodpovědný za vznik karcinomu prsu. Tento gen je lokalizován na krátkém p raménku chromozomu 16 v pozici 12.1 (Obrázek č. 3), kde zaujímá oblast o velikosti 38,2 Kb a skládá se ze 13 exonů. Velikost exonů 4 a 5 je několikanásobně větší než velikosti zbylých exonů, společně kódují téměř 65 % z celého proteinu. Kódující oblast je transkribována do mrna o velikosti přibližně 3,5 kb. Obrázek č. 3: Schematické znázornění lokalizace genu PALB2 na krátkém p raménku chromozomu 16. Převzato z ( 6.2 Struktura proteinu PALB2 Gen PALB2 kóduje protein o aminokyselinách a velikosti 131 KDa. Na N-konci proteinu je tzv. coiled-coil motiv v rozsahu 9 44 aminokyselin a na C-konci je série WD40 repetic (repetice bohaté na tryptofan a kyselinu asparagovou) v rozsahu aminokyselina (Obrázek č. 4). Oba tyto motivy patří mezi konzervované motivy podílející se na protein-proteinových interakcích. Přes coiled-coil motiv se váže PALB2 na coiled-coil motiv pre-brct domény BRCA1 proteinu (Sy et al., 2009). U této domény se dříve 8

14 předpokládalo, že je určená k navázání BRCA2 (Chen et al., 1998). Struktura C-koncové části proteinu byla detailně krystalograficky popsána. Je složena do struktury takzvané sevenbladed-propeller a slouží k interakci s N-koncem proteinu BRCA2 (Obrázek č. 4). Sedmý blade neboli lopatka je tvořena A, B a C řetězci z C-konce celé struktury a řetězec D je dodán z N-konce. To zajišťuje uzavření celé domény, což je důležité pro stabilitu celého proteinu a vysvětluje tak patogenitu mutace c.3459c/g, p.y1183x, která zkracuje protein pouze o poslední čtyři aminokyselinové zbytky (Reid et al., 2007). Absence těchto zbytků narušuje tvorbu slabých vodíkových interakcí v sedmé lopatce a špatně složený protein je pravděpodobně rychle degradován. Obrázek č. 4: Navržená struktura sbalené C-koncové části proteinu PALB2. Řetězce A, B a C u 7 lopatky jsou z C- konce domény a řetězec D je dodán z N- konce, což umožní uzavření celé domény. Převzato z (Oliver et al., 2009). Kromě těchto domén se na proteinu PALB2 nachází také dvě DNA vazebné domény (Buisson et al., 2010), dvě domény které přímo interagují s proteinem RAD51 (Dray et al., 2010) a tzv. ChAM doména (Chromatin Association Motif), která je situována uprostřed proteinu a slouží k lokalizaci na chromatinu (Bleuyar et al., 2012) (Obrázek č. 5). 9

15 Obrázek č. 5: Schematické znázornění struktury proteinu PALB2 s vyznačenými dvěma DNA doménami, WD40 doménou na C-konci, coiled-coil (znázorněna jako CC) motivem na N-konci, ChAM doménou a dvěma vazebnými doménami pro proteiny KEAP1 a MRG15. Převzato z (Buisson and Masson, 2012). 7 Funkce genu PALB2 a jeho proteinového produktu 7.1 Interakce s proteinem BRCA2 Poprvé byl protein PALB2 objeven v roce 2006 jako součást BRCA2 komplexu (Xia et al., 2006). Protein BRCA2 je klíčový pro lokalizaci a funkci rekombinázy RAD51, která zajišťuje párování homologních vláken DNA během rekombinace (West and Stephen, 2003). PALB2 se váže přes C-konec na N-konec BRCA2 proteinu v oblasti aminokyseliny, kde byly také nalezeny patogenní missense mutace (Xia et al., 2006). Samotná interakce je zprostředkována aminokyselinami tryptofanem 31, fenylalaninem 32 a leucinem 35, které tvoří krátký α-helix ve struktuře proteinu BRCA2. Tento α-helix je při spojení s PALB2 proteinem zanořen do jeho hydrofobní kapsy tvořené aminokyselinovými zbytky (Val1019, Met1022, Ala1025, Ile1037, Leu1046, Lys1047, Leu1070, Pro1097 a Lys1098). Toto spojení je uskutečněno díky polárním vazbám a vodíkovým můstkům mezi aminokyselinami proteinu BRCA2 a PALB2 (Oliver et al., 2009) (Obrázek č. 6). 10

16 Obrázek č. 6: Znázornění vazby krátkého α-helixu na N-konci proteinu BRCA2 (purpurová barva) přes hydrofobní kapsu mezi 4 a 5 lopatkou na proteinu PALB2. Převzato z (Oliver et al., 2009). Patogenní mutace narušující funkční interakci PALB2 s proteinem BRCA2 vedou ke ztrátě funkce BRCA2. PALB2 je nezbytný pro správnou a stabilní jadernou lokalizaci BRCA2, váže ho na jaderné struktury, a tak umožňuje jeho další jaderné funkce v opravě dvouřetězcových zlomů pomocí homologní rekombinace (Xia et al., 2006). PALB2 je tedy nezbytný pro BRCA2- zprostředkovanou lokalizaci proteinu RAD51 do jádra a jeho oligomerizaci v reparačních ohniscích (Buisson et al., 2010). 7.2 Interakce s proteinem BRCA1 Protein BRCA1, podobně jako BRCA2, hraje významnou funkci v signalizaci poškození DNA a regulaci oprav dvouřetězcových zlomů pomocí homologní rekombinace (Roy et al., 2011). Přestože se oba proteiny účastní stejné opravné dráhy, mechanismus jejich interakce nebyl dlouho znám. Po objevení proteinu PALB2 tři různé studie potvrdily, že právě PALB2 fyzicky spojuje BRCA1 a BRCA2 do společného komplexu (Sy et al., 2009; Zhang et al., 2009; Zhang et al., 2009). Interakce mezi PALB2 a BRCA1 vzniká stejně jako s BRCA2 v jádře a je nezávislá na vytvoření dvouřetězcového zlomu, dochází k ní permanentně. BRCA1 a PALB2 jsou spojeny přes své coiled-coil motivy. Jak již bylo zmíněno, interakce PALB2 je důležitá pro lokalizaci BRCA2 do místa zlomu, ale tento krok by nemohl být učiněn, pokud by PALB2 11

17 zároveň neinteragoval s BRCA1. Zkrácený protein BRCA1, bez C-konce s BRCT doménou způsobuje velmi špatnou vazbu komplexu BRCA1/PALB2/BRCA2 do místa zlomu. Z toho vyplývá, že BRCA1 je nejdůležitějším z těchto proteinů pro vytvoření komplexu, nalezení místa zlomu a je tzv. upstream regulátorem (Zhang et al., 2009) (Obrázek č. 7). Obrázek č. 7: Znázornění vazby mezi proteiny BRCA1-PALB2-BRCA2 a RAD51 během homologní rekombinace. PALB2 protein se přes svůj N-konec váže na BRCA1 protein, který už je navázán do místa dvouřetězcového zlomu na DNA. Poté přes C-konec váže BRCA2 protein s navázanou rekombinázou RAD51 a je iniciována homologní rekombinace. Převzato z (Zhang et al., 2009). 7.3 Interakce s proteinem RAD51 Protein PALB2 mimo jiné interaguje přímo s proteinem RAD51, podporuje vznik jeho filament na jednořetězcové DNA, a tím stimuluje vznik invazivního vlákna a vytvoření D- smyčky během homologní rekombinace, pravděpodobně překonáním supresivního působení 12

18 RPA (Buisson et al., 2010; Dray et al., 2010). Z tohoto je patrné, že PALB2 není pouze důležitý pro lokalizaci proteinu BRCA2 do reparačního místa, ale je zároveň důležitým regulátorem rekombinázy RAD Interakce s proteinem MRG15 Na proteinu PALB2 se nalézá vazebná doména pro MRG15 protein. Tento vysoce konzervovaný protein obsahuje chromodoménu, která se specificky váže na metylovaný lysin histonu H3 (Zhang et al., 2006) histon acetylázy nebo histon deacetylázy. Jeho hlavní úloha je v remodelaci chromatinu a v regulaci transkripce (Tominaga et al., 2005). Další studie ukázala, že protein MRG15 interaguje s BRCA komplexem, a to přímo s proteinem PALB2, a je důležitý pro přivedení BRCA2, PALB2 a RAD51 do míst poškození DNA při homologní rekombinaci. Navázání proteinu MRG15 na PALB2 umožňuje vyšší afinitu PALB2 proteinu k chromatinu. Autoři navrhují, že interakce MRG15 s PALB2 je nezbytná pro přivedení BRCA komplexu do míst poškození DNA, kde je chromatin relaxován po acetylaci histonu. Protože pro přesné cílování PALB2 do místa poškození je nezbytný BRCA1, MRG15 pravděpodobně udává pouze afinitu PALB2 ke chromatinu (Hayakawa et al., 2010) (Obrázek č. 8). Obrázek č. 8: Schematické znázornění vazby proteinu MRG15 na protein PALB2 a BRCA komplex během opravy poškození DNA homologní rekombinací. Převzato z (Hayakawa et al., 2010). 7.5 Interakce s proteinem KEAP1 KEAP1 je senzor oxidativního stresu v jádře, bohatý na cystein, který váže a potlačuje hlavní antioxidační transkripční faktor NRF2. Oxidativní stres v buňce nastává, když hladina 13

19 kyslíkových radikálů (ROS) přesáhne obranyschopnost buňky. V tomto případě NRF2 aktivuje expresi genů obsahujících ARE (antioxidant response elements), které dokáží zmírnit poškození vyvolané oxidačním stresem a udržet stabilní redoxní prostředí v buňce (Taguchi et al., 2011). Za normálních podmínek v buňce KEAP1 váže NRF2 a funguje jako E3 ubikvitin ligáza, která směruje NRF2 k ubikvitinaci a degradaci (Cullinan et al., 2004). Bylo zjištěno, že KEAP1 přímo interaguje s proteinem PALB2, který má vazebný motiv pro tento senzor stejný jako transkripční faktor NRF2. V jádře se tak může při oxidačním stresu PALB2 protein vázat na KEAP1 a zabránit vazbě KEAP1 na NRF2. Tím je zabráněno degradaci transkripčního faktoru NRF1 a je podpořeno jeho hromadění v jádře a správná funkce. Kromě toho je také PALB2 schopen regulovat export NRF2 transkripčního faktoru z jádra (Ma et al., 2012). Tato asociace je také zajímavá tím, že oxidační stres je znám jako spouštěč mnoha onemocnění, včetně rakoviny a Fanconiho anémie (Pang and Andreassen, 2009). 7.6 Vlastní interakce přes coiled-coil motiv Jak bylo řečeno, coiled-coil motiv na N-konci proteinu PALB2 je nezbytný pro navázání proteinu BRCA1. Nedávné studie však ukazují i jinou funkci této domény. Tato část může být také zodpovědná za regulaci vlastní asociace, a tím homologní rekombinace. Monomerický PALB2 daleko účinněji váže DNA a napomáhá formaci RAD51 filament. Na druhé straně zvýšená exprese coiled-coil motivu negativně ovlivňuje vazbu RAD51 do míst zlomu. Kontrola homologní rekombinace může tedy probíhat skrz PALB2 a to tak, že záleží na stavu, kdy PALB2 interaguje sám se sebou nebo kdy je navázán na BRCA1. Bez poškození DNA PALB2 dimerizuje sám se sebou a udržuje minimální funkci BRCA2 v homologní rekombinaci. Po poškození DNA PALB2 disociuje, a může tak interagovat s BRCA1 a BRCA2 pro vytvoření jejich komplexu, který dále umožňuje lokalizaci RAD51 a spuštění homologní rekombinace. Tak může být celý proces regulován (Buisson and Masson, 2012). 7.7 Regulace G2 kontrolního bodu buněčného cyklu Během buněčného cyklu může docházet k různým poškozením, zvláště při replikaci DNA. Jedním z nejčastějších typů poškození je vznik dvouřetězcových zlomů. Při takovémto 14

20 poškození jsou během S fáze buněčného cyklu spuštěny signální kaskády, které vedou k zastavení buněčného cyklu a následné opravě poškození. Důležitým bodem tohoto procesu je G2 kontrolní bod. Během G2 fáze se zvyšuje exprese cyklinu B a tvorba komplexu s cyklin dependentní kinázou 1 (cyklin B/cdk1), který je zodpovědný za přesun buněčného cyklu z G2 fáze do M fáze neboli mitózy. Při poškození DNA je tento komplex deaktivován. Po opravení poškození dojde k aktivaci cyklin B/cdk1 a buněčný cyklus pokračuje (van Vugt et al., 2005). Funkce proteinů účastnících se kontroly kontrolního bodu musí být přesně koordinována s funkcí proteinů účastnících se přímo oprav DNA. Po poškození DNA radioaktivním zářením a umlčení genů PALB2 a BRCA2 pomocí sirna bylo zjištěno, že buňky překonaly zastavení v G2 kontrolním bodu, tím že ho inaktivovaly dříve, než došlo k dokončení opravy. Protein PALB2 tedy může mít vliv na udržení aktivního kontrolního bodu G2. Tato funkce může také přispívat k jeho funkci jako nádorového supresoru (Menzel et al., 2011). 7.8 Shrnutí funkce genu PALB2 PALB2 je tumor supresorovým genem, jehož hlavní úloha je v procesu homologní rekombinace. Proteinový produkt genu PALB2 je součástí endogenního BRCA2-komplexu. Tento komplex se formuje během homologní rekombinace, kdy se na PALB2 naváže BRCA1, a tím umožní lokalizaci BRCA2 do reparačního místa (Turner et al., 2005). Na BRCA2 se poté může navázat RAD51 (8 molekul RAD51 se váže na 8 BRC repetitivních domén na BRCA2) (Obrázek č. 9). Při výpadku jedné ze tří proteinových domén, coiled-coil domény, WD40 domény a ChAM domény, dochází ke špatnému formování RAD51 v místě dvouřetězcového zlomu. Při výpadku domény je také zvýšena citlivost buněk k mitomycinu C, který způsobuje ICLs (interstrandcrosslinks) a následný kolaps replikační vidličky (Sy et al., 2009). Nedávné studie také ukazují, že stejně jako BRCA2 je i PALB2 schopen přímo se navázat na RAD51 a stimulovat jeho funkci (Buisson et al., 2010; Dray et al., 2010). Mezi další pravděpodobné funkce patří regulace G2 kontrolního bodu buněčného cyklu nebo regulace buněčné redoxní homeostázy. Všechny tyto procesy jsou důležité pro normální fungování buňky a jejich ztráta inaktivací genu PALB2 může vést ke ztrátě jeho tumor supresorové funkce, destabilizaci genomu a predisponuje k nádorové transformaci. 15

21 Obrázek č. 9: Modelové znázornění role PALB2 během procesu homologní rekombinace. (A) Formace BRCA komplexu při opravě dvouřetězcového zlomu v DNA. BRCA1 protein nalezne místo zlomu a váže se do něj. PALB2 disociuje a interaguje s proteiny BRCA1 a vzápětí s BRCA2, který váže rekombinázu RAD51 a za pomocí PALB2 ho navádí do místa zlomu (B) Interakce BRCA komplexu s vláknem DNA. PALB2 přímo interaguje s RAD51, podporuje vznik jeho filament a zároveň se podílí na vytvoření D-smyčky. Převzato z (Buisson and Masson, 2012). 16

22 8 Role PALB2 při vzniku různých onemocnění Gen PALB2 je tumor supresorový gen, jenž se podílí hlavně na správném průběhu oprav dvouřetězcových zlomů DNA a jeho správná funkce přispívá ke genomové stabilitě. V opačném případě, při jeho nesprávné funkci, dochází k narušení genomové stability způsobené poruchami DNA reparačních pochodů. To může mít za následek tvorbu řady geneticky nestabilních dceřiných buněk, tolerujících další defekty postihující regulační mechanismy, a tím pádem rozvoj různých onemocnění. Monoalelické mutace jsou u nosičů příčinou dědičné predispozice k nádorovému onemocnění, a to především karcinomu prsu. Bialelické mutace způsobují rozvoj Fanconiho anémie podtypu N (FANCN) (Xia et al., 2007). 8.1 PALB2 a Fanconiho anémie Fanconiho anémie je vzácné recesivní onemocnění způsobené zárodečnými mutacemi v genech regulujících odstranění ICLs. Toto onemocnění je charakteristické růstovou retardací, vrozenými malformacemi, poškozením kostní dřeně a predispozicí pro vznik různých malignit v dětském věku (Kutler et al., 2003). Na buněčné úrovni je charakterizována zvýšeným výskytem chromozomálních aberací a hypersenzitivitou k činidlům způsobujícím vznik ICLs (mytomicin C, diepoxybutan). Fanconiho anémie jsou rozděleny do 15 skupin. Každá z těchto skupin se liší genem, jehož bialelická mutace způsobuje vznik tohoto onemocnění. Jejich proteinové produkty se podílejí na společné dráze signalizující poškození DNA, tzv. FA-BRCA cesta, která úzce spolupracuje s dalšími opravnými mechanismy na odstranění ICLs během replikace (Kee and D'Andrea, 2010). Gen BRCA2 je znám jako jeden z hlavních predispozičních genů zodpovědných za vznik karcinomu prsu. Známé jsou také jeho bialelické mutace, projevující se vznikem Fanconiho anémie subtypu FANCD1. Po objevení genu PALB2 jako funkčního partnera genu BRCA2, také s funkcí v homologní rekombinaci, byly krátce nato prokázány jeho patogenní bialelické mutace u FA pacientů (Xia et al., 2007). U genu PALB2 se jedná o nový subtyp N (FANCN) a je zde fenotypová podobnost s podtypem FANCD1 (Reid et al., 2007). 17

23 8.2 PALB2 a karcinom prsu Krátce po objevu genu PALB2 jako interakčního partnera BRCA2 s obdobnou funkcí a díky fenotypové podobnosti FA pacientů nosičů bialelických mutací v obou genech, bylo možno předpokládat, že heterozygotní mutace genu PALB2 by mohly stejně jako u genu BRCA2 zvyšovat riziko vzniku karcinomu prsu. První studie následně objevila pět různých mutací u deseti pacientek ve skupině 923 případů s hereditárním karcinomem prsu (Rahman et al., 2007). Později byly patogenní mutace nalezeny v různé míře ve většině testovaných populací s rakovinou prsu napříč celým světem. Mutační analýzy genu PALB2 u vysoce rizikových rodin, které jsou BRCA1 a BRCA2 negativní, vykazují frekvenci 0,6 3,4 % (Casadei et al., 2011). Jako patogenní byly klasifikovány nonsense mutace, posunové mutace a sestřihové mutace s posunem čtecího rámce. Význam missense variant zůstává nejasný (Hellebrand et al., 2011). Velká genomová přestavba byla také nalezena u španělské rodiny s výskytem hereditární formy karcinomu prsu (Blanco et al., 2012). Přesto jsou tyto přestavby považovány za velmi vzácné a u dalších studií se je nepodařilo znovu potvrdit (Pylkäs et al., 2008). Frekvence patogenních mutací genu PALB2 v rámci pilotní studie v České republice je relativně vysoká, dosahuje hodnot až 3,1 % (Pohlreich et al., 2012). Dosud nalezené mutace se vyskytují v celé oblasti genu a nevykazují místa se zvýšenou akumulací alterací, tzv. hot-spots. Do současné doby byla charakterizována řada opakujících se populačně-specifických variant genu PALB2, které jsou unikátní pro daný geografický region, tzv. founder mutace. Patrné je to u Finů a francouzských Kanaďanů. U finské populace byla zjištěna zvýšená frekvence výskytu posunové mutace c.1592delt. (Erkko et al., 2007), ve francouzsko-kanadské populaci byla nalezena opakující se nonsense mutace c.2323c/t (Foulkes et al., 2007). Relativní riziko vzniku karcinomu prsu u nosiček mutace v genu PALB2 bylo zpočátku odhadnuto na 2,3 (Rahman et al., 2007). V následujících pracích bylo popsáno riziko vyšší (2,3 6,1) (Erkko et al., 2008). U australské populace bylo dokonce riziko pro nosičky mutace c.3113g>a spočítáno na 30,1. Tato hodnota odpovídá riziku u nosiček mutace v genu BRCA2 (Southey et al., 2010). Tyto výsledky potvrzují, že gen PALB2 je řazen do skupiny středněpenetrantních genů, ale v porovnání s ostatními geny této skupiny je patrné, že PALB2 je 18

24 středně-penetrantní gen vyššího řádu. Díky malému počtu dosud studovaných neselektovaných případů je odhad penetrance problematický, a vzhledem k neúplné segregaci mutací genu PALB2 s nádorovým fenotypem by měl být klinický význam těchto variant předmětem podrobnějších studií v každé populaci. 8.3 PALB2 a jiné druhy nádorových onemocnění Kromě karcinomu prsu u žen zvyšují mutace genu BRCA2 u nosičů riziko vzniku karcinomu prsu u mužů, karcinomu ovaria, prostaty a pankreatu, s čímž roste pravděpodobnost, že nosiči PALB2 mutace by mohli mít také zvýšené riziko vzniku těchto nádorových onemocnění. Mutace genu PALB2 byla nalezena u 1 % pacientů v populaci s výskytem rakoviny prsu u mužů (Silvestri et al., 2010). Dále v roce 2009 byla zjištěna možná souvislost mutací PALB2 genu se vznikem rakoviny pankreatu (Jones et al., 2009). Za tímto účelem byla provedena rozsáhlá studie, kde byly nalezeny mutace, nejčastěji zkrácené verze proteinu PALB2. Tyto mutace byly nalezeny ve 3 4 % pacientů s karcinomem pankreatu jak u evropských, tak u amerických rodin (Slater et al., 2010). Zvýšení rizika vzniku karcinomu ovaria u nosičů mutace genu PALB2 zatím není zcela jasné, mutace byla zatím popsána pouze u malého počtu pacientů (0,4 a 0,6 %) ve dvou studiích (Dansonka-Mieszkowska et al., 2010; Prokofyeva et al., 2012). Pouze jedna mutace byla dosud popsána u pacienta s karcinomem prostaty (Erkko et al., 2007). 19

25 9 Závěr Protein PALB2 byl objeven jako funkční partner proteinu BRCA2, který kontroluje lokalizaci BRCA2 proteinu do jádra, jeho stabilitu, má roli v homologní rekombinaci a funkci v udržení aktivního G2 kontrolního bodu při poškození DNA během buněčného cyklu (Xia et al., 2006). Krátce po jeho objevení bylo zjištěno, že mutovaná zkrácená verze proteinového produktu tohoto genu je zodpovědná za rozvoj rakoviny prsu (Rahman et al., 2007) a zároveň je také proteinem Fanconiho anémie subtypu N (FANCN) (Reid et al., 2007). Později byl také dán do souvislosti s rozvojem hereditární formy rakoviny pankreatu a po genu BRCA2 je druhým nejčastěji mutovaným genem v rodinách s dědičnou formou tohoto onemocnění (Jones et al., 2009). V dnešní době jsou mutace v tomto genu, především zkrácené verze proteinu, známy v různé frekvenci v populacích po celém světě, kde způsobují střední až relativně vysoké riziko rozvoje rakoviny prsu (Southey et al., 2010). V České republice byly nalezeny mutace v tomto genu až u 3,1 % rodin s dědičnou formou rakoviny prsu (Pohlreich et al., 2012), proto je mu věnována větší pozornost. Samotný protein PALB2 má několik vazebných domén, přes které interaguje s DNA nebo s proteiny, jejichž role je v opravě poškození DNA homologní rekombinací. Je součástí BRCA1-PALB2-BRCA2-RAD51 komplexu nezbytného pro rozpoznání míst poškození DNA a spuštění homologní rekombinace, podílí se také na regulaci G2 kontrolního bodu buněčného cyklu po poškození DNA (Menzel et al., 2011) nebo odpovědi buňky na oxidativní stres (Ma et al., 2012). Přestože tento gen spadá do skupiny středně-penetrantních genů, které se vyznačují menším rizikem onemocnění, společně se nízko-penetrantní a středně-penetrantní geny vyznačují vysokou frekvencí, a tím je umožněn kooperativní účinek těchto alel, což může být příčinou zvýšeného rodinného výskytu nádorových onemocnění (Pohlreich et al., 2012). Studie těchto středně-penetrantních genů, jako je gen PALB2, umožňuje zařazení onkologických pacientů do specializovaných programů pro časnou diagnostiku či uplatnění speciálních léčebných postupů. Zároveň je také možná prevence zdravých jedinců v rodinách s dědičným výskytem těchto alterací. 20

26 10 Seznam zkratek ATM Ataxia-telangiectasia mutated kinase (kináza indukovaná DNA poškozením) ATR Ataxia-telangiectasia and RAD-3 related (kináza fungující jako senzor poškození DNA) ARE Antioxidant response elements (antioxidační responzivní elementy) BRCA1 Breast cancer 1 (gen rakoviny prsu 1) BRCA2 Breast cancer 2 (gen rakoviny prsu 2) BRIP1 BRCA1- interancting protein 1 (interakční protein BRCA1) CDH1 Cadherin 1, type 1, E-cadherin (kadherin 1 typu 1, E kadherin) cham Chromatin-association motif (motiv asociován s chromatinem) CHEK2 Checkpoint kinase 2 (kináza kontrolního bodu 2) DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit (katalytická podjednotka DNA dependentní proten kinázy) FA Fanconi anemia (Fanconiho anémie) FANCD1 Fanconi anemia, complementation group D1 (Fanconiho anémie, komplementační skupina D1) FANCN Fanconi anemia, complementation group N (Fanconiho anémie, komplementační skupina N) ICLs Interstrand crosslinks (meziřetězcové kroslinky) KEAP1 Kelch-like ECH-associated protein 1 (senzor oxidativního stresu v jádře) KRAS v-ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (homolog virového onkogenu krysích nádorů z rodiny ras proteinů) LOH Loss of heterozygosity (ztráta heterozygosity) MRN Multiprotein complex of MRE11 / RAD50 / NBS1 (trimérní komplex) NER Nucleotide excision repair (excize nukleotidů) NHEJ Non homologous end joining (nehomologníí spojování konců) NRF2 Nf-E2 related factor 2 (transkripční faktor podílející se na zmírnění oxidačního stresu v buňce) PALB2 Partner and localizer of BRCA2 (partner a lokalizér BRCA2 proteinu) PTEN Phosphatase and tensin homolog (homolog fosfatáz a tenzinu) Rbgen Retinoblastoma gene (retinoblastomový gen) ROS Reactive oxygen species (reaktivní kyslíkové radikály) RPA Replication protein A (replikační protein A) sirna Small interfering RNA (malá interferující RNA) STK11 Serine/ threonine kinase 11 (serin/treonin kináza 11) XRCC4 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (protein zajišťující spojení konců při procesu nehomologního spojování konců) 21

27 11 Citovaná literatura Anglian Breast Cancer Study Group. Prevalence and penetrance of BRCA1 and BRCA2 mutations in a population-based series of breast cancer cases. Br. J. Cancer, 2000: Antoniou AC, Easton DF,. Models of genetic susceptibility to breast cancer. Oncogene, 2006: Blanco A, de la Hoya M, Balmaña J, Ramón y Cajal T, Teulé A, Miramar MD, Esteban E, Infante M, Benítez J, Torres A, Tejada MI, Brunet J, Graña B, Balbín M, Pérez- Segura P, Osorio A, Velasco EA, Chirivella I, Calvo MT, Feliubadaló L, Lasa A, Díez O, Carrac. Detection of a large rearrangement in PALB2 in Spanish breast cancer families with male breast cancer. Breast Cancer Res Treat., 2012: Bleuyar JY, Buisson R, Masson JY, Esashi F. ChAM, a novel motif that mediates PALB2 intrinsic chromatin binding and facilitates DNA repair. EMBO Rep, 2012: Buisson R, Dion-Côté AM, Coulombe Y, Launay H, Cai H, Stasiak AZ, Stasiak A, Xia B, Masson JY. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat Struct Mol Biol, 2010: Buisson R, Masson JY. PALB2 self- interaction controls homologous recombination. Oxford journals, 2012: Casadei S, Norquist BM, Walsh T, Stray S, Mandell JB, Lee MK, Stamatoyannopoulos JA, King MC. Contribution of inherited mutations in the BRCA2-interacting protein PALB2 to familial breast cancer. Cancer Res., 2011: Cullinan SB, Gordan JD, Jin J, Harper JW, Diehl JA.,. The Keap1-BTB protein is an adaptor that bridges Nrf2 to a Cul3-based E3 ligase: oxidative stress sensing by a Cul3- Keap1 ligase. Mol Cell Biol., 2004: Dansonka-Mieszkowska A, Kluska A, Moes J, Dabrowska M, Nowakowska D, Niwinska A, Derlatka P, Cendrowski K, Kupryjanczyk J. A novel germline PALB2 deletion in Polish breast and ovarian cancer patients. BMC Med Genet., 2010:

28 Dray E, Etchin J, Wiese C, Saro D, Williams GJ, Hammel M, Yu X, Galkin VE, Liu D, Tsai MS, Sy SM, Schild D, Egelman E, Chen J, Sung P. Enhancement of RAD51 recombinase activity by the tumor supresorr supresor suppressor PALB2. Nat Struct Mol Biol, 2010: Erkko H, Xia B, Nikkilä J, Schleutker J, Syrjäkoski K, Mannermaa A, Kallioniemi A, Pylkäs K, Karppinen SM, Rapakko K, Miron A, Sheng Q, Li G, Mattila H, Bell DW, Haber DA, Grip M, Reiman M, Jukkola-Vuorinen A, Mustonen A, Kere J, Aaltonen LA, Kosma VM,. A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families. Nature, 2007: Erkko H, Dowty JG, Nikkilä J, Syrjäkoski K, Mannermaa A, Pylkäs K, Southey MC, Holli K, Kallioniemi A, Jukkola-Vuorinen A, Kataja V, Kosma VM, Xia B, Livingston DM, Winqvist R, Hopper JL. Penetrance analysis of the PALB2 c.1592delt founder mutation. Clin Cancer Res, 2008 : Foulkes WD, Ghadirian P, Akbari MR, Hamel N, Giroux S, Sabbaghian N, Darnel A, Royer R, Poll A, Fafard E, Robidoux A, Martin G, Bismar TA, Tischkowitz M, Rousseau F, Narod SA. Identification of a novel truncating PALB2 mutation and analysis of its contribution to early-onset breast cancer in French-Canadian women. Breast Cancer Res., 2007: 83. Friedberg, Graham C. Walker, Wolfram Siede, Richard D. Wood, Roger A. Schultz, Tom Ellenburger. DNA Repair and Mutagenesis. Washington: American Society for Microbiology, Hayakawa T, Zhang F, Hayakawa N, Ohtani Y, Shinmyozu K, Nakayama J, Andreassen PR. MRG15 binds directly to PALB2 and stimulates homology-directed repair of chromosomal breaks. J Cell Sci., 2010: Hellebrand H, Sutter C, Honisch E, Gross E, Wappenschmidt B, Schem C, Deissler H, Ditsch N, Gress V, Kiechle M, Bartram CR, Schmutzler RK, Niederacher D, Arnold N, Meindl A. Germline mutations in the PALB2 gene are population specific and occur with low frequencies in familial breast cancer. Hum Mutat., 2011: Chen J, Silver DP, Walpita D, Cantor SB, Gazdar AF, Tomlinson G, Couch FJ, Weber BL, Ashley T, Livingston DM, Scully R,. Stable interaction between the products of the 23

29 BRCA1 and BRCA2 tumor supresorr supresor suppressor genes in mitotic and meiotic cells. Moll Cell., 1998: Jones S, Hruban RH, Kamiyama M, Borges M, Zhang X, Parsons DW, Lin JC, Palmisano E, Brune K, Jaffee EM, Iacobuzio-Donahue CA, Maitra A, Parmigiani G, Kern SE, Velculescu VE, Kinzler KW, Vogelstein B, Eshleman JR, Goggins M, Klein AP. Exomic sequencing identifies PALB2 as a pancreatic cancer susceptibility gene. Science, 2009: 217. Kee Y, D'Andrea AD.,. Expanded roles of the Fanconi anemia pathway in preserving genomic stability. Genes Dev., 2010: Kutler DI, Singh B, Satagopan J, Batish SD, Berwick M, Giampietro PF, Hanenberg H, Auerbach AD. A 20-year perspective on the International Fanconi Anemia Registry (IFAR). Blood, 2003: Ma J, Cai H, Wu T, Sobhian B, Huo Y, Alcivar A, Mehta M, Cheung KL, Ganesan S, Kong AN, Zhang DD, Xia B. PALB2 interacts with KEAP1 to promote NRF2 nuclear accumulation and function. Mol Cell Biol., 2012: Meindl A, Hellebrand H, Wiek C, Erven V, Wappenschmidt B, Niederacher D, Freund M, Lichtner P, Hartmann L, Schaal H, Ramser J, Honisch E, Kubisch C, Wichmann HE, Kast K, Deissler H, Engel C, Müller-Myhsok B, Neveling K, Kiechle M, Mathew CG, Schindler D,. Germline mutations in breast and ovarian cancer pedigrees establish RAD51C as a human cancer susceptibility gene. Nat Genet, 2010: Menzel T, Nähse-Kumpf V, Kousholt AN, Klein DK, Lund-Andersen C, Lees M, Johansen JV, Syljuåsen RG, Sørensen CS. A genetic screen identifies BRCA2 and PALB2 as key regulators of G2 checkpoint maintenance. EMBO reports, 2011: Miki Y, Swensen J, Shattuck - Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science, 1994: Moldovan GL, D Andrea AD.,. How the Fanconi anemia pathway guards the genome. Annu Rev Genet., 2009: Oliver AW, Swift S, Lord CJ, Ashworth A, Pearl LH. Structural basis for recruitment of BRCA2 by PALB2. EMBO Rep., 2009:

30 Pang Q, Andreassen PR. Fanconi anemia proteins and endogenous stresses. Mutat Res., 2009: Pastink A, Eeken JC, Lohman PH,. Genomic integrity and the repair of double-strand DNA breaks. Mutat Res., 2001: Pohlreich P, Kleibl Z, Kleiblová P, Janatová M, Soukupová J, Macháčková E, Házová J, Vašíčková P, Sťahlová Hrabincová E, Navrátilová M, Svoboda M, Foretová L. Klinický význam analýz genů středního rizika pro hodnocení rizika vzniku karcinomu prsu a dalších nádorů v České republice. Klin Onkol, 2012: Poumpouridou N, Kroupis C,. Hereditary breast cancer:beyond BRCA genetic analysis: PALB2 emerges. Clin Chem Lab Med, 2012: Prokofyeva D, Bogdanova N, Bermisheva M, Zinnatullina G, Hillemanns P, Khusnutdinova E, Dörk T. Rare occurrence of PALB2 mutations in ovarian cancer patients from the Volga-Ural region. Clin Genet., 2012: Pylkäs K, Erkko H, Nikkilä J, Sólyom S, Winqvist R. Analysis of large deletions in BRCA1, BRCA2 and PALB2 genes in Finnish breast and ovarian cancer families. BMC Cancer, 2008: 146. Rahman N, Seal S, Thompson D, Kelly P, Renwick A, Elliott A, Reid S, Spanova K, Barfoot R, Chagtai T, Jayatilake H, McGuffog L, Hanks S, Evans DG, Eccles D, a Stratton MR, Easton DF. PALB2, which encodes a BRCA2-interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene. Nat Genet., 2007: Reid S, Schindler D, Hanenberg H, Barker K, Hanks S, Kalb R, Neveling K, Kelly P, Seal S, Freund M, Wurm M, Batish SD, Lach FP, Yetgin S, Neitzel H, Ariffin H, Tischkowitz M, Mathew CG, Auerbach AD, Rahman N. Biallelic mutations in PALB2 cause Fanconi anemia subtype FA-N and predispose to childhood cancer. Nat Genet., 2007: Roy R, Chun J, Powell SN,. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer., 2011: Schärer OD. Chemistry and biology of DNA repair. Angew Chem Int Ed Engl., 2003: Schulz, Wolfgang Arthur. Molecular Biology od Human Cancers. Dordrecht: Springer,

31 Silvestri V, Rizzolo P, Zanna I, Falchetti M, Masala G, Bianchi S, Papi L, Giannini G, Palli D, Ottini L.,. PALB2 mutations in male breast cancer: a population-based study in Central Italy. Breast Cancer Res Treat., 2010: Slater EP, Langer P, Niemczyk E, Strauch K, Butler J, Habbe N, Neoptolemos JP, Greenhalf W, Bartsch DK. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin Genet., 2010: Southey MC, Teo ZL, Dowty JG, Odefrey FA, Park DJ, Tischkowitz M, Sabbaghian N, Apicella C, Byrnes GB, Winship I, Baglietto L, Giles GG, Goldgar DE, Foulkes WD, Hopper JL, a kconfab for the Beast Cancer Family, Registry. A PALB2 mutation associated with high risk of breast cancer. Breast Cancer Res., 2010: 109. Sy SM, Huen MS, Chen J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proc Natl Acad Sci USA, 2009: Sy SM, Huen MS, Zhu Y,Chen J. PALB2 regulates recombinational repair through chromatin association and oligomeration. J. Biol. Chem, 2009: Taguchi K, Motohashi H, Yamamoto M. Molecular mechanisms of the Keap1 Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution. Genes Cells, 2011: Thompson D, Easton DF. Cancer incidence in BRCA 1 mutation carries. J Nat Cancer Inst, 2002: Tominaga K, Kirtane B, Jackson JG, Ikeno Y, Ikeda T, Hawks C, Smith JR, Matzuk MM, Pereira- Smith OM. MRG15 regulates embryonic development and cell proliferation. Mol Cell Biol., 2005: Turner N, Tutt A, Ashworth A. Targeting the DNA repair defekt of BRCA tumor supresorurs. Curr Opin Pharmacol, 2005: van Vugt MA, Bràs A, Medema RH.,. Restarting the cell cycle when the checkpoint comes to a halt. Mol Cell, 2005: Walsh T, King MC. Ten genes for inherited breast cancer. Cancer Cell, 2007: West, Stephen C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2003: Wooster R, Bignell G, Lancaster J, Swift S, Seal S, Mangion J, et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature, 1995:

32 Xia B, Dorsman JC, Ameziane N, de Vries Y, Rooimans MA, Sheng Q, Pals G, Errami A, Gluckman E, Llera J, Wang W, Livingston DM, Joenje H, de Winter JP. Fanconi anemia is associated with a defect in the BRCA2 partner PALB2. Nat Genet., 2007: Xia B, Sheng Q,Nakanishi K, Ohashi A, Wu J, Christ N,. Control of BRCA2 cellular and clinical functions by a nuclear partner, PALB2. Mol cell, 2006: Zhang F, Bick G, Park JY, Andereassen PR,. MDC1 and RNF8 function in a pathway that directs BRCA1- dependent localization of PALB2 required for homologous recombination. J Cell Sci., 2012: Zhang F, Fan Q, Ren K, Andreassen PR,. PALB2 Functionally Connects the Breast Cancer Susceptibility Proteins BRCA1 and BRCA2. Mol Cancer Res., 2009: Zhang F, Ma J, Wu J, Ye L, Cai H, Xia B, Yu X,. PALB2 links BRCA1 and BRCA2 in the DNA- Damage Response. Current Biology, 2009: Zhang P, Du J, Sun B, Dong X, Xu G, Zhou J, Huang Q, Liu Q, Hao Q, Ding J. Structure of human MRG15 chromo domain and its binding to Lys36-methylated histone H3. Nucleic Acids Res., 2006: Internetové zdroje: databáze OMIM 27