Nanotransportéry pro teranostické aplikace

Transkript

1 Název: Nanotransportéry pro teranostické aplikace Školitel: Simona Dostálová, Markéta Vaculovičová Datum: Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik

2 CÍLE PRÁCE Provést literární rešerši o současném stavu teranostického výzkumu a možnostech uplatnění virových kapsid a dalších nanočástic v tomto oboru. Prostudovat možnosti virových kapsid, proteinů a anorganických sloučenin jako nanotransportérů léčiv. Charakterizovat proteinovou architekturu virové kapsidy pomocí analytických a molekulárněbiologických metod. Prakticky ověřit možnost enkapsulace léčiva do vybraného nanotransportéru Porovnat schopnost virového a proteinového nanotransportéru enkapsulovat léčivo

3 TERANOSTIKA = diagnostika + cílená doprava + zobrazování + odezva na léčbu Personalizace medicíny Rakovina, záněty, KVO, degenerativní onemocnění Platforma: proléčiva/nanomedicína

4 NANOMEDICÍNA Snížení systémové toxicity léčiv Zvýšení efektivity, doby skladovatelnosti EPR efekt - akumulace v nádorech snížení aplikované dávky léčiva

5 NANOTRANSPORTÉRY Enkapsulace nebo rozpouštění léčiv Cílené dopravování léčiv + zobrazování nm Terapeutický náklad, přenašeč nákladu, cílící ligand a emitor signálu

6 VIRY JAKO NANOTRANSPORTÉRY Genů Doprava DNA vakcín CCMV Ftalocyanin zinku Rostlinné viry CPMV Proflavin RCNMV Zlaté nanočástice Porfyriny Léčiv MS2 Cisplatina Bakteriofágy M13 Ftalocyanin zinku Doxorubicin Doxorubicin

7 BAKTERIOFÁG Infikuje bakterii Escherichia coli Lyzogenní / lytická reprodukce Ikozahedrální kapsida trimery (E), hexamery a pentamery (D) E - hlavní protein kapsidy (38 kda) D minoritní protein kapsidy (12 kda) 1 virion tvoří až 50 nových virionů 1 generace se vytvoří za 5,5-6,5 hod

8 KULTIVACE BAKTERIOFÁGA

9 Intenzita fluorescence (%) Absorbance (AU) 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 ČASOVÁ ZÁVISLOST RŮSTU BAKTERIOFÁGA Růstová křivka E.coli E.coli + fág Amplifikace genu xis bakteriofága bp hod 500 % ,10 0,05 0, Doba kultivace (hod) y = 7,0892x + 71,988 R² = 0, Doba kultivace (hod)

10 ANALÝZA PROTEINŮ VIROVÉ KAPSIDY 20% 30% 40% 6000g g g 60% Sacharózový/cesiový gradient E. coli Fág Proteiny Nečistoty

11 ANALÝZA PROTEINŮ VIROVÉ KAPSIDY kda L Protein J (135 kda) Protein H (80 kda) Protein E (37 kda) Protein V (31 kda) Protein D (11 kda) 1 Přímo odebrané médium E. coli kultivované s bakteriofágem. 2 Supernatant po centrifugaci vzorku 1. 3 Pelet vzniklý ultracentrifugací vzorku 2 a resuspendovaný ve fosfátovém pufru. 4 První frakce sacharózového gradientu po ultracentrifugaci vzorku 3. 5 Druhá frakce sacharózového gradientu (20% sacharóza). 6 Třetí frakce sacharózového gradientu (30% sacharóza). 7 Čtvrtá frakce sacharózového gradientu (40% sacharóza). 8 Pátá frakce sacharózového gradientu (60% sacharóza).

12 Absorbance (AU) VLIV PŘÍDAVKU DOXORUBICINU NA RŮST BAKTERIOFÁGA E. coli E. coli + fág E. coli + doxo E. coli + fág + doxo 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Absorbance 620 nm Doba kultivace (hod) 280 μl E. coli + 10 μl bakteriofág λ + 10 μl 2 mg/ml doxorubicinu

13 ENKAPSULACE DOXORUBICINU DO BAKTERIOFÁGA 2 hod, 20 C 6000g g

14 Fluorescence (a. u.) ENKAPSULACE DOXORUBICINU DO BAKTERIOFÁGA Fluorescence bakteriofága po přídavku různých koncentrací DOX PAGE elektroforéza μg/ml μg/ml 50 μg/ml 25 μg/ml µg/ml μg/ml Excitace 480 nm Vlnová délka (nm) µg/ml Excitace 480 nm

15 AMPLIFIKACE GENU XIS PO ENKAPSULACI DOXORUBICINU Kontrolní PCR z komerční DNA s přídavkem doxorubicinu Ladder 0,001 0,01 0,05 0,

16 Fluorescence (a. u.) Fluorescence (a. u.) FLUORESCENCE IZOLOVANÉ DNA μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml Excitace 480 nm Vlnová délka (nm) Zvýšení koncentrace bakteriofága ~ Kontrola DOX 200 μg/ml Excitace 480 nm Vlnová délka (nm)

17 Fluorescence 475 (a. u.) Fluorescence (a. u.) OZNAČENÍ -NH SKUPIN DOX FLUORESKAMINEM μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml Excitace 390 nm Vlnová délka (nm) Koncentrace aplikovaného doxorubicinu (μg/ml) Excitace 390 nm

18 SOUHRN Provést literární rešerši o současném stavu teranostického výzkumu a možnostech uplatnění virových kapsid a dalších nanočástic v tomto oboru. Prostudovat možnosti virových kapsid, proteinů a anorganických sloučenin jako nanotransportérů léčiv. Charakterizovat proteinovou architekturu virové kapsidy pomocí analytických a molekulárněbiologických metod. Prakticky ověřit možnost enkapsulace léčiva do vybraného nanotransportéru Porovnat schopnost virového a proteinového nanotransportéru enkapsulovat léčivo

19 PODĚKOVÁNÍ

20 Děkuji za pozornost Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik